Summary
Vi præsenterer en protokol i to dele, der kombinerer fluorescerende calciumbilleddannelse med in situ-hybridisering, så eksperimentatoren kan korrelere farvemønstre for calciumaktivitet med genekspressionsprofiler på et encelleniveau.
Abstract
Spontan intracellulær calcium aktivitet kan observeres i en række forskellige celletyper og foreslås at spille kritiske roller i en række fysiologiske processer. Især passende regulering af calcium aktivitet mønstre under embryogenese er nødvendig for mange aspekter af hvirveldyr neurale udvikling, herunder korrekt neuralrør lukning, synaptogenese, og neurotransmitter fænotype specifikation. Mens observationen af, at calciumaktivitetsmønstre kan variere i både frekvens og amplitude, tyder på en overbevisende mekanisme, hvorved disse strømme kan sende kodede signaler til downstream-effektorer og regulere genekspression, befolkningsniveau tilgange har manglet den præcision, der er nødvendig for yderligere at undersøge denne mulighed. Desuden begrænser disse tilgange undersøgelser af cellecelleinteraktioners rolle ved at udelukke evnen til at analyse af neuronal bestemmelses tilstand i mangel af cellecellekontakt. Derfor har vi etableret en eksperimentel arbejdsgang, der parrer time-lapse calcium imaging af dissociated neuronal explants med en fluorescens in situ hybridisering assay, så den utvetydige korrelation af calcium aktivitet mønster med molekylær fænotype på et enkeltcelleniveau. Vi var med succes i stand til at bruge denne tilgang til at skelne og karakterisere specifikke calcium aktivitetsmønstre forbundet med at differentiere neurale celler og neurale stamceller, henholdsvis; ud over dette, dog kunne de eksperimentelle rammer, der er beskrevet i denne artikel, let tilpasses for at undersøge sammenhænge mellem enhver tidsserie aktivitetsprofil og udtryk for et gen eller gener af interesse.
Introduction
Frit cytosolcalcium er afgørende for en række biologiske processer, lige fra celleproliferation og migration til apoptose og autofagi1,2,3. Inden for disse veje kan calcium udøve downstream-effekter på genekspression ved at interagere med calciumbindende domæner for at fremkalde kropsdannelsesændringer, der modulerer proteinaktivitet og interaktioner. For eksempel, en neuronal calcium sensor kendt som Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) holdes i en udfoldet mellemliggende kropsbygning, når bundet af calcium, forhindrer det i at interagere med sit protein og DNA mål4. Ud over at fungere som et simpelt signalmolekyle gør den dynamiske karakter af intracellulære calciumtransienter imidlertid disse aktivitetsmønstre til at indkode mere komplekse amplitude- eller frekvensbaserede signaler5,6. Nuklear omplantning af transskriptionsfaktoren for aktiverede T-celler (NFAT) forstærkes af højfrekvente calciumsvingninger, men hæmmes af lavfrekvente svingninger7. Overbevisende, seneste arbejde har antydet, at NFAT faktisk kan lydhøre over for kumulativcalcium eksponering8. Både calcineurin og Ca2+/calmodulin-afhængige protein kinase II (CaMKII) udviser også forskellige reaktioner på calciumtransienter af en bestemt frekvens, varighed eller amplitude9. For at tilføje en yderligere grad af lovgivningsmæssig kompleksitet tyder beregningsmodeller på , at mange calciumbindende proteiner i senere led bliver mere eller mindre frekvensafhængige som reaktion på tilstedeværelsen eller fraværet af bindende konkurrenter10,11.
Inden for det udviklende nervesystem, to hovedklasser af calcium aktivitet adfærd er blevet defineret og forbundet med specifikke biologiske processer. Calcium tilstrømning er klassificeret som "pigge", hvis de forekommer inden for de enkelte celler, nå en topintensitet på ~ 400% af baseline inden for fem sekunder, og udviser dobbelt eksponentiel henfald12. Denne type signal er primært forbundet med neurotransmitteren fænotype specifikation13. I modsætning hertil defineres "bølger" som langsommere, mindre ekstreme calciumtransienter, hvor en celles intracellulære calciumkoncentration stiger til ~ 200% af baseline over en periode på tredive sekunder eller mere, derefter henfalder over flere minutter12. Disse signaler ofte udbredes på tværs af flere tilstødende celler, og deres tilstedeværelse har været forbundet med nitrit udvækst og cellespredning14,15. Selv om disse to klasser er defineret på grundlag af karakteristiske kinetiske profiler, er det dog fortsat uklart, præcis hvilke karakteristika disse mønstre der rent faktisk påvises af celler og oversat af downstream-effektorer.
Forståelse af forholdet mellem intracellulære calciumsvingninger og genekspression ville give afgørende indsigt i en af de lovgivningsmæssige mekanismer, der sikrer en passende udvikling og mønstre af nervesystemet. Med henblik herpå har undersøgelser af den embryonale rygmarv vist, at øget calcium spike aktivitet under udvikling er forbundet med højere niveauer af hæmmende neuroner, mens nedsat calcium spike aktivitet er forbundet med højere niveauer af excitatoriske neuroner13. Disse befolkningsniveauanalyser er imidlertid ikke blevet brugt til at forbinde calciumaktivitet med genekspression på et encelleniveau.
Nærmer sig disse spørgsmål om niveauet for den enkelte celle giver flere forskellige fordele i forhold til tidligere arbejde. For det første gør evnen til at vurdere calciumaktivitet og genekspression i mange celler individuelt det fulde repertoire af forskellige aktivitetsmønstre, der skal observeres uden at blive korrumperet af en måling på bulkniveau. Derudover betyder undersøgelse af disse relationer i primærkultur med en celle, at celleautonome forbindelser mellem calciumaktivitet og genekspression vil blive opretholdt, mens interaktioner, der kræver cellecellekommunikation, vil blive ophævet. Derfor gør denne fremgangsmåde det muligt at studere disse celleautonome mekanismer isoleret. Men det giver også mulighed for den rolle, ikke-celle-autonome calcium aktivitet, der skal belyses og afhøres. For eksempel kan celler dissekeres fra et foster på neurale plade fase, dyrket indtil søskende kontrol nå neurale rør fase, og derefter sammenlignet med celler, der er blevet frisk dissekeret fra en neuralrør-trins embryo. Dette gør det muligt direkte sammenligning af celler, der har bevaret cellecellekommunikation på tværs af en vigtig udviklingsperiode, til dem, hvor cellecellekommunikationblev afskaffet.
I forsøget på at løse begrænsningerne i tidligere eksperimentelle tilgange, udviklede vi en protokol, der ville gøre det muligt at vurdere både calcium aktivitet og genekspression i individuelle neurale stamceller celler, lette sammenhængen mellem specifikke aktivitetsmønstre med efterfølgende differentiering programmer. Neurale væv blev dissekeret fra Xenopus laevis på forskellige stadier af neurale udvikling, dissocieret i enkelte celler, og afbildet via konfokal mikroskopi i overværelse af en fluorescerende calcium indikator. Efter levende cellebilleddannelse blev prøverne fastsat og analysen via fluorescens i situ-hybridisering (FISH) for at detektere ekspression af et gen eller isoform af interesse. Det er vigtigt, at de enkelte celler kan spores på tværs af begge billeddannelseseksperimenter, hvilket betyder, at en celles calciumaktivitetsprofil og dens genekspressionsniveau kan forbindes med hinanden (figur 1). Den protokol, der rapporteres her, har til formål at sonde relationer mellem calcium aktivitetsmønstre og genekspression på tværs af embryonale neuroudvikling i Xenopus laevis. Men den bredere eksperimentelle ramme (single-celle tid-kursus billeddannelse efterfulgt af FISH og billede coregistration) kan ændres og anvendes på stort set enhver celle type, fluorescerende reporter, og gen af interesse.
Protocol
Alt arbejde, der involverer dyr, blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på College of William and Mary.
1. Håndtering af dyrepleje og embryon
- Inducer naturlig parring ved at administrere en subkutan injektion af humant choriongonic gonadotropin (HCG) i rygsansen af voksne Xenopus laevis med en dosis på 600 U for kvinder og 400 U for mænd.
- Efter injektion, placere mindst én mandlig og en kvindelig frø i en stuetemperatur bedrift tank natten over. Æglægning begynder typisk 9-12 timer efter HCG administration.
- Indsamle embryoner. Dejelly ved forsigtigt at vaske med 2% cystein (pH 8,0) i 2-4 min.
- Skyl embryonerne 3x i 0,1 x Mark's Modified Ringer's solution (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH justeret til 7,4-7,6).
- Embryonerne overføres til 100 mm glaspetriskåle, der indeholder 0,1 x MMR og 50 μg/ml gentamycin. En massefylde på 50-100 embryoner pr. plade er passende.
- Inkuber opvasken ved 14 °C-22°C, og lad embryonerne udvikle sig, indtil de når det ønskede udviklingstrin.). Fjern periodisk ubefrugtede celler og nekrotiske eller unormalt udviklende embryoner med en plastoverførselspipette.
BEMÆRK: For at sikre konsistens udføres udviklingsiscenesættelse efter morfologiske kriterier defineret af Nieuwkoop og Faber16. Interessefaserne vil variere afhængigt af forsøgsfokus. For eksempel er vigtige neurodevelopmental landemærker forbundet med Stage 14 (udbrud af neurulation), Stage 18 (udbrud af neuralrør lukning), og Stage 22 (udbrud af tailbud forlængelse).
2. Embryodissektion og prøveforberedelse
- Løsningsforberedelse
- Forbered 2 mM Ca2+ opløsning indeholdende 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mM MgSO4og 4,6 mM Tris. For hver 100 ml opløsning tilsættes 1 ml penicillin/streptomycin (10.000 U/ml penicillin; 10.000 μg/ml streptomycin). Juster pH til 7,8 og filtersteriliser.
- Forbered calcium- og magnesiumfri (CMF) løsning ved at kombinere 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris og 0,4 mM EDTA. Juster pH til 7,8 og autoklave for at sterilisere. For hver 100 ml opløsning tilsættes 1 ml penicillin/streptomycin (10.000 U/ml penicillin; 10.000 μg/ml streptomycin). Juster pH til 7,8 og filtersteriliser.
- Fremstilling af plader til dissektion og billeddannelse
- UV-sterilisere to 35 mm plast Petri skålog en 35 mm Cell Culture Dish (se Tabel over materialer).
- Mens du arbejder i en laminar flow hætte, forberede to 50 ml plast koniske rør, der indeholder 10 ml 2 mM Ca2 + opløsning hver.
- Forbliver arbejder i laminar flow hætte og tilsæt 2 ml 2 mM Ca2 + opløsning til en 35 mm plast Petri skål, 2 ml 2 mM Ca2 + opløsning til en 35 mm Cell Culture Dish, og 2 ml CMF opløsning til en 35 mm plast Petri skål.
- Uden for laminarflowhætten fyldes to 100 mm plastpetriskåle og en 35 mm plastpetriskål med 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml). Fyld en 60 mm plast petriskål med 70% ethanol.
- Umiddelbart før dissektion tilsættes 0,01 g Collagenase B til et af de 50 ml rør, der indeholder Ca2+ opløsning. Bland godt og overfør opløsningen til en frisk 60 mm plast petriskål.
- Ved hjælp af et dissekeret mikroskop skal du identificere embryoner fra den ønskede udviklingsfase. Brug en steril overførselspipette til at overføre mindst seks egnede embryoner til en af de 100 mm plader, der indeholder 0,1 x MMR + gentamycin fremstillet i trin 2.2.4. Dette vil tjene som bedriftspladen.
- Brug en steril overførselspipette til at overføre et embryon til den anden 100 mm plade, der indeholder 0,1 x MMR + gentamycin. Dette vil tjene som dissektionplade.
- Hvis dissekere embryoner, der er gamle nok til at bevæge sig (ca. fase 23 eller ældre), bedøves hvert embryon før dissektion ved at overføre det til en skål, der indeholder 0,1% 3-aminobenzosyreethylester fortyndet i 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml). Når fosteret er immobiliseret, overføres det tilbage til skålen indeholdende 0,1 x MMR med gentamycin (50 μg/ml) og fortsætte med dissektion.
- Fjern forsigtigt den vitellinmembran, der omgiver fosteret. Dette kan lettest gøres ved hjælp af et par stumpe pincet til at stabilisere fosteret, mens du bruger et par fine pincet til at gribe membranen. Træk forsigtigt med de fine pincet for at skrælle vitellinmembranen fra hinanden.
- Brug fine pincet til at adskille embryomens dorsale og ventrale områder. Dette kan gøres ved at bruge pincet til at 'knibe' fosteret langs den bageste-bageste akse, skære det i halve. Med en steril overførselspipette overføres rygdelen til 60 mm pladen med kollagenopløsning fremstillet i trin 2.2.5. Udsmid ventraldelen.
- Lad dorsale explant at inkubere i kollagen opløsning i 1-2 min ved stuetemperatur. Overfør den forsigtigt tilbage til dissektionspladen.
- Fuldfør dissektion ved omhyggeligt at fjerne alle resterende endodermal og mesodermal forurening fra den formodede neurale væv i ektodermen. For embryoner på fase 22 eller ældre, neuralrøret bør også fjernes og kasseres.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt under dissektion, kan skålen af 70% ethanol fremstillet i trin 2.2.4 bruges til at rydde eller re-sterilisere pincet. - Når dissektionen er færdig, skal du forsigtigt overføre udskillelsen til den 35 mm pladeca. 2+ opløsning, der er fremstillet i trin 2.2.3.
- Gentag trin 2.4-2.9, indtil der er indsamlet fire explants.
- Brug en P1000 mikropipette til at overføre alle fire explants til 35 mm plade, der indeholder CMF-opløsning, og vær omhyggelig med at undgå enhver kontakt mellem explanterne og luftvandsgrænsefladen. Forsigtigt hvirvle fadet, så alle de explants klynge i midten af pladen.
- Inkubere 1 time ved stuetemperatur for at tillade explants at adskille.
BEMÆRK: For at hjælpe med dissociation kan 0,025% -0,01% trypsin føjes til CMF-løsningen. Dette kan være nødvendigt for effektiv dissociation af ældre embryoner (fase 22 og ældre). - På dette tidspunkt bør mindst to behørigt iscenesatte embryoner forblive på bedriftspladen. Overfør disse embryoner til en frisk skål fyldt med 0,1 x MMR med gentamycin fremstillet i trin 2.2.4 og lad dem udvikle sig uforstyrret med skålen dækket til at matche explant skålen. Disse embryoner vil tjene som søskende kontrol.
- Brug superlim til at fastgøre en mikrostyret dæksel (se Tabel over materialer)til bunden af 35 mm Cell Culture Dish udarbejdet i trin 2.2.3.
BEMÆRK: Placer små dabs af superlim omkring kanterne af dæksslip, og tryk den fast mod undersiden af Cell Culture Dish. Positionsmarkeringerne vil blive tilsløret overalt limen kontakter nettet, så det er vigtigt at holde den centrale gitterded del af dækstrækket fri for lim. - Når udstillingerne har dissociaret i 1 time, skal du bruge en P100 mikropipette til at overføre dem til Cell Culture Dish. For at plade så mange celler som muligt på gitterded del af skålen, holde pipetteret i en lavvandet vinkel tæt på overfladen af skålen, placere pipette spidsen i hjørnet af nettet vender indad, og fast udvise cellesuspension en del af gitteret ar ea. Ideelt set vil cellerne bosætte sig i en stram tæt klynge.
- Inkubere i 1 time ved stuetemperatur for at give cellerne mulighed for at klæbe til pladen. Bestem og registrere den udviklingsmæssige fase af søskende kontrol embryoner, når denne inkubation begynder.
- Kombiner 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (se Tabel over materialer)med 2 μL 10% pluronic F-127 syre.
BEMÆRK: Fluo-4 AM er lysfølsom og bør altid opbevares i et lyssikkert eller foliedækket rør. - Når inkubationen er færdig, skal du flytte prøveskålen til et mørkekammer eller et andet lysbeskyttet sted. Brug en mikropipette til at fjerne 100 μL opløsning fra kanten af skålen. Tilsæt denne opløsning til aliquoten af Fluo-4 AM/Pluronic F-127 syre, pipette op og ned for at blande, og returnere hele volumen til prøveskålen. Swirl forsigtigt at blande.
- Dæk pladen med aluminiumsfolie og lad det inkubere i 1 time ved stuetemperatur. Bestem og registrere den udviklingsmæssige fase af søskende kontrol embryoner, når denne inkubation begynder.
- I slutningen af inkubationen skal du bruge det resterende koniske rør på 2 mM Ca2+ til at udføre tre medievaske på følgende måde: 1) fjern 1 ml opløsning fra skålen, tilsæt 3 ml frisk opløsning, 2) fjern 3 ml opløsning fra fadet, tilsæt 3 ml frisk opløsning.
3. Calcium Billeddannelse
BEMÆRK: Calciumbilleddannelse blev udført ved hjælp af et omvendt konfokalmikroskop (Materialetabel).
- Anbring prøvepladen på mikroskopstadiet, og pas på at beskytte den mod eksponering for omgivende lys. Når pladen er fastgjort, skal du bruge en markør til at mærke pladens forreste punkt, så det samme synsfelt kan findes i efterfølgende billeddannelse.
- Find prøven under mikroskopet – først ved 10X og derefter ved 20X forstørrelse – og vælg et passende synsfelt til billedbehandling. Et ideelt synsfelt er celletæt, men ikke så tæt, at celler klumper sig sammen eller er svære at skelne individuelt.
- Juster mikroskopfokus, så den gitterstyrede dækslip er synlig. De tal, der er markeret på dæksslip, fungerer som entydige identifikatorer for bestemte gitterlocus og kan bruges til at finde det samme synsfelt for yderligere billedbehandling. Hvis det oprindeligt valgte synsfelt ikke overlapper med tal, skal du justere, indtil et identificerbart tal er inden for rammen.
- Tag et lysfeltbillede af det valgte synsfelt med den gitterstyrede coverslip i fokus.
- Juster fokusindstillingerne, og tag et lysfeltbillede af det markerede synsfelt med cellerne i fokus.
- Med cellelaget i fokus, belyse prøverne med en 488 nm laser. HV- og Offsetværdier kan optimeres for hvert eksperiment for at sikre, at der registreres et dynamisk område af fluorescens på FITC-kanalen.
- Hvis du vil have et billede på to timer, skal du ændre billedkonfigurationen for at optage 901 billeder med en scanningstid på 3,93 s og et interval på 8 s. Kør konfiguration for at hente billedet.
- Når billeddannelse er færdig, skal du fjerne pladen fra mikroskopscenen. Fjern 1 ml opløsning fra pladen og udskift den med 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA og 2 mM MgSO4 i 7,4% formaldehyd).
- Inkuber pladen i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Bestem og registrere den udviklingsmæssige fase af søskende kontrol embryoner, når denne inkubation begynder.
- Når fikseringen er fuldført, fjernes al opløsning fra pladen, og den udskiftes med 2 ml 1x PBS. Pladerne opbevares ved 4 °C til videre behandling.
4. Analyse af genudtryk: Sondesyntese
- Som beskrevet nedenfor, generere en antisense RNA sonde til in situ hybridisering. Derudover skal du generere en sansesonde for det samme gen til brug som negativ kontrol.
- For at rense plasmid DNA, der indeholder sonde skabelon sekvens, inokulere 150 ml LB bouillon med bakterielglycerol bestande, der indeholder skabelonen plasmid. Inkuber ved 37 °C med omrystning natten over, eller indtil kulturen er uklar.
- Purify plasmid DNA fra bakteriekulturen ved hjælp af din foretrukne metode.
BEMÆRK: Vi bruger McNary-Nagel midi-prep kit til at opnå høje udbytter af plasmid DNA. - For at bekræfte, at plasmid indeholder den forventede indsats, udføre en begrænsning fordøje og analysere produkterne på en agarose gel. Uncut plasmid kan også analyseres på en agarose gel for at kontrollere for genomisk DNA-forurening.
- For at linearisere skabelon-DNA'en skal der opstilles en 100 μL-begrænsningsfordøjereaktion, der indeholder 20 μg plasmid-DNA, 2 μL passende restriktionsenzym og 1x passende buffer. Inkuber ved 37 °C i mindst 2 timer.
- Ekstrakt lineariseret DNA ved at udføre en phenol/chloroform ekstraktion efterfulgt af en chloroform ekstraktion.
- Udfælde DNA med 100% ethanol. Dette kan gøres hurtigt ved at tilføje to mængder kold ethanol til prøven og inkubere den ved -80 °C, indtil den størkner (15-30 min).
- Brug en kølecentrifuge til at pelletDNA ved at dreje i 20 min ved 12.000 x g/4 °C.
- Fjern supernatantet, og pelleten vaskes med 200 μL ethanol. Drej i 5 min ved 12.000 x g/4 °C.
- Fjern den supernatant og lufttørre pellet i ca. 5 min. Ophæng i 20 μL af 1x TE og opbevares ved 4 °C indtil videre brug.
- For at syntetisere og rense antisense RNA-sonde skal der skabes en 2,5 mM rNTP-blanding ved at kombinere 15 μL 10 mM rCTP, 15 μL 10 mM rGTP, 15 μL 10 mM rATP, 9,75 μL 10 mM rUTP og 5,25 μL 10 mM dig-11 UTP (Se materialetabel).
- Der opstilles en 50 μL in vitro transskriptionsreaktion, der indeholder 4 μg lineariseret type DNA fra trin 4.2-4.10 15 μL 2,5 mM rNTP blandes fra trin 4.11, 10 μL 5x transskriptionsbuffer, 5 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL RNAse-hæmmer (20 U/μL) og 1,5 μL egnet RNA-polymerase (T3, T7 eller SP6). Inkuber 1 h ved 37 °C.
- Der tilsættes yderligere 1,5 μL RNA-polymerase til reaktionen og vende tilbage til 37 °C i en ekstra time.
- Der tilsættes 1 μL RQ1 DNAse til reaktion og inkuber ved 37 °C i 10 minutter for at forringe DNA-skabelonen.
- Der tilsættes 30 μL licl-opløsning på 7,5 m til prøven. Pipette til at blande og inkubere ved -20 °C i mindst 1 time.
- Ved hjælp af en kølecentrifuge drejes prøven 25 min ved 14.000 x g/4 °C.
- Fjern supernatantet, og pelletpelleten skylles med 500 μL ethanol. Drej i 5 min ved 14.000 x g/4 °C.
- Fjern den supernatant og lufttørre pellet i ca. 5 min. Resuspend i 20 μL nuklease-fri vand.
- Der på 10 x sondelager forarbejdes ved at fortynde prøven til en koncentration på 10 ng/μL i hybridiseringsbufferen (50 % formamid, 5x SSC (saltvandsnatriumcitrat; 750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7.0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardts opløsning, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA og 100 μg/ml heparin). Opbevares ved -20 °C indtil videre brug.
5. GenekspressionAnalyse: Fluorescens In Situ Hybridisering
BEMÆRK: Alle vasker skal udføres med ca. 1 ml opløsning ved hjælp af en steril, individuelt indpakket overførselspipette. Pipetten skal placeres på pladens kant, når der tages ud eller tilsættes opløsning, og vasker skal udføres så forsigtigt som muligt for at sikre, at cellerne ikke løsnes fra pladeoverfladen og går tabt.
- Fjern 1x PBS fra pladen (fra trin 3.10). Udskift med frisk 1x PBS og inkuber 5 min ved stuetemperatur.
- Kombiner 25 ml 0,1 M triethanolamin (pH 8.0) med 62,5 μL eddikesyreanhydrid. Bland godt. Pladen vaskes med denne opløsning i 10 minutter.
- Pladen vaskes med 1x SSC i 5 min.
- Pladen vaskes med 0,02 M HCl i 10 minutter for at gennemtrænge celler.
- Vask 2x med 1x PBS i 5 min hver.
- Fjern løsningen, og tilføj 1 ml hybridiseringsbuffer (50 % formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7.0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardts opløsning, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA og 100 μg/ml heparin) til plade. Inkuber med omrystning i mindst 6 timer ved 60 °C.
- Fjern hybridiseringsbufferen, og udskift med 750 μL 1x RNA-sondeopløsning (fortyndet form af 10x-lageret i trin 4.19. Sense RNA-sonder kan bruges som negativ kontrol.
- Inkuber med omrystning i 8-14 timer ved 60 °C.
- Sonden fjernes, og den opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: 1x sondefortynding kan genbruges op til tre gange, før den kasseres. - Skyl pladen med 0,2 x SSC.
- Vask med frisk 0,2 x SSC i 1 time ved 60 °C.
- Flyt pladerne til stuetemperatur og ligevægt i 5 min.
- Pladen vaskes med 0,2 x SSC i 5 min.
- Pladen vaskes med 1x PBT i 15 min.
- Pladen vaskes med 2% H2O2 i 1x PBT (0,1% Triton-x-100) i 1 time.
BEMÆRK: Denne løsning er lysfølsom, så den skal være frisk for hvert eksperiment og afskærmet mod lys. Plader ne skal også beskyttes mod lys eller folieres under denne inkubation. - Pladen vaskes med 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) i 15 min.
- Fortyndes blokering reagens til 2% i malesyre buffer (100 mM malesyre, 150 mM NaCl, pH 7,5). Bloker cellerne i denne blanding i mindst 1 time ved stuetemperatur.
- Udskift blokeringsopløsning med anti-digoxygenin-POD antistof fortyndet 1:1,000 i 2% blokering reagens i malesyre buffer. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Skyl pladen 3x med 1x TBST.
- Vask 4x med 2mL 1x TBST i mindst 15 min per vask med kontinuerlig vuggening.
- Vask 2x med 1x PBT i mindst 10 min per vask med kontinuerlig vuggening.
- Fortyndecy3-konjugeret tyramid 1:25 i 1x PBT. Pladen vaskes med 750 μL af denne fortynding i 5 min.
BEMÆRK: Denne opløsning er ekstremt lysfølsom, og plader skal holdes forpurret eller afskærmet fra lys i resten af forsøget for at undgå signalforringelse. - Der tilsættes 2,5 μL på 0,3% H2O2 til denne opløsning og inkuberes med kontinuerlig rokkende i yderligere 40 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 4x med 1x TBST i mindst 15 min per vask med kontinuerlig vuggening.
- Skyl med 1x PBT.
- Fastgør cellerne ved at inkubere i 1 time ved stuetemperatur i 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA og 1 mM MgSO4 i 3,7% formaldehyd).
- Fjern opløsningen og udskift med 1x PBS. Pladerne opbevares i en folieret beholder ved 4 °C indtil videre behandling.
6. Billeddannelseceller
BEMÆRK: Billeddannelse blev udført ved hjælp af et omvendt konfokalmikroskop.
- Anbring prøvepladen på mikroskopscenen, og mærket justeres i trin 3.1 til forsiden af scenen.
- Fokuser billedet, så den gitterforede dæksel er synlig, og juster det synsfelt, der passer til det synsfelt, der er taget i calciumbilledet (afsnit 3), ved hjælp af gitterbilledet taget i trin 3.4 som reference, for at matche det synsfelt, der er taget i calciumbilledet (afsnit 3).
- Anskaf billeder i det lyse felt af både gitteret og cellerne.
- Belyse prøverne med en 595 nm TRITC laser. Juster forstærkningsværdier for at skelne signal fra baggrund på passende vis ved hjælp af billederne fra de negative kontrolceller og hente et stillbillede.
BEMÆRK: Ideelt set bestemmes baggrundsfluorescensniveauer baseret på en negativ kontrolplade, der behandles parallelt med en ikke-målrettet sansRNA-sonde. Forstærkningsindstillinger justeres, så denne plade fremstår helt sort (svarende til baggrundsniveauer), og derefter holdes konstant for andre plader, der er afbildet fra det eksperimentelle parti.
7. Databehandling
BEMÆRK: Databehandling blev udført ved hjælp af Nikon Elements software.
- Åbn calciumbilledet på 2 timer fra trin 3.7. Identificer de pixel, der svarer til hver enkelt celle, ved at markere Binær > Spotregistrering > Lyse pletter. Sørg for, at FITC-kanalen er valgt.
- Farvede cirkler vises over de enkelte celler, efter at dette lag er blevet genereret. Juster cellefordelings- og størrelsesparametrene, så så mange celler som muligt genkendes og knyttes til et entydigt id.
- Spor cellerne på tværs af alle billeder ved at navigere til Vis > Analysekontrolelementer > Sporingsindstillinger. Angiv 5 rammer som den maksimale afstand mellem spor, slet objekter, der er knyttet til færre end 600 rammer, og vælg indstillingen Luk mellemrum. Vælg Spor binære filer for at anvende cellesporing på billedet.
- Når cellerne er blevet sporet, skal du slette ethvert objekt manuelt, der ikke svarer til en enkelt celle (f.eks. en klump celler). Datapunkter bør dog ikke udelukkes fra yderligere analyser baseret på morfologien af calciumaktivitetssporingen.
- Vælg Vis overlejring > Vis binært objekt-idi ruden Billede . Rul til slutningen af billedet (Ramme 901), og vælg Rediger > Opret vissnapshot (8bit RGB)> Aktuel ramme > OK. Dette vil skabe et øjebliksbillede af den sidste ramme i billedet med hver celles tilknyttede binære id synlig. Gem dette billede.
- Eksporter tidsseriedata ved at markere alle objekter efterfulgt af Eksporter data til Excel. Gem output som en CSV-fil.
- Åbn FISH-billedet. Optimer pletregistrering som i trin 7.1-7.2 ved hjælp af TRITC-kanalen i stedet for FITC-kanalen. Slet eventuelle forkert tildelte binære filer manuelt, og vælg derefter Automatiserede måleresultater > Opdater måling for at beregne signalintensiteten for hver celle. Eksporter et snapshot af billeder og datatabellen ved at gentage trin 7.5 og 7.6.
- Opret et regneark, hvor kolonne A er mærket BINÆRT FISK-id, og kolonne B er mærket Calciumbinary-id. Åbn de billeder, der eksporteres i trin 7.5 og 7.7. For hvert objekt, der er identificeret i FISH-billedet (trin 7.7), skal du registrere det binære id i kolonne A. Find derefter den tilsvarende celle i calciumbilledet (trin 7.5) og registrerer det binære id i kolonne B. Celler, der ikke kan identificeres med sikkerhed i begge billeder, bør ikke føjes til regnearket.
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at bruge et fotoredigeringsprogram som Adobe Photoshop eller GIMP billededitor til at åbne begge billeder, gøre en semi-gennemsigtig, og overlejre det på sin partner billede til lettere at identificere og forbinde de to binære id'er forbundet med hver celle. - For hver identificeret celle, sammenskoling (enten manuelt eller med et script) sine tid-serie calcium data (forbundet med Calcium Binary ID og eksporteres i trin 7.6) og dens genekspression data (forbundet med FISH Binary ID og eksporteret i trin 7.7).
BEMÆRK: Downstream databehandling og analyse kan indebære indsamling af disse data i en enkelt datatabel og anvendelse af en række analytiske teknikker, herunder spike counting, fraktal analyse, og Markovian entropi , der gør det muligt for investigator at skelne nye mønstre af calcium aktivitet 17,18.
Representative Results
Et vellykket eksempel på adskilte celler, der er forberedt til calciumbilleddannelse, kan ses i figur 2A. Celler er tæt belagt, så den maksimale mængde oplysninger, der skal indsamles fra hvert billede, men ikke så tæt belagt, at de enkelte celler ikke kan være trygt skelnes danne hinanden. Fluorescens registreres for hver defineret celle i løbet af 2 timers billeddannelsesperioden. Visualisering af et sammensat plot, der indeholder spor for alle celler, der er registreret i et eksperiment, afslører, i hvor høj grad masse- eller populationsmålinger kan skjule mere nuancerede mønstre af spikingadfærd (figur 2B). Når de registrerede profiler af de enkelte celler er isoleret, eksempler på den uregelmæssige spiking aktivitet karakteristisk for neurale sogenitor celler kan tydeligt identificeres. I modsætning til modne neuroner udviser embryonale neuronceller uregelmæssig, meget varierende og kompleks karakter af calciumaktivitet (figur 2B). For at kvantificere denne kompleksitet er der anvendt forskellige dataanalysemetoder17,18, herunder forskellige parametre til at definere en stigning (figur 2C).
Vellykket fluorescens in situ hybridisering, herunder vellykket design og syntese af en antisense mRNA sonde, kan vurderes ved at sammenligne forsøgspladen med en baggrundskontrol inkuberet med en ikke-bindende forstand RNA kontrol (Figur 3A,B). En positiv sonde kontrol kan også udføres ved at behandle en celle type kendt for at udtrykke målet mRNA på påviselige niveauer.
Identifikation af den samme celle på tværs af calcium og FISK billeddannelse kræver, at cellerne bevarer nogenlunde samme position under sonde hybridisering og forarbejdning. Hvis pladerhåndteres groft eller vasker udføres for kraftigt, kan cellerne løsnes fra pladeoverfladen og enten gå tabt, når opløsningen kasseres eller deponeres på et andet sted på pladen, hvilket gør det umuligt for dem at blive matchet på tværs af billeder (figur 4A). Hvis denne afbrydelse kun påvirker nogle af cellerne i synsfeltet, kan det stadig være muligt at registrere og tildele nogle celler i billedet (figur 4B). Den maksimale mængde data hentes dog ved et eksperiment, hvor FISH udføres omhyggeligt, og kun få celler går tabt eller flyttes mellem billeder (figur 4C).
Når der er indsamlet data til beskrivelse af både calciumaktiviteten og genekspressionen af et rimeligt antal celler i det eller de udviklingsmæssige faser af interesse, kan der foretages yderligere analyser for at vurdere sammenhængen mellem disse to egenskaber (figur 1). Der er anvendt en række målinger til kvantificering af calciumaktivitetsmønstre, herunder spikecounting/frekvens, gennemsnitlig effekt, Hurst eksponent skøn og Markovian entropimåling17,18. Genekspression kan defineres kvantitativt ved absolut fluorescensniveau eller sorteres på en binær (ja/nej) skala, afhængigt af de eksperimentelle spørgsmål, der behandles.
Resultater fra eksperimenter, der samler calciumaktivitet med ekspressionaf neurale sogenitormarkørgener, afslørede talrige sammenhænge mellem specifikke mønstre af calciumaktivitet og neurotransmitterende fænotyper. På neurale plade fase (Stage 14), GABAergic celler udtrykke hæmmende neuron markør gad1.1 udstille calcium aktivitet, der er mere regelmæssig og højere amplitude end celler, der mangler gad1.1 udtryk (Figur 5A). Desuden, mens disse gad1.1-udtrykkeceller er forbundet med højere niveauer af høj amplitude spiking, lav amplitude spiking er hyppigere i glutamatergic celler udtrykke excitatoriske neuron markør slc17a7.
Figur 1: Skemaaf eksperimentel arbejdsgang. Skalastang = 100 μm. Billeder i paneler 3-5 blev taget fra Paudel et al. (2019)17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Calciumbilleddannelse og eksempel aktivitetsprofiler. (A) Intracellulær calcium aktivitet som rapporteret af Fluo4-AM. Hvert 2 h billede består af 901 billeder, med en repræsentativ ramme show her. (B) Sammensat farvestofaffluorescensintensitet over tid i alle celler inden for det afbildede synsfelt. Sporene viser tydeligt fotoblegning af indikatorfarvestof (Fluo4) overarbejde. Raster plot på øverste venstre viser repræsentative spor af calcium aktivitet efter anvendelse af en de-trending algoritme udviklet af Eilers og Boelen19, hvor celler vist her udviser forskellige mønster af spiking adfærd. C) Anvendelse af forskellige tærskler (150 % og 200 % af basisbaseline, hvor basislinjen er gennemsnittet af den aftrendende fluorescerende intensitet) til at definere en spids (grønne og blå pile). Skalastang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: FISKEbilleddannelse. (A) FISH udført med en ikke-bindende sansRNA-sonde som negativ kontrol. Billeddannelsesindstillinger er blevet justeret, så ingen celler fremstår fluorescerende. Nogle synsfelter kan omfatte ikke-celleaffald med noget fluorescens, f.eks. disse kan ignoreres med henblik på baggrundsindstilling. (B) De samme billeddannelsesindstillinger bruges derefter til at afbilde en eksperimentel plade (antisense RNA-sonde). Fluorescens under disse forhold svarer til genekspression over baggrunden. Skalastang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Billedoverlejring og samregistrering. Skematiske gengivelser af en prøve afbildet til calciumaktivitet (celler repræsenteret af fyldte grønne cirkler) og efter FISH (celler repræsenteret af skyggefulde røde cirkler). (A) Celler, der har bevæget sig betydeligt under prøvehåndtering og -behandling, kan ikke identificeres pålideligt på tværs af de to billeder. (B) Celleforstyrrelser kan kun påvirke nogle celler i synsfeltet. Nogle celler kan tydeligt identificeres i begge billeder, mens andre ikke kan matches trygt. (C) Hvis prøverne håndteres omhyggeligt, vil de fleste celler forblive uforstyrrede og kan identificeres i begge billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Et eksempel på anvendelse af denne metode, boxplots viser sammenhænge mellem calcium aktivitet og genekspression (GABA og Glut for gener gad1.1 og slc17a7 henholdsvis) i neurale plade fase Xenopus laevis. I fase 14 udviser gad1,1-postive celler (GABA) højere amplitude og mere regelmæssig calciumaktivitet som defineret af (A) Markovian entropy18 og(B)spike counts ved hjælp af tærskler 125%, 150%, 200% og 300% af gennemsnittet af den aftrendede fluorescerende intensitet (baseline)17 end slc17a7 positive celler (Glut). Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle i henhold til både Bonferroni-korrigeret to-prøve Kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) og Cohen's d statistik for effekt størrelse (n = 5 kulturer og >100 celler; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Tallet blev gentegnet og tilpasset fra datasæt fra Paudel et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Karakteristiske mønstre af calcium aktivitet er blevet observeret i de celler, der udgør det udviklende nervesystem, med specifikke typer af aktivitet forbundet med forskellige neurodevelopmental processer. En yderligere forståelse af de mekanismer, hvorved disse informationskompakte aktivitetsmønstre omsættes til transskriptionelle svar, kræver imidlertid, at oplysninger om calciumaktivitet og genekspression indsamles med encellede opløsning. Mens systemer, der udviser mere stereotype calcium aktivitet, såsom modne neuroner, kan med rimelighed analyse på bulk niveau, de uregelmæssige mønstre, der karakteriserer fosternervesystemet er let maskeret af mindre præcise optagelser.
De eksperimentelle rammer, der er fastlagt i denne protokol, kan let tilpasses en lang række forskellige celletyper og fluorescerende journalister. Væv, der indeholder stort set enhver celletype eller kombination af celletyper, kan dissekeres fra en modelorganisme af interesse og afforgyldt til encellede billeddannelse. Ud over at tillade celleidentifikation og isolere effekten af celleautonome processer gør en primær cellekulturtilgang det muligt for eksperimentatoren at definere mediekomponenter som ønsket. For eksempel er der udført forsøg, der sammenligner aktiviteten af neuronale prækursorer i 2 mM Ca2+ opløsning for at undersøge, om forholdet mellem spike frekvens og neurotransmitter fænotype i fosterrygmarven kan opsummeres uden indflydelse af cellecelle interaktioner13,20.
Mens denne protokol udnytter fluorescerende markør Fluo4-AM til at opdage intracellulære calcium aktivitet, afhængigt af udvælgelseskriterierne, brugere kan vælge andre kommercielt tilgængelige markører21, herunder genetisk kodet calcium indikatorer. På samme måde kan alternative markører bruges til at overvåge dynamiske ændringer i koncentrationen af en ion af interesse (herunder K+, Na+, og Zn2 +),membran potentiale, eller cellulære pH. Billedindstillinger og billedvarighed kan ændres efter behov.
Selv om vi korreleret calcium aktivitet og neuronal fænotype som en specifik anvendelse, denne metode gælder også for en række andre cellulære egenskaber. For eksempel kan fluorescens in situ hybridisering udføres med sonder mod ethvert gen af interesse, herunder neuronal markør ChAT eller transskription faktor Engrailed, så følsomme påvisning af en tilpasselig panel af mRNA arter. Disse sonder kan designes til at være isoform-specifikke, støtte yderligere mål specificitet, hvis det ønskes. Dobbelt FISK kan udføres ved hjælp af sonder konjugeret til flere to forskellige fluorophores, så den samtidige vurdering af udtrykket af flere gener. Men de ekstra vasker, der kræves af denne type eksperiment er forbundet med en øget chance for celletab eller bevægelse og kræver erfaring og delikatesse, der skal udføres med succes.
Uanset eventuelle eksperimentspecifikke ændringer af denne protokol er der flere vigtige trin, der kræver omhyggelig opmærksomhed. Dissektioner bør udføres med omhu for at fjerne alle forurenende væv eller cellepopulationer; fordi rumlige mønstre går tabt, når explants er adskilt, vil eventuelle resterende celler fra tilstødende væv blive afbrudt med og umulig at skelne fra cellerne af interesse. Når cellerne er belagt, skal prøverne håndteres så forsigtigt som muligt for at forhindre, at celler løsnes. Vigtigst af alt betyder det, at alle opløsningsændringer skal udføres langsomt og omhyggeligt, med pipetten placeret på kanten af pladen, når opløsningen fjernes og tilsættes. Dette vil sikre, at celler kan identificeres trygt i både calcium- og FISH-billeder. Hvis celler afbrydes under behandlingen, kan det være umuligt at identificere nogle eller alle de tilsvarende celler mellem de to billeder. Vi anbefaler at være forsigtig med disse opgaver, således at kun entydigt tilsvarende celler bruges til yderligere analyse.
Afhængigt af det biologiske spørgsmål, der behandles, kan det være hensigtsmæssigt at foretage en række forskellige analysemetoder. Calciumaktivitet i timeserien kan behandles og kvantificeres på mange forskellige måder med eksperimentatorfleksibilitet i valget af af-trendparametre, analysemålinger og analyseparametre (f.eks. den % af referencetærsklen, der anvendes til at definere en calciumspike). Korrelationer mellem calciumaktivitet og genekspressionsniveau kan tegnes ved at analysere genekspression som en absolut eller relativ fluorescensværdi udvundet af FISH-billedet. Alternativt kan der tegnes sammenhænge mellem calciumaktivitet og genekspressifikator (tilstedeværelse/fravær) ved at definere en fluorescenstærskel for positivt genekspressionssignal og tildele "ja" eller nej-identifikatorer til individuelle celler. Som helhed giver dette eksperimentelle skema en utrolig fleksibel pipeline til indsamling og indledende analyse af data i timeserien i forbindelse med cellematchede genekspressionsdata. Sådanne eksperimenter vil være afgørende for bedre at forstå de komplekse relationer mellem cellulære dynamik og transskriptionelle ændringer, som eksemplificeret ved identifikation af calcium aktivitet mønstre karakteristisk for hæmmende-fated og excitatoriske-fated neuronal prækursorer i embryonale Xenopus laevis.
Disclosures
Der er ikke angivet interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Wendy Herbst og Lindsay Schleifer for deres bidrag til udviklingen af disse protokoller. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 og 1R15HD096415-01) til MSS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Animal Husbandry & Cell Culture | |||
| CHORULON (chorionic gonodotropin) | Merck Animal Health | ||
| Gentamycin sulfate salt | Millipore Sigma | G1264 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
| Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521 | |
| Collagenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Dumont #55 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
| For Calcium Imaging | |||
| Fluo-4, AM, cell permeant | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
| For RNA Probe Generation | |||
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| rATP | Promega | P1132 | |
| rCTP | Promega | P1142 | |
| rGTP | Promega | P1152 | |
| rUTP | Promega | P1162 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
| Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
| T3 RNA Polymerase | Promega | P2083 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| RQ1 Rnase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| LiCl Precipitation Solution (7.5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
| For Fluorescence In Situ Hybridization | |||
| Acetic Anhydride | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
| Blocking Reagent | Millipore Sigma | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Millipore Sigma | 11207733910 | |
| Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
| Solution Components | |||
| Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
| Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | C3306 | |
| CHAPS hydrate | Millipore Sigma | C3023 | |
| Denhardt's Solution (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Millipore Sigma | E3889 | |
| Formamide (Deionized) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
| Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Millipore Sigma | H3393 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore Sigma | H1109 | |
| L-Cysteine | Millipore Sigma | 168149 | |
| Magnesium chloride, pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
| Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous | Fisher Scientific | AC413480050 | |
| Maleic Acid, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
| MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX | Millipore Sigma | R3629 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S7653 | |
| Triethanolamine | Millipore Sigma | 90279 | |
| Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
| Equipment | |||
| Laminar Flow Hood | model of choice | ||
| Dissecting Microscope | model of choice | ||
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | TE200 | |
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Shaking Incubator | model of choice | ||
| Refrigerated Centrifuge | model of choice | ||
| Miscellaneous | |||
| Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity | Millipore Sigma | CLS430769 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
References
- Humeau, J., et al. Calcium signaling and cell cycle: Progression or death. Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).
- Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration. PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).
- Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).
- Pham, K., et al. Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator. Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).
- Smedler, E., Uhlén, P.
- Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development. Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).
- Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).
- Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load. Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).
- Li, L., Stefan, M. I. Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII. PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).
- Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).
- Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).
- Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation. Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).
- Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).
- Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation. Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).
- Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex. Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).
- Nieuewkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
- Paudel, S., et al. Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner. International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).
- Marken, J. P., et al. A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series. PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).
- Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing. Leiden University Medical Centre Report. , (2005).
- Guemez-Gamboa, A., et al. Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching. Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).
- Paredes, R., Madelaine,, et al.
