Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Summary

Nous présentons un protocole en deux parties qui combine l’imagerie fluorescente de calcium avec l’hybridation in situ, permettant à l’expérimentateur de corréler des modèles de l’activité de calcium avec des profils d’expression de gène sur un niveau unicellulaire.

Abstract

L’activité intracellulaire spontanée de calcium peut être observée dans une série de types de cellules et est proposée pour jouer des rôles critiques dans une série de processus physiologiques. En particulier, la régulation appropriée des modèles d’activité de calcium pendant l’embryogenèse est nécessaire pour beaucoup d’aspects du développement neural vertébré, y compris la fermeture appropriée de tube neural, la synaptogenesis, et la spécification de phénotype de neurotransmetteur. Bien que l’observation selon laquelle les modèles d’activité calcique peuvent différer à la fois en fréquence et en amplitude suggère un mécanisme convaincant par lequel ces flux pourraient transmettre des signaux codés aux effecteurs en aval et réguler l’expression des gènes, les approches au niveau de la population n’ont pas eu la précision nécessaire pour explorer davantage cette possibilité. En outre, ces approches limitent les études sur le rôle des interactions cellules-cellules en empêchant la capacité d’essayer l’état de détermination neuronale en l’absence de contact cellule-cellule. Par conséquent, nous avons établi un flux de travail expérimental qui associe l’imagerie calcique en accéléré d’explants neuronaux dissociés avec un test d’hybridation in situ de fluorescence, permettant la corrélation sans ambiguïté du modèle d’activité de calcium avec le moléculaire phénotype au niveau d’une seule cellule. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour distinguer et caractériser les modèles spécifiques d’activité de calcium liés à différencier des cellules neurales et des cellules progénitrices neurales, respectivement ; au-delà de cela, cependant, le cadre expérimental décrit dans cet article pourrait être facilement adapté pour étudier les corrélations entre n’importe quel profil d’activité de série temporelle et l’expression d’un gène ou de gènes d’intérêt.

Introduction

Le calcium cytosolique gratuit est essentiel à une variété de processus biologiques, allant de la prolifération cellulaire et la migration à l’apoptose et l’autophagie^1,2^,3. Dans ces voies, le calcium peut exercer des effets en aval sur l’expression des gènes en interagissant avec les domaines liant le calcium pour induire des changements conformationnels qui modulent l’activité et les interactions des protéines. Par exemple, un capteur neuronal de calcium connu sous le nom de Modulateur antagoniste de l’élément régulateur en aval (DREAM) est maintenu dans une conformation intermédiaire dépliée lorsqu’il est lié par le calcium, l’empêchant d’interagir avec ses cibles protéiques et d’ADN⁴. Au-delà de servir de simple molécule de signalisation, cependant, la nature dynamique des transitoires intracellulaires de calcium permet à ces modèles d’activité d’encoder des signaux plus complexes basés sur l’amplitude ou la fréquence^5,6. La translocation nucléaire du facteur de transcription du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) est améliorée par des oscillations de calcium à haute fréquence, mais inhibée par des oscillations à basse fréquence⁷. De façon convaincante, des travaux récents ont suggéré que nFAT peut effectivement répondre à l’exposition cumulative de calcium⁸. La calcineurine et la protéine kinase II (CaMKII) dépendante de la calcineetine Ca²et de la protéine calmoduline II (CaMKII) présentent également des réponses distinctes aux transitoires de calcium d’une fréquence, d’une durée ou d’une amplitude spécifiques⁹. Pour ajouter un niveau supplémentaire de complexité réglementaire, les modèles de calcul suggèrent que de nombreuses protéines en aval de calcium-liaison deviennent plus ou moins dépendantes de la fréquence en réponse à la présence ou à l’absence de concurrents contraignants^10,11.

Dans le système nerveux en développement, deux classes principales de comportements d’activité de calcium ont été définies et associées à des processus biologiques spécifiques. Les afflux de calcium sont classés comme des « pics » s’ils se produisent dans des cellules individuelles, atteignent une intensité maximale de 400 % de la ligne de base en cinq secondes et présentent une double décomposition exponentielle¹². Ce type de signal est associé principalement à la spécification de phénotype de neurotransmetteur¹³. En revanche, les « ondes » sont définies comme des transitoires de calcium plus lents et moins extrêmes dans lesquels la concentration intracellulaire de calcium d’une cellule s’élève à 200 % de la ligne de base sur une période de trente secondes ou plus, puis se désintègre sur plusieurs minutes¹². Ces signaux se propagent souvent à travers plusieurs cellules voisines, et leur présence a été associée à la prolifération neurite et à la prolifération cellulaire^14,15. Cependant, bien que ces deux classes aient été définies en fonction de profils cinétiques caractéristiques, on ne sait pas exactement quelles caractéristiques de ces modèles sont réellement détectées par les cellules et traduites par les effecteurs en aval.

Comprendre la relation entre les oscillations intracellulaires de calcium et l’expression de gène fournirait un aperçu crucial dans un des mécanismes régulateurs qui assure le développement approprié et le modèle du système nerveux. À cette fin, les études de la moelle épinière embryonnaire ont démontré que l’augmentation de l’activité de pic de calcium pendant le développement est associée à des niveaux plus élevés de neurones inhibiteurs, tandis que l’activité diminuée de pic de calcium est associée à des niveaux plus élevés de neurones excitateurs¹³. Cependant, ces tests au niveau de la population n’ont pas été utilisés pour associer l’activité du calcium à l’expression des gènes à un niveau unicellulaire.

L’approche de ces questions au niveau de la cellule unique offre plusieurs avantages distincts par rapport aux travaux antérieurs. D’une part, la capacité d’évaluer l’activité du calcium et l’expression des gènes dans de nombreuses cellules individuellement permet d’observer le répertoire complet des modèles d’activité distincts sans être obscurci par une mesure en vrac. En outre, l’étude de ces relations dans la culture primaire unicellulaire signifie que les liens cellulaires autonomes entre l’activité du calcium et l’expression des gènes seront maintenus, tandis que les interactions nécessitant une communication cellule-cellule seront abrogées. Par conséquent, cette approche permet d’étudier ces mécanismes cellulaires autonomes isolément. Cependant, il permet également d’élucider et d’interroger le rôle de l’activité calcique non autonome. Par exemple, les cellules peuvent être disséquées à partir d’un embryon au stade de la plaque neurale, cultivées jusqu’à ce que les témoins de la fratrie atteignent le stade du tube neural, puis comparées aux cellules qui ont été fraîchement disséquées à partir d’un embryon de phase du tube neural. Ceci permet la comparaison directe des cellules qui ont maintenu la communication de cellule-cellule à travers une période développementale principale à ceux dans lesquels la communication de cellule-cellule a été supprimée.

En cherchant à aborder les limites des approches expérimentales précédentes, nous avons développé un protocole qui permettrait l’évaluation de l’activité calcique et de l’expression génique dans les cellules progénitrices neuronales individuelles, facilitant la corrélation des modèles d’activité spécifiques avec les programmes de différenciation ultérieurs. Le tissu neural a été disséqué des laevis de Xenopus à divers stades du développement neural, dissocié en cellules simples, et imaged par microscopie confocale en présence d’un indicateur fluorescent de calcium. Après l’imagerie à cellules vivantes, des échantillons ont été fixés et analysés par hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour détecter l’expression d’un gène ou d’un isoforme d’intérêt. Il est important de noter que les cellules individuelles peuvent être suivies dans les deux expériences d’imagerie, ce qui signifie que le profil d’activité calcique d’une cellule et son niveau d’expression génique peuvent être associés les uns aux autres(figure 1). Le protocole rapporté ici est destiné à sonder les relations entre les modèles d’activité du calcium et l’expression des gènes à travers le neurodéveloppement embryonnaire dans Xenopus laevis. Cependant, le cadre expérimental plus large (imagerie temporelle à cellule unique suivie de FISH et de coenregistrement d’image) peut être modifié et appliqué à pratiquement n’importe quel type de cellule, journaliste fluorescent et gène d’intérêt.

Protocol

Tous les travaux impliquant des animaux ont été exécutés conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Collège De William et Mary.

1. Soins aux animaux et manipulation d’embryons

1. Induire l’accouplement naturel en administrant une injection sous-cutanée de gonadotropine chorionique humaine (HCG) dans le sac lymphatique dorsal de Xenopus laevis adulte à une dose de 600 U pour les femelles et 400 U pour les mâles.
2. Après l’injection, placez au moins un mâle et une grenouille femelle dans un réservoir de retenue à température ambiante pendant la nuit. La ponte commence généralement de 9 à 12 h après l’administration de HCG.
3. Recueillir des embryons. Dégelée en lavant doucement avec 2% de cystéine (pH 8.0) pendant 2-4 min.
4. Rincer les embryons 3x dans la solution de 0.1x Mark’s Modified Ringer (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH ajusté à 7,4 à 7,6).
5. Transférer les embryons dans des boîtes Petri en verre de 100 mm contenant 0,1 x MMR et 50 g/mL de gentamycine. Une densité de 50-100 embryons par plaque est appropriée.
6. Incuber les plats à 14 oC et 22 oC et permettre aux embryons de se développer jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité. Enlevez périodiquement les cellules non fertilisées et les embryons nécrotiques ou anormalement en développement avec une pipette de transfert en plastique.
   REMARQUE : Pour assurer la cohérence, la mise en scène du développement est réalisée selon des critères morphologiques définis par Nieuwkoop et Faber¹⁶. Les stades d’intérêt varieront en fonction de l’accent expérimental. Par exemple, les principaux repères neurodéveloppementaux sont associés à l’étape 14 (début de la neurulation), à l’étape 18 (début de la fermeture du tube neural) et à l’étape 22 (début de l’allongement du tailbud).

2. Dissection d’embryon et préparation d’échantillon

1. Préparation de la solution
   1. Préparer une solution de 2 mM Ca^2M contenant 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl₂x 2H₂O, 1,31 mM MgSO₄et 4,6 mM Tris. Pour chaque solution de 100 ml, ajouter 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline; 10 000 g/mL de streptomycine). Ajuster le pH à 7,8 et filtrer-stériliser.
   2. Préparer une solution sans calcium et magnésium (CMF) en combinant 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris et 0,4 mM EDTA. Ajuster le pH à 7,8 et l’autoclave pour stériliser. Pour chaque solution de 100 ml, ajouter 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline; 10 000 g/mL de streptomycine). Ajuster le pH à 7,8 et filtrer-stériliser.
2. Préparation des plaques pour la dissection et l’imagerie
   1. Stérilisez les UV deux boîtes Petri en plastique de 35 mm et un plat de culture cellulaire de 35 mm (voir Tableau des matériaux).
   2. Tout en travaillant dans une hotte à débit laminaire, préparer deux tubes coniques en plastique de 50 ml contenant 10 ml de solution De 2 mM Ca^{2 chacun.}
   3. Restez en état de travailler dans le capot à débit laminaire et ajoutez 2 ml de solution Ca^{2 à} un plat Petri en plastique de 35 mm, 2 ml de solution Ca^{2 à} un plat de culture cellulaire de 35 mm et 2 mL de solution CMF à un plat Petri en plastique de 35 mm.
   4. À l’extérieur du capot à débit laminaire, remplissez deux boîtes Petri en plastique de 100 mm et un plat Petri en plastique de 35 mm avec 0,1 x MMR avec de la gentamycine (50 g/mL). Remplir un plat Petri en plastique de 60 mm avec 70 % d’éthanol.
   5. Immédiatement avant la dissection, ajouter 0,01 g de Collagène B à l’un des tubes de 50 ml contenant la solution Ca^2. Bien mélanger et transférer la solution dans un plat Petri en plastique frais de 60 mm.
3. À l’aide d’un microscope disséquant, identifiez les embryons du stade de développement souhaité. Utilisez une pipette de transfert stérile pour transférer au moins six embryons appropriés dans l’une des plaques de 100 mm contenant 0,1x ROR et la gentamycine préparées à l’étape 2.2.4. Cela servira de plaque de retenue.
4. Utilisez une pipette de transfert stérile pour transférer un embryon dans la deuxième plaque de 100 mm contenant 0,1x ROR et la gentamycine. Cela servira de plaque de dissection.
   1. Si vous disséquez des embryons assez âgés pour se déplacer (environ 23 ou plus), anesthésiez chaque embryon avant la dissection en le transférant dans un plat contenant 0,1 % d’estreur éthylique acide 3-aminobenzoïque dilué en 0,1x MMR avec de la gentamycine (50 g/mL). Une fois l’embryon immobilisé, transférez-le dans le plat contenant 0,1x ROR avec de la gentamycine (50 g/mL) et continuez avec la dissection.
5. Retirez soigneusement la membrane vitelline qui entoure l’embryon. Cela peut plus facilement être fait en utilisant une paire de forceps émoussés pour stabiliser l’embryon tout en utilisant une paire de forceps fins pour saisir la membrane. Tirez soigneusement avec les fines forceps pour éplucher la membrane vitelline.
6. Utilisez des forceps fins pour séparer les régions dorsal et ventrale de l’embryon. Cela peut être fait en utilisant les forceps pour «pincer» l’embryon le long de l’axe antérieur-postérieur, le coupant en deux. À l’avance d’une pipette de transfert stérile, transférer la partie dorsal sur la plaque de 60 mm avec une solution de collagène préparée à l’étape 2.2.5. Jeter la partie ventrale.
7. Laisser l’explante dorsal incuber dans la solution de collagène pendant 1 h 2 à température ambiante. Revenez délicatement sur la plaque de dissection.
8. Terminer la dissection en enlevant soigneusement toute contamination endodermale et mésodermale résiduelle du tissu neural présumé de l’ectoderm. Pour les embryons à l’étape 22 ou plus, le tube neural doit également être enlevé et jeté.
   REMARQUE : Si nécessaire pendant la dissection, le plat de 70 % d’éthanol préparé à l’étape 2.2.4 peut être utilisé pour effacer ou re-stériliser les forceps.
9. Une fois la dissection terminée, transférer délicatement l’explante sur la plaque de 35 mm de la solution Ca^2MD préparée à l’étape 2.2.3.
10. Répétez les étapes 2.4-2.9 jusqu’à ce que quatre explants aient été collectés.
11. Utilisez une micropipette P1000 pour transférer les quatre explants sur la plaque de 35 mm contenant la solution CMF, en prenant soin d’éviter tout contact entre les explants et l’interface air-eau. Faites tourbillonner doucement le plat de sorte que toutes les explantations se regroupent au centre de l’assiette.
12. Incuber 1 h à température ambiante pour permettre aux explants de se dissocier.
    REMARQUE : Pour faciliter la dissociation, la trypsine de 0,025 % à 0,01 % peut être ajoutée à la solution CMF. Cela peut être nécessaire pour une dissociation efficace des embryons plus âgés (stade 22 et plus).
13. À ce stade, au moins deux embryons correctement mis en scène devraient rester sur la plaque de retenue. Transférer ces embryons dans un plat frais rempli de 0,1x ROR avec de la gentamycine préparée à l’étape 2.2.4 et leur permettre de se développer sans être dérangéavec le plat couvert pour correspondre au plat d’explantation. Ces embryons serviront de contrôle des frères et sœurs.
14. Utilisez la superglue pour attacher un bordereau micro-gouverné (voir Tableau des matériaux) au fond du plat de culture cellulaire de 35 mm préparé à l’étape 2.2.3.
    REMARQUE : Placez de petites touches de superglue sur les bords de la couverture, puis appuyez fermement contre le dessous du plat de culture cellulaire. Les marques positionnelles seront masquées partout où la colle entre en contact avec la grille, il est donc important de garder la partie centrale quadrillée de la couverture libre de l’adhésif.
15. Une fois que les explants se sont dissociés pendant 1 h, utilisez une micropipette P100 pour les transférer au plat de culture cellulaire. Afin de plaquer autant de cellules que possible sur la partie quadrillée du plat, maintenez la pipette à un angle peu profond près de la surface du plat, placez la pointe de pipette dans le coin de la grille faisant face vers l’intérieur, et expulsez fermement la suspension de cellule à travers l’ar quadrillé ea. Idéalement, les cellules s’installeront dans un amas dense serré.
16. Incuber pendant 1 h à température ambiante pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence.
17. Combiner 5 L 1 mM Fluo-4 AM (voir Tableau des matériaux) avec 2 l l de 10 % d’acide Pluronic F-127.
    REMARQUE : Fluo-4 AM est sensible à la lumière et doit être conservé dans un tube léger ou recouvert de papier d’aluminium en tout temps.
18. Une fois l’incubation terminée, déplacez l’échantillon de plat dans une chambre noire ou un autre endroit protégé par la lumière. Utilisez une micropipette pour enlever 100 l de solution du bord du plat. Ajoutez cette solution à l’aliquot de l’acide Fluo-4 AM/Pluronic F-127, pipette de haut en bas pour mélanger, et retournez le volume complet au plat d’échantillon. Tourbillonner doucement pour mélanger.
19. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence.
20. À la fin de l’incubation, utilisez le tube conique restant de 2 mM Ca^{2 pour} effectuer trois lavages de support de la manière suivante : 1) retirer 1 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche, 2) retirer 3 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche, 3) retirer 3 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche.

3. Imagerie de calcium

REMARQUE : L’imagerie calcique a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal inversé(tableau des matériaux).

1. Placez la plaque d’échantillon sur l’étape du microscope, en prenant soin de la protéger de l’exposition à la lumière ambiante. Une fois la plaque fixée, utilisez un marqueur pour étiqueter le point avant de la plaque afin que le même champ de vision puisse être trouvé dans l’imagerie ultérieure.
2. Localisez l’échantillon au microscope — d’abord à 10X, puis à 20X grossissement — et sélectionnez un champ de vision approprié pour l’imagerie. Un champ de vision idéal est dense en cellules, mais pas si dense que les cellules sont agglomérées ou difficiles à distinguer individuellement.
3. Ajuster la mise au point du microscope de sorte que la glissière de couverture à grille soit visible. Les nombres marqués sur la feuille de couverture servent d’identifiants uniques pour un locus de grille particulier et peuvent être utilisés pour localiser le même champ de vision pour une imagerie supplémentaire. Si le champ de vision initialement sélectionné ne se chevauche pas avec les nombres, réajuster jusqu’à ce qu’un nombre identifiable soit dans le cadre.
4. Prenez une image lumineuse du champ de vision avec le bordereau de couverture à grille au point.
5. Ajustez les réglages de mise au point et prenez une image de champ lumineux du champ de vision sélectionné avec les cellules au point.
6. Avec la couche cellulaire en ligne, illuminez les échantillons avec un laser de 488 nm. Les valeurs HV et Offset peuvent être optimisées pour chaque expérience afin de s’assurer qu’une plage dynamique de fluorescence est détectée sur le canal FITC.
7. Pour une image de deux heures, modifiez la configuration d’imagerie pour enregistrer 901 images avec un temps de balayage de 3,93 s et un intervalle de 8 s. Configuration de course pour acquérir l’image.
8. Une fois l’imagerie terminée, retirez la plaque du stade du microscope. Retirer 1 ml de solution de la plaque et la remplacer par 1 ml de 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA, et 2 mM MgSO₄ dans 7,4% de formaldéhyde).
9. Incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence.
10. Une fois la fixation terminée, retirer toute la solution de la plaque et la remplacer par 2 ml de 1x PBS. Conserver les assiettes à 4 oC pour un traitement ultérieur.

4. Analyse de l’expression génique : Synthèse de sonde

1. Comme décrit ci-dessous, générer une sonde d’ARN antisens pour l’hybridation in situ. En outre, générer une sonde de sens pour le même gène pour une utilisation comme un contrôle négatif.
2. Afin de purifier l’ADN plasmide contenant la séquence de modèle de sonde, inoculer 150 ml de bouillon LB avec des stocks bactériens de glycérol contenant le plasmide du modèle. Incuber à 37 oC en secouant pendant la nuit ou jusqu’à ce que la culture soit turbide.
3. Purifiez l’ADN plasmide de la culture bactérienne en utilisant votre méthode de choix.
   REMARQUE : Nous utilisons le kit de préparation midi McNary-Nagel pour obtenir des rendements élevés d’ADN plasmide.
4. Pour confirmer que le plasmide contient l’insert attendu, effectuer un digest de restriction et d’analyser les produits sur un gel d’agarose. Le plasmide non coupé peut également être analysé sur un gel d’agarose pour vérifier la contamination par l’ADN génomique.
5. Pour linéariser l’ADN du modèle, configurez une réaction de digestion de restriction de 100 L contenant 20 g d’ADN plasmide, 2 l d’enzyme de restriction appropriée et 1x tampon approprié. Incuber à 37 oC pendant au moins 2 h.
6. Extraire de l’ADN linéaire en effectuant une extraction de phénol/chloroforme suivie d’une extraction de chloroforme.
7. Précipitez l’ADN avec 100% d’éthanol. Cela peut être fait rapidement en ajoutant deux volumes d’éthanol froid à l’échantillon et en l’incubant à -80 oC jusqu’à ce qu’il se solidifie (15-30 min).
8. Utilisez une centrifugeuse réfrigérée pour granuler l’ADN en filant pendant 20 min à 12 000 x g/4 oC.
9. Retirer le supernatant et laver la pastille avec 200 ll d’éthanol à 70%. Faire tourner pendant 5 min à 12 000 x g/4 oC.
10. Retirer le supernatant et le granule à air sec pendant environ 5 min. Resuspendre dans 20 oL de 1x TE et conserver à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage.
11. Pour synthétiser et purifier la sonde à ARN antisens, créez un mélange de 2,5 mM de rNTP en combinant 15 ml de 10 mL de rCTP, 15 l de 10 mM rGTP, 15 oL de 10 mL de rATP, 9,75 l de 10 ml de rUTP, et 5,25 oL de 10 mM de creusement-11 UTP (Voir tableau des matériaux).
12. Mettre en place une réaction de transcription in vitro de 50 L contenant 4 g d’ADN de modèle linéaire à partir de l’étape 4.2-4.10, 15 l de mélange rNTP de 2,5 mM à partir de l’étape 4,11, 10 l de tampon de transcription 5x, 5 l de 0,1 M DTT, 0,5 oL d’inhibiteur de la RNAse (20 U/L) et 1,5 l de polymérase d’ARN appropriée (T3, T7 ou SP6). Incuber 1 h à 37 oC.
13. Ajouter 1,5 l de polymérase d’ARN supplémentaire à la réaction et revenir à 37 oC pendant une heure supplémentaire.
14. Ajouter 1 An1 RQ1 DNAse à la réaction et incuber à 37 oC pendant 10 min pour dégrader le modèle d’ADN.
15. Ajouter 30 L de 7,5 M de solution LiCl à l’échantillon. Pipette à mélanger et à incuber à -20 oC pendant au moins 1 h.
16. À l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée, faire tourner l’échantillon 25 min à 14 000 x g/4 oC.
17. Retirer le supernatant et rincer le granule avec 500 ll d’éthanol à 70%. Faire tourner pendant 5 min à 14 000 x g/4 oC.
18. Retirer le supernatant et le granule à air sec pendant environ 5 min. Resuspendre dans 20 l d’eau exempte de nucléane.
19. Créer à 10x stock de sondes en diluant l’échantillon à une concentration de 10 ng/L dans hybridation Buffer (50% formamide, 5x SSC (citrate saline-sodium; 750 mM NaCl, 75 mM de citrate de sodium, pH 7,0), 1 mg/mL d’ARN torula, 0,1 % Tween-20, 1x Solution de Denhardt, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA et 100 oG/mL heparin). Conserver à -20 oC jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage.

5. Analyse de l’expression génique : Fluorescence in Situ Hybridization

REMARQUE : Tous les lavages doivent être exécutés avec environ 1 ml de solution à l’aide d’une pipette stérile et emballée individuellement. La pipette doit être placée au bord de la plaque lors de l’enlèvement ou de l’ajout de la solution, et les lavages doivent être effectués aussi doucement que possible pour s’assurer que les cellules ne sont pas délogées de la surface de la plaque et perdues.

1. Retirer 1x PBS de la plaque (à partir de l’étape 3.10). Remplacer par du PBS frais 1x et incuber 5 min à température ambiante.
2. Combiner 25 mL de 0,1 M de triéthanolamine (pH 8,0) avec 62,5 l d’anhydride acétique. Bien mélanger. Laver l’assiette avec cette solution pendant 10 min.
3. Laver l’assiette avec 1x SSC pendant 5 min.
4. Laver la plaque avec 0,02 M HCl pendant 10 min pour perméabilize cellules.
5. Laver 2x avec 1x PBS pendant 5 min chacun.
6. Retirez la solution et ajoutez 1 ml de tampon d’hybridation (50% formamide, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM de citrate de sodium, pH 7,0), 1 mg/mL d’ARN torula, 0,1 % Tween-20, 1x Solution de Denhardt, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA et 100 og/mL d’héparine) à l’assiette. Incuber en secouant pendant au moins 6 h à 60 oC.
7. Supprimer le tampon d’hybridation et remplacer par une solution de sonde à ARN de 750 l l de 1x (sous forme diluée du stock 10x effectué à l’étape 4.19. Les sondes d’ARN de sens peuvent être employées comme contrôle négatif.
8. Incuber en secouant pendant 8-14 h à 60 oC.
9. Retirez la sonde et entreposez-la à -20 oC.
   REMARQUE : La dilution de la sonde 1x peut être réutilisée jusqu’à trois fois avant d’être jetée.
10. Rincer la plaque avec 0.2x SSC.
11. Laver avec du SSC frais de 0,2x pendant 1 h à 60 oC.
12. Déplacer les assiettes à température ambiante et réquilibrer pendant 5 min.
13. Laver l’assiette avec 0,2 x SSC pendant 5 min.
14. Laver l’assiette avec 1x PBT pendant 15 min.
15. Laver la plaque avec 2% H₂O₂ en 1x PBT (0.1% Triton-x-100) pendant 1 h.
    REMARQUE : Cette solution est sensible à la lumière, de sorte qu’elle doit être fraîche pour chaque expérience et protégée de la lumière. Les plaques doivent également être protégées de la lumière ou déjouées pendant cette incubation.
16. Laver l’assiette avec 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) pendant 15 min.
17. Diluer le réactif de blocage à 2% dans le tampon d’acide mâle (100 mM acide mâle, 150 mM NaCl, pH 7.5). Bloquer les cellules de ce mélange pendant au moins 1 h à température ambiante.
18. Remplacer la solution de blocage par un anticorps anti-digoxygéné-POD dilué 1:1,000 dans 2% de réagent de blocage dans le tampon d’acide mâle. Incuber toute la nuit à 4 oC.
19. Rincer la plaque 3x avec 1x TBST.
20. Laver 4x avec 2mL de 1x TBST pendant au moins 15 min par lavage avec bascule continue.
21. Laver 2x avec 1x PBT pendant au moins 10 min par lavage avec bascule continue.
22. Diluer Cy3-conjugué tyramide 1:25 en 1x PBT. Laver l’assiette avec 750 l de cette dilution pendant 5 min.
    REMARQUE : Cette solution est extrêmement sensible à la lumière, et les plaques doivent être déjouées ou protégées de la lumière pour le reste de l’expérience afin d’éviter la détérioration du signal.
23. Ajouter 2,5 'L de 0.3% H₂O₂ à cette solution et couver avec le basculement continu pendant 40 min supplémentaires à température ambiante.
24. Laver 4x avec 1x TBST pendant au moins 15 min par lavage avec bascule continue.
25. Rincer avec 1x PBT.
26. Fixer les cellules en couve pendant 1 h à température ambiante dans 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA, et 1 mM MgSO₄ dans 3,7% de formaldéhyde).
27. Retirez la solution et remplacez-la par 1x PBS. Conserver les assiettes dans un contenant déjoué à 4 oC jusqu’à ce qu’elles soient traitées.

6. Cellules d’imagerie

REMARQUE : L’imagerie a été exécutée utilisant un microscope confocal inversé.

1. Placez la plaque d’échantillon sur la scène du microscope, en alignant la marque faite à l’étape 3.1 à l’avant de la scène.
2. Concentrez l’image de manière à ce que la glissière doublée par grille soit visible et, à l’aide de l’image de grille prise à l’étape 3.4 comme référence, ajustez le champ de vision pour correspondre au champ de vision capturé dans l’image calcium (section 3).
3. Acquérir des images lumineuses de la grille et des cellules.
4. Illuminez les échantillons à l''infini d’un laser TRITC de 595 nm. Ajustez les valeurs de gain pour distinguer convenablement le signal de l’arrière-plan en utilisant les images des cellules témoins négatives et acquerdez une image fixe.
   REMARQUE : Idéalement, les niveaux de fluorescence de fond sont déterminés en fonction d’une plaque de contrôle négative traitée en parallèle avec une sonde d’ARN de sens non ciblage. Les réglages de gain sont ajustés de sorte que cette plaque semble complètement noire (correspondant aux niveaux de fond), puis maintenue constante pour d’autres plaques représentées à partir de ce lot expérimental.

7. Traitement des données

REMARQUE : Le traitement des données a été effectué à l’aide du logiciel Nikon Elements.

1. Ouvrez l’image de calcium de 2 h à partir de l’étape 3.7. Identifiez les pixels correspondant à chaque cellule individuelle en sélectionnant la détection binaire et la détection des tachesvives. Assurez-vous que le canal FITC est sélectionné.
2. Des cercles colorés apparaîtront sur des cellules individuelles après que cette couche a été générée. Ajustez les paramètres de distribution et de taille des cellules afin que le plus grand nombre possible de cellules soient reconnues et associées à un identifiant unique.
3. Suivre les cellules à travers toutes les images de l’image en naviguant à la vue de l’analyse contrôles 'gt; Options de suivi. Définir 5 images comme l’écart maximal entre les pistes, supprimer les objets associés à moins de 600 images et sélectionner l’option Close Gaps. Sélectionnez les binaires de suivi pour appliquer le suivi cellulaire à l’image.
4. Une fois les cellules suivies, supprimez manuellement tout objet qui ne correspond pas à une cellule individuelle (par exemple un amas de cellules). Cependant, les points de données ne devraient pas être exclus d’une analyse plus approfondie basée sur la morphologie de la trace d’activité calcique.
5. Sur le volet image, sélectionnez Afficher la superpose -gt; Afficher l’ID d’objet binaire. Faites défiler jusqu’à la fin de l’image (Frame 901) et sélectionnez Edit 'gt; Créer Afficher Snapshot (8bit RGB)'gt; Frame actuel 'gt; OK. Cela créera un instantané de la dernière image de l’image avec l’ID binaire associé de chaque cellule visible. Enregistrer cette image.
6. Exportez des données de la série chronologique en sélectionnant tous les objets suivis par Export Data vers Excel. Enregistrer la sortie en tant que fichier CSV.
7. Ouvrez l’image FISH. Optimisez la détection des taches comme dans les étapes 7.1-7.2, en utilisant le canal TRITC au lieu du canal FITC. Supprimer manuellement tous les binaires mal attribués, puis sélectionnez les résultats de mesure automatisés pour calculer l’intensité du signal de chaque cellule. Exportez un instantané d’image et une table de données en répétant les étapes 7.5 et 7.6.
8. Créez une feuille de calcul où la colonne A est étiquetée FISH Binary ID et la colonne B est étiquetée Calcium Binary ID. Ouvrez les images exportées dans les étapes 7.5 et 7.7. Pour chaque objet identifié dans l’image FISH (étape 7.7), enregistrez l’ID binaire dans la colonne A. Ensuite, localisez la cellule correspondante dans l’image calcium (étape 7.5) et enregistrez cet ID binaire dans la colonne B. Les cellules qui ne peuvent pas être identifiées en toute confiance dans les deux images ne doivent pas être ajoutées à la feuille de calcul.
   REMARQUE : Il peut être utile d’utiliser un programme de retouche photo comme Adobe Photoshop ou gIMP image editor pour ouvrir les deux images, en faire une semi-transparente et la reconssurer sur l’image de son partenaire afin d’identifier et de relier plus facilement les deux identifiants binaires associés à chaque cellule.
9. Pour chaque cellule identifiée, rassemblez (manuellement ou avec un script) ses données de calcium de série temporelle (associées à l’ID binaire de calcium et exportées à l’étape 7.6) et ses données d’expression génique (associées à l’ID binaire FISH et exportées à l’étape 7.7).
   REMARQUE : Le traitement et l’analyse des données en aval peuvent impliquer la collecte de ces données dans une seule table de données et l’application d’un éventail de techniques analytiques, y compris le comptage des pointes, l’analyse fractale et l’entropie markovienne qui permettent à l’enquêteur de discerner de nouveaux modèles d’activité calcique ^17,18.

Representative Results

Un exemple réussi de cellules dissociées préparées pour l’imagerie calcique peut être vu dans la figure 2A. Les cellules sont densément plaquées, ce qui permet de recueillir le maximum d’informations sur chaque image, mais pas si densément plaquéques que les cellules individuelles ne peuvent pas être distinguées en toute confiance se forment les unes les autres. La fluorescence est détectée pour chaque cellule définie au cours de la période d’imagerie de 2 h. La visualisation d’une parcelle composite contenant les traces de toutes les cellules enregistrées dans une expérience révèle dans quelle mesure les mesures en vrac ou en population peuvent masquer des modèles plus nuancés de comportement de piette(figure 2B). Lorsque les profils enregistrés des cellules individuelles sont isolés, des exemples de l’activité irrégulière de pointe caractéristique des cellules progénitrices neurales peuvent être clairement identifiés. Contrairement aux neurones matures, les cellules neuronales embryonnaires présentent une nature irrégulière, très variable et complexe de l’activité calcique(figure 2B). Afin de quantifier cette complexité, l’application de différentes méthodes d’analyse de données a été appliquée^17,18, y compris divers paramètres pour définir un pic (Figure 2C).

L’hybridation in situ réussie de fluorescence, y compris la conception et la synthèse réussies d’une sonde d’ARNm d’antisens, peut être évaluée en comparant la plaque expérimentale à un contrôle de fond incubé avec un contrôle non contraignant d’ARN de sens (figure 3A,B). Un contrôle positif de sonde peut également être exécuté en traitant un type de cellule connu pour exprimer l’ARNm cible à des niveaux détectables.

L’identification de la même cellule à travers le calcium et l’imagerie FISH exige que les cellules conservent à peu près la même position pendant l’hybridation et le traitement des sondes. Si les plaques sont manipulées grossièrement ou si les lavages sont exécutés avec trop de force, les cellules peuvent être délogées de la surface de la plaque et perdues lorsque la solution est jetée ou déposée à un endroit différent sur la plaque, ce qui rend impossible leur correspondance sur les images (Figure 4A). Si cette perturbation n’affecte que certaines cellules du champ de vision, il peut encore être possible de détecter et d’attribuer certaines cellules de l’image (Figure 4B). Cependant, la quantité maximale de données est obtenue à partir d’une expérience dans laquelle FISH est effectué avec soin et peu de cellules sont perdues ou repositionnées entre les images (Figure 4C).

Une fois que les données ont été recueillies pour décrire à la fois l’activité calcique et l’expression génique d’un nombre raisonnable de cellules au stade de développement, d’autres analyses peuvent être effectuées pour évaluer les corrélations entre ces deux caractéristiques (figure 1). Un certain nombre de mesures ont été appliquées pour quantifier les modèles d’activité du calcium, y compris le comptage des pointes/fréquence, la puissance moyenne, l’estimation de l’exposant Hurst et la mesure de l’entropie Markovienne^17,18. L’expression génique peut être définie quantitativement par le niveau absolu de fluorescence ou notée sur une échelle binaire (oui/non), selon les questions expérimentales abordées.

Les résultats d’expériences de compilation de l’activité calcique avec l’expression des gènes de marqueur progéniteur neural ont indiqué de nombreuses associations entre les modèles spécifiques de l’activité de calcium et les phénotypes de neurotransmetteur. Au stade de la plaque neurale (stade 14), les cellules GABAergic exprimant le marqueur inhibiteur de neurone gad1.1 montrent l’activité de calcium qui est plus régulière et plus élevée-amplitude que celle des cellules qui manquent d’expression de gad1.1 (figure 5A). En outre, tandis que ces cellules gad1.1-exprimant sont associées à des niveaux plus élevés de pointe à haute amplitude, le pieux à faible amplitude est plus fréquent dans les cellules glutamatergiques exprimant le marqueur neuronal excitateur slc17a7.

Figure 1 : Schéma du flux de travail expérimental. Barre d’échelle de 100 m. Des images en panneaux 3-5 ont été prises de Paudel et al. (2019)¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Imagerie calcique et exemple de profils d’activité. (A) Activité de calcium intracellulaire telle que rapportée par Fluo4-AM. Chaque image de 2 h est composée de 901 images, avec un spectacle de cadre représentatif ici. (B) Parcelle composite d’intensité de fluorescence au fil du temps dans toutes les cellules du champ de vision image. Les traces indiquent clairement le photoblanchiment des heures supplémentaires de colorant indicateur (Fluo4). Raster parcelle en haut à gauche montre des traces représentatives de l’activité calcique après l’application d’un algorithme de dé-tendance développé par Eilers et Boelen¹⁹, où les cellules montrées ici présentent un modèle diversifié de comportement de pointe. (C) Application de différents seuils (150 % et 200 % de la ligne de base, où la ligne de base est la moyenne de l’intensité fluorescente déthlisée) pour définir un pic (flèches vertes et bleues). Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Imagerie FISH. (A) FISH effectué avec une sonde d’ARN sens non contraignant comme un contrôle négatif. Les réglages d’imagerie ont été ajustés de sorte qu’aucune cellule ne semble fluorescente. Certains champs de vision peuvent inclure des débris non cellulaires avec une certaine fluorescence, comme on le voit dans les coins supérieur droit et inférieur droit de (A); ceux-ci peuvent être ignorés aux fins de l’arrangement d’arrière-plan. (B) Les mêmes paramètres d’imagerie sont ensuite utilisés pour l’image d’une plaque expérimentale (sonde à ARN antisens). La fluorescence dans ces conditions correspond à l’expression génique au-dessus du fond. Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : La pariation d’images et la coenregistrement. Représentations schématiques d’un échantillon représenté pour l’activité calcique (cellules représentées par des cercles verts remplis) et après FISH (cellules représentées par des cercles rouges ombragés). (A) Les cellules qui se sont déplacées de façon significative au cours de la manipulation et du traitement de l’échantillon ne peuvent pas être identifiées de façon fiable sur les deux images. (B) La perturbation cellulaire ne peut affecter que certaines cellules dans le champ de vision. Certaines cellules peuvent être clairement identifiées dans les deux images, tandis que d’autres ne peuvent pas être assorties en toute confiance. (C) Si les échantillons sont manipulés avec soin, la plupart des cellules resteront intactes et peuvent être identifiées dans les deux images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Exemple d’application de cette méthode, des diagrammes de boîte montrant des associations entre l’activité de calcium et l’expression de gène (GABA et glut pour des gènes gad1.1 et slc17a7 respectivement) dans le stade neural de plaque Xenopus laevis. Au stade 14, les cellules gad1.1-postives (GABA) présentent une amplitude plus élevée et une activité calcique plus régulière telle que définie par (A) Markovian entropy18 et (B) nombres de pointes utilisant des seuils 125%, 150%, 200% et 300% de la moyenne de l’intensité fluorescente dé-tendance (baseline)¹⁷ que les cellules positives slc17a7 (Glut). Les étoiles indiquent des différences statistiquement significatives selon les deux tests Kolmogorov-Smirnov corrigés par Bonferroni (p 'lt; 0.05) et les statistiques d de Cohen pour la taille de l’effet (n ' 5 cultures et '100 cellules; '0.2 'd ' lt; 0.5). Le chiffre a été redessiné et adapté à partir d’ensembles de données obtenus auprès de Paudel et coll.¹⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Des modèles caractéristiques de l’activité calcique ont été observés dans les cellules qui composent le système nerveux en développement, avec des types spécifiques d’activité associés à des processus neurodéveloppementaux distincts. Cependant, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels ces modèles d’activité denses en informations sont traduits en réponses transcriptionnelles nécessite des informations sur l’activité du calcium et l’expression des gènes à recueillir avec une résolution unicellulaire. Tandis que les systèmes qui montrent l’activité plus stéréotypée de calcium, tel que les neurones mûrs, peuvent être raisonnablement évalués sur un niveau en vrac, les modèles irréguliers qui caractérisent le système nerveux embryonnaire sont facilement masqués par des enregistrements moins précis.

Le cadre expérimental établi dans ce protocole est facilement adaptable à une grande variété de types de cellules et de reporters fluorescents. Les tissus contenant pratiquement n’importe quel type de cellule ou combinaison de types de cellules peuvent être disséqués à partir d’un organisme modèle d’intérêt et plaqués pour l’imagerie unicellulaire. En plus de permettre l’identification cellulaire et d’isoler l’effet des processus cellulaires autonomes, une approche de culture cellulaire primaire permet à l’expérimentateur de définir les composants des médias comme désiré. Par exemple, des expériences comparant l’activité des précurseurs neuronaux dans la solution 2 mM Ca^{2 ont} été réalisées pour déterminer si les relations entre la fréquence des pointes et le phénotype neurotransmetteur dans la moelle épinière embryonnaire peuvent être récapitulées sans l’influence des interactions cellules-cellules^13,20.

Bien que ce protocole tire parti du marqueur fluorescent Fluo4-AM pour détecter l’activité calcique intracellulaire, selon les critères de sélection, les utilisateurs peuvent sélectionner d’autres marqueurs disponibles dans le commerce²¹, y compris les indicateurs de calcium génétiquement codés. De même, d’autres marqueurs pourraient être utilisés pour surveiller les changements dynamiques à la concentration d’un ion d’intérêt (y compris K^,Na^,et Zn²⁾, le potentiel de membrane, ou le pH cellulaire. Les paramètres d’imagerie et la durée de l’image peuvent être modifiés au besoin.

Bien que nous avons corrélé l’activité de calcium et le phénotype neuronal comme application spécifique, cette méthode est également applicable pour une série d’autres propriétés cellulaires. Par exemple, l’hybridation in situ de fluorescence peut être effectuée avec des sondes contre n’importe quel gène d’intérêt, y compris le marqueur neuronal ChAT ou le facteur de transcription Engrailed, permettant la détection sensible d’un panneau personnalisable d’espèces d’ARNm. Ces sondes peuvent être conçues pour être spécifiques à l’isoforme, soutenant une spécificité cible supplémentaire si désiré. Double FISH peut être effectué à l’aide de sondes conjuguées à plusieurs fluorophores différents, permettant l’évaluation simultanée de l’expression de plusieurs gènes. Cependant, les lavages supplémentaires requis par ce type d’expérience sont associés à un risque accru de perte ou de mouvement cellulaire et nécessitent de l’expérience et de la délicatesse pour être exécutés avec succès.

Indépendamment de toute modification spécifique à l’expérience apportée à ce protocole, il y a plusieurs étapes clés qui nécessitent une attention particulière. Les dissections doivent être effectuées avec soin pour enlever tous les tissus contaminants ou les populations cellulaires; parce que le modelage spatial est perdu lorsque les explants sont dissociés, toutes les cellules restantes des tissus voisins deviendront entrecoupées et indiscernables des cellules d’intérêt. Une fois les cellules plaquées, les échantillons doivent être manipulés aussi doucement que possible pour empêcher les cellules d’être délogées. Plus important encore, cela signifie que tous les changements de solution doivent être effectués lentement et soigneusement, avec la pipette placée au bord de la plaque lorsque la solution est enlevée et ajoutée. Cela permettra de s’assurer que les cellules peuvent être identifiées en toute confiance dans les images de calcium et fish. Si les cellules sont perturbées pendant le traitement, il peut être impossible d’identifier une partie ou la totalité des cellules correspondantes entre les deux images. Nous conseillons de faire preuve de prudence à l’égard de ces affectations, de sorte que seules des cellules correspondantes sans ambiguïté sont utilisées pour une analyse plus approfondie.

Selon la question biologique abordée, une variété d’approches d’analyse peuvent être appropriées. L’activité calcique de la série chronologique peut être traitée et quantifiée de diverses façons, avec une flexibilité d’expérimentation dans le choix des paramètres de dé-tendance, des mesures d’analyse et des paramètres d’analyse (par exemple, le % du seuil de référence utilisé pour définir un pic de calcium). Les corrélations entre l’activité calcique et le niveau d’expression génique peuvent être établies en analysant l’expression des gènes en tant que valeur de fluorescence absolue ou relative extraite de l’image FISH. Alternativement, des corrélations entre l’activité calcique et l’expression génique (présence/absence) peuvent être établies en définissant un seuil de fluorescence pour le signal d’expression génétique positif et en attribuant des identificateurs « oui » ou « non » à des cellules individuelles. Dans l’ensemble, ce schéma expérimental fournit un pipeline incroyablement flexible pour la collecte et l’analyse préliminaire des données de la série chronologique en conjonction avec des données d’expression génique appariées par cellules. De telles expériences seront cruciales pour mieux comprendre les relations complexes entre la dynamique cellulaire et les changements transcriptionnels, comme en témoigne l’identification des modèles d’activité calcique caractéristiques des précurseurs neuronaux inhibiteurs et excitatoires dans les laevis embryonnaires de Xenopus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Animal Husbandry & Cell Culture
CHORULON (chorionic gonodotropin)	Merck Animal Health
Gentamycin sulfate salt	Millipore Sigma	G1264
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm	Millipore Sigma	CLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm	Fisher Scientific	08-772A
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm	Fisher Scientific	08-772F
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08-772E
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta	Fisher Scientific	12-565-90
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL	Fisher Scientific	13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Millipore Sigma	E10521
Collagenase B	Millipore Sigma	11088807001
Dumont #55 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 Forceps, Dumostar	Fine Science Tools	11295-00
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface	Nexcelom Bioscience	CLS5-25D-050
For Calcium Imaging
Fluo-4, AM, cell permeant	Thermo Fisher Scientific	F14201
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Thermo Fisher Scientific	P6866
For RNA Probe Generation
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
rATP	Promega	P1132
rCTP	Promega	P1142
rGTP	Promega	P1152
rUTP	Promega	P1162
Digoxigenin-11-UTP	Millipore Sigma	3359247910
Rnase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	N8080119
T3 RNA Polymerase	Promega	P2083
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
RQ1 Rnase-Free Dnase	Promega	M6101
LiCl Precipitation Solution (7.5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9480
For Fluorescence In Situ Hybridization
Acetic Anhydride	Thermo Fisher Scientific	320102
Blocking Reagent	Millipore Sigma	11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments	Millipore Sigma	11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester	Millipore Sigma	GEPA13105
Solution Components
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs	Fisher Scientific	AC349610
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	C3306
CHAPS hydrate	Millipore Sigma	C3023
Denhardt's Solution (50X)	Thermo Fisher Scientific	750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)	Promega	P1171
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate	Fisher Scientific	S311
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Millipore Sigma	E3889
Formamide (Deionized)	Thermo Fisher Scientific	AM9342
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Millipore Sigma	H3393
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher Scientific	11344041
Hydrogen peroxide solution	Millipore Sigma	H1109
L-Cysteine	Millipore Sigma	168149
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC223211000
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous	Fisher Scientific	AC413480050
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	ACS125231000
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP308
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX	Millipore Sigma	R3629
Sodium chloride	Millipore Sigma	S7653
Triethanolamine	Millipore Sigma	90279
Tris	Millipore Sigma	GE17-1321-01
TWEEN 20	Millipore Sigma	P9416
Equipment
Laminar Flow Hood	model of choice
Dissecting Microscope	model of choice
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	TE200
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Shaking Incubator	model of choice
Refrigerated Centrifuge	model of choice
Miscellaneous
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity	Millipore Sigma	CLS430769
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22