Summary
Un andamio bioinspirado se fabrica mediante una técnica de fotolitografía suave utilizando hidrogeles mecánicamente robustos y conductores eléctricos. Los hidrogeles micropatrónizados proporcionan alineación direccional de células de cardiomiocitos, lo que resulta en una dirección personalizada de accionamiento. Los microelectrodos flexibles también se integran en el andamio para lograr control eléctrico para un tejido cardíaco autoaccionado.
Abstract
Los sistemas robóticos blandos bioinspirados que imitan a los organismos vivos utilizando tejido muscular y biomateriales de ingeniería están revolucionando el paradigma actual de la biorobótica, especialmente en la investigación biomédica. La recreación de dinámicas de accionamiento artificiales realistas es crucial para un sistema soft-robótico. Sin embargo, el control preciso y la afinación del comportamiento de accionamiento todavía representa uno de los principales desafíos de los sistemas robóticos blandos modernos. Este método describe un procedimiento de bajo costo, altamente escalable y fácil de usar para fabricar un robot blando eléctricamente controlable con movimientos realistas que es activado y controlado por la contracción del tejido muscular cardíaco en una picadura micropatrón andamio hidrogel similar a un rayo. El uso de métodos de fotolitografía suave permite integrar con éxito múltiples componentes en el sistema robótico blando, incluidos los andamios micropatrónizados a base de hidrogel con nanotubos de carbono (CNT) de gelatina integrada de metacriloyl (CNT-GelMA), diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA), microelectrodos de oro flexible (Au) y tejido muscular cardíaco. En particular, la alineación de los hidrogeles y el micropatrón están diseñados para imitar la estructura muscular y del cartílago del rayo de picadura. El hidrogel CNT-GelMA conductor eléctrico actúa como un andamio celular que mejora el comportamiento de maduración y contracción de los cardiomiocitos, mientras que el hidrogel PEGDA mecánicamente robusto proporciona un soporte estructural similar al cartílago a todo el robot blando. Para superar la naturaleza dura y frágil de los microelectrodos a base de metal, diseñamos un patrón de serpentina que tiene una alta flexibilidad y puede evitar obstaculizar la dinámica de paliza de los cardiomiocitos. Los microelectrodos Au flexibles incorporados proporcionan estimulación eléctrica a través del robot blando, lo que facilita el control del comportamiento de contracción del tejido cardíaco.
Introduction
Los robots blandos modernos de última generación pueden imitar las estructuras jerárquicas y la dinámica muscular de muchos organismos vivos, como las medusas1,2, rayo de picadura2, pulpo3, bacteria4y espermatozoides5. Imitar la dinámica y arquitectura de los sistemas naturales ofrece un mayor rendimiento en términos de eficiencia energética y estructural6. Esto está intrínsecamente relacionado con la naturaleza blanda del tejido natural (por ejemplo, piel o tejido muscular con un módulo de Young entre 104x 109 Pa) que permite mayores grados de libertad y deformación superior y adaptabilidad en comparación con los actuadores de ingeniería estándar (por ejemplo, un módulo de Young generalmente entre 109x 1012 Pa)6. Los actuadores blandos a base de músculo cardíaco, especialmente, muestran una eficiencia energética superior debido a su auto-accionamiento, así como a su potencial de autoreparación y regeneración en comparación con un sistema robótico basado mecánicamente7. Sin embargo, la fabricación de robots blandos es un reto debido a la necesidad de integrar diferentes componentes con diferentes propiedades físicas, biológicas y mecánicas en un solo sistema. Por ejemplo, los sistemas sintéticos de ingeniería deben integrarse con los sistemas biológicos vivos, no sólo proporcionándoles apoyo estructural, sino también influyendo y modulando su comportamiento de actuación. Además, muchos métodos de microfabricación requieren procesos agresivos/citotóxicos y productos químicos que disminuyen la viabilidad y la función de cualquier componente vivo. Por lo tanto, son necesarios nuevos enfoques para mejorar la funcionalidad de los robots blandos y para controlar y modular su comportamiento.
Para integrar con éxito los componentes vivos con una buena viabilidad, un andamio a base de hidrogel es un excelente material para crear el cuerpo de un robot blando. Las propiedades físicas y mecánicas de un hidrogel se pueden ajustar fácilmente para crear microambientes para componentes vivos como los tejidos musculares8,9. Además, puede adoptar fácilmente diversas técnicas de microfabricación, dando como resultado la creación de estructuras jerárquicas con alta fidelidad1,2,10. Los dispositivos electrónicos flexibles se pueden incorporar al robot blando para controlar su comportamiento con estimulación eléctrica. Por ejemplo, las técnicas optogenéticas para diseñar células electrogénicas (por ejemplo, cardiomiocitos), que muestran una activación electrofisiológica dependiente de la luz, se han utilizado para desarrollar un rayo de picadura robótica suave basado en polidimetilsiloxano (PDMS) guiado por la luz que fue capaz de recrear el movimiento ondulatorio del pez in vitro2. Aunque las técnicas optogenéticas han demostrado una excelente capacidad de control, el trabajo presentado utiliza la estimulación eléctrica, un método de simulación convencional y tradicional. Esto se debe a que la estimulación eléctrica a través de microelectrodos flexibles es fácil y simple en comparación con las técnicas optogenéticas, que requieren procesos de desarrollo extensivos11. El uso de dispositivos electrónicos flexibles puede permitir la estimulación a largo plazo y procesos de fabricación estándar / simples, así como la biocompatibilidad ajustable y las propiedades físicas y mecánicas12,13.
Aquí, presentamos un método innovador para fabricar un robot blando bioinspirado, accionado por la paliza de tejido muscular cardíaco de ingeniería y controlado por la estimulación eléctrica a través de microelectrodos Au flexibles integrados. El robot blando está diseñado para imitar la estructura muscular y del cartílago del rayo de picadura. El rayo de picadura es un organismo con una estructura y movimiento relativamente fácil es fácil de imitar en comparación con otras especies de natación. Los músculos se recrean in vitro mediante la sembración de cardiomiocitos en un micropatrón de hidrogel conductor eléctrico. Como se informó anteriormente, la incorporación de nanopartículas conductoras eléctricas como LA CNT en el hidrogel GelMA no sólo mejora el acoplamiento eléctrico del tejido cardíaco, sino que también induce una excelente arquitectura de tejido in vitro y disposición8,9. Las articulaciones del cartílago se imitan utilizando un patrón de hidrogel PEGDA mecánicamente robusto que actúa como el sustrato mecánicamente robusto de todo el sistema. Los microelectrodos Au flexibles con un patrón de serpentina están incrustados en el patrón PEGDA para estimular localmente y eléctricamente el tejido cardíaco.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de Brigham and Women's Hospital.
1. Síntesis de GelMA
- Disolver 10 g de gelatina en 100 ml de solución salina con fosfato de Dulbecco (DPBS) utilizando un agitador magnético a 50 oC.
- Añadir 8 ml de anhídrido metacrílico lentamente mientras revuelve la solución de prepolímero de gelatina a 50 oC durante 2 h. Diluir la solución de gelatina reaccionada con DPBS precalentado a 50 oC.
- Transfiera la solución diluida a membranas de diálisis (corte de peso molecular de 12-14 kDa) y colóquela en agua desionizada (DI). Realizar diálisis a 40 oC durante aproximadamente 1 semana.
- Filtrar la solución de prepolímero GelMA dializada utilizando un filtro estéril (tamaño de los poros a 0,22 m) y transferir 25 o 30 ml de la solución en tubos de 50 ml y almacenar a -80 oC durante 2 días.
- Seque con gelisto la solución de prepolímero GelMA congelada con un secador de congelación durante 5 días.
2. Preparación de la solución de prepolímero de poli(etilenglicol) (PEGDA)
- Disolver 200 mg (20% de la solución total) de PEGDA (MW a 1.000) con 5 mg (0,5% de la solución total) de 2-hidroxi-4-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa (fotoiniciador, PI) en 1 ml de DPBS.
- Incubar la solución de prepolímero a 80oC durante 5 min.
3. Preparación de la solución de stock disperso CNT recubierta de GelMA
- Disolver 80 mg de GelMA (utilizado como biosurfactante) en 4 ml de DPBS y luego añadir 20 mg de nanotubos de carbono multipared funcionalizados por COOH (MMGNT) en la solución de prepolímero GelMA.
- Sonicar la solución de prepolímero GelMA lapidada por MWCNT durante 1 h (0,66 Hz, 100 vatios).
NOTA: Durante el proceso de sonicación, la solución debe sumergirse en un baño de agua a 15 oC para evitar la evaporación del disolvente debido al aumento de la temperatura.
4. Preparación de 1 mg/ml de CNT que contenga 5% de solución prepolímero GelMA
- Disolver 50 mg de GelMA y 5 mg (0,5% de la solución total) de PI en 0,8 ml de DPBS a 80 oC durante 10 min.
- Añadir 0,2 ml de la solución de stock CNT preparada (paso 3). Vórtice e incubar la solución a 80oC durante 10 min.
5. Preparación de un portaobjetos de vidrio recubierto de 3(trimetoxisilo)propyl (TMSPMA)
- Lavar los portaobjetos de vidrio (espesor de 1 mm, tamaño de 5,08 cm x 7,62 cm) con etanol puro.
- Apilar las diapositivas limpiadas verticalmente en un vaso de precipitados de 250 ml y esparcir 3 ml de TMSPMA encima de ellos utilizando una jeringa. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio para evitar la evaporación de TMSPMA.
- Incubar los toboganes en un horno de 80oC durante 1 día.
- Lave los portaobjetos recubiertos sumergiéndolos en etanol puro y luego seque.
- Almacene los portaobjetos recubiertos de vidrio envueltos en papel de aluminio a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Trate de minimizar tocar las superficies de las guías de vidrio recubiertas con TMSPMA.
6. Fabricación de los microelectrodos Au flexibles
- Diseñe una máscara de sombra utilizando un diseño asistido por ordenador(Archivo complementario 3).
- Fabrica y compra una máscara de sombra.
- Lavar el portaobjetos de vidrio (espesor de 1 mm, tamaño de 3 cm x 4 cm) con acetona y secar con una pistola de aire comprimido.
- Fije la máscara de sombra a los sustratos de vidrio usando cinta adhesiva de doble cara, luego colóquelas en un evaporador de haz E y espere hasta que la presión de la cámara alcance al menos 10-6 Torr.
NOTA: Las dos piezas de cinta se colocaron manualmente en el soporte a una distancia lo suficientemente corta como para alojar el vidrio y lo suficientemente grande como para adaptarse a todo el patrón. Este paso dura alrededor de 45-60 min. - Deposite una capa Au de 200 nm de espesor por evaporador de haz E (por ejemplo, con Denton EE-4, vacío a 10-6 Torr, potencia a 2,6%, velocidad de 2 s/s) y corte los microelectrodos fabricados utilizando una máquina de sierra de corte (tamaño de los electrodos de 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).
7. Fabricación de un andamio de hidrogel multicapa micropatrón integrado en microelectrodoS Au
NOTA: El resultado de este procedimiento es una membrana donde un hidrogel PEGDA micropatrón está en la capa inferior, un hidrogel CNT-GelMA micropatrón está en la parte superior, y los microelectrodos Au están entre las dos capas. Esta configuración garantiza una mejor flexibilidad para el electrodo y limita el riesgo de rotura.
- Diseñe y inventa dos fotomáscaras para crear las capas micropatrónadas PEGDA (1osa fotomáscara) y el hidrogel CNT-GelMA(2nd photomask). Consulte Archivo suplementario 2–3. El diseño se puede hacer mediante el uso de software CAD.
NOTA: Consulte la Figura 2B, E. - Coloque los espaciadores de 50 m fabricados apilando una capa de cinta invisible comercial (Espesor: 50 m) en un vidrio recubierto TMSPMA. Vierta 15 ml de solución de prepolímero PEGDA al 20% en la parte superior del vidrio recubierto TMSPMA y, a continuación, cubra con microelectrodo de oro. Coloque la 1a fotomáscara para el portaobjetos de vidrio (PEGDA micropatrón) enlaparte del microelectrodo de oro y exponga toda la construcción a la luz UV (lámpara de arco corto de vapor de mercurio de 200 W con filtro de 320-390 nm) a 800 mW de intensidad y 8 cm de distancia para 110 s.
NOTA: Consulte la Figura 1A. - Añadir DPBS para rodear el portaobjetos de vidrio y separar el hidrogel PEGDA micropatrón junto con los microelectrodos Au del sustrato de vidrio sin recubrimiento cuidadosamente después de 5-10 min para obtener el portaobjetos de vidrio que tiene el hidrogel PEGDA micropatrónizado con el Au Microelectrodos.
NOTA: Véase la Figura 1B. Debido al recubrimiento TMSPMA, la construcción se transfiere del sustrato de vidrio sin recubrimiento al recubierto con TMSPMA. Se separa cuidadosamente porque los microelectrodos Au pueden romperse fácilmente durante este paso(Figura 3). - Coloque los espaciadores de 100 m hechos apilando dos capas de cinta transparente comercial (espesor de 50 m) en la parte inferior de una placa Petri. Deposite una gota de 20 s l de solución de prepolímero CNT-GelMA entre los espaciadores y luego voltee el portaobjetos de vidrio obtenido en 7.3 y fíjelo en el plato con cinta adhesiva.
- Gire el dispositivo boca abajo y coloque la2a máscara de fotomáscara en la parte superior de la diapositiva de vidrio. Exponer bajo luz UV a 800 mW de intensidad y 8 cm de distancia para 200 s.
NOTA: Consulte la Figura 1C. La alineación de la 2a máscara es importante. - Lavar el andamio obtenido con DPBS y con medio de cultivo celular que incluya 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Dejarlos durante la noche en la incubadora de 37oC antes de sembrar las células.
8. Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de ratas neonatales
- Aislar los corazones de ratas Sprague-Dawley de 2 días de edad siguiendo protocolos aprobados por el Comité de Cuidado animal del Instituto8.
- Coloque las piezas del corazón en la coctelera durante la noche (alrededor de 16 h) en 0.05% trippsina sin EDTA en HBSS en una cámara fría.
- Recoger las piezas del corazón con una pistola de pipeta y minimizar la cantidad de trippsina, a continuación, ponerlos en un tubo de 50 ml con 10 ml de medios cardíacos calientes (10% FBS, 1% P / S, 1% L-glutamina).
- Revuelva lentamente (60 rpm) en un baño de agua de 37 oC durante 7 minutos. Retire el medio cuidadosamente del tubo con una pipeta de 10 ml y deje las piezas del corazón en el tubo.
- Añadir 7 ml de colagenasa al 0,1% tipo 2 en HBSS y remolinos en un baño de agua de 37oC durante 10 min.
- Mezclar con una pipeta de 10 ml 10 veces suavemente para interrumpir las piezas del corazón. Retire el soporte del tubo con una pipeta de 1 ml.
- Añadir 10 ml de colagenasa de 0,1% tipo 2 en HBSS y girar rápidamente (120–180 rpm) en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos, luego comprobar si las piezas del corazón se están disolviendo.
- Mezclar con una pipeta de 10 ml, luego repetir con una pipeta de 1 ml para romper las últimas piezas del corazón.
- Una vez que la solución parezca homogénea, coloque un colador de células de 70 m en un nuevo tubo de 50 ml y pipetee la solución 1 ml a la vez en el colador.
- Centrifugar la solución de células cardíacas a 180 x g durante 5 min a 37 oC.
NOTA: Si todavía hay algunas piezas del corazón o moco que no se disolvió, repita los pasos 8.7–8.9 de nuevo. - Retire cuidadosamente todo el líquido por encima del pellet celular y resuspendió las células en 2 ml de medios cardíacos.
- Agregue 2 ml de medios cardíacos de la pared del tubo con cuidado para resuspender las células y evitar romperlas.
- Agregue las células suspendidas en un matraz T175 con medios cardíacos calientes gota a gota. Coloque el matraz en una incubadora de 37oC durante 1 h para permitir que los fibroblastos cardíacos se adhieran a la parte inferior.
NOTA: En este paso de preparación, los fibroblastos cardíacos se unirán al matraz mientras que los cardiomiocitos permanecerán en el medio de suspensión. - Recoger el medio del matraz que contiene los cardiomiocitos y ponerlo en un tubo de 50 ml.
- Cuente las células y, a continuación, centrífuga a 260 x g durante 5 min a 37 oC.
- Resuspenda y siembre las células en la parte superior del robot blando fabricado en el paso 7. Verter el volumen específico de los medios cardíacos con los cardiomiocitos a una concentración de 1,95 x 106 células/ml gota a gota sobre toda la superficie del dispositivo.
- Incubar las muestras a 37oC y cambiar los medios con medios de cultivo celular de 5 ml con 2% de FBS y 1% de L-glutamina en el primero y el segundo días después de la sembrada. Cambie el medio cada vez que cambie el color de los medios.
9. Tinción celular para el análisis de alineación
- Retire el medio y lávelo con DPBS durante 5 min a RT.
- Fijar las células usando 4% paraformaldehído (PFA) durante 20 min en RT. A continuación, lavar con DPBS durante 5 min a RT.
- Incubar las células con 0.1% tritón en DPBS en RT durante 1 h. Lavar 3x con PBS durante 5 min en RT.
- Incubar las células con 10% de suero de cabra en DPBS a RT durante 1 h.
- Incubar las células con un anticuerpo primario (sarcomeric-actinina y connexina-43) en suero de cabra 10% en DPBS a 4 oC durante 14-16 h.
- Lavar 3x con DPBS durante 5 min a RT. Incubar las células con el anticuerpo secundario en suero de cabra 10% en DPBS a RT durante 1 h.
- Lavar 3x con DPBS durante 5 min en RT, luego células de contramancha con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en agua DI (1:1,000) durante 10 min en RT. Lavar 3x con DPBS durante 5 min en RT.
- Tome imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de escaneo láser invertido.
10. Pruebas de actuadores y evaluación del comportamiento
- Golpe espontáneo de los cardiomiocitos en el robot blando
- Incubar actuadores bioinspirados a 37 oC durante 5 días y refrescar los medios los días 1 y 2 y cuando sea necesario (es decir, cuando los medios se vuelven amarillos). Utilice un microscopio óptico invertido para tomar imágenes diariamente (5x y/o 10x). Grabe los movimientos celulares utilizando un software de captura de vídeo en la ventana en vivo del microscopio durante 30 s a 20 fotogramas por segundo (5x y/o 10x) cuando comience la actividad contráctea (generalmente alrededor del día 3).
- En el día 5, separe las membranas levantando suavemente del borde con un portaobjetos de cubierta.
NOTA: Si las células muestran un fuerte comportamiento de latido, las membranas se separarán por sí mismas debido a la acción mecánica de las contracciones.
- Estimulación de señal eléctrica a granel
- Usando un PDMS espaciado de 3 cm como soporte, coloca dos electrodos de varilla de carbono con alambre de platino (Pt) en una placa Petri de 6 cm llena de medios cardíacos. A continuación, transfiera cuidadosamente el robot blando a la placa Petri.
- Aplique una forma de onda cuadrada con un ancho de pulso de 50 ms, un valor de desplazamiento de CC 0 V y una amplitud de voltaje pico entre 0,5 y 6 V. La frecuencia varía entre 0,5, 1,0 y 2,0 Hz con un ciclo de trabajo entre 2,5%, 5% y 10%, respectivamente. Grabe contracciones de macroescala utilizando una cámara disponible en el uso comercial.
- Estimulación eléctrica con los microelectrodos Au
- Después de la fabricación del andamio de hidrogel multicapa integrado en microelectrodos Au, conecte dos cables de cobre a los electrodos Au a través de un puerto cuadrado externo con pasta de plata.
- Cubra la pasta de plata con una fina capa de PDMS precured a 80 oC durante 5 min. A continuación, coloque las muestras en una placa caliente a 45 oC durante 5 h para recruzar completamente el PDMS.
- Después de la sembración de cardiomiocitos, aplicar un estímulo eléctrico de onda cuadrada en los cables de cobre con el valor de compensación de CC 1 V, amplitud de tensión máxima entre 1,5 y 5 V, y frecuencias de 0,5, 1,0 y 2,0 Hz respectivamente.
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Representative Results
Diagrama de flujo de los pasos para desarrollar el robot blando bioinspirado con microelectrodo Au
El objetivo del diseño de robot suave era construir una membrana capaz de accionar un movimiento de natación con una complejidad mínima. La estructura debe ser capaz de mantener fuertes flexión repetidamente a lo largo del tiempo (alrededor de 1 Hz) y ser capaz de mantener su forma mientras se logra una fuerte paliza. Mediante la fotoretición selectiva del polímero utilizando fotomáscaras, fabricamos un andamio estructurado jerárquicamente compuesto por una capa de hidrogel PEGDA micropatrónizada, una capa flexible de microelectrodos Au y una capa de hidrogel CNT-GelMA micropatrónada. En la Figura 1se muestra un diagrama esquemático e imágenes reales del procedimiento de fabricación del robot blando como se describe en el protocolo. En resumen, hubo tres pasos principales de fabricación para el robot blando bioinspirado con microelectrodos Au incrustados: En primer lugar, un hidrogel PEGDA micropatrón con microelectrodos Au incorporados se obtuvo mediante reticulación UV utilizando la 1a fotomáscara(Figura 1A, B). En segundo lugar, una construcción multicapa compuesta por microelectrodos Au, el CNT-GelMA micropatrón y los hidrogeles PEGDA fue fabricado por el reticulado UV utilizando la 2a fotomáscara(Figura 1C). Finalmente, los cardiomiocitos fueron sembrados en la construcción de tres capas fabricada para proporcionar accionamiento al robot blando(Figura 1D).
Diferentes diseños del robot blando
En cuanto a la forma del robot blando, al principio, diseñamos dos formas bioinspiradas bioimitando los patrones de dos animales acuáticos diferentes. El primer diseño se inspiró en la apariencia de una estrella de mar caraíbica(Figura 2A, B, C),porque la estrella de mar se puede simplificar en un objeto bidimensional (2D), tiene una columna vertebral dura, y tiene una parte flexible que se une para moverse en el agua, minimizando el movimiento requerido. El segundo dispositivo se basó en la forma de un mantarraya(Figura 2D, E, F) que es fácil de reproducir en un dispositivo 2D. El manta ray puede nadar rápidamente usando movimientos únicos. Esbozamos el mantarraya utilizando formas geométricas básicas con una complejidad reducida para ser reticulados durante el paso de fotomáscara. El electrodo, colocado a lo largo de la línea media de la estructura, fue diseñado con un patrón ondulado, lo que permite una mejor difusión de los pulsos eléctricos y la flexibilidad(Figura 2D). Para desarrollar el robot blando bioinspirado, la forma inspirada en los rayos manta fue seleccionada y probada a fondo en este estudio.
El reto de incrustar los microelectrodos Au entre los hidrogeles CNT-GelMA y PEGDA
La encapsulación de microelectrodos Au de 200 nm de espesor en el cuerpo del robot fabricado podría controlar localmente la construcción proporcionando estimulación eléctrica. Aunque la reticulación UV de los patrones de hidrogel CNT-GelMA y PEGDA directamente en la superficie del electrodo dificultó la delaminación de los electrodos, garantizó la incorporación exitosa del electrodo en el robot blando. Sin embargo, después de transferir el electrodo Au en los hidrogeles PEGDA, el electrodo Au con forma rectangular y ancho ancho (>1 mm) se rompió fácilmente durante el proceso de fabricación debido a la hinchazón del hidrogel PEGDA(Figura 3A, B, C). Por lo tanto, necesitábamos asegurarnos de que los microelectrodos se transfirieran con éxito al hidrogel PEGDA e incrustados entre los hidrogeles CNT-GelMA y PEGDA mientras estaban intactos. Por lo tanto, los microelectrodos Au con un patrón de serpentina (espesor de 200 m) fueron diseñados y fabricados con litografía suave. Se tomaron imágenes de microscopio de contraste de fase con diferentes aumentos y etapas con el fin de inspeccionar los signos de fractura en el electrodo después del transporte en los hidrogeles PEGDA micropatrónizados(Figura 3D, E, F).
La optimización del espaciado entre micropatrones de hidrogel
La capa CNT-GelMA sembrada de cardiomiocitos mostró un comportamiento de latido diferente de acuerdo con las distancias del patrón(Figura 4A, B). Esto puede atribuirse a las diferentes formas en que las células se unen a la superficie de la membrana dependiendo de las distancias de las líneas. En el caso de la distancia de 50 m, las celdas estaban demasiado empaquetadas y no tenían la configuración organizada deseada. Las células parcialmente interconectadas y no alineadas en las alas no estaban contribuyendo simultáneamente al movimiento de natación. Por lo tanto, la fuerza generada por el cardiomiocito no fue suficiente para doblar las alas. A una distancia de 150 m, las células estaban muy bien alineadas. Sin embargo, se sentaron principalmente en la ranura y hubo pocas interconexiones entre las células en las capas superiores, lo que resultó en latidos débiles. A una distancia de 75 m, las células se alinearon en la parte inferior e interconectadas en la parte superior, mostrando el latido más fuerte. Además, para evitar la minación completa irreversible del robot blando durante el latido dinámico de los cardiomiocitos, optimizamos el espaciado del patrón de la capa de soporte de hidrogel PEGDA a 300 m(Figura 4C). Por último, después de este proceso de parametrización, decidimos centrarnos más en la membrana en forma de rayo de manta con patrones PEGDA de 300 m de distancia y patrones CNT-GelMA de distancia de 75 m. El tejido cardíaco en los patrones micropatrónizados pegDA- y CNT-GelMA también se mostró mediante imágenes de fase/contraste e imágenes confocales F-actin/DAPI(Figura 4B).
El análisis del movimiento del tejido cardíaco en hidrogeles micropatrones PEGDA- y CNT-GelMA
Para analizar el movimiento del actuador, tomamos videos de la membrana sin los microelectrodos Au mientras aplicamos un campo eléctrico utilizando un electrodo de varilla de carbono. La Figura 4D muestra algunos fotogramas tomados de los registros de contracción. Era claramente visible que el actuador en forma de rayo manta doblaba las alas como se esperaba. La cola equilibró la estructura enderezándose un poco y las alas se cerraban fuertemente en el medio. Algunas de las membranas mostraron un movimiento giratorio durante la contracción debido a los hidrogeles CNT-GelMA y PEGDA micropatrones desalineados(Figura 4E y Video 1). En este caso, el movimiento estaba menos definido en comparación con el anterior, pero la contracción todavía era lo suficientemente fuerte como para permitir la actuación de un movimiento giratorio. El tiempo total para completar un círculo completo fue de alrededor de 45 s.
La caracterización de los cardiomiocitos en el robot blando multicapa y el control del comportamiento de la paliza por estimulación eléctrica
Después de la sembración y maduración de cardiomiocitos en el sistema robótico bioinspirado(Figura 5A),se observó la alineación del tejido cardíaco a lo largo de la dirección de los patrones CNT-GelMA (Figura 5B-E) tanto por F-actina/DAPI como por inmunomanchas sacméricas/connexinas-43/DAPI. Las imágenes de fluorescencia confocal mostraban cardiomiocitos bien alargados y alineados en el patrón de hidrogel CNT-GelMA(Figura 5B, C). Se observó una alineación parcial de sarcomere uniaxial y estructura de sarcomere interconectada en las áreas con patrones(Figura 5D). También se observaron estructuras sarcomeres bien interconectadas de tejidos cardíacos situados directamente encima de los microelectrodos(Figura 5E). Para evaluar el robot blando bioinspirado, detectamos su función utilizando dos métodos: Primero, aplicamos un pulso eléctrico bifásico al robot blando a través de electrodos de varilla de carbono para afinar artificialmente y controlar el comportamiento de latido. En segundo lugar, conectamos dos cables de cobre al extremo más exterior del electrodo Au para generar una señal eléctrica a través de toda la construcción del robot. Cuando aplicamos una estimulación eléctrica a través del electrodo de carbono externo o cable de cobre conectado al electrodo Au, la tensión del umbral de excitación era diferente a diferentes frecuencias (0.5, 1.0, y 2.0 Hz, Figura 5F).
Figura 1: Diagrama esquemático e imágenes reales que representan el proceso de fabricación del robot blando multicapa bioinspirado controlado eléctricamente por señal eléctrica a través de la integración de microelectrodos Au flexibles. (A) Patrón y reticulación del hidrogel PEGDA utilizando la fotomascarilla de 1oso. (B) Hidrogel PEGDA micropatrónizado con los microelectrodos Au encapsulados en el vidrio TMSPMA obtenido después del paso (A). (C) Reticulación del hidrogel estampado CNT-GelMA utilizando la fotomáscara2. (D) La sembración de los cardiomiocitos en la construcción multicapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño de los robots blandos bioinspirados. (A) Imagen real de la estrella de mar y diferentes vistas del modelo CAD tridimensional (3D) señalando los componentes y rayas. (B) Diseño de máscara para patrón CNT-GelMA, patrón PEGDA y microelectrodos Au para la forma de estrella de mar. (C) Imagen del microscopio óptico de los patrones micropatrónizados CNT-GelMA y PEGDA para la forma de la estrella de mar. (D) Imagen de mantarraya real y diferentes vistas del modelo CAD 3D señalando los componentes. (E) Diseño de máscara para patrón CNT-GelMA, patrón PEGDA y microelectrodos Au para la forma de manta ray, adaptados con permiso de Su Ryon et al.10. (F) Imagen del microscopio óptico de los patrones micropatrónizados CNT-GelMA y PEGDA para la forma del manta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diseño de los microelectrodos Au flexibles. (A) Fotografía de electrodos Au fabricados con formas rectangulares y anchos. (B y C) Imágenes de microscopio óptico de electrodos Au que no se transfirió a los hidrogeles PEGDA. (D) Microelectrodos Wavy Au antes y después (E y F) siendo transferidos en el hidrogel PEGDA micropatrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La optimización de los hidrogeles micropatrónizados PEGDA y CNT-GelMA y el análisis de movimiento de robots blandos. (A) Imágenes ópticas de cardiomiocitos en el patrón de hidrogel CNT-GelMA con espaciado de 50, 75 y 150 m. (B) Imágenes ópticas y tinción F-actina/DAPI de cardiomiocitos en los patrones de hidrogel PEGDA y CNT-GelMA con un espaciado de 300 y 75 m, respectivamente. (C) Las morfologías rodantes de las construcciones bioinspiradas con y sin el hidrogel PEGDA micropatrón con 300 m de espaciado. (D) Marcos del vídeo robot suave bioinspirado de pie grabado mientras se aplica el estímulo eléctrico. (E) Collage de cuatro fotogramas diferentes tomados del vídeo grabando el movimiento giratorio del robot blando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterización de cardiomiocitos en el robot blando incorporado en microelectrodoAu Y control del comportamiento de paliza por estimulación eléctrica. (A) Imagen del microscopio óptico de los cardiomiocitos cultivados en los microelectrodos Au encapsulados entre los hidrogeles PEGDA y CNT-GelMA. (B) Imagen de fluorescencia F-actin/DAPI que muestra los cardiomiocitos bien alargados y alineados en el micropatrón de hidrogel CNT-GelMA. (C-E) Imágenes de fluorescencia confocal que muestran la alineación del sarcomere y estructuras de sarcomere interconectadas en el robot blando fabricado:(C y D)cardiomicitos cultivados en el micropatrón de hidrogel CNT-GelMA, y (E) cerca de los microelectrodos Au. (F) Tensión de umbral de excitación requerida a diferentes frecuencias (0,5, 1,0 y 2,0 Hz) al aplicar estimulación eléctrica a través de electrodo de varilla de carbono y microelectrodos Au integrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando este método, pudimos fabricar con éxito un robot blando bioinspirado en forma de pez batoide con un tejido cardíaco auto-accionador integrado en un andamio estructurado multicapa que es controlado por microelectrodos Au incrustados. Debido a dos capas de hidrogel micropatrón distintas hechas de hidrogeles PEGDA y CNT-GelMA, el andamio bioinspirado mostró buena estabilidad mecánica y alineación y maduración celular ideal. La capa de patrón PEGDA, que sirve como una articulación de cartílago de la arquitectura esquelética en un rayo de picadura, proporciona soporte mecánico para todo el cuerpo del robot. Específicamente, mantuvo la estabilidad mecánica durante la contracción y relajación del tejido cardíaco, al tiempo que permite un latido eficiente debido a su capacidad para liberar la tensión de la membrana después de la contracción. Además, el espesor nanométrico de los microelectrodos (200 nm), así como su patrón de serpentina, les permitió ser lo suficientemente flexibles como para no impedir o influir en la contracción del tejido cardíaco(Figura 2). Para transferir fácilmente microelectrodos en la superficie del hidrogel sin rotura, se fabricaron microelectrodos Au en el vidrio sin ninguna capa de adhesión, como el titanio, que se utiliza comúnmente para crear una fuerte adhesión entre el vidrio y Au. Mientras tanto, la capa CNT-GelMA, que proporciona soporte para la unión y alineación de cardiomiocitos, se hizo con patrones perpendiculares a la orientación del patrón de hidrogel PEGDA(Figura 3). Después de la maduración, los cardiomiocitos en la capa superior proporcionaron auto-actuación para todo el andamio. A través de la estimulación eléctrica local de los microelectrodos flexibles Au incorporados, podríamos modular la frecuencia de latido del robot sin dañar el tejido cardíaco en él. Aunque este método de fabricación es fácil de aprender y reproducir, todavía hay algunos pasos técnicamente desafiantes en el proceso de fabricación que necesitan ser enfatizados.
Hay cinco pasos críticos para la fabricación del biorobot blando: 1) la dispersión correcta de los CNT en el hidrogel GelMA; 2) la reticulación UV exitosa de los hidrogeles PEGDA y CNT-GelMA en el vidrio recubierto con TMSPMA; 3) transferencia de los microelectrodos Au del vidrio de soporte al patrón de hidrogel; 4) el desprendimiento correcto del actuador de la corredera de vidrio de soporte; 5) creación de un buen contacto eléctrico entre los microelectrodos Au y los cables utilizados para la conexión al generador de forma de onda.
En comparación con los sustratos prístinos de GelMA, la incorporación de CNTs proporciona al hidrogel GelMA propiedades mecánicas mejoradas y funciones electrofisiológicas avanzadas que contribuyen a mayores tasas espontáneas de latidos sincrónicos y un umbral de excitación más bajo del tejido miocárdico9. El problema de la citotoxicidad CNT se previene no sólo mediante el uso de CNT funcionalizado en superficie, sino también mediante la incorporación de las nanoestructuras en la matriz de hidrogel GelMA hasta una concentración de 5,0 mg/ml9. De hecho, la interacción entre los segmentos hidrofóbicos del hidrogel GelMA con las paredes laterales CNT conducen a la encapsulación de CNT en la matriz porosa de hidrogel14. Esto no sólo les impide formar agregados potencialmente tóxicos, sino que también mejora la solubilidad de los CNT en soluciones salinas (por ejemplo, DPBS o medio de cultivo celular).
Para incorporar con éxito los microelectrodos Au entre los hidrogeles PEGDA y CNT-GelMA, es necesario prestar especial atención a la reticulación UV de cada capa. Específicamente, para transferir los microelectrodos Au en la capa de hidrogel PEGDA, es necesario asegurarse de que la solución de hidrogel cubra toda la zona del electrodo para evitar la rotura de los electrodos durante el paso de pelado. Por lo tanto, la calidad del recubrimiento de vidrio TMSPMA es fundamental para garantizar una adhesión óptima del hidrogel PEGDA sobre el sustrato de vidrio, evitando así su desprendimiento durante el paso de transferencia de los microelectrodos.
Otro paso crítico del método es el desprendimiento del bioactuador de la corredera de vidrio de apoyo. Este problema se puede resolver fácilmente cuando el latido espontáneo de los tejidos cardíacos es síncrono y lo suficientemente fuerte como para pelar naturalmente el hidrogel de soporte de la diapositiva de vidrio. Por esta razón, como se informó anteriormente, es fundamental optimizar los patrones de hidrogel para inducir una alineación celular específica favorable para la organización de un tejido cardíaco funcional y síncrono.
Para conectar eléctricamente los microelectrodos al generador de forma de onda, se deben crear conexiones eléctricas en los microelectrodos. Durante este paso, es importante encapsular completamente el pegamento plateado utilizado para contactar los microelectrodos al alambre de cobre para evitar efectos citotóxicos. Esto se logra con éxito mediante el depósito de una gota delgada de PDMS en la parte superior del contacto eléctrico.
Este método no sólo podría superar las limitaciones de las técnicas optogenéticas existentes, como los complicados procesos de fabricación, los largos tiempos de fabricación y la toxicidad potencial de las herramientas optogenéticas, sino también mejorar fuertemente el rendimiento de las actuadores que conducen a la estimulación en tiempo real utilizando técnicas de bajo costo y fáciles de manejar. Aunque el diseño de nuestros actuadores bioinspirados actuales no podía generar propulsión hacia adelante, su éxito en el campo de los robots autónomos basados en células podría atraer mucho interés. Este método también puede contribuir potencialmente al desarrollo de parches implantables de potencia inalámbrica para todo el cuerpo del robot. Este método allana el camino para la futura estimulación eléctrica inalámbrica de los biorobots blandos a través de la integración de circuitos de RF flexibles directamente en el andamio a base de hidrogel.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este documento fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01AR074234, R21EB026824, R01 AR073822-01), el Premio Innovador Stepping Strong del Instituto de Investigación Brigham y el Premio AHA Innovative Project Award (19IPLOI34660079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL Beaker | PYREX | 1000-250CNEa | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Milipore | M6514 | |
| 37° Water bath | VWR | W6M | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | |
| 80° incubator | VWR | 1370GM | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| Anti-Connexin 43/GJAI antibody | Abcam | ab11370 | Rabbit polyclonal |
| Anti-Sarcomeric α-actinin | Abcam | ab9465 | Mouse monoclonal |
| Benchtop Freeze Dryers | Labconco | 77500-00 K | |
| Biosafety cabinet | Sterilgard | A/B3 | |
| Carbon rod electrodes | SGL Carbon Group | 6971105 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| CO2 incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Collagenase, Type II, Powder | Gibco | 17-101-015 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| COOH Functionalized Carbon Nanotubes | NanoLab | PD30L5-20-COOH | |
| Dicing saw machine | Giorgio Technology | DAD-321 | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11-965-118 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-144 | |
| E-beam evaporator | CHA | 57367 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10-437-028 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B, 300 bloom from porcine skin |
| Glass slide | VWR | 48382-180 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-079 | |
| Inverted optical microscope | Olympus | CK40 | |
| Magnetic hotplate | Corning | PC-420 | |
| methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276695 | Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor |
| Nunc EasYFlask 175cm2 | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| Olicscope | Siglent | SDS1052DL+ | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PDMS SYLGARD 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
| Photomask | Mini micro stencil inc | ||
| Platinum wire | Alfa Aesar | AA43014BU | |
| Polyethylene glycol dimethcrylate | Polysciences Inc. | 15178-100 | |
| Regenerated Cellulose Dialysis Tubing | Fisherbrand | 21-152-14 | |
| Silver Epoxy Adhesive | MG Chemicals | 8330S | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | S2GPU02RE | |
| Ultra sonicator | Qsonica | Q500 | |
| UV Curing System | OmniCure | S2000 | |
| Vortex mixer | Scientific Industry | SI-0246A | |
| Waveform generator | Agilent | 33500B | |
| Wrap Aluminium foil | Reynolds | N/A |
References
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- Alapan, Y., et al. Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery. Science Robotics. 3 (17), 4423 (2018).
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