Summary
כדי להציג ולכמת את התכונות הפנימיות של קנדידה אלביקנס ביוילאמים, אנו מכינים דגימות שלמות קבוע כי מובהר על ידי השבירה המדד התאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג נתוני תמונה תלת-ממדיים למרות העובי המלא של הנתונים.
Abstract
פטריה חיידקים קנדידה אלביקנס יכול לעבור שינוי מתוך הקולוניזציה המ, התקפה אלימה כי הוא מתואם מאוד עם היכולת שלה לעבור מצמיחה שמרים צורה הצמיחה hyphal. התאים היוזמים תהליך זה הופכים להיות חסיד של משטחים כמו גם זה לזה, עם התפתחות כתוצאה של מושבה של ביוilm. זה מתרחש בדרך כלל לא רק על משטחי רקמות מופאות בזיהומים שמרים, אלא גם על שתלים רפואיים כגון קטטרים. ידוע כי תאי ביו, עמידים בפני תרופות נגד פטריות, ושהתאים שנשפכו מתוך הביוilm יכולים להוביל לזיהומים מערכתית מסוכנים. טווח של ביוילאמים מתוך שקוף למחצה עד אטום בשל השבירה טרוגניות. לפיכך, קשה ללמוד באמצעות ביומיקרופטריה אופטית. כדי להמחיש את התכונות הפנימיות, הסלולר והתת הסלולאריות, אנו מבהירים את המבנה השלם של הממס באמצעות המרת ממיסים מיטביים לנקודת התאמה אופטימלית של השבירה. עבור C. אלביקנס ביודיאמים, הבהרה מספקת מושגת עם מתיל סלימיאוחר (n = 1.537) כדי לאפשר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מן הפיסגה לבסיס ב 600 יקרומטר ביווליאמים עם הנחתה קטנה. בפרוטוקול הדמיה זו אנו מתווה refractometry הניגודיות של הפאזה, התפתחותם של ביוגיאמים מעבדתיים, קיבעון, כתמים, החלפת ממיסים, הכיוונון של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית ותוצאות מייצגות.
Introduction
קנדידה אלביק היא פטרייה מיקרוביאלית שבדרך כלל משמשת כבבני אדם. זה עניין עקרוני לביולוגים כי לאורגניזם יש מורורפולוגיות מרובות. לדוגמה, בתגובה לרמזים סביבתיים מסוימים או לחצים, טופס שמרים לגבש תאים תעבור צמיחה filamentous כמו המחיצה של תאים מאורכים מאוד המכונה hyphae. המעבר חשוב כדוגמה של ביטוי פנוטימית של שינוי מעל בין חד-תאי ומגוון הביטוי גנים ביטויים. כמו כן, ג. אלביקנס הוא בעלי עניין רפואי כי האורגניזם הוא פתוגן ידוע אופורטוניסטי. היא אחראית על זיהומים שמרים רירית כגון (מנומר אוראלי), זיהומים בעלי מין, וגורם לזיהומים פולשנית או מערכתית מסוכן בחולים מוחלשים לוגית.
הפוטנציאל של האורגניזם הזה למען התקפה אלימה קשור באופן הדוק למספר הורגוטיפים שלה ולהיבטים אחרים של הרבגוניות הגנטית שלה1,2,3,4. שפופרת נבט הארכה, השלב הגלוי הראשון של המעבר לצמיחה hyphal, מתרחשת עם מהירות מספקת כדי לאפשר באופן מסיבי C. אלביקנס תאים לפרוץ phagocytes ובכך לברוח שלב מוקדם של התגובה החיסונית הסלולר של המארח5. בנוסף, filamentation לפני ומלווה על ידי עלייה גדולה תא אל התא והדבקות תא לפני השטח כי הוא בשל ביטוי מוסדר של מספר כיתות של הקיר תאים חלבונים המכונה הידכי חטאים6,7,8,9. באמצעות מגוון רחב של תנאים, שילוב הדבקות והfilamentation מביא לשינוי דרמטי מפלאנקוווני, גידול חד-תאי ועד לצמיחה קולוניאלית הקשורה לפני השטח המהווה ביוilm. ג. אלביקנס ביואילאמים עשויים להתפתח על מכשירים רפואיים מושתלים משותפים כגון קטטרים ורידים. זיהומים המופץ יכול לגרום כאשר ביואילאמים כגון להתחיל ניצן את התאים שמרים טופס לשפוך אותם למחזור דם. מחקרים מרובים הראו כי התאים של ביוilm עמידים יותר לתרופות נגד פטריות מאשר תאים פלנקטון10,11, אשר עשוי להיות בשל חלק הוריד את חילוף החומרים12. יתרה מזאת, הדבקות הכוללת של ביוilm עשויה לספק את העיגון הדרוש לצמיחה פולשנית ויעילה של מיקוף לרקמות מארחות1.
הבהרה אופטית של C. אלביקנס ביואילאמים על ידי התאמת המדד התאמה יש השפעה גדולה על היכולת שלנו להמחיש את המבנה של הקהילה החיידקים האלה ולגלות את היחסים בין הביטוי גנים ו פנוטיפים. ביוילאמים הגדלים במעבדה על משטחי מבחן תחת מדיום תרבות נוזלית עבור 48 h מופיעים כציפוי לבנבן מספיק צפוף ועבה מספיק כדי להיות אטום (איור 1). לכן, תכונות פנויואיות מעניינות רבות מוסתרות מהתצוגה. The 24 מסוג פראי ביוילאמים גדל ב YPD, RPMI-1640, או בינוני עכביש ב 37 ° c לטווח של עד 300 יקרומטר עבה, עם 48 ביואילאמים לעתים קרובות להגיע 500 יקרומטר. אטימות היא בשל פיזור אור, אשר עולה מן השבירה טרוגניות: קיר התא פטרייתי הוא השבירה יותר מאשר המדיום המקיף, ואת הציטופלסמה מעט יותר שבירה מאשר קיר התא. הצפיפות האופטית והמתקבלת של המבנה המקורי מסתירה את כל המבנים יותר מ-30 יקרומטר עמוק כאשר הם מוצגים עם מיקרוסקופ קונבנציונאלי או אפילו סורק קונפוקלית וקד (איור 2). עם זאת, מידה גדולה של הבהרה ניתן להשיג על ידי חדירה ביואילאמים קבוע עם השבירה הגבוה מדד נוזל כי בערך שבירה של המרכיבים הסלולריים העיקריים. לאחר הבהרה, ניתן לבצע הדמיה ברזולוציה של תת-מיקרון על ידי המיקרוסקופיה באמצעות מיקרוסקופ באמצעות העובי המלא של כמעט כל C. אלביקנס ביוilm13. בדגימות מסוג פראי, קל לראות כי ביוילאמים מורכבים מhyphae ורכב ארוך, אשכולות של תאים שמרים בצורת מודגש או תאים מדומה, חללים בחלל, וכמות כלשהי של מטריצה המומנת. יתר על כן, ביואילאמים בדרך כלל הם באופן שונה, מציג מרחב הבדלים מורפולוגיים בסוג תא, צפיפות התא, ואת הנוכחות של תאים הנצה או הסתעפות. וריאציות רבות באחת או יותר מהתכונות הללו נצפו ב ביויואמים שפותחו עלידי זניםמוטנטים 14,15. בנוסף, זנים העיתונאי להראות באתרו הבדלים מרחביים ביטוי גנים16,9,13. המידה המפתיע של הבהרה השגה עם גישה זו פשוטה יחסית וזולה גם מאפשר לראות כי ביוגיאמים רבים כוללים לקורבן ומיקוף פולשנית בסיס הארכת למרחקים מילימטר.
בפרוטוקול הדמיה זו, אנו מדגימים את התיקון, התיוג, ההבהרה והדימות של ביויוגים של C. אלביקנס באמצעות סמן תא בקיר פשוט ככתם. מקורו של הגרסה הנוכחית של הפרוטוקול הוא בהירות משופרת שראינו כאשר מפורמלדהיד-ביואילאמים קבוע שחדרו עם 97% גליקול מתיונין (גמה), אשר היה לאחר מכן להטביע את הביוilm בפלסטיק קשה בעל מדד השבירה הגבוה בינוני (n = 1.49). לאחר מכן השתמשנו במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה רגילה ובסדרה של שבירה הפניה לנוזלים באופן מדויק יותר לקבוע את הנקודה של היפוך ניגודיות (שקיפות מרבית) של הביוilm (איור 3). עבור C. אלביקנס ביוילאמים זה קרה קרוב n = 1.530, אשר היה גבוה באופן מפתיע בהתחשב בכך מבנה חלבון צפוף כגון קרטין שיער הוא רק מעט השבירה (1.54 – 1.55). למרות שהוא בקצה העליון של הטווח האופטימלי באיור 3, אימצנו מתיל סלייסק (שמן של וינטרגרין, n = 1.537) בפרוטוקול הנוכחי, משום שהוא כבר משמש כסוכן הבהרה למיקרוסקופיה באמבריולוגיה והיסטולוגיה, יש הרעלה נמוכה ולחץ אדי נמוך, וזה נתן תוצאות מצוינות בניסויים שלנו באמצעות
4 נקודות יש לעשות כאן:
(1) עם כמה יוצאים מן הכלל, המצב האידיאלי במיקרוסקופיה היא כי מדד השבירה של הדגימה צריך להיות שווה את מדד השבירה של העדשה המטרה טבילה נוזלים17,18,13. עבור שלושה מימדים (3D) לימודי הדמיה שבהם התמקדות עמוקה היא הכרחית, זה תמיד חשוב.
(2) התוצאה הניסיונית שלנו לניקוי אופטימלי (n = 1.525 – 1.535) היא מעט גבוהה יותר מאשר שמני טבילה סטנדרטיים (n = 1.515, 1.518) ולכן המפר נקודה (1), ובכך מציג מקור של סטייה כדורית בעת שימוש רגיל שמן טבילה אופטיקה. פתרון אחד לבעיה זו הוא שימוש במטרה המיועדת לאינדקס טבילה בטווח הגבוה יותר. בגלל תחיית העניין בדגימות הדמיה, המטרות הייחודיות עם התיקון הדרוש הופכים לזמינים. הפתרון השני הוא להתאים את האינדקס של הבינוני להבהרת עד 1.515 או 1.518 על-ידי תוספת של כמות קטנה של butanol (n = 1.399) לביצועים מיטביים טבילה בשמן, ולקבל את הבהירות מושפל מעט.
(3) מיקרוסקופ של ביוילאמים שלמים (ודגימות אחרות בקנה מידה זה) דורש מרחק עבודה משמעותי כדי להתאים את עובי הדגימה. זהו שיקול מעשי משמעותי. מרחק עבודה ארוך מגביל את האופטיקה לצמצם מספרי מתון (NA = 0.6 – 1.25), אשר מגביל את הרזולוציה, אך גם מגביל את חומרת סטייה כדורית.
(4) מפתח השבירה האופטימלי להבהרה עשוי להיות שונה מסוגים אחרים של דגימות קבועות. יש לבדוק את הדגימות בהתאם לעומת הפאזה וסדרת השבירה של החומר כמוצג באיור 3.
Protocol
1. צמיחת התרבויות של ביוilm
זהירות: קנדידה אלביקנס היא פתוגן אנושי. במוסדות מסוימים, התרבות של האורגניזם. הזה דורשת בלימה של BSL-2
- פס out מאמץ שנבחר על תמצית שמרים-peptone-דקסטרוז (YPD) לוחית אגר ולגדול 48 h ב 30 ° c.
- בחר מושבות יחיד מהצלחת לאיחסן 5 מ ל של YPD בינוני ב 15 מ ל שפופרות תרבות עבור הצמיחה אירובי לילה (מסובבי קרוסלה, 52 – 55 סל ד) ב 30 ° c.
- קביעת צפיפות התא באמצעות דילול 40-עד 50 של התרבות הלילה. חשב את מקדם הדילול הדרוש כדי להביא את צפיפות התא ל 3 x 106 תא/ml עבור שכבות סיליקון, או 0.6 – 1.2 x 106 תאים/ml לכיסוי משטחי זכוכית שטופלו באמצעות Concanavalin-A (קונה) או החיטה-נבט (WGA) (ראה דיון).
- עבור גידול ביוilm בצלחת 12 היטב (איור 1), מוותר על 2.0 mL של מדיום filamentation סטרילי לתוך כל באר, ולחמם את הצלחת ל 37 ° c באינקובטור מחולל לחות. מגוון של מדיה יגרום filamentation, חזק יותר בטמפרטורה מוגבה (37 ° c) עם סרום נוסף. מומלץ סרום של שור עוברי (FBS). המדיה המומלצת היא YPD, Spider-Mannitol, או RPMI-1640.
- עם פינצטה סטרילית, מניחים שכבת משנה מוכנה לתוך כל באר בצלחת החמם ובועות להוציא. הוסיפו את האירשת מתרבות הלילה כדי להגיע לצפיפות התא המומלצת בשלב 1.3 בכל הבאר. הבאר האחת ללא הצורך משמשת כריק ויזואלי ושליטה מפני זיהום.
- מניחים את הצלחת על 60 סל ד מערבל מסלולית בתוך מחולל לחות 37 מעלות צלזיוס החממה האווירית עבור 90 דקות כדי לאפשר זמן הדבקה תא. לאחר 90 דקות, להסיר את התאים בינונית ובלתי מחוברת, לשטוף עם מלוחים סטרילי או פוספט מאגור באגירה (PBS), ולמקם שכבות משנית לתוך מנות התרבות או לוחית אחרת multiwell המכיל מדיום prewarmed. עם לוחות multiwell יטב, זה מאוד נוח להשתמש בלוח השני עבור הצעד לשטוף את הצלחת השלישית עם 2.0 mL של מדיום prewarmed לכל טוב כדי לקבל את משנה שוטפים מחוסן. חטא מלקחיים לפני כל העברה.
- להחזיר את הצלחת על 37 ° c מחולל לחות באוויר הסביבה ולגדול את הבייואמים עד 48 h עם הערבוב של 60 rpm מסלולית עבור aeration. צריכה להיות צמיחה פלנקטון קטן בכל התרבות, אלא אם כן הביוilm המתפתח הוא שפיכת תאים שמרים. באחד הביוקיים שגדל בדרך זו מוצג באיור 1.
2. מעבד דגימה להדמיה
זהירות: התיקונים אלדהיד הם נדיפים ומסוכנים. הכינו את הדילול הקבוע בתוך. מכסה המנוע, לא בארונית ביולוגית אין להכניס לחממות שימוש בתאים חיים. העובדים עם מגוון של מאכלים מדוללים במאכלים מכוסים בתוך מרפסת או באזור שולחן בספסל מאוורר היטב. היפטר מתיקונים ופתרונות שטיפת שלאחר התיקון כפסולת מסוכנת.
- הכינו fixative טרייה, 4% פורמלדהיד או פאראפורמלדהיד ב-PBS, אופציונלית עם עד 2% גלוטרלדהיד. ניתן להשתמש בפורמאלין מדולל ל -4% לעבודה שגרתית.
הערה: גלוטרלדהיד בפרט יגדיל את הקרינה האוטומטית בפס רחב ועלול להחליש את הזריחה של תגי אקספרזיים כגון dTomato. - הסר את המדיום התרבותי מהדגימה והחלף ב-PBS כדי לדלל את החלבונים בסרום, או העבר את החברה ברובד המשנה שלו ל-PBS, במשך מספר דקות.
- העבר את הדגימה לתוך התיקונים, והגדר את המנה המכוסה על מערבל מסלולית איטי במשך 20 דקות. הארך את תקופת הזמן בעת עיבוד דגימות עבות יותר (ראה דיון). יש להוסיף את נפח התיקונים המספיק לכל מנה כדי לטבול את כל הצמיחה הבין-מדיה, כולל כל הצדדים הפנימיים של המנה.
- להסיר את הקבע ולמלא את הצלחת עם PBS לשטוף את שרידי קבע. היפטר מקבע כפסולת מסוכנת. חזור על מספר שוטף לטווח קצר, ולאחר מכן מנקה יותר כדי לאפשר את הזמן עבור תיקונים שיורית לפזר מתוך בלוק הבין-בלוקים או אגר. תקופת השטיפה תלויה בזמן המותר לקיבוע (ראה דיון).
- הכמות הדרושה של הכתם. תהיה תלויה במסה הבין-מרבית להסיר את כל היו, מן האזורים שאינם הדגימה של צלחת התרבות לפני כתמים, או להעביר את הדגימה קבוע לתוך תבשיל חדש לפני כתמים. אל תאפשר לאחד מבין האחרים לנקז או להתייבש. . שיהיה שקוע בערוץ הPBS
- הוסף את הכתם למנה (ראה דיון) והגדר את המנה המכוסה על מערבל מסלולית איטי לילה (ראה דיון). . הגנה מפני אור
- בבוקר, להסיר את הפתרון מכתים ולמלא את הצלחת עם PBS לדלל את הכתם לא מאוגד. הגדר את הכלים על מערבל מסלולית איטי לדכתם במשך כמה שעות.
3. הבהרה בפרוטוקול: ביויואמים בשכבות לא מיועדות
- ביואילאמים מובהר קשה להבחין באופן חזותי. לכן, אם תרצה, סמן צד אחד של כל שכבת משנה עם שריטה כדי לייעד את הצד השני לחיסון.
- השתמש בתווית באמצעות פיפטות פסטר לאורך כל הפסולת העוקבת והעברות ממס כדי למנוע זיהום צולב של ממיסים.
- בעזרת מלקחיים, העבירו את הביובין הקבוע מ-PBS ל-5 מ ל של 50:50 PBS: מתנול בבקבוקון זכוכית בעלת 20 מ ל עם כלפי מעלה. לערבב ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 5 דקות (ראה דיון).
- להסיר את הממס לבקבוק פסולת, להיות זהיר כדי למנוע מגע בין הפיפטה לבין ביוilm, או את הבקבוקון ואת המבחנה. מילוי בעדינות עם 3 מ ל של מתנול מסודר. לערבב ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 3 דקות.
- הסר את הממס לבקבוק פסולת, ולאחר מילוי מיידי עם 5 מ ל של מתנול. לערבב ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 5 – 10 דקות. הסר את הממס לבקבוק פסולת, ומיד ממלאים עם 3 מ ל של מתנול. ביואילאמים לעתים קרובות נראים יותר אטומים בשלב זה מאשר הופעתו הראשונית.
- להסיר את הממס לבקבוק פסולת, ומיד למלא את המבחנה עם 5 מ ל של 50:50 מתנול: מתיל סליייתאחר. לערבב באופן ידני עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 5 – 10 דקות. הביוilm צריך להיות שקוף למחצה בממס המעורב הזה.
- הסר את הממס לבקבוק פסולת. בעדינות למלא את הבקבוקון עם 3 מ ל של מתיל מסודר סלימיאחר (MS). לערבב ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 3 דקות.
- הסר את הממס לבקבוק פסולת, ולאחר מילוי מיידי עם 5 מ ל של MS מסודר. לערבב ידנית עם תנועה מסלולית במרווחי זמן של 1 דקות עבור 5 – 10 דקות. בשלב זה, השימוש ביוilm צריך להיות שקוף. הסר את הממס לבקבוק פסולת, ומיד למלא את המבחנה עם 3 מ ל של MS מסודר. הביוilm המעובד יציב בממס זה.
- עבור ביומאמים על אגר (ראה דיון) להאריך את כל תקופות זמן החליפין כדי לאפשר דיפוזיה מים הממס למרות אגר. תקופות הזמן הדרושות ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ מבתר כוח נמוך עם תאורה ושלכת כדי להציג את מקדמת הממס לתוך אגר. הפרוטוקול משיגה הבהרה טובה לא השפעות הצטמקות הגדולות כאשר 2% אגר משמש, אבל אגר מובהר יהיה לדחוס אם לחצה בעת טיפול עם מספריים. מומלץ להשתמש במרית.
4. הגדרת הדמיה למיקרוסקופיה קונפוקלית
- השלבים הבאים נועדו לשימוש במיקרוסקופ הפוך. השתמש צלחת ממס הוכחה כי יש כיסוי התחתון זכוכית כדי להחזיק את הדגימה ההפוכה על במת המיקרוסקופ (ראה דיון).
- הכינו מרווחים לתמיכה בדגימה ההפוכה. השתמש מלבנים קטנים לחתוך מתוך שקופיות מיקרוסקופ (1,000 יקרומטר עבה), כיסוי כוסות (170 יקרומטר), או 13 מ"מ טבעות סיליקון (330 יקרומטר, ראה טבלת חומרים), אשר עשוי להיות מוערמים לפי הצורך. להשרות את הטבעות במתיל סלייאחר עבור 1 h כדי למזער את להיסחף מיקוד עקב נפיחות.
- עבור ביוilm על כיכר סיליקון ברמה רפואית, הפוך את הכיכר (כלומר, להפוך אותו ביויוilm למטה) ולהגדיר אותו על מרווח בבריכה של מתיל סליייאחר במנה (איור 2). ודא להימנע כל בועות מתחת לדגימה.
- הר את המנה בחוזקה על הבמה של המיקרוסקופ ולהפוך שמן שקוע במגע עם המטרה (ראה דיון).
- להתאים את כמות MS במנה כך מניסקוס מחזיקה את הדגימה בחוזקה על מרווח על ידי מתח פני השטח. מניחים droplet של MS על גבי טקטי תשתית הכיכר ההפוכה כדי להפחית פיזור אור מן הגימור מאט, ולכסות את הצלחת עם צלחת זכוכית כדי להגביל את האידוי. לחכות מספר דקות כדי הדגימה להתיישב על מרווחים לפני הדמיה.
- השתמש באור משודר כדי לבדוק חזותית את שדה התצוגה ולאתר את מיקום המיקוד הנוכחי ביחס לאזורים הנוכחיים והבזליים של הביוראות הפוכים. הגדר את הצמצם המאיר מספריים (INA) למינימום (לסגור את הקשתית העבה) כדי להגביר את הניגודיות, אחרת הבייוilm הבהיר יהיה כמעט בלתי נראה. כשתסיים, כבה את מקור האור המשודר.
- עבור לקרינה פלואורסצנטית ממוקדת והגדר את המגבלות הנמוכות והעליונות של מחסנית התמונה הטורית המרכזית הדרושה כדי להתפרס על-ידי השימוש באחד. כלפי מעלה מיקוד הנסיעה, אשר מומלץ, הראשון להציג תאים שעברו התיישבו על הזכוכית המכסה ואת לקורבן ארוך מאוד כי הם נחים על הזכוכית. בקצה העליון של הרצף, יש לראות את התאים המייסדים לרובד המשנה בבסיס הביוilm. הגדר את קוטר הנקב, את מרווח הפיקסלים במישור התמונה, ואת המרווח בין שלב המיקוד באמצעות הקריטריונים הכלליים המתוארים בדיון.
Representative Results
ביוילאמים כגון זה באיור 1 הם שקופים למחצה לאטום, אך מובהר ומחושב באופן שגרתי על ידי שימוש בפרוטוקול לעיל. איור 2 מראה את ההינחתה החזקה של הקרינה הפלואורסצנטית עם עומק מיקוד קבוע ב-PBS, לעומת ביוilm זהה לאחר התאמת אינדקס. כפי שניתן לראות באיור 3, באמצעות miscible ממיסים הגוברת של מדד השבירה המרבי בבהירות יכול להיות מוערך במהירות. זה מעודן על ידי מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה קונבנציונאלי כדי למצוא את הנקודה של ניגודיות מינימלית (שקיפות מקסימלית). ניכר כי אופטימלי זה אינו מושגת על ידי התאמת המדד הומוגנית. הסיבה לכך היא שמבנים תת-סלולאריים שונים מעט במדד השבירה. במקרה זה, היפוך ניגודיות אירעה בקיר התא באינדקס ממס מעט נמוך יותר מאשר בציטופלסמה. עבור קנדידה אלביקנס ביואילאמים, האופטימלי מתרחשת קרוב n = 1.530. The 48 h סוג פראי ו cak1 DX מוטציה ביוילאמים באיור 4a היו 500 יקרומטר עובי, אך התאים שמרים בבסיס היו התמונה כמעט חדה כמו התאים האפיתים. כמו כן, כפי שמוצג באיור 4C, הנחתה של הקרינה הפלואורסצנטית לא היתה מקורלציה בחוזקה עם עומק המיקוד. איור 5 מראה לקורבן פולשנית ב אגר, מאות מיקרומטר מתחת לפני השטח של ביוilm. בוגרת לקורבן פולשנית בעקביות לייצר לרוחב שמרים האבוביים כדי septa בשרשרת לקורבן, מתן העלייה התת מושבות של תאים שמרים כמו במרווחי זמן קבועים לאורך hypha פולשנית.
איור 1: מתרבויות הביוilm לפני הבהרה. A 24 h ביוilm גדל מבידוד של efg1 ∆/∆ זן של C. אלביקנס בצלחת 12 היטב על כיכר סיליקון ב RPMI-1640 בינוני נוזלי שיושלם עם 10% fbs. הריק הסטרילי נמצא. בבאר של C4 שיבוץ מראה חתך חתך של 96-hr-מסוג פראי ביוilm גדל בצלחת 6-היטב על בסיס 3.75 mm אגר באותו בינוני מראה hyphae פולשנית. שני הפאנלים הם באותו קנה מידה. סרגל קנה מידה = 2.0 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיפור ההדמיה העמוקה על ידי התאמת המדד. הדמות מציגה הקרנות השקפה צדדית של ערימות התמונה מיקוד מתוך 48 h מסוג פראי ביוilm שהיה קבוע ומוכתם עם קונה-Alexafluor 594. (א) הדגימה הייתה מפויית ב-PBS באמצעות 63 x 1.0 NA ישיר לטבילה במים המטרה. החליש היה חמור בעומק מוקד של 30 μm. (ב) לאחר הבהרה על ידי שלבי הפרוטוקול 3.3 – 3.8, אותו ביוilm התמונה במתיל סלייסק עם הנחתה מינימלית באמצעות 40x 0.85 NA מטרת טבילה שמן. לאחר חיסור הרקע והקרנת התצוגה הצדדית של ערימות התמונה התלת-ממדית, נתוני 40x התאימו מחדש כדי להתאים לנתוני 63 x להשוואה. (ג) תרשים סכמטי מראה הרכבה הפוכה של הדגימה הנקיה (מ-ms) על ידי העברה ל-ms בצלחת אלומיניום שחור עם כיסוי מבטון זכוכית תחתית (ראה דיון). סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: refractometry ניגודיות פאזה מראה היפוך ניגודיות של תכונות סלולריות בטווח של התאמת אינדקס אופטימלית. ביואילאמים קבועים על משקפי הכיסוי הוחלפו מ PBS לתוך מתנול, ואז לתוך קסילן (n = 1.496). ביוגיאמים אלה הוחלפו לאחר מכן אחד מ קסילן לתוך קבוצה של שבירה התייחסות נוזלים (סדרה E, Cargille מעבדות, לראות את לוח החומרים) ו בדק חזותית זה לצד זה כדי לקבוע את טווח האינדקס נותן שקיפות הגבוהה ביותר. (החלונית העליונה) תמונות חדות פאזה: ביוilm אחד הוחלף באופן סדרתי בין קסילין וערכה צרה של נוזלי ייחוס בטווח זה. לאחר כל החלפה, אותו השדה הועבר והוצג למרות זכוכית כיסוי באמצעות 40x 0.85 NA Ph2 השמן טבילה היעד הניגודיות הPh2 העבה. כל התמונות נרשמו עם אותה הגדרה המנורה וחשיפת המצלמה כדי להציג במדויק שינויים. עם הגדלת המדד, היפוך ניגודיות נראה לראשונה ב n = 1.530 עבור הקיר התא, ואחריו ציטופלסמה ב n = 1.535. סרגל קנה מידה = 10 μm. (החלונית התחתונה) Graph המציג את המינימום של בהירות הביוilm הממוצעת בנקודת השקיפות המירבית. פיזור של אור חזק בתוך הביוilm גורם לבהירות הממוצעת לחרוג מהשדה הריק. תאים מבודדים מופיעים ככהים יותר מהשדה הריק, עד להיפוך ניגודיות בטווח 1.530 – 1.535. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה עמוקה של מוטציה ומסוג פראי C. אלביקנס ביוילאמים. זן מסוג פראי (DAY185) ו מחזור התא הקשורים חלבון קינאז ביטוי מופחת להתאמץ (cak1 DX)14 גדלו ב 37 ° c עבור 48 h על שכבות סיליקון במדיום נוזלי YPD. היווליאמים תוקנו, מוכתמים בקונה-אלכאפילואו 594, והובהר באמצעות פרוטוקול החלפת הממס למתיל סלימיסק. מיקרוסקופ קונפוקלית וקד 3d הראה כי שני ביואמים היו ~ 500 יקרומטר עבה. נתוני התמונה הומרו לתבנית 32-bit ב-ImageJ או בפיג (https://imagej.nih.gov/ij/או http://fiji.sc), ולאחר מכן עובדו באמצעות הפונקציה ' הפחת רקע ' עם רדיוס של כדור מתגלגל של 50 פיקסלים, סף כדי להגדיר פיקסלים שליליים לאפס, לערוך הקרנה, ולהשתמש בהטלה בעוצמה מרבית כדי להפיק תצוגות צדדיות. (א) צירית והתחזיות לצפייה מהצד: מסוג הביוilm הפראי גדל לעובי של 502 יקרומטר כפי שנראה בתחזית הצד התצוגה של מחסנית התמונה 558 מטוס. סרגל קנה מידה = 100 μm. (לוחות יד שמאל) 40-מישור התחזיות הציר מקודקוד (למעלה) לבסיס (למטה) להראות את הווריאציה בסוגי תאים בשכבות שונות של הביוilm. דוגמה זו הראתה מבנה מאפיין מסוג פראי: תאים חסיד בבסיס לתת היפוהה כי לעלות לתוך אזור באמצע צפוף של תאים דמויי שמרים ומשמרים. מעל אזור האמצע, מחדש התפתחה והוליד אשכולות של שמרים מבשלה. המהפכן הארוך שנראה באזור האפפיורי כנראה התרחב לתוך מדיום התרבות של הביו, אבל מקופל על פני השטח של הביוilm במהלך עיבוד הדגימה. Cak1 DX ביוilm גדל לעובי של 500 יקרומטר כפי שנראה בהטלה תצוגה צדדית של מחסנית התמונה 556-המטוס. מוטציה זו, אשר ידוע לעבור צמיחה filamentous בהיעדר גרימת מדגיש14, הפיק ארכיטקטורה שונה באופן דרמטי. כפי שרואים הן בתצוגה צדדית והן בהקרנות הציר (לוחות יד ימין), תאי הסתעפות רבים הביאו לעלייה לגידולים רדיאליים. (ב) דוגמאות של מסעף הסתעפות בתוך cak1 DX של ביוilm. סרגל קנה מידה = 10 μm. (ג) הנחתה של הזריחה עם עומק בתוך מסוג פראי מובהר הוכימות על ידי הסוואה של פיקסלים ברקע, ולאחר מכן לחשב את האות הדיגיטלי הממוצע עבור כל הפיקסלים שאינם ברקע בכל מישור התמונה. למעט לקורבן שאינם מסומנים בבהירות על ידי הקטין, לא הייתה מגמה חזקה של הנחתה עם עומק מוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: לקורבן פולשני ב אגר. C. אלביקנס לקורבן בתוך משטח הבין ביו, יחדור שכבת המשנה של אגר למרחקים מילימטר (ראה איור 1). לאחר בירור, ניתן לראות מבנים פולשניים כלפי מטה למרות המבנה, או כלפי מעלה מן הצד התחתון של אגר. האחרון דורש מרחק עבודה גדול יותר. לחילופין, לאחר קיבעון אבל לפני כתמים החליפין הממס, אגר עשוי להיות חתוך אנכית עם אזמל או סכין גילוח לתוך 1 – 2 מ"מ לוחות כי אז יכול להיות מופעל בצד התמונה ישירות לתצוגה צדדית לאחר כתמים והבהרה. הליך זה מומלץ. בתחזית זו של שדה מרובע 213 יקרומטר של השקפה, סולם צבע הקשת שימש לקודד מיקום צירית מעל טווח 75 יקרומטר: תכונות כחולות הם קרובים ותכונות אדומות עמוק לתוך מישור העמוד. השקפה זו מראה כי מיקוף ארוך ביטול תאים שמרים לרוחב במרווחי זמן חצי קבוע כי להצמיח תת מושבות. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
התקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהפרדה אופטית, רזולוציה, מהירות, הימנעות או פיצוי של סטייה, רכישת רב-ערוצי, ובכוח המחשוב, גרמו לתחייה בהדמיה בדגימות שלמות. לדגימות קבועות, הן הבהרה קלאסית והן רומן שיטות הרחבה היתה השפעה גדולה19,20,21,22,23,24. במקרה זה, התחלנו התאמה מהירה ופשוטה המבוססת על מדד ההתאמה כדי ללמוד את המבנה של ביוגיאמים פטרייתי כי הם שקופים בכבדות לאטום.
הפרוטוקולים הקודמים נבדקו עם מגוון של דגימות. ב מעבדה שלנו קנדידה ביוביאמים בעלי לרוב גדלים על 14 מ"מ ריבועים לחתוך מתוך גיליון של גומי סיליקון בכיתה רפואית (ראה לוח חומרים). שכבת משנה זו משמשת מכיוון שהגידול ב-PDMS (פולי דימתיתיל siloxane) שקוע במדיום תרבות נוזלית הוקם כמודל חשוב במיוחד עבור זיהומים הקשורים שתלים רפואיים, בעיקר קטטרים שכינתה. תאים הדגיש ייזום filamentation לדבוק במהירות משטחים שאינם קוטבי כגון PDMS. בפועל, משבצות משומשים שנוקו ומחוטאת מחדש במחזור החיטוי (מחזור יבש) נותנים את הביואמים העקביים ביותר עבור כל זן מסוים. ביואילאמים מגודלים גם בדרך כלל על משקפי כיסוי, במנות מהמטבח התחתון של המטבח, בפוליסטירן מוקצף סטנדרטי בקטיולוגי ובאגר. מכיוון ש -C. אלביקנס תאים לא לדבוק היטב זכוכית, משקפיים לכסות צריך להיות מטופלים עם לקטין כי יהיה לאגד את הקיר מפיברגלס. אנו מחילים 40 μL של 1 מ"ג/mL קונה או WGA במים סטריליים על כל משטח coverslip. לאחר ייבוש, משקפי כיסוי מטופלים עם 40 μL של 1% גלוטארלדהיד עבור 3 דקות כדי להצליב את החלבון לתוך סרט לא מסיסים. לאחר מכן הם נשטפים עם מים מזוקקים סטרילי כדי להסיר את הקבע ואת כל לקטין מסיסים ומיובשים האוויר. במקרה הצורך, משקפי הכיסוי שטופלו או מנות מטוהרים מחדש תחת מנורת UV קוטל חידקים עבור 10 דקות.
עובי הדגימה ישפיע על תקופות הדגירה הנדרשות בפרוטוקולים. הדיפוזיה הfixative לתוך ביוilm של 300 יקרומטר דורשת מספר דקות כדי להתמצא. תקופה זו הזמן מגדילה כריבוע של עובי הדגימה, ויש להרחיב לשעה או יותר עבור ביואילאמים עבה מאוד או בלוק לחסום דגימות שעשוי להיות 2 – 3 מ"מ עובי. תקופת הזמן הequiציה עבור הצביעת גם תלויה בעובי הדגימה כמתואר לתיקון וכשלון. עם זאת, כיוון שהפחיות מוארכים לאט יותר מאשר התוספות הנמוכות, במיוחד בתוך ג'ל אגר, יש להאריך בין לילה. אותו הדבר צריך להיעשות לכישלון של הכתם העודף.
כתמים מסוגים שונים עשויים להיות שולבו בפרוטוקולים. אנו משתמשים כתם תא הקיר עבור דימות מבניים, הנפוץ ביותר Calcofluor לבן M2R (Fluor. בריאר #28) או צבע מתויג לקטין כגון קונה-Alexafluor 594 או WGA-Alexafluor 594. שימו לב, יש לשלם את הטיפול בחלבון. הקונה הטטרמר עלול לגרום ליצירת קשר בין מיקוף גמיש ביותר באזור האפיאני של ביוilm. זה פחות ברור עם ה-WGA dimer. הסממנים הקאנוניים של הסמנים הללו הם קלקופלואור עבור כיטין, קונה עבור שאריות מנוז, ו-WGA לצורך שאריות החומצה הדו-מרחצילית-D-גלוקוסמורין.
מאחר שפרוטוקול החלפת הממס מדורגת מ-PBS או מהמים, למרות שמתנול לתוך מתיל סלימאחר, מכולות הדגימה חייבות להיות עמידות בפני ממס. מתיל מאוחר (MS) מרכך במהירות פוליסטירן פלסטלינה ומרכך באיטיות חומרים פלסטיים אחרים. שלבי הפרוטוקול עד לשימוש מתנול מסודר ניתן לבצע ב פלסטלינה, אבל בשלב זה בפרוטוקול אנחנו בדרך כלל מחליפים לתקן 20 מ ל הזכוכית המבחנות עם ברגים עמידים ממס. הבקבוקונים נוחים עבור ביואילאמים על תת מרובעים סיליקון מרובע, כי הריבועים ניתן לאסוף ולהעביר באמצעות פינצטה עדין. כמו כן, ניתן לרוקן בקבוקון ולמולא עם הריבוע השטוח השוכן על המשטח המעוקל הפנימי, כך שיורואים אינו מתקשר לזכוכית. שכבת המשנה צריכה להיות ביואושל-up כאשר היא שקועה בבקבוקון הזקוף. הבקבוקונים מצוינים לאחסון. דגימות לטווח ארוך
בפרוטוקול הבהרה, יותר מדורגים שלבים החליפין הממס למזער את הסיכון דפורמציה הדגימה עקב אפקטים ערבוב ממס. עבור מהירות ונוחות בפרוטוקול הבסיסי, ישנם ארבעה שלבים: 1) צעד 3.3, PBS כדי 50:50 PBS: מתנול; 2) שלבים 3.4 ו 3.5, PBS: מתנול כדי מתנול מסודר, 3) צעד 3.6, מסודר מתנול כדי 50:50 מתנול: MS; ו 4) שלבים 3.7 ו 3.8, מתנול: MS כדי מסודר MS. מתנול מספק את חוסר המעבר. עם זאת, בגלל מים ו-MS כמעט immiscible, זה חיוני כי כל המים להיות עקורים על ידי מתנול לפני המבוא של כל MS. כמו כן, כי מתנול הוא הפכפך מאוד, חשוב לעבור את כל מתנול על ידי MS. אחרת, המשך אידוי מתנול שיורית יגרום שבירה וריאציות מדד בתוך הדגימה. במסגרת רצף ארבעת השלבים, חוזר על הצעדים השני והרביעי על-ידי הוספת שינוי נוסף של ממיס מסודרת, או אפילו שינוי שלישי, מומלץ. לדגימות שבירות במיוחד, ניתן לניסח שינויי ממיסים בשלבים קטנים יותר.
עם דגימות לחסום אגר, שלבים 3.4 ו 3.5 (מסודר מתנול) עלול לגרום המראה של גבישי מלח בתוך אגר בשל חוסר מסיסות של מלחי PBS שיורית במתנול. זה יכול להיות נמנע על ידי שימוש במים מזוקקים (DW) בשלב הראשון מעורב הממס במקום PBS לדלל מלחים במהלך המים: מתנול exchange. רצף החליפין חלופה חלופית עבור ביואילאמים קבוע אז מורכב משלבים אלה: 1) צעד 3.3, להעביר את הדגימה מ-PBS לתוך 50:50 DW: מתנול (לאפשר זמן נוסף עבור דיפוזיה דרך אגר); 2) צעד 3.4, להעביר את הדגימה מ 50:50 DW: מתנול לתוך מתנול מסודר (לחזור על 2x עם מתנול כמו בשלב 3.5); 3) שלב 3.6, להעביר את הדגימה מ מתנול כדי 50:50 מתנול: מתיל סליייתאחר; ו 4) צעד 3.7, להעביר את הדגימה מ 50:50 מתנול: MS כדי MS מסודר (לחזור על 2x עם MS כמו בשלב 3.8).
בגלל שמתיל סליייסוף במהירות מרכך פוליסטירן מפלסטיק, אנו משתמשים בצלחת אלומיניום עם תחתית זכוכית כיסוי כדי להחזיק את הביוilm הבהיר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. הזכוכית המכסה מוחזק במקום באמצעות UV-ריפוי בטון אופטי (נורלנד #61 דבק אופטי, ראה לוח חומרים). בתנאי MS מוסר בסוף היום על ידי שטיפת הצלחת עם איזופנול ואחריו מים סבון ושטיפה, זכוכית לכסות חיזקו יהיה לשרת במשך חודשים רבים.
בחירת העדשה האובייקטיבית חשובה באופן קריטי בהדמיה בקנה מידה גדול של דגימות מובהר בשל החשיבות של מזעור סטייה כדורית ואת הצורך במרחק עבודה מספיק. יש לנו ניסיון עם שלוש מטרות במחקרים אלה. בכיוונון מיקרוסקופ הפוך, אנו משתמשים במרחק עבודה ארוך, מתון הצמצם מספריים (NA) שמן אובייקטיבי שקוע מתחת לזכוכית המכסה עם הביוilm שקוע במתיל סלייימאוחר בצלחת מעל זכוכית העטיפה. רוב העבודה שלנו נעשה עם המטרה האוניברסלית Zeiss סדרה מטרה, סוג 461708, 40x 0.85 NA Oel 160/1.5, משמש עם מתאם שלילי 160 מ"מ אורך מוקד עבור הנומינלי המשלים אינסופי (IC) תאימות. מטרה זו במקור תוכנן עבור שמן שקוע צפייה דרך מיקרוסקופ 1.5 מ"מ עם 0.35 mm מרחק עבודה25. כאשר משתמשים עם זכוכית כריכה סטנדרטית (0.17 מ"מ), מרחק העבודה הוא הרבה יותר: 1.5 + 0.35 – 0.17 = 1.68 mm = 1,680 μm. אנו משתמשים גם מטרה מרובת טבילה חדשה של Zeiss, סוג 420852, 25x 0.8 NA LD LCI תוכנית-apochromat עם מרחק עבודה העולה על 540 μm, עם תיקון טבילה להגדיר את הצד הגבוה של ' שמן '. מטרה זו מתוקנת מאוד ומייצרת תמונה מעולה. על דוכן מיקרוסקופ זקוף, השתמשנו מטרה מרובת טבילה חדשה של ניקון, סוג MRD71120, 10x 0.5 na cfi תוכנית-apochromat עם מרחק עבודה יעלה 5,000 יקרומטר (5 מ"מ), גם עם תיקון טבילה להגדיר את הצד הגבוה של ' שמן ' (n = 1.518). למרות מטרה זו יש NA נמוכה יותר מהאחרים, יש לו את היתרון של להיות ישירות מתוך מתיל סלימיאחר.
כדי לייעל את רכישת הנתונים במונחים של מהירות ורזולוציה, הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באופן אידיאלי צריך לעמוד הן מדגם נייקוויסט רוחבי ו-צירית בצפיפות18. באמצעות קריטריונים קונבנציונליים, הגדר את קוטר החור החרוט ליחידה אוורירית 1. , בקואורדינטות מוגדלות
dP (μm) = 1.22 x הגדלה x (אורך גל פליטה ב-μm)/NA
דגימת רוחבי (מרווח בין פיקסלים) לא תעלה על (1/2) x מגבלת הרזולוציה של אבה. בקואורדינטות של מרחב האובייקטים,
∆ x, ∆ y = (פליטה אורך הגל בננומטר)/(4 NA)
דגימת ציר (התמקדות בתוספת קבועה) לא תעלה על רוחב הפס ההופכי של הציר,
∆ z = (אינדקס טבילה) x (אורך גל פליטה בננומטר)/(NA2)
המערכת האופטית הקונקלית מרחיבה את רוחב הפס של המיקרוסקופ ומחדדת הן את הרזולוציה הרוחבי והצירית על ידי לפחות 1/√ 2.
עבור המטרה 40x 0.85 NA שאנו מנצלים בדרך כלל, לראות את הטבלה 1 עבור התוצאות של נוסחאות אלה עבור מ600 הפליטה ננומטר גל (אלקסה fluor 594).
| נוסחה | x 1/√ 2 | set (אופיינית) | |
| dP (μm) | 34.5 יקרומטר | - | 25 או 50 יקרומטר |
| ∆ x, ∆ y | 176 ננומטר | 125 ננומטר | 161 ננומטר |
| ∆ ז | 1200 ננומטר | 848 ננומטר | 900 ננומטר |
שולחן 1: קוטר מוקד מיקוד, דגימה לרוחב, וערכי דגימה צירית באורך של 600 ננומטר.
באמצעות סורק מסתובב בדיסק עם הגדרות אלה ושדה 1,392 x 1,040 פיקסל לסרוק השדה, נתונים מתוך דגימות של ביוilm ניתן לרכוש עם מהירות סבירה ורזולוציה. אופייני לתמונות תלת-ממד של התמונה מ0.35 – 1.55 GB.
הבהרת מדיה בטווח רחב של שימוש משמעותי בתחום השבירה. על ידי התאורה ושלכת ובדיקה חזותית, מצאנו את התקן C. אלביקנס ביואילאמים היו שקופים ביותר מעל n = 1.5. זה היה מעודן על ידי מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה n = 1.530 – 1.535. עבור מספר סיבות מעשיות, אנו משתמשים במתיל סלייימה (n = 1.537) כמו המדד הסופי התאמת הממס. למרות החליפין ממס מביא את הסיכון של דפורמציה הדגימה או חפצים אחרים, תאים קבועים, הבהיר דגימות יש מידות דומות גוף התא, hypha קוטרו, ו-interseptal מידות אורך כמו יצורים חיים.
וריאציות רבות בתהליך החלפת הממס אפשריות (לדוגמה, שימוש בממיסים שונים או מממס סופי שונה). מתנול נבחר קוטביות גבוהה ודיפוזיה מהירה, אבל אתנול הוכח לשמר טוב יותר חלבון פלורסנט אדום (RFP) התשואה הקוונטית26 כממס המעבר. מתיל מאוחר נבחר עבור האינדקס שלה, קוטביות מתונה, לחץ אדי נמוך, ותאימות עם כתמים רבים, צבעים, וחלבונים פלורסנט. עם זאת, הממס הסופי עם אינדקס מעט נמוך יותר, או תערובת של מתיל סלימאוחר וממיסים המדד נמוך יותר, כגון butanol, עשוי לשרת טוב יותר.
באופן בלתי צפוי, היכולת לראות דרך מבנה המבנה חושף לא רק את התכונות הפנימיות שטרם עברו, אלא גם מסייעת להציג את מקורם של מבנים מורחבים כגון מיקוף ארוך ומלא-מסובכת, ומיקוף בסיס פולשני בשכבות משנה מסוימות. התקפה של אופורטוניסטית ב -C. אלביקנס תלוי ברב-תכליתיות הגנטית שלה (כלומר, המעבר אל הצמיחה hyphal, upregulation של תא טקטי תשתית כבה ותא תא התא, הדור של osmolytes עבור התבגרות תא התארכות, ושימוש בחומרים מזינים חלופיים). הארכה hyphal מאפשר הפריצה של בודדים C. אלביקנס תאים מתאי החיסון phagocytic אלא גם חיוני לפלישה. שזירה הדבקה ומיקוף של ביו, מופיעות כדי לספק את המשטח הנדרש כדי לחדור ביעילות לשכבה משנית. כאשר שכבת המשנה היא רקמה מארחת, התקפה אלימה מוגברת עלולה לגרום.
הדמיה שלמה ביואילאמים מאפשר מספר עצום של ניסויים אינפורמטיביים ניצול זנים הכתב לביטוי גנים, מודל משנה רקמות, והכללת אורגניזמים אחרים כגון חיידקים שנמצאו ביואילאמים טבעיים. גם במקרה הפשוט ביותר של הדמיה מבנית גרידא עם כתם קיר תא, באתרו פנוטיפים מתגלים כי אז ניתן לכמת ומנותח גנטית.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים מתחרים לגלות.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי NIH מענקים R01 AI067703, R21 AI100270, ו R21 AI135178 ל-א. פ. מיטשל. המחברים אסירי תודה לגרינפילד ' קיפ ' סלודר לספק את היעד הארוך לטבילה בשמן הרחוק המשמש בעבודה זו, ודניאל Shiwarski למיקרוסקופיה מיקרוסקופית עם טבילה ישירה מתיל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator - 30 °C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator - 37 °C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5 W | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13 mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive - type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n = 1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL - Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin - Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
