Summary
Et bioinspirert stillas er fabrikkert av en myk fotoliografiteknikk ved hjelp av mekanisk robuste og elektrisk ledende hydrogeler. De mikromønstrede hydrogelene gir retningsbestemt kardiomyocyttercellejustering, noe som resulterer i en skreddersydd retning av aktivering. Fleksible mikroelektroder er også integrert i stillaset for å gi elektrisk kontrollbarhet for et selvaktiverende hjertevev.
Abstract
Bioinspirerte myke robotsystemer som etterligner levende organismer ved hjelp av konstruert muskelvev og biomaterialer revolusjonerer dagens biorobotparadigme, spesielt i biomedisinsk forskning. Å gjenskape kunstig livaktig aktuasjonsdynamikk er avgjørende for et mykt robotsystem. Imidlertid representerer den nøyaktige kontrollen og justeringen av aktuasjonsatferd fortsatt en av de viktigste utfordringene i moderne myke robotsystemer. Denne metoden beskriver en rimelig, svært skalerbar og brukervennlig prosedyre for å fremstille en elektrisk kontrollerbar myk robot med livaktige bevegelser som aktiveres og kontrolleres av sammentrekning av hjertemuskelvev på et mikromønstret stikk ray-lignende hydrogel stillas. Bruken av myke fotoliografimetoder gjør det mulig å integrere flere komponenter i det myke robotsystemet, inkludert mikromønstrede hydrogelbaserte stillas med karbonnanorør (CNTs) innebygd gelatin methacryloyl (CNT-GelMA), poly(etylenglykol) diacrylate (PEGDA), fleksible gull (Au) mikroelektroder og hjertemuskelvev. Spesielt er hydrogels justering og mikromønster designet for å etterligne muskel- og bruskstrukturen til stikkstrålen. Den elektrisk ledende CNT-GelMA hydrogel fungerer som et cellestillas som forbedrer modning og sammentrekning atferd av kardiomyocytter, mens mekanisk robust PEGDA hydrogel gir strukturell brusk-lignende støtte til hele myk robot. For å overvinne den harde og sprø natur metallbaserte mikroelektroder, designet vi et slangemønster som har høy fleksibilitet og kan unngå å hemme den slående dynamikken i kardiomyocytter. De inkorporerte fleksible Au-mikroelektrodene gir elektrisk stimulering over den myke roboten, noe som gjør det lettere å kontrollere sammentrekningsoppførselen til hjertevev.
Introduction
Moderne state-of-the-art myke roboter kan etterligne hierarkiske strukturer og muskeldynamikk av mange levende organismer, for eksempel maneter1,2, stikke ray2, blekksprut3, bakterier4,og sperm5. Etterligne dynamikken og arkitekturen av naturlige systemer tilbyr høyere forestillinger i form av både energisk og strukturell effektivitet6. Dette er iboende relatert til den myke naturen av naturlig vev (f.eks hud eller muskelvev med en Youngs modulus mellom 104-109 Pa) som gir høyere frihetsgrader og overlegen deformasjon og tilpasningsevne sammenlignet med standardkonstruerte aktuatorer (f.eks. en Youngs modulus vanligvis mellom 109 -1012 Pa)6. Hjertemuskelbaserte soft-aktuatorer, spesielt, viser overlegen energieffektivitet på grunn av deres selvaktivering samt deres potensial for autorepair og regenerering sammenlignet med et mekanisk basert robotsystem7. Imidlertid er fabrikasjon av myke roboter utfordrende på grunn av nødvendigheten av å integrere ulike komponenter med forskjellige fysiske, biologiske og mekaniske egenskaper i det ene systemet. For eksempel må konstruerte syntetiske systemer integreres med levende biologiske systemer, ikke bare gi dem strukturell støtte, men også påvirke og modulere deres aktiveringsatferd. I tillegg krever mange mikrofabrikasjonsmetoder harde/cytotoksiske prosesser og kjemikalier som reduserer levedyktigheten og funksjonen til eventuelle levende komponenter. Derfor er nye tilnærminger nødvendig for å forbedre funksjonaliteten til de myke robotene og for å kontrollere og modulere deres oppførsel.
For å integrere levende komponenter med god levedyktighet, er et hydrogelbasert stillas et utmerket materiale for å skape kroppen til en myk robot. En hydrogel fysiske og mekaniske egenskaper kan lett justeres for å skape mikromiljøer for levende komponenter som muskelvev8,9. Det kan også enkelt vedta ulike mikrofabrikasjonsteknikker, noe som resulterer i etablering av hierarkiske strukturer med høy gjengivelse1,2,10. Fleksible elektroniske enheter kan innlemmes i den myke roboten for å kontrollere sin oppførsel med elektrisk stimulering. For eksempel har optogenetiske teknikker for å konstruere elektrogene celler (f.eks. kardiomyocytter), som viser en lysavhengig elektrofysiologisk aktivering, blitt brukt til å utvikle en polydimethylsiloxane (PDMS)-basert myk robotrokkstyrt styrt av lys som var i stand til å gjenskape den bølgende bevegelsen av fisken in vitro2. Selv om optogenetiske teknikker har vist utmerket kontrollerbarhet, bruker arbeidet som presenteres elektrisk stimulering, en konvensjonell og tradisjonell simuleringsmetode. Dette skyldes at elektrisk stimulering via fleksible mikroelektroder er enkel og enkel sammenlignet med optogenetiske teknikker, som krever omfattende utviklingsprosesser11. Bruk av fleksible elektroniske enheter kan tillate langsiktig stimulering og standard / enkel fabrikasjonprosesser samt tunable biokompatibilitet og fysiske og mekaniske egenskaper12,13.
Her presenterer vi en innovativ metode for å fabrikkere en bioinspirert myk robot, utfelt ved å slå konstruert hjertemuskelvev og kontrollert av elektrisk stimulering gjennom innebygde fleksible Au-mikroelektroder. Den myke roboten er designet for å etterligne muskel- og bruskstrukturen til stikkstrålen. Stikkstrålen er en organisme med en relativt lett å etterligne struktur og bevegelse sammenlignet med andre svømmearter. Musklene gjenskapes in vitro ved å så kardiomyocytter på et elektrisk ledende hydrogelmikromønster. Som tidligere rapportert, inkorporerer elektrisk ledende nanopartikler som CNT i GelMA hydrogel ikke bare forbedrer elektrisk kobling av hjertevevet, men også induserer en utmerket in vitro vev arkitektur og arrangement8,9. Bruskleddene etterlignes deretter ved hjelp av et mekanisk robust PEGDA hydrogelmønster som fungerer som det mekanisk robuste substratet i hele systemet. Fleksible Au mikroelektroder med et slangemønster er innebygd i PEGDA-mønsteret for å lokalt og elektrisk stimulere hjertevevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av den institusjonelle Dyreverns- og brukskomiteen (IACUC) ved Brigham and Women's Hospital.
1. GelMA-syntese
- Løs opp 10 g gelatin i 100 ml dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) ved hjelp av en magnetisk røreved 50 °C.
- Tilsett 8 ml metakrylanhydrid sakte mens du rører gelatinprepolymeroppløsningen ved 50 °C i 2 timer. Fortynn den reaksjonerte gelatinoppløsningen med forvarmet DPBS ved 50 °C.
- Overfør den fortynnede oppløsningen til dialysemembraner (nedskjæring av molekylvekt = 12–14 kDa) og plasser dem i avionisert vann (DI). Utfør dialyse ved 40 °C i ca. 1 uke.
- Filtrer den dialyzed GelMA prepolymeroppløsningen ved hjelp av et sterilt filter (porestørrelse = 0,22 μm) og overfør 25 eller 30 ml av oppløsningen til 50 ml rør og oppbevar ved -80 °C i 2 dager.
- Frys fryse-dryss den frosne GelMA prepolymer oppløsningen ved hjelp av en frysetørker i 5 dager.
2. Tilberedning av poly(etylenglykol) diacrylate (PEGDA) prepolymerløsning
- Oppløs 200 mg (20 % av total oppløsning) av PEGDA (MW = 1000) med 5 mg (0,5 % av total oppløsning) av 2-hydroksy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofon (fotoinitiator, PI) i 1 ml DPBS.
- Inkuber prepolymeroppløsningen ved 80 °C i 5 min.
3. Utarbeidelse av GelMA-belagt CNT-dispergert lagerløsning
- Oppløs 80 mg GelMA (brukes som biosurfactant) i 4 ml DPBS og tilsett deretter 20 mg COOH-funksjonaliserte multiveggede karbonnanorør (MWCNTs) i GelMA-prepolymeroppløsningen.
- Sonikere MWCNT-laden GelMA prepolymer oppløsning for 1 t (0,66Hz, 100 Watt).
MERK: Under sonikeringsprosessen må oppløsningen senkes ned i et vannbad ved ~15 °C for å forhindre fordampning av løsningsmiddel på grunn av temperaturstigningen.
4. Tilberedning av 1 mg/ml CNT som inneholder 5 % GelMA prepolymerløsning
- Oppløs 50 mg GelMA og 5 mg (0,5 % av den totale oppløsningen) pi i 0,8 ml DPBS ved 80 °C i 10 min.
- Legg til 0,2 ml av den tilberedte CNT-lagerløsningen (trinn 3). Vortex og inkuber oppløsningen ved 80 °C i 10 min.
5. Tilberedning av en 3-(trimetoksysilyl)propyl metakrylat (TMSPMA) belagt glasslysbilde
- Vask glassskliene (tykkelse = 1 mm, størrelse = 5,08 cm x 7,62 cm) med ren etanol.
- Stable de rengjorte lysbildene vertikalt i et 250 ml beger og spre 3 ml TMSPMA oppå dem ved hjelp av en sprøyte. Dekk begeret med aluminiumsfolie for å forhindre fordampning av TMSPMA.
- Inkuber lysbildene i en 80 °C ovn i 1 dag.
- Vask de belagte glassskliene ved å dyppe dem i ren etanol, og tørk deretter.
- Oppbevar de belagte glassskliene innpakket i aluminiumsfolie ved romtemperatur (RT).
MERK: Prøv å minimere berøring av overflatene på tMSPMA-belagte glasslysbilder.
6. Fabrikasjon av de fleksible Au-mikroelektrodene
- Utforme en skyggemaske ved hjelp av dataassistert design (Tilleggsfil 3).
- Fabrikkere og kjøpe en skyggemaske.
- Vask glasssklien (tykkelse = 1 mm, størrelse = 3 cm x 4 cm) med aceton og tørk med trykkluftpistol.
- Fest skyggemasken til glasssubstratene ved hjelp av dobbeltsidig tape, legg dem deretter i en E-strålefordamper og vent til kammertrykket når minst 10-6 Torr.
MERK: De to båndbitene ble plassert manuelt på støtten på en avstand kort nok til å være vert for glasset og stort nok til å passe hele mønsteret. Dette trinnet tar rundt 45-60 min. - Depon et 200 nm tykt Au-lag med E-bjelkefordamper (f.eks. med Denton EE-4, vakuum = 10-6 Torr, effekt = 2,6 %, hastighet = 2 Å/s) og kutt de fabrikkerte mikroelektrodene ved hjelp av en terningerssagmaskin (elektroderstørrelse = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabrikasjon av et Au mikroelektrodeintegrert mikromønstret mikromønstret flerlags hydrogelstillas
MERK: Resultatet av denne prosedyren er en membran hvor en mikromønstret PEGDA hydrogel er i det nederste laget, en mikromønstret CNT-GelMA hydrogel er på toppen, og Au-mikroelektrodene er mellom de to lagene. Denne konfigurasjonen sikrer en bedre fleksibilitet til elektroden og begrenser risikoen for å bryte.
- Design og fremfør to fotomasker for å lage mikromønstrede PEGDA (1m fotomaske) og CNT-GelMA hydrogel (2nd fotomaske) lag. Se Tilleggsfil 2–3. Utformingen kan gjøres ved hjelp av CAD-programvare.
MERK: Se figur 2B, E. - Plasser 50 μm avstandsstykke laget ved å stable ett lag med kommersiell usynlig tape (Tykkelse: 50 μm) på et TMSPMA belagt glass. Hell 15 μL 20% PEGDA prepolymerløsning på toppen av TMSPMA belagt glass, og dekk deretter med gull mikroelektrod. Plasser den første fotomasken for glasssklien (mikromønstret PEGDA) på toppen av gullmikroelektroden og utsett hele konstruksjonen for UV-lys (200 W kvikksølvdamp kortbuelampe med 320–390 nm-filter) ved 800 mW intensitet og 8 cm avstand for 110 s.
MERK: Se figur 1A. - Tilsett DPBS for å omgi glasssklien og koble den mikromønstrede PEGDA-hydrogelen sammen med Au-mikroelektrodene fra det ubestrøkede glasssubstratet nøye etter 5–10 min for å få glasssklien som har den mikromønstrede PEGDA-hydrogelen med Au mikroelektroder.
MERK: Se figur 1B. På grunn av TMSPMA-belegget overføres konstruksjonen fra det ubestrøkede glasssubstratet til tmspma-belagt. Løsne forsiktig fordi Au-mikroelektrodene kan bryte lett i løpet av dette trinnet (Figur 3). - Plasser 100 μm avstandsstykke laget ved å stable to lag med kommersiell gjennomsiktig tape (tykkelse = 50 μm) på bunnen av en Petri-tallerken. Deponer en dråpe på 20 μL CNT-GelMA prepolymerløsning mellom avstandsstykkene og snu deretter glasssklien oppnådd i 7,3 og fest den på fatet med tape.
- Roter enheten opp ned og plasser denandre fotomasken på toppen av glasslysbildet. Utsett under UV-lys ved 800 mW intensitet og 8 cm avstand for 200 s.
MERK: Se figur 1C. Justering av den andre masken er viktig. - Vask det oppnådde stillaset med DPBS og med cellekulturmedium som inkluderer 10% føtal storfeserum (FBS).
- La dem overnatte i 37 °C inkubatoren før de så cellene.
8. Neonatal rotte kardiomyocytter isolasjon og kultur
- Isolere hjerter fra 2-dagers gamle Sprague-Dawley rotter etter protokoller godkjent av Instituttets komité for dyrepleie8.
- Sett hjertebitene på shakeren over natten (rundt 16 timer) i 0,05% trypsin uten EDTA i HBSS i et kaldt rom.
- Samle hjertebitene med en pipettepistol og minimer mengden trypsin, og legg dem deretter i et 50 ml rør med 10 ml varme hjertemedier (10 % FBS, 1 % P/S, 1 % L-glutamin).
- Virvle sakte (~ 60 rpm) i et 37 °C vannbad i 7 min. Fjern mediet forsiktig fra røret med en 10 ml pipette og la hjertebitene stå i røret.
- Tilsett 7 ml 0,1 % kollagenasetype 2 i HBSS og virvler i et vannbad på 37 °C i 10 min.
- Bland med en 10 ml pipette 10x forsiktig for å forstyrre hjertebitene. Fjern mediet fra røret med en 1 ml pipette.
- Tilsett 10 ml 0,1 % kollagenrør type 2 i HBSS og virvle raskt (~120–180 rpm) i et vannbad på 37 °C i 10 min, og kontroller deretter om hjertebitene oppløses.
- Bland med en 10 ml pipette, og gjenta deretter med en 1 ml pipette for å knuse de siste hjertebitene.
- Når oppløsningen ser homogen ut, plasser en 70 μm cellesil på et nytt 50 ml rør og pipette oppløsningen 1 ml om gangen på silen.
- Sentrifuge hjertecelleoppløsningen ved 180 x g i 5 min ved 37 °C.
MERK: Hvis det fortsatt er noen hjertestykker eller slim som ikke ble oppløst, gjentar du trinn 8.7–8.9 igjen. - Fjern forsiktig all væsken over cellepelleten og resuspendert cellene i 2 ml hjertemedier.
- Tilsett 2 ml hjertemedier fra rørveggen nøye for å suspendere cellene på nytt og unngå å bryte dem.
- Legg til suspenderte celler i en T175 kolbe med varm hjertemedia dråpe for dråpe. Sett kolben i en 37 ° C inkubator i 1 time for å tillate hjertefibroblaster å feste til bunnen.
MERK: På dette preplating trinnet vil hjertefibroblaster festes til kolben mens kardiomyocytter vil forbli i suspensjonsmediet. - Samle media fra kolben som inneholder kardiomyocytter og sette den inn i en 50 ml rør.
- Tell cellene, deretter sentrifuge ved 260 x g i 5 min ved 37 °C.
- Resuspendog frø cellene på toppen av den fabrikkerte myke roboten i trinn 7. Hell spesifikt volum av hjertemedier med kardiomyocytter i en konsentrasjon på 1,95 × 106 celle / ml fall for fall på hele overflaten av enheten.
- Inkuber prøvene ved 37 °C og endre mediene med 5 ml cellekulturmedier med 2 % FBS og 1 % L-glutamin på første og andre dager etter seeding. Endre mediet hver gang fargen på mediet skifter.
9. Cellefarging for justeringsanalyse
- Fjern mediet og vask med DPBS i 5 min på RT.
- Fest cellene ved hjelp av 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min ved RT. Vask deretter med DPBS i 5 min på RT.
- Inkuber cellene med 0,1% triton i DPBS ved RT i 1 t. Vask 3x med PBS i 5 min ved RT.
- Inkuber cellene med 10% geitserum i DPBS ved RT i 1 t.
- Inkuber cellene med et primært antistoff (sarkomeriske α-actinin inin og connexin-43) i 10% geitserum i DPBS ved 4 °C for ~ 14–16 h.
- Vask 3x med DPBS i 5 min ved RT. Inkuber cellene med det sekundære antistoffet i 10% geitserum i DPBS ved RT i 1 time.
- Vask 3x med DPBS i 5 min ved RT, deretter motflekkceller med 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI) i DI vann (1:1,000) for 10 min på RT. Vask 3x med DPBS i 5 min på RT.
- Ta fluorescensbilder ved hjelp av et omvendt laserskanningskonfokalmikroskop.
10. Aktuator testing og atferd evaluering
- Spontan juling av kardiomyocytter på den myke roboten
- Inkuber bioinspirerte aktuatorer ved 37 °C i 5 dager og oppdater mediene på dag 1 og 2 og når det er nødvendig (dvs. når mediene blir gule). Bruk et invertert optisk mikroskop til å ta bilder daglig (5x og/eller 10x). Ta opp cellebevegelser ved hjelp av videoopptaksprogramvare i mikroskopets livevindu for 30 s med 20 bilder per sekund (5x og/eller 10x) når kontraktileaktiviteten starter (vanligvis rundt dag 3).
- På dag 5 løsner du membranene ved å løfte forsiktig fra kanten med et deksellysbilde.
MERK: Hvis cellene viser en sterk slagatferd, vil membranene løsne av seg selv på grunn av den mekaniske virkningen av sammentrekningene.
- Bulk elektrisk signal stimulering
- Ved hjelp av en 3 cm fordelt PDMS som holder, fest to karbonstangelektroder med platina (Pt) ledning i en 6 cm Petriskål fylt med hjertemedier. Deretter forsiktig overføre den myke roboten til Petri parabolen.
- Påfør en firkantet bølgeform med 50 ms pulsbredde, DC-forskyvningsverdi 0 V og toppspenningsamplitude mellom 0,5 og 6 V. Frekvensen varierer mellom 0,5, 1,0 og 2,0 Hz med en driftssyklus mellom henholdsvis 2,5 %, 5 %og 10 %. Ta opp makroskalasammentrekninger ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kamera.
- Elektrisk stimulering med Au-mikroelektrodene
- Etter fabrikasjon av Au mikroelektrodeintegrert flerlags hydrogelstillas, fest to kobberledninger til Au-elektrodene selv om en ekstern firkantport ved hjelp av sølvpasta.
- Dekk sølvpastaen med et tynt lag med PDMS forhåndsherdet ved 80 °C i 5 min. Sett deretter prøvene på en kokeplate ved 45 °C i 5 timer for å krysskoble PDMS helt.
- Etter seeding cardiomyocyte, påfør en firkantet bølge elektrisk stimulans på kobberledningene med DC offset verdi 1 V, peak voltage amplitude mellom 1,5 og 5 V, og frekvenser på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 Hz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flytdiagram over trinnene for å utvikle den Au mikroelektrodeinnlemmede bioinspirerte myke roboten
Målet med den myke robotdesignen var å bygge en membran som kunne aktivere en svømmebevegelse med minimal kompleksitet. Strukturen må kunne opprettholde sterke fleksjoner gjentatte ganger over tid (ca. 1 Hz) og kunne holde formen samtidig som den oppnår en sterk juling. Ved selektivt fotokryssing av polymeren ved hjelp av fotomasker, fabrikkerte vi et hierarkisk strukturert stillas bestående av et mikromønstret PEGDA hydrogellag, et fleksibelt Au mikroelektroderlag og et mikromønstret CNT–GelMA hydrogellag. Et skjematisk diagram og faktiske bilder av fabrikasjonsprosedyren til den myke roboten som beskrevet i protokollen, vises i figur 1. Kort tid var det tre hovedfabrikasjonstrinn for den bioinspirerte myke roboten med innebygde Au mikroelektroder: For det første ble en mikromønstret PEGDA-hydrogel med inkorporerte Au-mikroelektroder oppnådd ved UV-krysskobling ved hjelp av den første fotomasken (Figur 1A, B). For det andre ble en flerlags konstruksjon bestående av Au mikroelektroder, mikromønstret CNT-GelMA og PEGDA-hydrogelene fabrikkert av UV-krysskobling ved hjelp av den andre fotomasken (figur 1C). Til slutt ble kardiomyocytter seeded på den fabrikkerte trelagskonstruksjonen for å gi aktivering til den myke roboten (Figur 1D).
Ulike design av den myke roboten
Når det gjelder formen på den myke roboten, designet vi i begynnelsen to bioinspirerte former ved å bioetterligne mønstrene til to forskjellige akvatiske dyr. Den første designen var inspirert av utseendet til en karaffel sjøstjerne (Figur 2A, B, C), fordi sjøstjernen kan forenkles til et todimensjonalt (2D) objekt, har en hard ryggrad, og har en fleksibel del som slår seg sammen for å bevege seg i vannet, minimere den nødvendige bevegelsen. Den andre enheten var basert på formen på en mantastråle (figur 2D, E, F) som er lett å reprodusere i en 2D-enhet. Mantastrålen kan svømme raskt ved hjelp av unike bevegelser. Vi skisserte mantastrålen ved hjelp av grunnleggende geometriske former med redusert kompleksitet som skal krysskobles under fotomasketrinnet. Elektroden, plassert langs midten av strukturen, ble designet med et bølget mønster, noe som gir en bedre spredning av elektriske pulser og fleksibilitet (Figur 2D). For å utvikle den bioinspirerte myke roboten ble den manta stråleinspirerte formen valgt og testet grundig i denne studien.
Utfordringen med å bygge inn Au-mikroelektrodene mellom CNT-GelMA og PEGDA hydrogeler
Innkapslingen av 200 nm tykke Au mikroelektroder i det fabrikkerte robothuset kan lokalt kontrollere konstruksjonen ved å gi elektrisk stimulering. Selv om UV-krysskoblingen av både CNT-GelMA- og PEGDA-hydrogelmønstrene direkte på elektrodeoverflaten hindret avlysningen av elektrodene, garanterte den den vellykkede inkorporeringen av elektroden i den myke roboten. Men etter å ha overført Au-elektroden på PEGDA-hydrogelene, ble Au-elektroden med rektangulær form og bred bredde (>1 mm) lett brutt under fabrikasjonsprosessen på grunn av hevelse i PEGDA hydrogel (Figur 3A, B, C). Derfor måtte vi sørge for at mikroelektrodene ble overført til PEGDA hydrogel og innebygd mellom CNT-GelMA og PEGDA hydrogeler mens intakt. Derfor ble Au mikroelektroder med et slangemønster (tykkelse = 200 μm) designet og fabrikkert med myk litografi. Fasekontrastmikroskopbilder med forskjellige forstørrelser og stadier ble tatt for å inspisere tegn på brudd på elektroden etter transport på mikromønstrede PEGDA-hydrogeler (Figur 3D, E, F).
Optimalisering av avstand mellom hydrogelmikromønstre
KardiomyocytterseededCNT-GelMA-laget viste forskjellig slagatferd i henhold til mønsteravstandene (figur 4A, B). Dette kan tilskrives de forskjellige måtene celler festet til membranens overflate, avhengig av linjenes avstander. I tilfelle av 50 μm avstand, cellene var for pakket og hadde ikke ønsket organisert konfigurasjon. De delvis sammenkoblede og ikke justerte cellene på vingene bidro ikke alle samtidig til svømmebevegelsen. Derfor var kraften generert av kardiomyocytter ikke nok til å bøye vingene. På en avstand på 150 μm var cellene svært godt justert. Men de satt hovedsakelig i sporet, og det var få forbindelser mellom celler i de øvre lagene, noe som resulterte i svak juling. På en 75 μm avstand ble cellene justert i den nederste delen og sammenkoblet i den øvre delen, som viser den sterkeste julingen. I tillegg, for å forhindre irreversibel fullstendig rulling av den myke roboten under dynamisk juling av kardiomyocytter, optimaliserte vi mønsteravstanden til PEGDA hydrogelstøttelaget til 300 μm (Figur 4C). Til slutt, etter denne parameteriseringsprosessen, bestemte vi oss for å fokusere mer på manta ray-formet membran med 300 μm avstand PEGDA mønstre og 75 μm avstand CNT-GelMA mønstre. Hjertevev på mikromønstrede PEGDA- og CNT-GelMA-mønstre ble også vist av fase/kontrastbilder og F-actin/DAPI konfokalbilder (Figur 4B).
Analysen av bevegelse av hjertevevet på mikromønstrede PEGDA- og CNT-GelMA hydrogeler
For å analysere bevegelsen til aktuatoren tok vi videoer av membranen uten Au-mikroelektrodene mens vi brukte et elektrisk felt ved hjelp av en karbonstangelektrode. Figur 4D viser noen rammer hentet fra sammentrekningspostene. Det var tydelig synlig at den manta ray-formet aktuator en bøye vingene som forventet. Halen balanserte strukturen ved å rette opp litt og vingene var sterkt lukke i midten. Noen av membranene viste en roterende bevegelse mens de kontraherte på grunn av feiljusterte mikromønstrede CNT-GelMA og PEGDA hydrogeler (Figur 4E og Video 1). I dette tilfellet var bevegelsen mindre definert i forhold til den forrige, men sammentrekningen var fortsatt sterk nok til å tillate aktivering av en roterende bevegelse. Den totale tiden for å fullføre en hel sirkel var rundt 45 s.
Karakterisering av kardiomyocytter på den flerlags myke roboten og kontroll av slående atferd ved elektrisk stimulering
Etter seeding og modning av kardiomyocytter på det bioinspirerte robotsystemet (Figur 5A),ble justering av hjertevevet langs retningen av CNT-GelMA-mønstre observert (Figur 5B-E) av både F-actin / DAPI og sacromeric / connexin-43 / DAPI immunstaining. Confocal fluorescensbilder viste godt langstrakt og justert kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogel mønster (Figur 5B, C). Delvis uniaxial sarkofamerjustering og sammenkoblet sarkofamerstruktur ble observert på de mønstrede områdene (figur 5D). Godt sammenkoblede sarkofamerstrukturer av hjertevev som ligger rett over mikroelektrodene ble også observert (Figur 5E). For å vurdere den bioinspirerte myke roboten oppdaget vi funksjonen ved hjelp av to metoder: Først brukte vi en bifasisk elektrisk puls på den myke roboten selv om karbonstangelektroder for kunstig tuning og kontroll av slagatferden. For det andre koblet vi to kobberledninger til den ytterste enden av Au-elektroden for å generere et elektrisk signal gjennom hele robotkonstruksjonen. Da vi påførte en elektrisk stimulering gjennom den eksterne karbonelektroden eller kobberledningen som er koblet til Au-elektroden, var eksitasjonsterskelspenningen forskjellig ved forskjellige frekvenser (0,5, 1,0 og 2,0 Hz, figur 5F).
Figur 1: Skjematisk diagram og faktiske bilder som viser fabrikasjonsprosessen til den bioinspirerte flerlags myke roboten elektrisk kontrollert av elektrisk signal via integrering av fleksible Au-mikroelektroder. (A) Mønster og krysskobling av PEGDA-hydrogelen ved hjelp av den førstelysmasken. (B) Mikromønstret PEGDA hydrogel med innkapslede Au mikroelektroder på TMSPMA-glasset oppnådd etter trinn (A). (C) Krysskobling av CNT-GelMA mønstret hydrogel ved hjelp av 2nd fotomaske. (D) Seeding av kardiomyocytter på flerlags konstruksjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Design av de bioinspirerte myke robotene. (A) Ekte sjøstjerner bilde og forskjellige visninger av den tredimensjonale (3D) CAD-modellen peker ut komponenter og striper. (B) Maskedesign for CNT-GelMA mønster, PEGDA mønster, og Au mikroelektroder for sjøstjerner form. (C) Optisk mikroskopbilde av mikromønstrede CNT-GelMA- og PEGDA-mønstre for sjøstjerneformen. (D) Ekte manta ray bilde og ulike visninger av 3D CAD-modellen peker ut komponentene. (E) Maskedesign for CNT-GelMA mønster, PEGDA mønster, og Au mikroelektroder for manta stråleform, tilpasset med tillatelse fra Su Ryon et al.10. (F) Optisk mikroskopbilde av mikromønstrede CNT-GelMA- og PEGDA-mønstre for mantastråleformen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utformingen av de fleksible Au-mikroelektrodene. (A) Fotografi av fabrikkerte Au-elektroder med rektangulære former og brede bredder. (B og C) Optiske mikroskopbilder av Au-elektroder som ikke klarte å overføre til PEGDA-hydrogelene. (D) Bølgete Au mikroelektroder før og etter (E og F) overføres på mikromønstret PEGDA hydrogel. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Optimalisering av mikromønstrede PEGDA og CNT–GelMA hydrogeler og bevegelsesanalyse av myke roboter. (A) Optiske bilder av kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmønster med 50, 75 og 150 μm avstand. (B) Optiske bilder og F-actin/DAPI-farging av kardiomyocytter på pegda- og CNT-Gelma hydrogelmønstre med henholdsvis 300 μm og 75 μm avstand. (C) De rullende morfologiene til de bioinspirerte konstruksjonene med og uten mikromønstret PEGDA-hydrogel med 300 μm avstand. (D) Rammer av frittstående bioinspirerte myke robotvideo som er tatt opp mens du bruker den elektriske stimulansen. (E) Collage av fire forskjellige rammer tatt fra videoopptaket den roterende bevegelsen til den myke roboten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Karakterisering av kardiomyocytter på Au mikroelektrode-inkorporert myk robot og kontroll av slående atferd ved elektrisk stimulering. (A) Optisk mikroskopbilde av de kultiverte kardiomyocytter på Au mikroelektroder innkapslet mellom PEGDA og CNT-GelMA hydrogeler. (B) F-actin/DAPI fluorescensbilde som viser de velforlengede og justerte kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmikromønsteret. -E) Confocal fluorescensbilder som viser sarkofamerjustering og sammenkoblede sarkofamerstrukturer på den fabrikkerte myke roboten: (C og D) kultiverte kardiomyocytter på CNT-GelMA hydrogelmikromønster, og (E) nær Au-mikroelektrodene. (F) Nødvendig eksitasjonterskelspenning ved forskjellige frekvenser (0,5, 1,0 og 2,0 Hz) ved bruk av elektrisk stimulering via karbonstangelektrode og innebygde Au-mikroelektroder. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Video 1. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 2. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 3. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne metoden var vi i stand til å fabrikkere en batoid fisk-lignende bioinspirert myk robot med et integrert selvaktiverende hjertevev på et flerlags strukturert stillas som styres av innebygde Au mikroelektroder. På grunn av to distinkte mikromønstrede hydrogellag laget av PEGDA og CNT–GelMA hydrogeler, viste det bioinspirerte stillaset god mekanisk stabilitet og ideell cellejustering og modning. PEGDA mønsterlag, som fungerer som en brusk felles av skjelettarkitekturi en rokk, gir mekanisk støtte for hele robotkroppen. Spesielt opprettholdt det mekanisk stabilitet under hjertevevsammentrekning og avslapning, samtidig som det tillater effektiv juling på grunn av sin evne til å frigjøre membranspenningen etter sammentrekning. Videre tillot den nanometriske tykkelsen på mikroelektrodene (200 nm), samt deres slangemønster, dem å være fleksible nok til ikke å hindre eller påvirke sammentrekningen av hjertevevet (figur 2). For å enkelt overføre mikroelektroder på hydrogeloverflaten uten brudd, ble Au mikroelektroder fabrikkert på glasset uten adhesjonslag, som titan, som vanligvis brukes til å skape sterk vedheft mellom glasset og Au. I mellomtiden ble CNT-GelMA-laget, som gir støtte for kardiomyocyttertilbehør og justering, laget med mønstre vinkelrett på orienteringen av PEGDA hydrogelmønster (figur 3). Etter modning ga kardiomyocytter på det øverste laget selvaktivering for hele stillaset. Gjennom den lokale elektriske stimuleringen av de inkorporerte Au-fleksible mikroelektrodene, kunne vi modulere robotens slående frekvens uten å skade hjertevevet på den. Selv om denne fabrikasjonsmetoden er lett å lære og reprodusere, er det fortsatt noen teknisk utfordrende trinn i fabrikasjonsprosessen som må understrekes.
Det er fem kritiske trinn for fabrikasjon av den myke bioroboten: 1) riktig spredning av CNTs i GelMA hydrogel; 2) vellykket UV krysskobling av PEGDA og CNT-GelMA hydrogels på TMSPMA-belagt glass; 3) overføring av Au mikroelektroder fra støtteglasset til hydrogelmønsteret; 4) riktig løsrivelse av aktuatoren fra støtteglasslysbildet; 5) etablering av god elektrisk kontakt mellom Au mikroelektroder og ledningene som brukes til tilkobling til bølgeform generator.
Sammenlignet med uberørte GelMA substrater, inkorporering av CNTs gir GelMA hydrogel med forbedrede mekaniske egenskaper og avanserte elektrofysiologiske funksjoner som bidrar til høyere spontansynkrone slåhastigheter og en lavere eksitasjonsterskel for hjerteinfarktvev 9. Problemet med CNT cytotoksisitet forhindres ikke bare ved hjelp av overflatefunksjonaliserte CNTs, men også ved å innlemme nanostrukturene i GelMA hydrogelmatrisen opp til en konsentrasjon på 5,0 mg/ml9. Faktisk fører samspillet mellom de hydrofobe segmentene av GelMA-hydrogelen med CNTs sideveggene til innkapsling av CNTs i hydrogelporøsematrisen 14. Dette hindrer dem ikke bare i å danne potensielt giftige aggregater, men det forbedrer også CNTs løselighet i saltvannsløsninger (f.eks. DPBS eller cellekulturmedium).
For å kunne innlemme Au-mikroelektrodene mellom PEGDA og CNT-GelMA hydrogeler, må spesifikk oppmerksomhet settes inn i UV-krysskoblingen av hvert enkelt lag. Spesielt for å overføre Au-mikroelektrodene på PEGDA hydrogellag, er det nødvendig å sikre at hydrogeloppløsningen dekker hele elektrodeområdet for å unngå brudd på elektrodene under peelingtrinnet. Derfor er kvaliteten på TMSPMA-glassbelegget grunnleggende for å garantere en optimal vedheking av PEGDA-hydrogelen på glasssubstratet, og dermed forhindre avløsning under overføringstrinnet til mikroelektrodene.
Et annet kritisk trinn i metoden er løsrivelse av bioaktuatoren fra støtteglasslysbildet. Dette problemet kan enkelt løses når spontan juling av hjertevevet er synkron og sterk nok til å naturlig skrelle den støttende hydrogelen fra glasssklien. Av denne grunn, som rapportert før, er det grunnleggende å optimalisere hydrogelmønstrene for å indusere en bestemt cellejustering gunstig for organiseringen av et funksjonelt og synkront hjertevev.
For å koble mikroelektrodene elektrisk til bølgeformgeneratoren, må elektriske tilkoblinger opprettes på mikroelektrodene. I løpet av dette trinnet er det viktig å fullstendig innkapsle sølvlimet som brukes til å kontakte mikroelektrodene til kobbertråden for å unngå cytotoksiske effekter. Dette oppnås ved å deponere en tynn dråpe PDMS på toppen av den elektriske kontakten.
Denne metoden kunne ikke bare overvinne begrensningene av eksisterende optogenetiske teknikker, for eksempel kompliserte fabrikasjonsprosesser, lange fabrikasjonstider og potensiell toksisitet av optogenetiske verktøy, men også sterkt forbedre ytelsen til cellebaserte aktuatorer som fører til sanntidsstimulering ved hjelp av rimelige og enkle å håndtere teknikker. Selv om utformingen av våre nåværende bioinspirerte aktuatorer ikke kunne generere fremdrift fremover, kan suksessen innen autonome cellebaserte roboter tiltrekke seg stor interesse. Denne metoden kan også potensielt bidra til utvikling av trådløst drevne implanterbare patcher for en hel robotkropp. Denne metoden baner vei for fremtidig trådløs elektrisk stimulering av myke bioroboter, selv om integrering av fleksible RF-kretser direkte i hydrogelbasert stillas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne artikkelen ble finansiert av National Institutes of Health (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), Brigham Research Institute Stepping Strong Innovator Award og AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).
- Park, S. J., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Laschi, C., et al. Soft Robot Arm Inspired by the Octopus. Advanced Robotics. 26 (7), 709-727 (2012).
- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
- Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot. Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).
- Rus, D., Tolley, M. T. Design, fabrication and control of soft robots. Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).
- Shin, S. R., et al. Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators. Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).
- Shin, S. R., et al. Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators. ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).
- Shin, S. R., et al. Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots. Advanced Materials. 30 (10), 1704189 (2018).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
- Jia, Z., et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).
- Shin, S. R. Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation. ACS Nano. , (2013).
