Clarification et imagerie Candida albicans Biofilms

Summary

Pour visualiser et quantifier les caractéristiques internes des biofilms Candida albicans, nous préparons des spécimens intacts fixes qui sont clarifiés par l’appariement des indices réfractifs. Ensuite, la microscopie de section optique peut être utilisée pour obtenir des données d’image tridimensionnelles bien que toute l’épaisseur du biofilm.

Abstract

Le champignon microbien Candida albicans peut subir un changement de la colonisation proportionnelle à la virulence qui est fortement corrélée avec sa capacité à passer de la croissance de levure-forme à la croissance hyphale. Les cellules initiant ce processus deviennent adhérentes aux surfaces ainsi qu’aux autres, avec le développement résultant d’une colonie de biofilm. Cela se produit généralement non seulement sur les surfaces des tissus muqueux dans les infections à levures, mais aussi sur les implants médicaux tels que les cathéters. Il est bien connu que les cellules biofilm sont résistantes aux médicaments antifongiques, et que les cellules qui se débarrassent du biofilm peuvent conduire à des infections systémiques dangereuses. Les biofilms vont de fortement translucide à opaque en raison de l’hétérogénéité réfractive. Par conséquent, les biofilms fongiques sont difficiles à étudier par microscopie optique. Pour visualiser les caractéristiques structurelles, cellulaires et subcellulaires internes, nous clarifions les biofilms intacts fixes par échange de solvants progressives à un point de correspondance optimale d’index réfractiv. Pour les biofilms C. albicans, des éclaircissements suffisants sont obtenus avec le salicylate méthyle (n - 1.537) pour permettre la microscopie confocienne d’apex à base dans 600 biofilms de m avec peu d’atténuation. Dans ce protocole de visualisation, nous décrivons la réfractomemétrie de contraste de phase, la croissance des biofilms de laboratoire, la fixation, la coloration, l’échange de solvants, la configuration pour la microscopie confocale de fluorescence, et les résultats représentatifs.

Introduction

Candida albicans est un champignon microbien qui est généralement commensal chez l’homme. Il est d’un intérêt fondamental pour les biologistes parce que l’organisme a de multiples morphologies. Par exemple, en réponse à certains indices environnementaux ou facteurs de stress, les cellules en herbe de forme de levure passeront à la croissance filamenteuse en tant que chaînes septating de cellules très allongées connues sous le nom d’hyphae. La transition est importante comme exemple de l’expression phénotypique d’un changement entre un programme unicellulaire et multicellulaire d’expression génique. De même, C. albicans est d’intérêt biomédical parce que l’organisme est un agent pathogène opportuniste bien connu. Il est responsable des infections muqueuses de levure telles que le muguet (candidiasis orale), les infections génito-urinaires, et une cause d’infections invasives ou systémiques dangereuses dans les patients immunologiquement affaiblis.

Le potentiel de virulence de cet organisme est étroitement lié à ses multiples morphotypes et à d’autres aspects de sa polyvalence génétique^1,2,3,4. L’extension du tube germinal, première étape visible de la transition vers la croissance hyphale, se produit avec une rapidité suffisante pour permettre aux cellules englouties de C. albicans de sortir des phagocytes et ainsi échapper à une phase précoce de la réponse immunitaire cellulaire de l’hôte⁵. En outre, la filamentation est précédée et accompagnée d’une forte augmentation de l’adhérence cellulaire à cellule et cellule à la surface qui est due à l’expression réglementée de plusieurs classes de protéines de mur cellulaire connu sous le nom d’adhésins^6,7,8,9. Dans une grande variété de conditions, la combinaison de l’adhérence et de la filamentation entraîne un passage spectaculaire de la croissance planctonique et unicellulaire à la croissance coloniale associée à la surface qui forme un biofilm. Les biofilms C. albicans peuvent se développer sur des dispositifs médicaux implantés communs tels que des cathéters veineux. Les infections disséminées peuvent se traduire par le fait que ces biofilms commencent à se débarrasser des cellules de forme de levure et les jettent dans le sang circulant. Plusieurs études ont montré que les cellules biofilm sont plus résistantes aux médicaments antifongiques que les cellules planctoniques^10,11, qui peuvent être dues en partie à l’abaissement du métabolisme¹². En outre, l’adhésion globale élevée d’un biofilm peut fournir l’ancrage nécessaire pour une croissance invasive efficace de l’hyphe dans le tissu hôte¹.

La clarification optique des biofilms C. albicans par appariement d’index réfractif a eu un impact majeur sur notre capacité à visualiser la structure de cette communauté microbienne et à découvrir des relations entre l’expression génique et le phénotype. Les biofilms cultivés en laboratoire sur des surfaces d’essai sous un milieu de culture liquide de 48 h apparaissent comme un revêtement blanchâtre assez dense et assez épais pour être opaque(figure 1). Par conséquent, de nombreuses caractéristiques phénotypiques intéressantes du biofilm sont cachées de la vue. Les biofilms de type sauvage de 24 h cultivés en YPD, RPMI-1640, ou Spider moyen à 37 oC gamme jusqu’à 300 m d’épaisseur, avec 48 h biofilms atteignant souvent 500 m. L’opacité est due à la diffusion de la lumière, qui résulte de l’hétérogénéité réfractive: la paroi fongique cellulaire est plus réfractive que le milieu environnant, et le cytoplasme légèrement plus réfractive que la paroi cellulaire. La forte densité optique résultante d’un biofilm indigène obscurcit toutes les structures de plus de 30 m de profondeur lorsqu’elle est vue avec un microscope conventionnel ou même un scanner confocal(figure 2). Cependant, un grand degré de clarification peut être réalisé en infiltrant les biofilms fixes avec un liquide d’index réfractif élevé qui correspond approximativement à la réfractivité des principaux constituants cellulaires. Après clarification, l’imagerie à la résolution submicron peut être effectuée par microscopie confocienne à travers toute l’épaisseur de presque n’importe quel biofilm C. albicans ¹³. Dans les spécimens de type sauvage, il est facile de voir que les biofilms se composent de hyphes enchevêtrés longs, des grappes de cellules burées de levure-forme ou des cellules pseudohyphales, des espaces vides, et une certaine quantité de matrice extracellulaire. En outre, les biofilms sont généralement stratifiés, montrant des différences morphologiques spatialement variantes dans le type de cellule, la densité cellulaire, et la présence de cellules en herbe ou de ramification. De nombreuses variations dans une ou plusieurs de ces caractéristiques ont été observées dans les biofilms développés par les souches mutantes^14,15. En outre, les souches de journaliste montrent des différences spatiales in situ dans l’expression des gènes^16,9,13. Le degré surprenant de clarification obtenu avec cette approche relativement simple et peu coûteuse permet également de voir que de nombreux biofilms comprennent l’hyphae apique et les hyphes invasifs basiques s’étendant sur des distances millimétriques.

Dans ce protocole de visualisation, nous démontrons la fixation, l’étiquetage, la clarification et l’imagerie d’un biofilm C. albicans à l’aide d’un simple marqueur de mur cellulaire comme une tache. L’origine de la version actuelle du protocole est l’amélioration de la clarté que nous avons observée lorsque les biofilms fixés au formaldéhyde ont été infiltrés avec 97% de mthacrylate glycol (GMA), qui a ensuite été polymérisé pour intégrer le biofilm dans un plastique dur ayant un indice de réfraction modérément élevé (n - 1,49). Nous avons ensuite utilisé la microscopie conventionnelle de contraste de phase et une série de liquides de référence d’index réfractifs pour déterminer plus précisément le point d’inversion de contraste (transparence maximale) du biofilm(figure 3). Pour les biofilms de C. albicans, cela s’est produit près de 1,530 n, ce qui était étonnamment élevé étant donné qu’une structure dense de protéines comme la kératine capillaire n’est qu’un peu plus réfractive (1,54-1,55). Bien qu’il soit sur l’extrémité supérieure de la gamme optimale de la figure 3, nous avons adopté le salicylate méthyle (huile de wintergreen, n - 1.537) dans le protocole actuel parce qu’il a longtemps été utilisé comme agent de clarification pour la microscopie dans l’embryologie et l’histologie, il a une faible toxicité et une basse pression de vapeur, et il a donné d’excellents résultats dans nos essais utilisant des optiques d’immersion d’huile modérée-NA.

Quatre points devraient être faits ici:

(1) À quelques exceptions près, la situation idéale en microscopie est que l’indice réfractiv du spécimen doit être égal à l’indice réfractiv du fluide d’immersion de la lentille objective^17,18,13. Pour les études d’imagerie tridimensionnelles (3D) où une mise au point profonde est nécessaire, c’est toujours important.

(2) Notre résultat expérimental pour une compensation optimale (n - 1.525-1.535) est légèrement supérieur aux huiles d’immersion standard (n - 1.515, 1.518) et viole donc le point (1), et introduit ainsi une source d’aberration sphérique lors de l’utilisation d’optiques standard d’immersion d’huile. Une solution à ce problème est l’utilisation d’un objectif conçu pour un indice d’immersion dans la gamme supérieure. En raison d’un regain d’intérêt pour l’imagerie des spécimens effacés, les objectifs spécialisés avec la correction nécessaire sont de plus en plus disponibles. L’autre solution consiste à ajuster l’indice du milieu de clarification à 1,515 ou 1,518 par l’ajout d’une petite quantité de butanol (n - 1,399) pour une performance optimale d’immersion d’huile, et d’accepter la clarté légèrement dégradée.

(3) La microscopie des biofilms intacts (et d’autres spécimens de cette échelle) nécessite une distance de travail importante pour tenir compte de l’épaisseur du spécimen. Il s’agit d’une considération pratique majeure. Une longue distance de travail limite l’optique à une ouverture numérique modérée (NA de 0,6 à 1,25), ce qui limite la résolution mais limite également la sévérité de l’aberration sphérique.

(4) L’indice réfractiv optimal pour la clarification peut être différent pour d’autres types de spécimens fixes. Les échantillons doivent être testés en conséquence à l’aide d’un contraste de phase et d’une série de liquides de référence réfractifs, comme le montre la figure 3.

Protocol

1. Croissance des cultures Biofilm

CAUTION: Candida albicans est un agent pathogène humain. Dans certaines institutions, la culture de cet organisme nécessite un confinement BSL-2.

1. Écartez la souche sélectionnée sur une plaque d’agar de levure extrait-peptone-dextrose (YPD) et poussez 48 h à 30 oC.
2. Sélectionnez des colonies uniques de la plaque pour inoculer 5 ml de milieu YPD dans des tubes de culture de 15 ml pour une croissance aérobie de nuit (rotateur de carrousel, 52 à 55 tr/min) à 30 oC.
3. Déterminer la densité cellulaire à l’aide d’une dilution de 40 à 50 fois de la culture du jour au lendemain. Calculer le facteur de dilution nécessaire pour porter la densité cellulaire à 3 x 10⁶ cellules/mL pour le substrat en silicone, ou 0,6 à 1,2 x 10⁶ cellules/mL pour couvrir les surfaces en verre traitées avec concanavalin-A (ConA) ou agglutinine blé-germe (WGA) (voir Discussion).
4. Pour la croissance du biofilm dans une plaque de 12 puits(figure 1), distribuer 2,0 ml de milieu de filamentation stérile dans chaque puits, et réchauffer la plaque à 37 oC dans un incubateur humidifié. Une variété de supports induira la filamentation, plus fortement à une température élevée (37 oC) et avec le sérum ajouté. Le sérum bovin fœtal (FBS) est recommandé. Les supports recommandés sont YPD, Spider-Mannitol, ou RPMI-1640.
5. À l’égard des pinces stériles, placez un substrat préparé dans chaque puits dans la plaque réchauffée et déloger les bulles. Ajouter l’inoculum de la culture de nuit pour atteindre la densité cellulaire recommandée dans l’étape 1.3 dans chaque puits. Un puits sans inoculum sert de blanc visuel et de contrôle contre la contamination.
6. Placer la plaque sur un mélangeur orbital de 60 tr/min dans un incubateur d’air humidifié de 37 oC pendant 90 min afin de laisser le temps à l’adhérence cellulaire. Après 90 min, retirer les cellules moyennes et non attachées, laver avec du milieu stérile ou du phosphate tamponné saline (PBS), et placer le substrat inoculé dans des plats de culture ou une autre plaque multiwell contenant le milieu de filamentation pré-édaillé. Avec des plaques multiwell, il est très pratique d’utiliser une deuxième plaque pour l’étape de lavage et une troisième plaque avec 2,0 ml de milieu prédémé par puits pour recevoir le substrat inoculé lavé. Stérilisez les pinces avant chaque transfert.
7. Remettre la plaque à l’incubateur d’air ambiant humidifié à 37 oC et faire pousser les biofilms jusqu’à 48 h avec un mélange orbital de 60 tr/min pour l’aération. Il devrait y avoir peu de croissance planctonique dans chaque culture à moins que le biofilm en développement est la perte de cellules de levure-forme. Un biofilm cultivé de cette façon est montré dans la figure 1.

2. Traitement des spécimens pour l’imagerie

CAUTION: Les fixatifs d’aldéhyde sont volatils et dangereux. Préparer des dilutions fixatives dans une hotte à fumée, et non dans une armoire de biosécurité. Ne mettez pas de fixatifs dans les incubateurs utilisés pour les cellules vivantes. Travailler avec des fixatifs dilués dans des plats couverts dans une hotte à fumée ou une zone de banc bien ventilée. Éliminez les fixatifs et les solutions de lavage post-fixe comme déchets dangereux.

1. Préparer le fixatif frais, 4% de formaldéhyde ou paraformaldéhyde dans PBS, en option avec jusqu’à 2% de glutaraldéhyde. Formaline dilué à 4% peut être utilisé pour le travail de routine.
   REMARQUE: Le glutaraldéhyde en particulier augmentera l’autofluorescence à large bande et peut atténuer la fluorescence des étiquettes expressibles telles que dTomato.
2. Retirez le milieu de culture du spécimen et remplacez-le par PBS pour diluer les protéines sériques, ou transférer le biofilm sur son substrat à PBS, pendant plusieurs minutes.
3. Transférer le spécimen dans le fixatif, et mettre le plat couvert sur un mélangeur orbital lent pendant 20 min. Prolonger la période de temps lors du traitement des spécimens plus épais (voir Discussion). Un volume fixe suffisant doit être ajouté à chaque plat pour immerger toute la croissance du biofilm, y compris tout sur les côtés intérieurs du plat.
4. Retirer le fixatif et remplir le plat avec PBS pour laver le fixatif résiduel. Éliminez le fixatif comme déchets dangereux. Répétez plusieurs lavages à court terme, puis des lavages plus longs pour laisser le temps au fixatif résiduel de se diffuser hors du biofilm ou du bloc d’agar. La période de lavage dépend du temps autorisé pour la fixation (voir Discussion).
5. La quantité nécessaire de tache dépendra de la masse de biofilm. Retirer tous les biofilms des zones non-spécimen du plat de culture avant la coloration, ou transférer le spécimen fixe dans un nouveau plat avant la coloration. Ne laissez pas le biofilm s’écouler ou sécher.  Gardez-le immergé dans PBS.
6. Ajouter la tache au plat (voir Discussion) et mettre le plat couvert sur un mélangeur orbital lent pendant la nuit (voir Discussion). Protégez-vous de la lumière.
7. Le matin, retirez la solution de coloration et remplissez le plat avec PBS pour diluer la tache non liée. Placez les plats sur un mélangeur orbital lent pour les détainer pendant plusieurs heures.

3. Protocole de clarification : Biofilms sur imperméant Substrata

1. Les biofilms clarifiés sont difficiles à discerner visuellement. Par conséquent, si désiré, marquer un côté de chaque substrat avec une égratignure pour désigner le côté pour l’inoculation.
2. Utilisez les longues pipettes Pasteur étiquetées pour tous les déchets et transferts de solvants suivants pour éviter la contamination croisée des solvants.
3. À l’aide d’une pince à épile, transférez le biofilm fixe de PBS à 50:50 PBS:methanol dans un flacon de verre de 20 ml avec le biofilm face vers le haut. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 5 min (voir Discussion).
4. Retirez le solvant d’une bouteille de déchets, en étant prudent pour éviter tout contact entre la pipette et le biofilm, ou le biofilm et le flacon. Remplissez doucement avec 3 ml de méthanol soigné. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 3 min.
5. Retirer le solvant dans une bouteille de déchets et recharger immédiatement avec 5 ml de méthanol. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 5 à 10 min. Retirer le solvant de la bouteille de déchets et rechargez immédiatement avec 3 ml de méthanol. Les biofilms semblent souvent plus opaques à ce stade que leur apparence initiale.
6. Retirer le solvant de la bouteille de déchets et remplir immédiatement la fiole avec 5 ml de méthanol de 50:50: salicylate méthyle. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 5-10 min. Le biofilm doit être semi-transparent dans ce solvant mixte.
7. Retirer le solvant dans une bouteille de déchets. Remplissez délicatement la fiole avec 3 ml de salicylate méthyle soigné (MS). Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 3 min.
8. Retirer le solvant de la bouteille de déchets et recharger immédiatement avec 5 ml de MS soigné. Mélanger manuellement avec le mouvement orbital à 1 min d’intervalle pendant 5 à 10 minutes. À ce stade, le biofilm doit être transparent. Retirer le solvant de la bouteille de déchets et remplir immédiatement la fiole avec 3 ml de SEP soignée. Le biofilm traité est stable dans ce solvant.
9. Pour les biofilms sur l’agar (voir Discussion) prolonger toutes les périodes d’échange pour permettre la diffusion de l’eau et du solvant à la fois l’agar. Les périodes de temps nécessaires peuvent être estimées à l’aide d’un microscope disséquant de faible puissance avec éclairage de champ noir pour voir l’avance du solvant dans l’agar. Le protocole permet de clarifier et aucun effet de rétrécissement majeur lorsque 2% d’agar est utilisé, mais l’agar clarifié se condensera si pressé lors de la manipulation avec des pincettes. L’utilisation d’une spatule est recommandée.

4. Configuration d’imagerie pour microscopie confocale

1. Les étapes suivantes sont pour l’utilisation d’un microscope inversé. Utilisez un plat à l’épreuve du solvant qui a un fond en verre de couverture pour tenir le spécimen inversé sur la scène du microscope (voir Discussion).
2. Préparer les astronautes à l’appui du spécimen inversé. Utilisez de petits rectangles coupés à partir de lames de microscope (1 000 m d’épaisseur), des verres à couverture (170 m) ou des anneaux de silicone de 13 mm (330 m, voir Tableau des matériaux),qui peuvent être empilés au besoin. Présoak les anneaux dans le salicylate méthyle pendant 1 h pour minimiser la dérive de mise au point due à l’enflure.
3. Pour un biofilm sur un carré de silicone de qualité médicale, inverser la place (c.-à-d., le rendre biofilm vers le bas) et le mettre sur un espaceur dans une piscine de salicylate méthyle dans le plat (figure 2). Assurez-vous d’éviter les bulles sous le spécimen.
4. Montez le plat fermement sur la scène du microscope et faites de l’huile en contact avec l’objectif (voir Discussion).
5. Ajuster la quantité de SP dans le plat de sorte que le ménisque maintient le spécimen fermement vers le bas sur l’espaceur par tension de surface. Placez une gouttelette de SP sur le substrat carré inversé pour réduire la diffusion de la lumière de la finition mate, et recouvrir le plat d’une plaque en verre pour limiter l’évaporation. Attendez que le spécimen s’installe sur les espaceurs avant l’imagerie.
6. Utiliser la lumière transmise pour inspecter visuellement le champ de vision et localiser la position de mise au point actuelle par rapport aux régions apiques et basales du biofilm inversé. Réglez l’ouverture numérique éclairante du condenseur (INA) au minimum (fermer l’iris condensateur) pour augmenter le contraste, sinon le biofilm clarifié sera presque invisible. Une fois terminé, éteignez la source de lumière transmise.
7. Passez à la fluorescence confocale et définissez les limites inférieures et supérieures de la pile d’images en série nécessaire pour couvrir le biofilm. Le pas vers le haut de la mise au point, qui est recommandé, montrera d’abord les cellules délogées qui se sont installées sur le verre de couverture et les hyphes apiques très longs qui reposent sur le verre. À l’extrémité supérieure de la séquence, les cellules fondatrices doivent être vues adhérées au substrat à la base du biofilm. Réglez le diamètre du sténopé, l’espacement de pixel dans le plan d’image, et l’incrément de l’étape de mise au point à l’aide des critères généraux décrits dans la discussion.

Representative Results

Les biofilms comme celui de la figure 1 sont fortement translucides à opaques, mais sont systématiquement clarifiés et photographiés en utilisant le protocole ci-dessus. La figure 2 montre la forte atténuation de la fluorescence avec la profondeur de mise au point dans un biofilm fixe dans PBS, par rapport au même biofilm après l’appariement de l’index. Comme le montre la figure 3, l’utilisation de solvants invendables en série de l’index réfractiv croissant, le maximum de clarté peut être rapidement estimé. Ceci est affiné par la microscopie conventionnelle de contraste de phase pour trouver le point de contraste minimum (transparence maximale). Il est évident que cet optimum n’est pas atteint par l’appariement homogène de l’indice. C’est parce que les structures subcellulaires diffèrent légèrement dans l’index réfractif. Dans ce cas, l’inversion de contraste s’est produite dans la paroi cellulaire à un indice de solvant légèrement inférieur que dans le cytoplasme. Pour les biofilms Candida albicans, l’optimum se produit près de n - 1.530. Les biofilms mutants de type sauvage de 48 h et de cak1 dans la figure 4A avaient une épaisseur de 500 m, mais les cellules de levure à la base ont été illustrées presque aussi fortement que les cellules apicales. De même, comme le montre la figure 4C, l’atténuation de la fluorescence n’était pas fortement corrélée avec la profondeur de mise au point. La figure 5 montre des hyphes invasifs dans l’agar, des centaines de micromètres sous un biofilm de surface. Les hyphes envahissants matures produisent uniformément la levure en herbe latérale proximale au septa dans la chaîne hyphale, donnant lieu à des sous-clonies de cellules de levure-comme à intervalles réguliers le long d’un hypha envahissant.

Figure 1 : Cultures biofilm avant clarification. Un biofilm de 24 h cultivé à partir d’un isolat d’un efg1/souche de C. albicans complété dans une plaque de 12 puits sur un carré de silicone en milieu liquide RPMI-1640 complété par 10% FBS. Le blanc stérile est bien C4.  Inset montre une section transversale coupée de 96 heures de biofilm de type sauvage cultivé dans une plaque de 6 puits sur une base d’agar de 3,75 mm dans le même milieu montrant des hyphes invasifs. Les deux panneaux sont à la même échelle. Barre d’échelle de 2,0 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Amélioration de l’imagerie profonde par correspondance d’index. La figure montre des projections de vues latérales des piles d’images confocales d’un biofilm de type sauvage de 48 h qui a été fixé et taché avec ConA-Alexafluor 594. (A) Le spécimen a été photographié dans PBS à l’aide d’un objectif direct d’immersion anté 63x 1.0 NA. L’atténuation était sévère à une profondeur de mise au point de 30 m. (B) Après clarification par étapes de protocole 3.3-3.8, le même biofilm a été photographié dans le salicylate de méthyle avec une atténuation minimale utilisant un objectif d’immersion d’huile de 40x 0.85 NA. Après la soustraction de fond et la projection de vue latérale des piles d’images 3D, les données 40x ont été réalycées spatialement pour correspondre aux données 63x pour la comparaison. (C) Diagramme schématique montrant le montage inversé du spécimen effacé (de la SP) par transfert à la SP dans un plat en aluminium noir-anodisé avec un fond en verre de couverture cimenté (voir discussion). Barre d’échelle à 50 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : La réfractometry de contraste de phase montre l’inversion contrastée des dispositifs cellulaires dans la gamme de correspondance optimale d’index. Les biofilms fixes sur les verres de couverture ont été échangés de PBS dans le méthanol, puis dans le xylène (n - 1,496). Ces biofilms ont ensuite été échangés chacun du xylène dans un ensemble de liquides de référence d’index réfractifs (série E, Laboratoires Cargille, voir Tableau des matériaux) et examinés visuellement côte à côte pour déterminer la plage d’index donnant la plus grande transparence. (panneau supérieur) Images de contraste de phase : Un biofilm a été échangé en série entre le xylène et un ensemble étroit de liquides de référence dans cette gamme. Après chaque échange, le même champ a été déplacé et vu par un verre de couverture à l’aide d’un objectif de contraste de phase d’immersion d’huile ph2 40x 0.85 NA et condenseur Ph2. Toutes les images ont été enregistrées avec le même réglage de lampe et l’exposition de la caméra pour afficher avec précision les changements. Avec l’indice croissant, l’inversion de contraste est d’abord vu à n 1.530 pour la paroi cellulaire, suivie par le cytoplasme à n ' 1.535. Barre d’échelle à 10 m. (panneau inférieur) Graphique montrant le minimum dans la luminosité moyenne de biofilm au point de transparence maximale. Une forte diffusion de la lumière dans le biofilm fait que la luminosité moyenne dépasse le champ blanc. Les cellules isolées semblent plus foncées que le champ blanc, jusqu’à l’inversion de contraste dans la gamme 1.530-1.535. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Imagerie profonde des biofilms mutants et sauvages de type C. albicans. Une souche de type sauvage (DAY185) et une souche d’expression diminuée de protéine de cycle de cellules(cak1 DX)¹⁴ ont été cultivées à 37 oC pendant 48 h sur le substrat en silicone dans le milieu liquide de YPD. Les biofilms ont été fixés, tachés de ConA-Alexafluor 594, et clarifiés à l’aide du protocole d’échange de solvants en salicylate méthyle. La microscopie confocale 3D a montré que les deux biofilms avaient une épaisseur de 500 m. Les données d’image ont été converties en format 32 bits dans ImageJ ou Fidji (https://imagej.nih.gov/ij/ ou http://fiji.sc), puis traitées à l’aide de la fonction Soustract Background avec un rayon de boule roulant de 50 pixels, le seuil pour définir les pixels négatifs à zéro, le reslicage et l’utilisation de la projection d’intensité maximale pour produire des vues latérales. (A) Projections axial et de vue latérale : Le biofilm de type sauvage s’est développé à une épaisseur de 502 m comme on le voit dans la projection de vue latérale de la pile d’images confocales de 558 avions. Barre d’échelle à 100 m. (panneaux gauches) les projections axial de 40 plan de l’apex (en haut) à la base (en bas) montrent la variation des types de cellules dans différentes strates du biofilm. Cet exemple a montré la structure de type sauvage caractéristique : les cellules adhérentes à la base donnent lieu à des hyphes qui montent dans une zone centrale dense de cellules pseudohyphales et de levure-comme. Au-dessus de la zone médiane, les hyphes ont réapparu et donné lieu à des grappes de levure en herbe. Le long hyphe vu dans la zone apicale s’est probablement étendu dans le milieu de culture dans le biofilm vivant, mais s’est replié sur la surface du biofilm pendant le traitement des spécimens. Le biofilm Cak1 DX a atteint une épaisseur de 500 m, comme on peut le voir dans la projection latérale de la pile d’images de 556 avions. Ce mutant, connu pour subir une croissance filamenteuse en l’absence de stress induisant¹⁴, a produit une architecture radicalement différente. Comme on le voit dans les projections latérales et axial (panneaux de droite), de nombreuses cellules de ramification ont donné lieu à des excroissances radiales. (B) Exemples de branchement hyphes dans le biofilm Cak1 DX. Barre d’échelle à 10 m. (C) L’atténuation de fluorescence avec profondeur dans le biofilm de type sauvage clarifié a été quantifiée en masquant les pixels de fond, puis en calculant le signal numérique moyen pour tous les pixels non-arrière-arrière dans chaque plan d’image. À l’exception de l’hyphae apique qui sont brillamment étiquetés par la lectine, il n’y avait pas de tendance forte atténuation avec la profondeur de mise au point. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : L’hyphae invasive dans l’agar. C. albicans hyphae dans un biofilm de surface pénétrera un substrat d’agar à des distances millimétriques (voir la figure 1). Après clarification, les structures invasives peuvent être vues vers le bas par le biofilm, ou vers le haut du côté inférieur de l’agar. Ce dernier exige une plus grande distance de travail. Alternativement, après fixation, mais avant la coloration et l’échange de solvants, l’agar peut être coupé verticalement avec un scalpel ou une lame de rasoir en dalles de 1 à 2 mm qui peuvent ensuite être tournés sur un côté et photographiés directement en vue latérale après coloration et clarification. Cette procédure est recommandée. Dans cette projection d’un champ de vision carré de 213 m, une échelle de couleur arc-en-ciel a été utilisée pour coder la position axiale sur une plage de 75 m : les caractéristiques bleues sont proches et les caractéristiques rouges sont plus profondes dans le plan de la page. Cette vue montre que les longs bourgeons d’hyphes au large des cellules latérales de levure-forme à des intervalles semi-réguliers qui donnent lieu à des sous-clonies. Barre d’échelle à 50 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Les progrès de la microscopie de fluorescence dans la section optique, la résolution, la vitesse, l’évitement ou la compensation de l’aberration, l’acquisition de multicanaux et dans la puissance de calcul ont provoqué une résurgence des spécimens intacts d’imagerie. Pour les spécimens fixes, les méthodes classiques et nouvelles de clarification et d’expansion ont eu un impact majeur^{19,20,21,22,23,24}. Dans ce cas, nous avons appliqué une approche rapide et simple de jumelage d’index basée sur le solvant pour étudier la structure des biofilms fongiques qui sont fortement translucides à opaques.

Les protocoles précédents ont été testés avec une gamme de spécimens. Dans notre laboratoire Candida albicans biofilms sont le plus souvent cultivés sur des carrés de 14 mm coupés à partir d’une feuille de caoutchouc en silicone de qualité médicale (voir Tableau des matériaux). Ce substrat est utilisé parce que la croissance sur PDMS (poly-dimylsiloxane) immergé dans le milieu de la culture liquide a été établie comme un modèle in vitro important pour les infections associées aux implants médicaux, en particulier les cathéters d’englomement. Les cellules stressées qui initie la filamentation adhèrent rapidement aux surfaces nonpolaires telles que le PDMS. Dans la pratique, les carrés usagés qui ont été nettoyés et restilés dans un autoclave (cycle sec) donnent les biofilms les plus cohérents pour une souche particulière. Les biofilms sont également couramment cultivés sur des verres de couverture, dans des plats de culture de fond de verre de couverture, dans des plats bactériologiques standard de polystyrène de catégorie, et sur l’agar. Étant donné que les cellules C. albicans n’adhèrent pas bien au verre, les verres de couverture doivent être traités avec une lectine qui liera les polysaccharides de mur cellulaire. Nous appliquons 40 L de ConA ou WGA de 1 mg/mL ou de WGA dans de l’eau stérile sur chaque surface de coverlip. Après le séchage, les verres de couverture sont traités avec 40 L de glutaraldéhyde de 1% pendant 3 min pour traverser la protéine dans un film insoluble. Ils sont ensuite lavés avec de l’eau distillée stérile pour enlever la lectine fixative et soluble et séché à l’air. Si nécessaire, les verres ou plats traités sont restés dans une lampe UV germicide pendant 10 min.

L’épaisseur du spécimen affectera les périodes d’incubation requises dans les protocoles. La diffusion fixative dans un biofilm de 300 m nécessite plusieurs minutes pour équilibrer. Cette période augmente au fur et à mesure que le carré de l’épaisseur du spécimen est prolongée jusqu’à une heure ou plus pour des biofilms très épais ou des spécimens de blocs d’agar qui peuvent être d’une épaisseur de 2 à 3 mm. La période d’équilibre pour la coloration dépend également de l’épaisseur du spécimen tel que décrit pour la fixation et le lavage. Cependant, parce que les lectines diffusent plus lentement que les fixatifs à faible MW, en particulier dans un gel d’agar, la coloration devrait être prolongée pendant la nuit. La même chose devrait être faite pour le lavage de l’excès de tache.

Les taches de différents types peuvent être incorporées dans les protocoles. Nous utilisons une tache de mur cellulaire pour l’imagerie structurelle, le plus souvent Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) ou une lectine étiquetée teinture comme ConA-Alexafluor 594 ou WGA-Alexafluor 594. Une attention particulière doit être accordée à la vaillance de la protéine. Le tétramer ConA peut causer des liens croisés d’hyphes très flexibles dans la région apicale d’un biofilm. C’est moins évident avec le dimer WGA. Les spécificités canoniques de ces marqueurs sont Calcofluor pour la chitine, ConA pour les résidus de mannose, et WGA pour N-acétyl-D-glucosamine et résidus d’acide sialique.

Étant donné que le protocole d’échange de solvants est classé à partir de PBS ou d’eau bien que le méthanol en salicylate méthyle, les contenants de spécimens doivent être résistants au solvant. Le salicylate méthyle (MS) adoucira rapidement la plastique en polystyrène et adoucira lentement d’autres plastiques. Le protocole s’intensifie à l’utilisation du méthanol soigné peut être effectué dans la plastique, mais à ce moment-là dans le protocole, nous passons généralement à la norme de 20 mL flacons scintillation en verre avec des bouchons à vis résistants aux solvants. Les flacons sont pratiques pour les biofilms sur substrat carré de silicone, parce que les carrés peuvent être ramassés et transférés à l’aide de pincettes fines. En outre, une fiole peut être drainée et remplie avec le carré plat reposant sur la surface courbe intérieure de sorte que le biofilm ne contacte pas le verre. Le substrat doit être biofilm-up quand il est immergé dans la fiole verticale. Les flacons sont excellents pour le stockage à long terme des spécimens.

Dans le protocole de clarification, des étapes d’échange de solvants plus notées minimisent le risque de déformation des spécimens en raison d’effets de mélange de solvants. Pour plus de vitesse et de commodité dans le protocole de base, il y a quatre étapes : 1) étape 3.3, PBS à 50:50 PBS:methanol; 2) étapes 3.4 et 3.5, PBS:methanol au méthanol soigné, 3) étape 3.6, méthanol soigné à 50:50 méthanol:MS; et 4) les étapes 3.7 et 3.8, méthanol:MS à la SP soignée. Methanol fournit la miscibilité transitoire. Cependant, étant donné que l’eau et la SP sont presque immiscibles, il est essentiel que toute l’eau soit déplacée par le méthanol avant l’introduction de toute SP. De même, parce que le méthanol est très volatil, il est important de déplacer tout le méthanol par LA SP. l’évaporation du méthanol résiduel entraînera des variations d’index réfractives au sein du spécimen. Dans la séquence en quatre étapes, répéter les deuxième et quatrième étapes en ajoutant un autre changement de solvant soigné, ou même un troisième changement, est conseillé. Pour les spécimens particulièrement fragiles, des changements de solvants pourraient être formulés en plus petits pas.

Avec les spécimens de blocs d’agar, les étapes 3.4 et 3.5 (méthanol soigné) peuvent causer l’apparition de cristaux de sel dans l’agar en raison de l’insolubilité des sels résiduels de PBS dans le méthanol. Ceci peut être évité en utilisant de l’eau distillée (DW) dans la première étape mixte de solvant à la place de PBS pour diluer les sels pendant l’échange d’eau : méthanol. La séquence alternative d’échange de solvants pour les biofilms fixes se compose alors de ces étapes : 1) étape 3.3, transférer le spécimen de PBS en 50:50 DW:methanol (laisser plus de temps pour la diffusion par l’agar); 2) étape 3.4, transférer le spécimen de 50:50 DW:methanol dans le méthanol soigné (répéter 2x avec le méthanol comme dans l’étape 3.5); 3) étape 3.6, transférer le spécimen du méthanol à 50:50 méthanol:methyl salicylate; et 4) étape 3.7, transférer le spécimen de 50:50 méthanol:MS à la SEP soignée (répéter 2x avec la SP comme dans l’étape 3.8).

Parce que le salicylate méthyle adoucit rapidement la plastique en polystyrène, nous utilisons un plat anodisé en aluminium avec un fond en verre de couverture pour tenir le biofilm clarifié sur la scène d’un microscope inversé. Le verre de couverture est maintenu en place à l’aide de ciment optique de traitement UV (Norland Optical Adhesive #61, voir Tableau des matériaux). Pourvu que la SP soit enlevée à la fin de la journée en lavant le plat avec de l’isopropanol suivi de l’eau savonneuse et du rinçage, le verre de couverture cimenté servira pendant de nombreux mois.

La sélection objective des lentilles est d’une importance cruciale dans l’imagerie à grande échelle des spécimens clarifiés en raison de l’importance de minimiser l’aberration sphérique et la nécessité d’une distance de travail suffisante. Nous avons de l’expérience avec trois objectifs dans ces études. Dans la configuration inversée du microscope, nous utilisons une longue distance de travail, modérée huile objective d’ouverture numérique (NA) immergée sous le verre de couverture avec le biofilm immergé dans le salicylate de méthyle dans le plat au-dessus du verre de couverture. La plupart de nos travaux ont été effectués avec un objectif achromatique de la série Zeiss Universal, type 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1.5, utilisé avec un adaptateur négatif de longueur focale de 160 mm pour la compatibilité nominale infini-conjuguée (IC). Cet objectif a été conçu à l’origine pour l’huile immergée visualisation à travers des diapositives de microscope de 1,5 mm avec 0,35 mm de distance de travail²⁵. Lorsqu’il est utilisé avec un verre de couverture standard (0,17 mm), la distance de travail est beaucoup plus grande: 1,5 à 0,35-0,17 à 1,68 mm à 1 680 m. Nous utilisons également un nouvel objectif de multi-immersion Zeiss, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat avec une distance de travail supérieure à 540 m, avec la correction d’immersion fixée sur le côté élevé de «l’huile». Cet objectif est très corrigé et produit une superbe image. Sur un stand de microscope droit, nous avons utilisé un nouvel objectif multi-immersion Nikon, type MRD71120, 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat avec une distance de travail supérieure à 5.000 m (5 mm), également avec la correction d’immersion réglée sur le côté élevé de l’huile (n - 1.518). Bien que cet objectif ait un NA inférieur à celui des autres, il a l’avantage d’être directement immersible dans le salicylate méthyle.

Afin d’optimiser l’acquisition de données en termes de rapidité et de résolution, idéalement, les paramètres de microscope confocal devraient répondre à la densité d’échantillonnage transversal et axial Nyquist¹⁸. En utilisant des critères conventionnels, définissez le diamètre du sténopé confocal nominalement à 1 unité aérée. Dans les coordonnées agrandies,

d_P (m) à 1,22 x grossissement x (longueur d’onde d’émission en m) / NA

L’échantillonnage transversal (espacement de pixels) ne doit pas dépasser (1/2) x limite de résolution de l’abbé. Dans les coordonnées de l’espace objet,

X, y (longueur d’onde d’émission en nm) / (4 NA)

L’échantillonnage axial (augmentation de la mise au point) ne doit pas dépasser la bande passante axial inverse,

Z (indice d’immersion) x (longueur d’onde d’émission en nm) / (NA²)

Le système optique confocal élargit la bande passante du microscope et aiguise à la fois la résolution transversale et axiale d’au moins 1/2.

Pour l’objectif 40x 0.85 NA que nous utilisons le plus souvent, voir le tableau 1 pour les résultats de ces formules pour une longueur d’onde d’émission de 600 nm (Alexa Fluor 594).

	Formule	x 1/2	ensemble (typique)
dP (m)	34,5 m	-	25 ou 50 m
x, y	176 nm	125 nm	161 nm
z z	1200 nm	848 nm	900 nm

Tableau 1 : Diamètre du sténopé confocal, échantillonnage transversal et valeurs d’échantillonnage axial pour une longueur d’onde d’émission de 600 nm.

À l’aide d’un scanner confocal à disque tournant avec ces paramètres et d’un champ de balayage de 1 392 x 1 040 pixels, les données provenant de spécimens de biofilms peuvent être acquises avec une vitesse et une résolution raisonnables. Les piles d’images 3D monocolores typiques s’exécutent 0,35 à 1,55 Go.

Les médias de clarification largement utilisés couvrent une gamme d’indices réfractaires significative. Par l’éclairage de darkfield et l’inspection visuelle, nous avons constaté que les biofilms C. albicans fixes étaient les plus transparents au-dessus de n 1,5. Ceci a été affiné par microscopie de contraste de phase à n 1.530-1.535. Pour un certain nombre de raisons pratiques, nous utilisons le salicylate méthyle (n - 1.537) comme solvant final correspondant à l’index. Bien que l’échange de solvants apporte le risque de déformation de spécimen ou d’autres artefacts, les cellules dans les spécimens fixes et clarifiés ont des dimensions semblables de corps cellulaire, diamètre d’hypha, et dimensions de longueur interseptale comme spécimens vivants.

De nombreuses variantes du processus d’échange de solvants sont possibles (p. ex., à l’aide d’un solvant transitoire différent ou d’un solvant final différent). Le méthanol a été choisi pour sa grande polarité et sa diffusion rapide, mais il a été démontré que l’éthanol préservait mieux le rendement quantique des protéines fluorescentes rouges (DP)²⁶ comme solvant transitoire. Le salicylate méthyle a été choisi pour son index, sa polarité modérée, sa faible pression de vapeur et sa compatibilité avec de nombreuses taches, colorants et protéines fluorescentes. Cependant, un solvant final avec un indice légèrement inférieur, ou un mélange de salicylate méthyle et un solvant d’index inférieur, tel que le butanol, peut mieux servir.

De façon inattendue, la capacité de voir à travers un biofilm révèle non seulement ses caractéristiques internes stratifiées, mais aide également à voir l’origine de structures étendues telles que de longues hyphes apiques non emmêlées et hyphes basiques envahissants sur certains substrats. La virulence opportuniste chez C. albicans dépend de sa polyvalence génétique (c.-à-d. le passage à la croissance hyphale, l’amélioration du substrat cellulaire et de l’adhérence cellulaire, la génération d’osmolytes pour le bourgeonnement cellulaire et l’allongement, et l’utilisation de nutriments alternatifs). L’extension hyphale permet l’évasion des cellules individuelles de C. albicans des cellules immunitaires phagocytiques mais est également essentielle pour l’invasion. L’adhérence biofilm et l’enchevêtrement hyphal semblent fournir l’ancrage de surface nécessaire pour que l’hyphae envahisse efficacement un substrat. Lorsque ce substrat est tissu hôte, une virulence accrue peut en résulter.

L’imagerie des biofilms intacts permet un grand nombre d’expériences informatives utilisant des souches de reporter pour l’expression des gènes, le substrat tissulaire modèle, et l’inclusion d’autres organismes tels que les bactéries trouvées dans les biofilms naturels. Même dans le cas le plus simple de l’imagerie purement structurelle avec une tache de mur cellulaire, phénotypes in situ sont révélés qui peuvent alors être quantifiés et génétiquement analysés.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water			DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute			EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37%	Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules	Electron Microscopy Sciences
Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70%			iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W	Cole-Parmer Scientific		for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick	Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/		Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9%			MeOH
Methyl salicylate 99%			MS
Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets	Millipore Corp.	SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61	Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com	NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment)	Cargille Laboratories, https://cargille.com	Series E	Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner	Fisher Scientific Co.	03-341-25H	for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)