Vi præsenterer en protokol i to dele, der kombinerer fluorescerende calciumbilleddannelse med in situ-hybridisering, så eksperimentatoren kan korrelere farvemønstre for calciumaktivitet med genekspressionsprofiler på et encelleniveau.
Spontan intracellulær calcium aktivitet kan observeres i en række forskellige celletyper og foreslås at spille kritiske roller i en række fysiologiske processer. Især passende regulering af calcium aktivitet mønstre under embryogenese er nødvendig for mange aspekter af hvirveldyr neurale udvikling, herunder korrekt neuralrør lukning, synaptogenese, og neurotransmitter fænotype specifikation. Mens observationen af, at calciumaktivitetsmønstre kan variere i både frekvens og amplitude, tyder på en overbevisende mekanisme, hvorved disse strømme kan sende kodede signaler til downstream-effektorer og regulere genekspression, befolkningsniveau tilgange har manglet den præcision, der er nødvendig for yderligere at undersøge denne mulighed. Desuden begrænser disse tilgange undersøgelser af cellecelleinteraktioners rolle ved at udelukke evnen til at analyse af neuronal bestemmelses tilstand i mangel af cellecellekontakt. Derfor har vi etableret en eksperimentel arbejdsgang, der parrer time-lapse calcium imaging af dissociated neuronal explants med en fluorescens in situ hybridisering assay, så den utvetydige korrelation af calcium aktivitet mønster med molekylær fænotype på et enkeltcelleniveau. Vi var med succes i stand til at bruge denne tilgang til at skelne og karakterisere specifikke calcium aktivitetsmønstre forbundet med at differentiere neurale celler og neurale stamceller, henholdsvis; ud over dette, dog kunne de eksperimentelle rammer, der er beskrevet i denne artikel, let tilpasses for at undersøge sammenhænge mellem enhver tidsserie aktivitetsprofil og udtryk for et gen eller gener af interesse.
Frit cytosolcalcium er afgørende for en række biologiske processer, lige fra celleproliferation og migration til apoptose og autofagi1,2,3. Inden for disse veje kan calcium udøve downstream-effekter på genekspression ved at interagere med calciumbindende domæner for at fremkalde kropsdannelsesændringer, der modulerer proteinaktivitet og interaktioner. For eksempel, en neuronal calcium sensor kendt som Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) holdes i en udfoldet mellemliggende kropsbygning, når bundet af calcium, forhindrer det i at interagere med sit protein og DNA mål4. Ud over at fungere som et simpelt signalmolekyle gør den dynamiske karakter af intracellulære calciumtransienter imidlertid disse aktivitetsmønstre til at indkode mere komplekse amplitude- eller frekvensbaserede signaler5,6. Nuklear omplantning af transskriptionsfaktoren for aktiverede T-celler (NFAT) forstærkes af højfrekvente calciumsvingninger, men hæmmes af lavfrekvente svingninger7. Overbevisende, seneste arbejde har antydet, at NFAT faktisk kan lydhøre over for kumulativcalcium eksponering8. Både calcineurin og Ca2+/calmodulin-afhængige protein kinase II (CaMKII) udviser også forskellige reaktioner på calciumtransienter af en bestemt frekvens, varighed eller amplitude9. For at tilføje en yderligere grad af lovgivningsmæssig kompleksitet tyder beregningsmodeller på , at mange calciumbindende proteiner i senere led bliver mere eller mindre frekvensafhængige som reaktion på tilstedeværelsen eller fraværet af bindende konkurrenter10,11.
Inden for det udviklende nervesystem, to hovedklasser af calcium aktivitet adfærd er blevet defineret og forbundet med specifikke biologiske processer. Calcium tilstrømning er klassificeret som “pigge”, hvis de forekommer inden for de enkelte celler, nå en topintensitet på ~ 400% af baseline inden for fem sekunder, og udviser dobbelt eksponentiel henfald12. Denne type signal er primært forbundet med neurotransmitteren fænotype specifikation13. I modsætning hertil defineres “bølger” som langsommere, mindre ekstreme calciumtransienter, hvor en celles intracellulære calciumkoncentration stiger til ~ 200% af baseline over en periode på tredive sekunder eller mere, derefter henfalder over flere minutter12. Disse signaler ofte udbredes på tværs af flere tilstødende celler, og deres tilstedeværelse har været forbundet med nitrit udvækst og cellespredning14,15. Selv om disse to klasser er defineret på grundlag af karakteristiske kinetiske profiler, er det dog fortsat uklart, præcis hvilke karakteristika disse mønstre der rent faktisk påvises af celler og oversat af downstream-effektorer.
Forståelse af forholdet mellem intracellulære calciumsvingninger og genekspression ville give afgørende indsigt i en af de lovgivningsmæssige mekanismer, der sikrer en passende udvikling og mønstre af nervesystemet. Med henblik herpå har undersøgelser af den embryonale rygmarv vist, at øget calcium spike aktivitet under udvikling er forbundet med højere niveauer af hæmmende neuroner, mens nedsat calcium spike aktivitet er forbundet med højere niveauer af excitatoriske neuroner13. Disse befolkningsniveauanalyser er imidlertid ikke blevet brugt til at forbinde calciumaktivitet med genekspression på et encelleniveau.
Nærmer sig disse spørgsmål om niveauet for den enkelte celle giver flere forskellige fordele i forhold til tidligere arbejde. For det første gør evnen til at vurdere calciumaktivitet og genekspression i mange celler individuelt det fulde repertoire af forskellige aktivitetsmønstre, der skal observeres uden at blive korrumperet af en måling på bulkniveau. Derudover betyder undersøgelse af disse relationer i primærkultur med en celle, at celleautonome forbindelser mellem calciumaktivitet og genekspression vil blive opretholdt, mens interaktioner, der kræver cellecellekommunikation, vil blive ophævet. Derfor gør denne fremgangsmåde det muligt at studere disse celleautonome mekanismer isoleret. Men det giver også mulighed for den rolle, ikke-celle-autonome calcium aktivitet, der skal belyses og afhøres. For eksempel kan celler dissekeres fra et foster på neurale plade fase, dyrket indtil søskende kontrol nå neurale rør fase, og derefter sammenlignet med celler, der er blevet frisk dissekeret fra en neuralrør-trins embryo. Dette gør det muligt direkte sammenligning af celler, der har bevaret cellecellekommunikation på tværs af en vigtig udviklingsperiode, til dem, hvor cellecellekommunikationblev afskaffet.
I forsøget på at løse begrænsningerne i tidligere eksperimentelle tilgange, udviklede vi en protokol, der ville gøre det muligt at vurdere både calcium aktivitet og genekspression i individuelle neurale stamceller celler, lette sammenhængen mellem specifikke aktivitetsmønstre med efterfølgende differentiering programmer. Neurale væv blev dissekeret fra Xenopus laevis på forskellige stadier af neurale udvikling, dissocieret i enkelte celler, og afbildet via konfokal mikroskopi i overværelse af en fluorescerende calcium indikator. Efter levende cellebilleddannelse blev prøverne fastsat og analysen via fluorescens i situ-hybridisering (FISH) for at detektere ekspression af et gen eller isoform af interesse. Det er vigtigt, at de enkelte celler kan spores på tværs af begge billeddannelseseksperimenter, hvilket betyder, at en celles calciumaktivitetsprofil og dens genekspressionsniveau kan forbindes med hinanden (figur 1). Den protokol, der rapporteres her, har til formål at sonde relationer mellem calcium aktivitetsmønstre og genekspression på tværs af embryonale neuroudvikling i Xenopus laevis. Men den bredere eksperimentelle ramme (single-celle tid-kursus billeddannelse efterfulgt af FISH og billede coregistration) kan ændres og anvendes på stort set enhver celle type, fluorescerende reporter, og gen af interesse.
Karakteristiske mønstre af calcium aktivitet er blevet observeret i de celler, der udgør det udviklende nervesystem, med specifikke typer af aktivitet forbundet med forskellige neurodevelopmental processer. En yderligere forståelse af de mekanismer, hvorved disse informationskompakte aktivitetsmønstre omsættes til transskriptionelle svar, kræver imidlertid, at oplysninger om calciumaktivitet og genekspression indsamles med encellede opløsning. Mens systemer, der udviser mere stereotype calcium aktivitet, såsom modne neuroner, kan med rimelighed analyse på bulk niveau, de uregelmæssige mønstre, der karakteriserer fosternervesystemet er let maskeret af mindre præcise optagelser.
De eksperimentelle rammer, der er fastlagt i denne protokol, kan let tilpasses en lang række forskellige celletyper og fluorescerende journalister. Væv, der indeholder stort set enhver celletype eller kombination af celletyper, kan dissekeres fra en modelorganisme af interesse og afforgyldt til encellede billeddannelse. Ud over at tillade celleidentifikation og isolere effekten af celleautonome processer gør en primær cellekulturtilgang det muligt for eksperimentatoren at definere mediekomponenter som ønsket. For eksempel er der udført forsøg, der sammenligner aktiviteten af neuronale prækursorer i 2 mM Ca2+ opløsning for at undersøge, om forholdet mellem spike frekvens og neurotransmitter fænotype i fosterrygmarven kan opsummeres uden indflydelse af cellecelle interaktioner13,20.
Mens denne protokol udnytter fluorescerende markør Fluo4-AM til at opdage intracellulære calcium aktivitet, afhængigt af udvælgelseskriterierne, brugere kan vælge andre kommercielt tilgængelige markører21, herunder genetisk kodet calcium indikatorer. På samme måde kan alternative markører bruges til at overvåge dynamiske ændringer i koncentrationen af en ion af interesse (herunder K+, Na+, og Zn2 +),membran potentiale, eller cellulære pH. Billedindstillinger og billedvarighed kan ændres efter behov.
Selv om vi korreleret calcium aktivitet og neuronal fænotype som en specifik anvendelse, denne metode gælder også for en række andre cellulære egenskaber. For eksempel kan fluorescens in situ hybridisering udføres med sonder mod ethvert gen af interesse, herunder neuronal markør ChAT eller transskription faktor Engrailed, så følsomme påvisning af en tilpasselig panel af mRNA arter. Disse sonder kan designes til at være isoform-specifikke, støtte yderligere mål specificitet, hvis det ønskes. Dobbelt FISK kan udføres ved hjælp af sonder konjugeret til flere to forskellige fluorophores, så den samtidige vurdering af udtrykket af flere gener. Men de ekstra vasker, der kræves af denne type eksperiment er forbundet med en øget chance for celletab eller bevægelse og kræver erfaring og delikatesse, der skal udføres med succes.
Uanset eventuelle eksperimentspecifikke ændringer af denne protokol er der flere vigtige trin, der kræver omhyggelig opmærksomhed. Dissektioner bør udføres med omhu for at fjerne alle forurenende væv eller cellepopulationer; fordi rumlige mønstre går tabt, når explants er adskilt, vil eventuelle resterende celler fra tilstødende væv blive afbrudt med og umulig at skelne fra cellerne af interesse. Når cellerne er belagt, skal prøverne håndteres så forsigtigt som muligt for at forhindre, at celler løsnes. Vigtigst af alt betyder det, at alle opløsningsændringer skal udføres langsomt og omhyggeligt, med pipetten placeret på kanten af pladen, når opløsningen fjernes og tilsættes. Dette vil sikre, at celler kan identificeres trygt i både calcium- og FISH-billeder. Hvis celler afbrydes under behandlingen, kan det være umuligt at identificere nogle eller alle de tilsvarende celler mellem de to billeder. Vi anbefaler at være forsigtig med disse opgaver, således at kun entydigt tilsvarende celler bruges til yderligere analyse.
Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der behandles, kan det være hensigtsmæssigt at foretage en række forskellige analysemetoder. Calciumaktivitet i timeserien kan behandles og kvantificeres på mange forskellige måder med eksperimentatorfleksibilitet i valget af af-trendparametre, analysemålinger og analyseparametre (f.eks. den % af referencetærsklen, der anvendes til at definere en calciumspike). Korrelationer mellem calciumaktivitet og genekspressionsniveau kan tegnes ved at analysere genekspression som en absolut eller relativ fluorescensværdi udvundet af FISH-billedet. Alternativt kan der tegnes sammenhænge mellem calciumaktivitet og genekspressifikator (tilstedeværelse/fravær) ved at definere en fluorescenstærskel for positivt genekspressionssignal og tildele “ja” eller nej-identifikatorer til individuelle celler. Som helhed giver dette eksperimentelle skema en utrolig fleksibel pipeline til indsamling og indledende analyse af data i timeserien i forbindelse med cellematchede genekspressionsdata. Sådanne eksperimenter vil være afgørende for bedre at forstå de komplekse relationer mellem cellulære dynamik og transskriptionelle ændringer, som eksemplificeret ved identifikation af calcium aktivitet mønstre karakteristisk for hæmmende-fated og excitatoriske-fated neuronal prækursorer i embryonale Xenopus laevis.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Wendy Herbst og Lindsay Schleifer for deres bidrag til udviklingen af disse protokoller. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 og 1R15HD096415-01) til MSS.
For Animal Husbandry & Cell Culture | |||
CHORULON (chorionic gonodotropin) | Merck Animal Health | ||
Gentamycin sulfate salt | Millipore Sigma | G1264 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521 | |
Collagenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Dumont #55 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dumont #5 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
For Calcium Imaging | |||
Fluo-4, AM, cell permeant | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
For RNA Probe Generation | |||
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
rATP | Promega | P1132 | |
rCTP | Promega | P1142 | |
rGTP | Promega | P1152 | |
rUTP | Promega | P1162 | |
Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
T3 RNA Polymerase | Promega | P2083 | |
T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
RQ1 Rnase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
For Fluorescence In Situ Hybridization | |||
Acetic Anhydride | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
Blocking Reagent | Millipore Sigma | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Millipore Sigma | 11207733910 | |
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
Solution Components | |||
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | C3306 | |
CHAPS hydrate | Millipore Sigma | C3023 | |
Denhardt's Solution (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Millipore Sigma | E3889 | |
Formamide (Deionized) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Millipore Sigma | H3393 | |
HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore Sigma | H1109 | |
L-Cysteine | Millipore Sigma | 168149 | |
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous | Fisher Scientific | AC413480050 | |
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX | Millipore Sigma | R3629 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S7653 | |
Triethanolamine | Millipore Sigma | 90279 | |
Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
Equipment | |||
Laminar Flow Hood | model of choice | ||
Dissecting Microscope | model of choice | ||
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | TE200 | |
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Shaking Incubator | model of choice | ||
Refrigerated Centrifuge | model of choice | ||
Miscellaneous | |||
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity | Millipore Sigma | CLS430769 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |