Summary
For å vise og kvantifisere de interne funksjonene i Candida albicans biofilms, forbereder vi faste intakte prøver som er avklart ved brytningsindeksmatching. Deretter kan optisk snitting mikroskopi brukes til å få tredimensjonale bildedata gjennom full tykkelse av biofilmen.
Abstract
Den mikrobielle soppCandida albicans kan gjennomgå en endring fra commensal kolonisering til virulens som er sterkt korrelert med sin evne til å bytte fra gjær-form vekst til hyphal vekst. Celler som initierer denne prosessen blir tilhenger av overflater så vel som til hverandre, med den resulterende utviklingen av en biofilmkoloni. Dette forekommer vanligvis ikke bare på slimhinnevevoverflater i gjærinfeksjoner, men også på medisinske implantater som katetre. Det er velkjent at biofilmceller er resistente mot antifungale legemidler, og at celler som kaster seg fra biofilmen kan føre til farlige systemiske infeksjoner. Biofilms spenner fra tungt gjennomskinnelig til ugjennomsiktig på grunn av brytningsheterogenitet. Derfor er soppbiofilmer vanskelig å studere ved optisk mikroskopi. For å visualisere interne strukturelle, cellulære og subcellulære funksjoner, avklarer vi faste intakte biofilmer ved trinnvis løsemiddelutveksling til et punkt med optimal brytningsindeksmatching. For C. albicans biofilms oppnås tilstrekkelig avklaring med metylsalicylate (n = 1.537) for å muliggjøre konfokal mikroskopi fra toppunkt til base i 600 μm biofilms med liten dempering. I denne visualiseringsprotokollen skisserer vi fasekontrastrefraktomi, veksten av laboratoriebiofilmer, fiksering, farging, løsemiddelutveksling, oppsettet for konfokal fluorescensmikroskopi og representative resultater.
Introduction
Candida albicans er en mikrobiell sopp som vanligvis er i samsvar med mennesker. Det er av grunnleggende interesse for biologer fordi organismen har flere morfologier. For eksempel, som svar på visse miljømessige signaler eller stressfaktorer, vil gjærdannende spirende celler bytte til filamentousvekst som septerende kjeder av svært langstrakte celler kjent som hyphae. Overgangen er viktig som et eksempel på fenotypisk uttrykk for en overgang mellom et encellulært og flercellet genuttrykksprogram. På samme måte er C. albicaner av biomedisinsk interesse fordi organismen er et velkjent opportunistisk patogen. Det er ansvarlig for slimhinnegjærinfeksjoner som trost (oral candidiasis), genitourinary infeksjoner, og en årsak til farlige invasive eller systemiske infeksjoner hos immunologisk svekkede pasienter.
Denne organismens potensial for virulens er nært knyttet til sine flere morftyper og andre aspekter av sin genetiske allsidighet1,2,3,4. Germ tube forlengelse, den første synlige fasen av overgangen til hyphal vekst, oppstår med tilstrekkelig hurtighet for å aktivere oppslukt C. albicans celler å bryte ut av phagocytes og dermed unnslippe en tidlig fase av cellulær immunrespons av verten5. I tillegg er filamentering innledes og ledsaget av en stor økning i celle-til-celle og celle-til-overflate-overholdelse som skyldes regulert uttrykk for flere klasser av celleveggproteiner kjent som adhesiner6,7,8,9. Under et bredt spekter av forhold resulterer kombinasjonen av etterlevelse og filamentering i et dramatisk skifte fra planktonisk, encellulær vekst til overflateassosiert kolonial vekst som danner en biofilm. C. albicans biofilms kan utvikle seg på vanlige implanterte medisinske enheter som venøse katetre. Disseminerte infeksjoner kan oppstå når slike biofilmer begynner å knoppav gjærdannende celler og kaste dem inn i sirkulerende blod. Flere studier har vist at biofilmceller er mer motstandsdyktige mot antifungale legemidler enn planktoniske celler10,11, som delvis kan skyldes senket metabolisme12. Videre kan den høye generelle overholdelsen av en biofilm gi forankring som trengs for effektiv invasiv vekst av hyphae i vertsvev1.
Optisk avklaring av C. albicans biofilms ved brytningsindeksmatching har hatt stor innvirkning på vår evne til å visualisere strukturen i dette mikrobielle samfunnet og oppdage relasjoner mellom genuttrykk og fenotype. Biofilms dyrket i laboratoriet på testflater under flytende kultur medium i 48 h vises som et hvitt belegg som er tett nok og tykk nok til å være ugjennomsiktig (Figur 1). Derfor er mange interessante fenotypic trekk ved biofilmen skjult for visning. De 24 h vill type biofilms dyrket i YPD, RPMI-1640, eller Spider medium på 37 °C rekkevidde opp til 300 μm tykk, med 48 h biofilms ofte nå 500 μm. Tettheten skyldes lysspredning, som oppstår fra brytningsheterogenitet: soppcelleveggen er mer brytning enn det omkringliggende mediet, og cytoplasma litt mer brytning enn celleveggen. Den resulterende høye optiske tettheten til en innfødt biofilm skjuler alle strukturer mer enn 30 μm dypt når de ses med et konvensjonelt mikroskop eller til og med en konfokal skanner (Figur 2). Imidlertid kan en stor grad av avklaring oppnås ved å infiltrere faste biofilmer med en høy brytningsindeksvæske som omtrent samsvarer med refraktivitet av store cellulære bestanddeler. Etter avklaring kan avbildning ved submikronoppløsning utføres ved konfokal mikroskopi gjennom hele tykkelsen på nesten alle C. albicans biofilm13. I villtypeprøver er det lett å se at biofilmer består av lang sammenfiltret hyphae, klynger av spirende gjærdannede celler eller pseudohyphalceller, tomrom og en viss mengde ekstracellulær matrise. Videre er biofilmer generelt stratifisert, viser romlig variant morfologiske forskjeller i celletype, celletetthet, og tilstedeværelsen av spirende eller forgreningceller. Mange variasjoner i en eller flere av disse funksjonene har blitt observert i biofilmer utviklet av mutant stammer14,15. I tillegg viser reporterstammer i situ romlige forskjeller i genuttrykk16,9,13. Den overraskende graden av avklaring oppnåelig med denne relativt enkle og rimelige tilnærmingen gjør det også mulig å se at mange biofilmer inkluderer apical hyphae og basal invasiv hyphae som strekker seg ut til millimeter avstander.
I denne visualiseringsprotokollen demonstrerer vi fiksering, merking, avklaring og avbildning av en C. albicans biofilm ved hjelp av en enkel celleveggmarkør som en flekk. Opprinnelsen til den nåværende versjonen av protokollen er den forbedrede klarheten vi observerte da formaldehyd-faste biofilmer ble infiltrert med 97% glykol metakrylat (GMA), som deretter ble polymerisert for å bygge inn biofilmen i en hard plast som hadde en moderat høy brytningsindeks (n = 1,49). Vi brukte deretter konvensjonell fasekontrastmikroskopi og en rekke brytningsindeksreferansevæsker for å bedre nøyaktig bestemme punktet for kontrastreversering (maksimal gjennomsiktighet) av biofilmen (Figur 3). For C. albicans biofilms dette skjedde nær n = 1.530, som var overraskende høy gitt at en tett protein struktur som hår keratin er bare litt mer brytning (1,54-1,55). Selv om det er på den øvre enden av det optimale området i figur 3, vi vedtok metylsalicylate (olje av wintergreen, n = 1.537) i dagens protokoll fordi det lenge har vært brukt som et avklarende middel for mikroskopi i embryologi og histologi, har den lav toksisitet og lavt damptrykk, og det ga gode resultater i våre forsøk ved hjelp av moderat-NA olje nedsenking optikk.
Fire poeng bør gjøres her:
(1) Med få unntak er den ideelle situasjonen i mikroskopi at refraktiv indeksen for prøven skal være lik brytningsindeksen for objektivlinsenedsenmmerjonsvæsken17,18,13. For tredimensjonale (3D) bildestudier der dyp fokusering er nødvendig, er dette alltid viktig.
(2) Vårt eksperimentelle resultat for optimal rydding (n = 1.525–1.535) er litt høyere enn standard nedsenkingoljer (n = 1.515, 1.518) og bryter derfor punkt (1), og introduserer dermed en kilde til sfærisk avvik ved bruk av standard oljenedsenkingoptikk. En løsning på dette problemet er bruk av et mål designet for en nedsenking indeks i høyere område. På grunn av en gjenoppblomstring av interesse for å forestille seg klarerte prøver, blir spesialmål med den nødvendige korreksjonen tilgjengelig. Den andre løsningen er å justere indeksen for det klargjørende mediet ned til 1,515 eller 1,518 ved å tilsetning av en liten mengde butanol (n = 1,399) for optimal oljenedsenking ytelse, og godta den litt forringet klarhet.
(3) Mikroskopi av intakte biofilmer (og andre prøver på denne skalaen) krever en betydelig arbeidsavstand for å imøtekomme prøvetykkelsen. Dette er en stor praktisk vurdering. En lang arbeidsavstand begrenser optikken til en moderat numerisk blenderåpning (NA = 0,6–1,25), som begrenser oppløsningen, men begrenser også alvorlighetsgraden av sfærisk avvik.
(4) Den optimale brytningsindeksen for avklaring kan være forskjellig for andre typer faste prøver. Prøver bør testes tilsvarende ved hjelp av fasekontrast og en rekke brytningsindeksreferansevæsker som vist i figur 3.
Protocol
1. Vekst av biofilmkulturer
FORSIKTIG: Candida albicans er et menneskelig patogen. På noen institusjoner krever kulturen i denne organismen BSL-2 containment.
- Strek ut valgt belastning på en gjær ekstrakt-peptone-dextrose (YPD) agar plate og vokse 48 timer ved 30 °C.
- Velg enkeltkolonier fra platen for å inokulere 5 ml YPD-medium i 15 ml kulturrør for overnatting aerob vekst (karusellrotator, 52–55 rpm) ved 30 °C.
- Bestem celletetthet ved hjelp av en 40- til 50-fold fortynning av overnattingskulturen. Beregn fortynningsfaktoren som trengs for å bringe celletettheten til 3 x 106 celle/ml for silikonsubstrata, eller 0,6–1,2 x 106 celler/ml for dekkglassoverflater behandlet med concanavalin-A (ConA) eller hvete-germe agglutinin (WGA) (se Diskusjon).
- For biofilmvekst i en 12 brønnplate (Figur 1), dispenser 2,0 ml sterilt filamenteringsmedium i hver brønn, og varm platen til 37 °C i en fuktet inkubator. En rekke medier vil indusere filamentering, sterkere ved en forhøyet temperatur (37 °C) og med tilsatt serum. Føtal storfe serum (FBS) anbefales. Anbefalte medier er YPD, Spider-Mannitol eller RPMI-1640.
- Med sterile pinsett, legg et forberedt substratum i hver brønn i den oppvarmede platen og løsne bobler. Legg til inokulumet fra overnattingskulturen for å nå celletettheten som anbefales i trinn 1.3 i hver brønn. En brønn uten inokulum fungerer som en visuell blank og kontroll mot forurensning.
- Plasser platen på en 60 rpm orbital mikser i en fuktet 37 °C luftinkubator i 90 min for å gi tid til cellevedhesjon. Etter 90 minutter, fjern mellomstore og utilkoblede celler, vask med sterilt medium eller fosfatbufret saltvann (PBS), og legg inokulert substrata i kulturretter eller en annen multiwell plate som inneholder førvarmet filamenteringsmedium. Med multiwell plater, er det veldig praktisk å bruke en annen plate for vasketrinn og en tredje plate med 2,0 ml førvarmet medium per brønn for å motta vasket inokulert substrata. Steriliser pinsett før hver overføring.
- Returner platen til 37 °C fuktet omgivelsesluftinkubatoren og øk biofilmene opptil 48 timer med 60 rpm orbital blanding for lufting. Det bør være liten planktonisk vekst i hver kultur med mindre den utviklende biofilmen kaster gjærdannede celler. En biofilm dyrket på denne måten er vist i figur 1.
2. Prøvebehandling for bildebehandling
FORSIKTIG: Aldehydfikseringer er flyktige og farlige. Forbered fikseringsfortynninger i en røykhette, ikke i et biosikkerhetsskap. Ikke legg fikseringsmidler i inkubatorer som brukes til levende celler. Arbeid med fortynnede fikseringsmidler i overbygde retter i en røykhette eller et godt ventilert benkeområde. Kast fikseringsmidler og vaskeløsninger etter fastrett som farlig avfall.
- Forbered fersk fikseringsmiddel, 4% formaldehyd eller paraformaldehyd i PBS, eventuelt med opptil 2% glutaraldehyd. Formalin fortynnet til 4% kan brukes til rutinemessig arbeid.
MERK: Glutaraldehyd spesielt vil øke bredbånd autofluorescens og kan demperfluorescensen av uttrykksfulle koder som dTomato. - Fjern kulturmediet fra prøven og skift ut med PBS for å fortynne serumproteiner, eller overfør biofilmen på substratumet til PBS, i flere minutter.
- Overfør prøven til fikseringsmiddel, og sett den tildekkede parabolen på en langsom orbital mikser i 20 min. Forlenge tidsperioden ved behandling av tykkere prøver (se Diskusjon). Tilstrekkelig fikseringsvolum bør legges til hver tallerken for å fordype all biofilmvekst, inkludert noen på de indre sidene av parabolen.
- Fjern fikseringsmiddelet og fyll på parabolen med PBS for å vaske ut gjenværende fikseringsmiddel. Kast fikseringsmiddelet som farlig avfall. Gjenta flere kortsiktige vasker, deretter lengre vasker for å gi tid for gjenværende fikseringsmiddel å diffuse ut av biofilmen eller agarblokken. Vaskeperioden avhenger av tiden som er tillatt for fiksering (se Diskusjon).
- Den nødvendige mengden flekk vil avhenge av biofilmmassen. Fjern all biofilm fra ikke-prøveområder av kulturretten før farging, eller overfør den faste prøven til en ny tallerken i forkant av farging. Ikke la biofilmen tømmes eller tørke. Hold den nedsenket i PBS.
- Tilsett flekken på fatet (se Diskusjon) og sett den overbygde parabolen på en langsom orbital mikser over natten (se Diskusjon). Beskytt mot lys.
- Om morgenen fjerner du fargeløsningen og etterfyller parabolen med PBS for å fortynne den ubundne flekken. Sett oppvasken på langsom orbital mikser for å destain i flere timer.
3. Avklaring Protokoll: Biofilms på Impermeant Substrata
- Avklart biofilms er vanskelig å skjelne visuelt. Merk derfor den ene siden av hvert substratum med en ripe for å angi siden for inokulasjon.
- Bruk merkede lange Pasteur-pipetter for alle påfølgende avfalls- og løsemiddeloverføringer for å unngå krysskontaminering av løsemidlene.
- Ved hjelp av pinsett, overføre den faste biofilmen fra PBS til 5 ml av 50:50 PBS:metanol i et 20 ml glasshetteglass med biofilmen vendt opp. Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 5 min (se Diskusjon).
- Fjern oppløsningsvæsken til en avfallsflaske, vær forsiktig for å unngå kontakt mellom pipette og biofilm, eller biofilm og hetteglass. Fyll forsiktig på med 3 ml pen metanol. Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 3 min.
- Fjern oppløsningsvæsken til en avfallsflaske, og fyll umiddelbart på med 5 ml metanol. Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 5–10 min. Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken, og fyll straks på fyll med 3 ml metanol. Biofilms ser ofte mer ugjennomsiktige ut på dette punktet enn deres første utseende.
- Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken, og fyll hetteglasset umiddelbart med 5 ml 50:50 metanol:metylsalisylat. Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 5–10 min. Biofilmen skal være halvgjennomsiktig i dette blandede løsningsmidlet.
- Fjern løsningsmidlet til en avfallsflaske. Fyll hetteglasset forsiktig med 3 ml pen metylsalicyat (MS). Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 3 min.
- Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken, og fyll straks på med 5 ml pent MS. Bland manuelt med orbital bevegelse med 1 min intervaller i 5–10 min. På dette punktet bør biofilmen være gjennomsiktig. Fjern oppløsningsvæsken til avfallsflasken, og fyll hetteglasset umiddelbart med 3 ml pent MS. Den behandlede biofilmen er stabil i dette løsningsmidlet.
- For biofilmer på agar (se Diskusjon) utvide alle utvekslingsperioder for å tillate vann og løsemiddel diffusjon om agar. De nødvendige tidsperiodene kan estimeres ved hjelp av et laveffekts dissekerende mikroskop med darkfield-belysning for å vise løsningsmidlet som går inn i agaren. Protokollen oppnår god avklaring og ingen store krympingseffekter når 2% agar brukes, men den avklarede agaren vil kondensere hvis presset under håndtering med pinsett. Bruk av slikkepott anbefales.
4. Bildeoppsett for konfokal mikroskopi
- Følgende trinn er for bruk av et omvendt mikroskop. Bruk en løsemiddelsikker tallerken som har en dekselglassbunn for å holde den omvendte prøven på mikroskopstadiet (se Diskusjon).
- Forbered avstandsstykkene for støtte av den inverterte prøven. Bruk små rektangler kuttet fra mikroskoplysbilder (1000 μm tykke), dekkbriller (170 μm) eller 13 mm silikonringer (330 μm, se Materialarket), som kan stables etter behov. Presoak ringene i metylsalicylate i 1 h for å minimere fokus drift på grunn av hevelse.
- For en biofilm på en medisinsk klasse silikon firkant, invertere torget (dvs. slå den biofilm ned) og sette den på en spacer i et basseng av metylsalicylate i parabolen (Figur 2). Sørg for å unngå bobler under prøven.
- Monter fatet godt på mikroskopets stadium og få oljenedsenket kontakt med målet (se Diskusjon).
- Juster mengden MS i fatet slik at menisken holder prøven godt nede på avstandsstykket med overflatespenning. Plasser en dråpe MS på toppen av det inverterte firkantede substratumet for å redusere lysspredningen fra den matte finishen, og dekk parabolen med en glassplate for å begrense fordampning. Vent i flere minutter på at prøven skal slå seg ned på avstandsstykket før bildebehandling.
- Bruk overført lys til å visuelt inspisere synsfeltet og finne gjeldende fokusposisjon i forhold til de apikale og basalområdene i den inverterte biofilmen. Sett kondensatoren som lyser numerisk blenderåpning (INA) til et minimum (lukk kondensatoririsen) for å øke kontrasten, ellers vil den avklarede biofilmen være nesten usynlig. Når du er ferdig, slå av den overførte lyskilden.
- Bytt over til konfokal fluorescens og sett de nedre og øvre grensene for seriefokusbildestakken som trengs for å strekke seg over biofilmen. Oppadgående fokusdrivtrinn, som anbefales, vil først vise løsnede celler som har slått seg ned på dekkglasset og svært lang apikal hyphae som hviler på glasset. I den øvre enden av sekvensen bør grunnleggercellene ses festet til substratumet ved foten av biofilmen. Angi pinhole diameter, pikselavstanden i bildeplanet, og fokustrinnet trinnøkning ved hjelp av de generelle kriteriene som er beskrevet i Diskusjonen.
Representative Results
Biofilmer som det i figur 1 er sterkt gjennomskinnelig til ugjennomsiktig, men er rutinemessig avklart og avbildet ved å bruke protokollen ovenfor. Figur 2 viser den sterke demperingen av fluorescens med fokusdybde i en fast biofilm i PBS, sammenlignet med samme biofilm etter indeksmatching. Som vist i figur 3, ved hjelp av seriell blandbare løsemidler for å øke brytningsindeksen, kan maksimal i klarhet raskt estimeres. Dette er raffinert av konvensjonell fasekontrastmikroskopi for å finne punktet for minimum kontrast (maksimal gjennomsiktighet). Det er tydelig at denne optimale ikke oppnås ved homogen indeksmatching. Dette skyldes at undercellede strukturer varierer noe i brytningsindeksen. I dette tilfellet oppstod kontrastreversering i celleveggen ved en litt lavere løsningsmiddelindeks enn i cytoplasma. For Candida albicans biofilms skjer det optimale nær n = 1.530. Den 48 h vill type og cak1 DX mutant biofilms i figur 4A var 500 μm i tykkelse, men gjær cellene på basen ble avbildet nesten like skarpt som de apikale cellene. Likeledes, som vist i figur 4C,demning av fluorescens var ikke sterkt korrelert med fokusdybde. Figur 5 viser invasiv hyphae i agar, hundrevis av mikrometer under en overflate biofilm. Modne invasive hyphae produserer konsekvent lateral spirende gjærproksimal til septa i hyphalkjeden, noe som gir opphav til subkolonier av gjærlignende celler med jevne mellomrom langs en invasiv hypha.
Figur 1: Biofilmkulturer før avklaring. En 24 timers biofilm vokst fra et isolat av en supplert efg1 / stamme av C. albikaner i en 12 brønnplate på en silikonfirkant i RPMI-1640 flytende medium supplert med 10% FBS. Det sterile tomrommet er i brønn C4. Innfelt viser kuttet tverrsnitt av 96-timers villtype biofilm dyrket i en 6-brønnplate på en 3,75 mm agarbase i samme medium som viser invasiv hyphae. Begge panelene er i samme skala. Skala bar = 2,0 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forbedring av dyp bildebehandling ved indeksmatching. Figuren viser sideview projeksjoner av konfokale bilde stabler fra en 48 h vill type biofilm som ble fikset og farget med ConA-Alexafluor 594. (A) Prøven ble avbildet i PBS ved hjelp av et mål for 63x 1,0 NA direkte vannnedsenking. Dempering var alvorlig med en fokusdybde på 30 μm. (B) Etter avklaring ved protokolltrinn 3.3–3.8, ble den samme biofilmen avbildet i metylsalicylate med minimal dempering ved hjelp av et mål for 40x 0,85 NA-oljenedsenking. Etter bakgrunnssubtraksjon og sidevisning projeksjon av 3D-bildestabler, ble 40x-dataene romlig skalert for å samsvare med 63x-dataene for sammenligning. (C) Skjematisk diagram som viser omvendt montering av den klarerte prøven (fra MS) ved overføring til MS i en svart-anodisert aluminiumsfat med en sementert dekselglassbunn (se Diskusjon). Skalabar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fasekontrastrefraktometer viser kontrastreversering av cellulære funksjoner i området optimal indeksmatching. Faste biofilmer på dekkbriller ble byttet fra PBS til metanol, deretter til xylen (n = 1,496). Disse biofilmene ble deretter byttet ut hver fra xylen til et sett med brytningsindeksreferansevæsker (serie E, Cargille Laboratories, se Materialtabellen) og visuelt undersøkt side om side for å bestemme indeksområdet som gir høyeste gjennomsiktighet. (øvre panel) Fasekontrastbilder: En biofilm ble serielt utvekslet mellom xylen og et smalt sett med referansevæsker i dette området. Etter hver utveksling ble det samme feltet flyttet og sett om et dekkglass ved hjelp av en 40x 0,85 NA Ph2 oljenedsenking fase kontrast mål og Ph2 kondensator. Alle bildene ble tatt opp med samme lampeinnstilling og kameraeksponering for nøyaktig visningsendringer. Med økende indeks, kontrast reversering er først sett på n = 1.530 for celleveggen, etterfulgt av cytoplasma på n = 1.535. Skalabar = 10 μm. (nedre panel) Graf som viser minimum i gjennomsnittlig biofilm lysstyrke på punktet av maksimal gjennomsiktighet. Sterk spredning av lys i biofilmen fører til at gjennomsnittlig lysstyrke overskrider det tomme feltet. Isolerte celler vises mørkere enn det tomme feltet, opp til kontrastreversering i området 1.530–1.535. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dyp avbildning av mutant og vill type C. albicans biofilms. En vill type stamme (DAY185) og en celle syklus relatert protein kinase redusert uttrykk belastning(cak1 DX)14 ble dyrket ved 37 °C for 48 h på silikon substrata i flytende YPD medium. Biofilmene ble fikset, farget med ConA-Alexafluor 594, og avklart ved hjelp av løsningsmiddelutvekslingsprotokollen i metylsalicylate. 3D konfokal mikroskopi viste at begge biofilmene var ~ 500 μm tykk. Bildedata ble konvertert til 32-biters format i ImageJ eller Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ eller http://fiji.sc), deretter behandlet ved hjelp av funksjonen Trekk bakgrunns med en 50-piksel rullende ballradius, tersetter for å sette negative piksler til null, reslicing og bruke maksimal intensitetsprojeksjon for å produsere sidevisninger. (A) Aksial og side-view projeksjoner: Den ville typen biofilm vokste til en tykkelse på 502 μm sett i sidevisning projeksjon av 558-plan confocal bilde stabelen. Skalabar = 100 μm. (venstre paneler) 40-plan aksiale projeksjoner fra apex (øverst) til base (nederst) viser variasjonen i celletyper i forskjellige lag av biofilmen. Dette eksemplet viste karakteristisk vill type struktur: tilhengerceller ved basen gi opphav til hyphae som stiger inn i en tett midtsone av pseudohyphal og gjær-lignende celler. Over midtsonen dukket hyphae opp igjen og ga opphav til klynger av spirende gjær. Den lange hyphae sett i den apikale sonen sannsynligvis utvidet inn i kulturmediet i den levende biofilm, men brettet over på overflaten av biofilm under prøvebehandling. Cak1 DX biofilm vokste til en tykkelse på 500 μm som sett i side-view projeksjon av 556-flyet bilde stabelen. Denne mutanten, som er kjent for å gjennomgå filamentousvekst i fravær av induserende stress14, produserte en dramatisk annen arkitektur. Som sett i både sideview og aksiale projeksjoner (høyre paneler), mange forgreningceller ga opphav til radiale utvekster. (B) Eksempler på forgrening hyphae i cak1 DX biofilm. Skalabar = 10 μm. (C) Fluorescensdempering med dybde i den avklarede villtypen biofilm ble kvantifisert ved å maskere ut bakgrunnspiksler, og deretter beregne det gjennomsnittlige digitale signalet for alle ikke-bakgrunnspiksler i hvert bildeplan. Med unntak av apical hyphae som er sterkt merket av lectin, var det ingen sterk demning trend med fokusdybde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Invasiv hyphae i agar. C. albicans hyphae i en overflate biofilm vil trenge inn i et agarsubstratum til millimeteravstander (se figur 1). Etter avklaring kan invasive strukturer ses nedover gjennom biofilmen, eller oppover fra bunnen av agaren. Sistnevnte krever større arbeidsavstand. Alternativt, etter fiksering, men før farging og løsemiddelutveksling, kan agaren kuttes vertikalt med en skalpell eller barberblad i 1–2 mm plater som deretter kan slås på en side og avbildet direkte i sidevisning etter farging og avklaring. Denne prosedyren anbefales. I denne projeksjonen av et 213 μm kvadratfelt, ble en regnbuefargeskala brukt til å kode aksial posisjon over et 75 μm-område: blå funksjoner er nær og røde funksjoner er dypere inn i planet på siden. Denne visningen viser at lang hyphae knopp av lateralgjær-form celler med semiregelmessige intervaller som gir opphav til subkolonier. Skalabar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Fremskritt i fluorescensmikroskopi i optisk snitting, oppløsning, hastighet, unngåelse eller kompensasjon av avvik, flerkanals oppkjøp og i datakraft, har forårsaket en oppblomstring i avbildning intakte prøver. For faste prøver har både klassiske og nye avklarings- og utvidelsesmetoder hatt stor innvirkning19,20,21,22,23,24. I dette tilfellet brukte vi en rask og enkel løsningsmiddelbasert indeksmatchingstilnærming for å studere strukturen til soppbiofilmer som er sterkt gjennomsiktige for ugjennomsiktige.
De foregående protokollene er testet med en rekke prøver. I vårt laboratorium candida albicans biofilms er oftest dyrket på 14 mm firkanter kuttet fra et ark med medisinsk kvalitet silikon gummi (se Table of Materials). Denne substratum brukes fordi vekst på PDMS (poly-dimethylsiloxane) nedsenket i flytende kultur medium er etablert som en viktig in vitro modell for infeksjoner forbundet med medisinske implantater, spesielt iboende katetre. Stressede celler som starter filamenter holder seg raskt til ikke-polare overflater som PDMS. I praksis, brukte firkanter som har blitt rengjort og resterilisert i en autoklav (tørr syklus) gi de mest konsekvente biofilms for en bestemt belastning. Biofilms dyrkes også ofte på dekkbriller, i dekkeglassbunnskulturretter, i standard bakteriologiske polystyrenretter og på agar. Fordi C. albicans celler ikke holder seg godt til glass, bør dekkbriller behandles med et lectin som vil binde celleveggpolysakkarider. Vi bruker 40 μL av 1 mg/ml ConA eller WGA i sterilt vann på hver dekksklioverflate. Etter tørking behandles dekkbriller med 40 μL av 1% glutaraldehyd i 3 min for å krysskoble proteinet til en uoppløselig film. De vaskes deretter med sterilt destillert vann for å fjerne fikseringsmiddelet og eventuelle løselige lectin og lufttørket. Om nødvendig resteriliseres de behandlede dekkbrillene eller rettene på nytt under en germicidal UV-lampe i 10 min.
Prøvetykkelsen vil påvirke de nødvendige inkubasjonsperiodene i protokollene. Fixativ diffusjon i en 300 μm biofilm krever flere minutter å likevekt. Denne tidsperioden øker som kvadratet av prøvetykkelsen, og bør utvides til en time eller mer for svært tykke biofilmer eller agarblokkprøver som kan være 2–3 mm tykke. Likegyldighetsperioden for farging avhenger også av prøvetykkelsen som beskrevet for festing og utvasking. Men fordi lectins diffuserer saktere enn de lave MW fikseringene, spesielt i en agargel, bør flekker utvides over natten. Det samme bør gjøres for utvasking av overflødig flekk.
Flekker av ulike typer kan innlemmes i protokollene. Vi bruker en celleveggflekk for strukturell avbildning, oftest Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) eller en farget-merket lectin som ConA-Alexafluor 594 eller WGA-Alexafluor 594. Det bør tas hensyn til proteinets valency. ConA tetramer kan forårsake krysskobling av svært fleksibel hyphae i den apikale regionen i en biofilm. Dette er mindre tydelig med WGA dimer. De kanoniske spesifisitetene til disse markørene er Calcofluor for chitin, ConA for mannoserester, og WGA for N-acetyl-D-glukosamin og sialsyrerester.
Fordi løsningsmiddelutvekslingsprotokollen er gradert fra PBS eller vann, selv om metanol til metylsalisylat, må prøvebeholdere være løsemiddelbestandige. Metylsalicylate (MS) vil raskt myke polystyren plasttøy og sakte myke andre plast. Protokollen går opp til bruk av den pene metanol kan utføres i plasttøy, men på det tidspunktet i protokollen vi vanligvis bytte over til standard 20 ml glass scintillation hetteglass med løsemiddel-resistente skrue caps. Hetteglassene er praktiske for biofilmer på silikon firkantet substrata, fordi rutene kan plukkes opp og overføres ved hjelp av fine pinsett. Også et hetteglass kan dreneres og fylles med den flate firkanten hviler på den indre buede overflaten slik at biofilmen ikke kommer i kontakt med glasset. Substratumet skal være biofilm-up når det er nedsenket i det oppreist hetteglasset. Hetteglassene er utmerket for langsiktig prøvelagring.
I avklaringsprotokollen minimerer flere graderte løsemiddelutvekslingstrinn risikoen for prøvedeformasjon på grunn av oppløsningsvæskeblandingseffekter. For hastighet og bekvemmelighet i den grunnleggende protokollen, er det fire trinn: 1) trinn 3.3, PBS til 50:50 PBS:metanol; 2) trinn 3.4 og 3.5, PBS:metanol til ryddig metanol, 3) trinn 3.6, pen metanol til 50:50 metanol:MS; og 4) trinn 3.7 og 3.8, metanol: MS å ryddig MS. Metanol gir overgangsfeil. Men fordi vann og MS er nesten ublandbare, er det viktig at alt vann forskyves av metanol før innføringen av ms. På samme måte, fordi metanol er svært flyktig, er det viktig å fortrenge all metanol av MS ellers, fortsatte den fortsatte fortsatte fortsatte å forskyve all metanol av MS. Ellers fortsetter den fortsatte fortsatte fortsatte å forskyve sms. fordampning av restmetanol vil føre til brytningsindeksvariasjoner i prøven. I løpet av den fire trinns sekvens, gjenta andre og fjerde trinn ved å legge til en annen endring av ryddig løsemiddel, eller til og med en tredje endring, er tilrådelig. For spesielt skjøre prøver kan løsemiddelendringer formuleres i mindre prosenttrinn.
Med agarblokkprøver kan trinn 3,4 og 3,5 (pen metanol) forårsake utseendet av saltkrystaller i agaren på grunn av uoppløseligheten til gjenværende PBS-salter i metanol. Dette kan unngås ved hjelp av destillert vann (DW) i det første blandede løsemiddeltrinnet i stedet for PBS for å fortynne salter under vann:metanolutveksling. Den alternative løsemiddelutvekslingssekvensen for faste biofilmer består deretter av disse trinnene: 1) trinn 3.3, overføre prøven fra PBS til 50:50 DW:metanol (gi ekstra tid til diffusjon gjennom agar); 2) trinn 3.4, overføre prøven fra 50:50 DW:metanol til pen metanol (gjenta 2x med metanol som i trinn 3.5); 3) trinn 3.6, overføre prøven fra metanol til 50:50 metanol:metylsalicylate; og 4) trinn 3.7, overføre prøven fra 50:50 metanol:MS til ryddig MS (gjenta 2x med MS som i trinn 3.8).
Fordi metylsalisylat raskt myker polystyrenplastware, bruker vi en anodisert aluminiumsrett med en dekselglassbunn for å holde den avklarede biofilmen på scenen til et omvendt mikroskop. Dekkglasset holdes på plass ved hjelp av UV-herding optisk sement (Norland Optisk klebemiddel #61, se Materialtabellen). Forutsatt at MS fjernes på slutten av dagen ved å vaske parabolen med isopropanol etterfulgt av såpevann og sskylling, vil det sementerte dekkglasset tjene i mange måneder.
Objektivlinsevalg er kritisk viktig i storskala avbildning av avklarede prøver på grunn av viktigheten av å minimere sfærisk avvik og behovet for tilstrekkelig arbeidsavstand. Vi har erfaring med tre mål i disse studiene. I det inverterte mikroskopoppsettet bruker vi en lang arbeidsavstand, moderat numerisk blenderåpning (NA) objektiv olje nedsenket under dekkglasset med biofilmen nedsenket i metylsalisylat i parabolen over dekkglasset. Det meste av vårt arbeid er gjort med en Zeiss Universal-serien achromatisk mål, type 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, brukt med en negativ 160 mm brennviddeadapter for nominell uendelig konjugat (IC) kompatibilitet. Dette målet ble opprinnelig designet for oljenedsenket visning gjennom 1,5 mm mikroskoplysbilder med 0,35 mm arbeidsavstand25. Når arbeidsavstanden brukes med et standard dekselglass (0,17 mm), er arbeidsavstanden mye større: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1680 μm. Vi bruker også et nytt Zeiss multi-immersion mål, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat med en arbeidsavstand som overstiger 540 μm, med nedsenking korreksjon satt til den høye siden av "olje". Dette målet er svært korrigert og gir et ypperlig bilde. På et oppreist mikroskopstativ har vi brukt et nytt Nikon multi-nedsenkingmål, type MRD71120, 10x 0,5NA CFI Plan-apochromat med en arbeidsavstand som overstiger 5000 μm (5 mm), også med nedsenkingkorreksjonen satt til den høye siden av "olje" (n = 1.518). Selv om dette målet har en lavere NA enn de andre, har det fordelen av å være direkte uforsonlig i metylsalicylate.
For å optimalisere datainnsamling når det gjelder hastighet og oppløsning, bør konfokalmikroskopinnstillinger ideelt sett møte både tverrgående og aksial Nyquist prøvetakingstettheter18. Ved hjelp av konvensjonelle kriterier, sett konfokal pinhole diameter nominelt til 1 luftig enhet. I forstørrede koordinater,
dP (μm) = 1,22 x forstørrelse x (utslippsbølgelengde i μm) / NA
Tverrgående prøvetaking (pikselavstand) bør ikke overskride (1/2) x Abbes oppløsningsgrense. I objekt-plass koordinater,
x, y = (utslippsbølgelengde i nm) / (4 NA)
Aksial prøvetaking (fokusøkning) bør ikke overskride den inverse aksialbåndbredden,
z = (nedsenking indeks) x (utslipp bølgelengde i nm) / (NA2)
Det konfokale optiske systemet utvider båndbredden til mikroskopet og skjerper både tverrgående og aksial oppløsning med minst 1 /√2.
For 40x 0,85 NA-målet som vi bruker oftest, se tabell 1 for resultatene av disse formlene for en 600 nm utslippsbølgelengde (Alexa Fluor 594).
| Formel | x 1/√2 | sett (typisk) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | - | 25 eller 50 μm |
| x, y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| z (Andre) | 1200 nm | 848 nm (andre kan være på samme tid) | 900 nm (andre kan være på) |
Tabell 1: Konfokal pinhole diameter, tverrgående prøvetaking og aksiale prøvetakingsverdier for en 600 nm utslippsbølgelengde.
Ved hjelp av en konfokal skanner med spinningdisk med disse innstillingene og et skannefelt på 1392 x 1040 piksler, kan data fra biofilmprøver anskaffes med rimelig hastighet og oppløsning. Typiske 3D-bildestabler med én farge kjører 0,35–1,55 GB.
Avklaringsmedier i bred bruk spenner over et betydelig brytningsindeksområde. Ved darkfield belysning og visuell inspeksjon fant vi at faste C. albicans biofilms var mest gjennomsiktig over n = 1.5. Dette ble raffinert etter fasekontrastmikroskopi til n = 1.530–1.535. Av en rekke praktiske årsaker bruker vi metylsalisylat (n = 1.537) som det endelige indeksmatchende løsningsmiddelet. Selv om løsemiddelutveksling medfører risiko for prøvedeformasjon eller andre artefakter, har celler i faste, avklarede prøver lignende cellekroppsdimensjoner, hyphadiameter og interseptelle lengdedimensjoner som levende prøver.
Mange variasjoner i løsemiddelutvekslingsprosessen er mulig (f.eks. ved hjelp av et annet overgangsløsningsmiddel eller et annet endelig løsningsmiddel). Metanol ble valgt for sin høye polaritet og rask diffusjon, men etanol ble vist å bedre bevare rødt fluorescerende protein (RFP) quantum yield26 som et overgangsløsningsmiddel. Metylsalicylate ble valgt for sin indeks, moderat polaritet, lavt damptrykk og kompatibilitet med mange flekker, fargestoffer og fluorescerende proteiner. Imidlertid kan et endelig løsningsmiddel med litt lavere indeks, eller en blanding av metylsalisylat og et lavere indeksløsningsmiddel, som butanol, tjene bedre.
Uventet avslører evnen til å se gjennom en biofilm ikke bare sine stratifiserte interne egenskaper, men også hjelpemidler i å se opprinnelsen til utvidede strukturer som lange, uomviklede apical hyphae og invasive basal hyphae på visse substrata. Opportunistisk virulens i C. albicans avhenger av dens genetiske allsidighet (dvs. overgang til hyphalvekst, upregulering av cellesubstratum og cellecelleoverholdelse, generering av osmolyte for cellespirende og forlengelse, og bruk av alternative næringsstoffer). Hyphal forlengelse muliggjør breakout av individuelle C. albicans celler fra fagocytiske immunceller, men er også avgjørende for invasjon. Biofilmvedhesjon og hyphalforvikling ser ut til å gi overflateforankring som trengs for hyphae å effektivt invadere et substratum. Når det substratet er vertsvev, kan økt virulens resultat.
Imaging intakt biofilms muliggjør et stort antall informative eksperimenter ved hjelp av reporter stammer for genuttrykk, modell vev substrata, og inkludering av andre organismer som bakterier som finnes i naturlige biofilms. Selv i det enkleste tilfellet av rent strukturell avbildning med en celleveggflekk, avsløres in situ fenotyper som da kan kvantifiseres og genetisk analyseres.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av NIH tilskudd R01 AI067703, R21 AI100270, og R21 AI135178 til A.P. Mitchell. Forfatterne er takknemlige for Greenfield 'Kip' Sluder for å gi den lange arbeidsdistanseoljenedsenking målet som brukes i dette arbeidet, og til Daniel Shiwarski for konfokal mikroskopi med direkte metylsalicylate nedsenking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
