Summary
שתי שיטות של העשרה כולסטרול מוצגים: היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים, ואת השימוש של פוספוליפיד זרחן מועשר מבוססי מפזרים (ליפוזומים) כדי להעשיר Xenopus oocytes. שיטות אלה הן אינסטרומנטלי לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב.
Abstract
העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מיונקים, כולל Xenopus oocytes המשמשים ללימוד תפקוד התא, ניתן לבצע באמצעות מגוון שיטות. כאן אנו מתארים שתי גישות חשובות המשמשות למטרה זו. ראשית, אנו מתארים כיצד להעשיר רקמות ותאים עם כולסטרול באמצעות cyclodextrin רווי כולסטרול באמצעות עורקים מוחין (רקמות) ו נוירונים היפוקמאל (תאים) כדוגמאות. גישה זו יכולה לשמש עבור כל סוג של רקמות, תאים, או קווי תאים. גישה חלופית להעשרה כולסטרול כרוכה בשימוש בליפרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). היתרון של גישה זו הוא כי היא משתמשת בחלק ממנגנון הומאוסטזיס טבעי של הכולסטרול של התא. עם זאת, בעוד הגישה cyclodextrin ניתן להחיל להעשיר כל סוג תא של עניין עם כולסטרול, גישה LDL מוגבל לתאים המבטאים קולטני LDL (למשל, תאי הכבד, מח עצם נגזר תאים כגון לוקיציטים דם ומקרופאגים רקמות), ואת רמת העשרה תלוי בריכוז וניידות של קולטן LDL. יתר על כן, חלקיקי LDL כוללים שומנים אחרים, כך משלוח כולסטרול הוא לא ספציפי. שנית, אנו מתארים כיצד להעשיר Xenopus oocytes עם כולסטרול באמצעות הפיזור פוספוליפיד מבוסס (כלומר, ליפוזומים) הכולל כולסטרול. קסנפוס אוציטים מהווה מערכת הטרוולוגי פופולרית המשמשת ללימוד תאים וחלבונים. הן הגישה הcyclodextrin המבוססת על כולסטרול של רקמת היונקים (עורקים מוחית) ועל הגישה המבוססת פוספוליפיד כולסטרול של Xenopus oocytes, אנו מדגימים כי רמות הכולסטרול להגיע למקסימום הבא 5 דקות של דגירה. רמה זו של כולסטרול נשאר קבוע במהלך תקופות ממושכות של דגירה (למשל, 60 דקות). יחד, נתונים אלה לספק את הבסיס עבור תנאים הזמני אופטימיזציה עבור העשרה כולסטרול של רקמות, תאים, ו Xenopus oocytes למחקרים פונקציונליים שמטרתה חקירת ההשפעה של העשרה כולסטרול.
Introduction
כולסטרול, השומנים הסלולר העיקריים, משחק תפקידים קריטיים מבניים רבים1,2,3,4,5,6,7,8,9. מתוך ויסות התכונות הפיזיות של קרום הפלזמה כדי להבטיח את הכדאיות התאית, צמיחה, התפשטות, והגשה כמולקולה איתות ו קודמן בשפע של מסלולים ביוכימיים, כולסטרול הוא רכיב חיוני הכרחי תאים תא נורמלי הפונקציה. כתוצאה מכך, חוסר כולסטרול תוצאות מומים פיזיים חמורים מגוון רחב של הפרעות. מצד שני, אפילו עלייה קטנה בכולסטרול מעל רמות פיזיולוגיות (2-3x) הוא ציטוטוקסי11,2,10 והוא נקשר עם פיתוח של הפרעות, כולל לב וכלי דם11,12,13 מחלות נוירוניווניות14,15,16,17. כך, כדי לחקור את הפונקציות הקריטיות של כולסטרול כדי לקבוע את ההשפעה של שינויים ברמות הכולסטרול, גישות שונות המשנות את התוכן של כולסטרול ברקמות, תאים, ו- Xenopus oocytes פותחו.
שינוי ברמות הכולסטרול ברקמות ובתאים של היונקים
מספר גישות ניתן לרתום כדי להקטין את רמות הכולסטרול ברקמות ובתאים18. גישה אחת כרוכה החשיפה שלהם כדי סטטינים התפרקה ליפופרוטאין סרום לקויה לעכב hmg-CoA רדוקטאז, אשר שולטת על שיעור סינתזה כולסטרול19,20. עם זאת, אלה תרופות הפחתת כולסטרול גם לעכב את היווצרות של מוצרים שאינם sterol לאורך השביל mevalonate. לכן, כמות קטנה של mevalonate מתווסף כדי לאפשר היווצרות של מוצרים אלה21 ולשפר את הספציפיות של גישה זו. גישה נוספת להפחתת רמות הכולסטרול כרוכה בשימוש בβ-ציקלודטרינים. אלה ונומרים מונודורים בעלי חלל הידרופובי פנימי עם קוטר המתאים לגודל של תחום ה סטרולים22, אשר מקלה על החילוץ של כולסטרול מתאים, ובכך מכלה אותם מתוכן כולסטרול יליד שלהם23. דוגמה היא 2-הידרוקסיל-β-cyclodextrin (HPβCD), תרופה פרה-קלינית הנבדקת כיום לטיפול במחלת מחלת הבחור הנימן, הפרעת מטבולית קטלנית תורשתית המאופיינת באחסון כולסטרול ליזוזומבית24. רמת המחסור בכולסטרול תלויה בנגזרת הספציפית שבשימוש. לדוגמה, HPβCD מחלצת כולסטרול בקיבולת נמוכה יותר מאשר הנגזרת המתיל, הβ-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. בעיקר, עם זאת, β-ציקלודטרינים יכולים גם לחלץ מולקולות הידרופובי אחרים בנוסף לכולסטרול, אשר עשוי לגרום להשפעות שאינן ספציפיות31. בניגוד דלדול, תאים ורקמות יכול להיות מועשר במיוחד עם כולסטרול באמצעות הטיפול עם β-cyclodextrin כי כבר presaturated עם כולסטרול23. גישה זו יכולה לשמש גם כשליטה על הספציפיות של β-ציקלודטרינים המשמשים למחסור בכולסטרול31. דלדול כולסטרול מן הרקמות והתאים הוא פשוט יכול להיות מושגת על ידי חשיפת התאים עבור 30-60 דקות כדי 5 mM MβCD מומס במדיום המשמש לאחסון התאים. גישה זו יכולה לגרום לירידה של 50% בתוכן כולסטרול (למשל, ב נוירונים בהיפוקמפוס32, העורקים המוח מוחין33). מצד שני, הכנת מורכבות β-cyclodextrin-כולסטרול עבור העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מורכבים יותר, והוא יתואר בסעיף הפרוטוקול.
גישה חלופית להעשרת רקמות ותאים באמצעות β-cyclodextrin רווי כולסטרול כרוך בשימוש LDL, אשר מסתמך על קולטני LDL המבוטא ברקמות/תאים18. בעוד גישה זו מציעה את היתרון של שימוש במנגנון הומאוסטזיס כולסטרול טבעי של התא, יש לו מספר מגבלות. ראשית, רקמות ותאים שאינם מבטאים את קולטן ה-LDL לא ניתן להעשיר באמצעות גישה זו. שנית, חלקיקי LDL מכילים שומנים אחרים בנוסף לכולסטרול. באופן ספציפי, LDL מורכב חלבון ApoB100 (25%) ואת השומנים הבאים (75%): ~ 6-8% כולסטרול, ~ 45-50% cholesteryl אסתר, ~ 18-24% פוספוליפידים, ו ~ 4-8% triacylglycerols34. כך, משלוח של כולסטרול באמצעות חלקיקי LDL הוא לא ספציפי. שלישית, אחוז העלייה בתוכן כולסטרול על-ידי LDL ברקמות ובתאים המבטאים את קולטן ה-LDL עשוי להיות נמוך באופן משמעותי מהעלייה שנצפתה באמצעות cyclodextrin רווי בכולסטרול. למשל, במחקר הקודם, העשרה של עורקים מוחין מכרסמים עם כולסטרול דרך LDL הביא רק 10-15% עלייה ברמות הכולסטרול35. לעומת זאת, העשרת העורקים הללו עם cyclodextrin רווי כולסטרול כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול הביאו לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגים, איור 1).
שינוי של רמות כולסטרול בקסנפוס אוציטים
קסנפוס אוציטים מהווים מערכת ביטוי הטרוולוגי המשמשת בדרך כלל לחקר תאי וחלבון. מחקרים מוקדמים הראו כי הכולסטרול ליחס פוספוליפיד טוחנת ב Xenopus oocytes הוא 0.5 ± 0.136. בשל רמה גבוהה פנימית של כולסטרול, הגדלת התוכן של כולסטרול במערכת זו הוא מאתגר, עדיין ניתן להשיג באמצעות דיספרסיות ממברנה פוספוליפידים וכולסטרול. פוספוליפידים כי בחרנו למטרה זו דומים לאלה המשמשים ליצירת השומנים מישורי מלאכותי bilayers וכוללים L-α-פוספולידילטנולטואמין (האפיפיור) ו-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-פוספאו-L-סרין (פופס), כמתואר בסעיף הפרוטוקול. גישה זו יכולה לגרום לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגות, איור 2).
גישה חלופית כדי להעשיר Xenopus מועשר עם מפזרים פוספוליפיד זרחן כרוך בשימוש של cyclodextrin רווי כולסטרול, אשר דומה הרקמות והתאים מועשרים. עם זאת, מצאנו את הגישה הזאת כדי להיות בלתי מנוצחת ויעילות נמוכה, עם ממוצע של ~ 25% עלייה בתוכן כולסטרול. ייתכן שהדבר נובע מיכולת הטעינה השונה של שתי גישות אלה (ראה סעיף ' תוצאות מייצגות ', איור 3). לעומת זאת, זה הוכח כי באמצעות cyclodextrin כדי לרוקן את הכולסטרול מ Xenopus oocytes יכול לגרום ~ 40% ירידה בתוכן כולסטרול36.
כאן, אנו מתמקדים העשרה כולסטרול של רקמות ותאים באמצעות היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול, ו Xenopus אוציטים באמצעות ליפוזומים. שתי הגישות ניתן לרתום כדי להתוות את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול על תפקוד החלבון. המנגנונים של אפנון כולסטרול של פונקציית חלבון עשויים לכלול אינטראקציות ישירות8 ו/או אפקטים עקיפים9. כאשר הכולסטרול משפיע על תפקוד החלבון באמצעות אינטראקציות ישירות, ההשפעה של גידול ברמות הכולסטרול על פעילות החלבון היא כנראה עצמאית של סוג התא, מערכת הביטוי, או גישה העשרה. לדוגמה, אנו מנוצל שתי גישות אלה כדי לקבוע את ההשפעה של כולסטרול ב-G-חלבון מגודרת בתוכו אשלגן (girk) ערוצים מבוטא פרפור מייציטים37, היפוקמוניות נוירונים32,38, HEK29339 תאים, ו xenopus oocytes32,37. התוצאות שהתקבלו במחקרים אלה היו עקביים: בכל שלושת הסוגים של התאים המיונקים ובתוך הכולסטרול האמפיבי הכולסטרול של הערוץ (ראה מדור תוצאות נציג, איור 4, עבור נוירונים היפוקמאל והניסויים המתאימים xenopus oocytes). יתר על כן, תצפיות שנעשו במחקרים אלה היו גם עקבי עם תוצאות המחקרים שבוצעו ב פרפור מייציטים37,40 ו היפוקמאל נוירונים32,38 מבודדים טרי מבעלי חיים נתון דיאטה כולסטרול גבוה40. בעיקר, העשרה כולסטרול של נוירונים היפוקמאל באמצעות MβCD הפך את ההשפעה של טיפול atorvastatin המשמש לטיפול ההשפעה של הדיאטה הכולסטרול הגבוה הן על רמות כולסטרול ו-GIRK פונקציה38. במחקרים אחרים, חקרנו את ההשפעה של מוטציות על רגישות כולסטרול של מבפנים לתקן אשלגן לתקן את קיר 2.1 באמצעות שניהם Xenopus oocytes ו HEK293 תאים41. שוב, השפעת המוטציות על רגישות הערוץ הייתה דומה בשתי המערכות.
היישומים של שתי שיטות העשרה לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב הם רבים. בפרט, השימוש של מתחמי cyclodextrin-כולסטרול כדי להעשיר את התאים והרקמות הוא נפוץ מאוד בעיקר בשל הייחוד שלה. דוגמאות אחרונות של גישה זו כוללות את קביעת ההשפעה של כולסטרול על הפעלת ערוץ HERG ומנגנונים הבסיסי42, גילוי כי כולסטרול מפעיל את חלבון G מצמידים קולטן Smoothened כדי לקדם קיפוד איתות43, ואת הזיהוי של התפקיד של כולסטרול בביומכניקה של תא גזע ו אדיפוגנזה באמצעות רפידת מקשר הקשורים חלבונים44. בעבודתנו שלנו, אנו מנוצלים העשרה רקמות המסיביות עם MβCD: קומפלקס כולסטרול כדי ללמוד את ההשפעה של העשרה כולסטרול על הפונקציה הבסיסית ואת פרופיל פרמקולוגית של סידן, מתח מגודרת ערוצים של מוליכות גדולה (BK, מקסימינק) בשריר חלק וסקולרית35,45,46. במחקרים אחרים, השתמשנו הגישה מבוססי פוספוליפיד מבוסס פיזור עבור מעשיר xenopus של הכולסטרול עם כולסטרול כדי לקבוע את התפקידים של אזורים שונים ב-קיר 2.1 ו-girk של הרגישות כולסטרול41,47,48,49, כמו גם כדי לקבוע אתרים כולסטרול בכבלים הללו בערוצים אלה32,50,51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים עם בעלי חיים בוצעו באוניברסיטת טנסי במרכז למדעי הבריאות (UTHSC). הטיפול של בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של UTHSC, אשר הוא מוסד מוכר על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בחיות מעבדה הבינלאומי.
1. העשרת רקמות ותאים באמצעות מתיל-β-cyclodextrin רווי בכולסטרול
הערה: פרוטוקול העשרת הכולסטרול המופיע להלן מתאים לרקמות, תאים וקווי תאים. כדוגמה, אנו מתארים את השלבים שבוצעו להעשרת העורקים המוחית של היונקים. התוצאות הייצוגיות מסופקות עבור העורקים המוחית (איור 1) ונוירונים (איור 4).
- הכנת MβCD רווי בכולסטרול
- שוקלים 0.064 g של MβCD ולפזר אותו בבקבוקון המכיל 10 מ ל של התמיסה מלוחים באגירה פוספט (PBS) כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מ"מ MβCD. מערבבים את הפתרון עם בר מהומה כדי להבטיח כי MβCD הוא התפרקה לחלוטין.
- שוקלים 0.0024 g של אבקת כולסטרול ולהוסיף אותו בקבוקון אותו כדי להשיג ריכוז 0.63 מ"מ כולסטרול. ואז לערבב את הפתרון במרץ. השתמש מרית כדי לשבור כמה נתחי כולסטרול רבים ככל האפשר (כמה גושים יישארו עד הדגירה).
- לכסות את הבקבוקון עם לפחות שתי שכבות של סרט פרפין ולרעוד לאט (~ 30 תנודה/דקות) באמבט מים 37 ° c בלילה. שלב זה הוא קריטי.
- לאחר 8-16 h, מגניב את הפתרון לטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לסנן אותו באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר polyethersulfone מזרק לתוך בקבוק זכוכית.
הערה: כדי להגיע לריכוזי כולסטרול שונים בתמיסה, התאימו את כמויות הכולסטרול והMβCD בפרופורציה פשוטה. חשוב לשמור על MβCD: יחס כולסטרול טוחנת ב 8:1 להשיג רוויה של הספק β-cyclodextrin מתיל עם כולסטרול. ניתן להשתמש בפתרון מעשיר הכולסטרול באופן מיידי או במהלך מספר ימים, אם הוא מאוחסן ב -4 ° c. עם זאת, היכולת העשירה בכולסטרול מסרב לאורך זמן כאשר אגרגטים כולסטרול מופיעים, והפתרון הופך להיות מעונן.
- טיפול בעורקים מוחית עם MβCD רווי כולסטרול
- המתת חסד מלשן מג (250-300 g) על ידי הצבת אותו בחדר עם 2% isofלוריאן. בעזרת גיליוטינה חדה או. זוג מספריים גדול וחד
הערה: אם ביצוע הליכים אלה באופן קבוע, מומלץ לפתח לוח זמנים לחידוד הגיליוטינה. כמו כן, זוג נפרד של מספריים צריך להיות מוקדש לעריפת ראש מכרסם. עריפת ראש מכרסם הוא הליך מסוף; לכן, המכשירים אינם צריכים להיות עקרים. ניקוי עם מי סבון לאחר כל שימוש מספיק. - הצב את ראשו של העכברוש בפנים קדימה, הרחק מהחוקר. מניחים את החלק המחודד של זוג מספריים בגודל בינוני בין הגולגולת לגזע המוח, וחותכים משני הצדדים לשניים.
- השתמש מלקחיים לחטט הגולגולת העליון פתוח על ידי משיכת בסיס של הגולגולת שבו החתכים לרוחב נעשו בזהירות להסיר את המוח. הקפד לחתוך את העצבים האופטיים כי להחזיק את המוח בתוך הגולגולת.
- שים את המוח בגביע עם הערוץ. לאחר ההסרה בקרח
הערה: המוח יכול להיות מאוחסן על קרח 4-6 h ב -4 ° c. - בסביבה לא סטרילית להעביר את המוח העכברוש לתוך קערת חיתוך שעווה עם מספיק PBS להטביע אותו. להצמיד את המוח למטה כדי למנוע ממנו לנוע.
הערה: שלב 1.2.5 יכול להתבצע ב-RT אם מבוצע במהירות. . אחרת, זה צריך להיעשות בקרח - השתמש מלקחיים חדים מספריים כירורגי קטן כדי לנתח את העורקים מוחין וענפים שיוצרים את מעגל ויליס בבסיס המוח תחת המיקרוסקופ ב-PBS ב-RT. להיות עדין בעת הניתוח כדי להבטיח כי רקמת העורק אינו נמתח או גזור. שלב זה הוא קריטי.
- לשטוף בקצרה את מקטעי העורק (עד 1 ס מ ארוך) ב PBS או בצלחת היטב 96 או בצלחת 35 מ"מ כדי להסיר את שאריות הדם, ולאחר מכן למקם אותם 10 דקות לתוך מספיק של הפתרון כולסטרול מעשיר (מוכן בשלב 1.1) כדי לכסות את מקטעי העורק כולו. השתמש במנה 35 מ"מ אם יש כמות גדולה של פתרון מעשיר כולסטרול וצלחת מ96 היטב אם העורקים קטנים או אם יש מחסור בפתרון מעשיר כולסטרול.
הערה: הגישה אותה ניתן להשתמש כדי להעשיר רקמות ותאים אחרים עם כולסטרול באמצעות זמן דגירה 60 דקות. לדוגמה, גישה זו כבר שימש בעבר העשרה כולסטרול של העורקים מוחין העכבר35,45, היפוקמאל נוירונים32, פרפור מייציטים37, ו hek 293 תאים39. זמן הדגירה המינימלי צריך להיקבע עבור כל רקמה או סוג תא מבוסס על אימות של העשרה כולסטרול בנקודות זמן שונות עם שיטת כולסטרול רגיש (למשל, הקביעה הביוכימית של כמות הכולסטרול ברקמה על ידי הצביעת עם לצבוע עם צבע כולסטרול רגיש הפיליפין).
- המתת חסד מלשן מג (250-300 g) על ידי הצבת אותו בחדר עם 2% isofלוריאן. בעזרת גיליוטינה חדה או. זוג מספריים גדול וחד
- כתם את רקמת העורק עם הפיליפין רגישות לסטרואידים רגישים לצבע כדי לקבוע שינויים ברמות הכולסטרול.
הערה: בסעיף תוצאות הנציג, אנו מדגימים את התוצאות של שתי גישות כדי להעריך שינויים ברמות הכולסטרול: שיטת ביוכימית שבוצעה באמצעות היישום של ערכת אוקסידאז כולסטרול מסחרית זמין (ראה טבלת חומרים) ומכתים עם הצבע הפלואורסצנטי רגישות לסטרואידים. הגישה הראשונה יכולה להתבצע על-ידי ביצוע הוראות היצרן. הפרוטוקול עבור הגישה האחרונה מסופק להלן.- באמצעות בקבוק טרי של אבקה פיליפין, להכין פתרון 10 מ"ג/mL במלאי diמתיל סולפוקסיד (DMSO). שלב זה הוא קריטי.
הערה: הפתרון המתקבל הוא רגיש לאור. אם הוא מוכן נכון, פתרון המניה הפיליפין הוא צהבהב. אבקה כלשהי עלולה להיצמד למכסה הבקבוק. לכן, חשוב לשטוף את הבקבוק ואת הכובע עם הממס DMSO כדי לשמור על כמות כולה של הפיליפין. ברגע שהוכן, יש להשתמש במלאי הפיליפין תוך מספר ימים. פיליפין מאבד לחלוטין את יכולת הזריחה שלה לאחר 5 ימים, גם כאשר הוא מאוחסן בחשיכה ב-20 ° c. - הסר את מקטעי העורק מהפתרון המעשירים כולסטרול ושטוף אותם 3x עם PBS במשך 5 דקות.
- תקן את מקטעי העורק ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 15 דקות על הקרח.
התראה: פאראפורמלדהיד הוא רגיש לאור. לכן, העבודה חייבת להתבצע בחשכה. - הצב את מקטעי העורק לתוך 0.5% טריטון ב-PBS ב-RT במשך 10 דקות כדי לחדור את הרקמה ולהקל על חדירת צבע.
- לשטוף את מקטעי העורק 3x עם PBS עבור 5 דקות על שייקר. שלב זה הוא קריטי.
הערה: כאשר הטריטון נשטף לגמרי, לא צריך להיות בועות על פני השטח של הפתרון PBS. - דלל את פתרון מלאי הפיליפין ב-PBS לריכוז הסופי של 25 μg/mL. הסר את העורקים בצורה הפתרון PBS ולמקם אותם בפתרון הפיליפין מדולל עבור 1 h בחושך. שלב זה הוא קריטי.
- שטוף את הפיליפין על ידי שטיפה של מקטעי העורק 3x עם PBS עבור 5 דקות על שייקר. שלב זה הוא קריטי.
- שטפו את מקטעי העורק בקצרה עם מים מזוקקים, סופגים נוזלים מוגזמת במפית נייר, ומהר את העורקים בשקופית באמצעות מדיה הרכבה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- לכסות את העורק עם שמיכות הימנעות מתגלגל או פיתול של העורק ולהגדיר את השקופיות להתייבש באזור חשוך ב RT עבור 24 שעות.
- לאחר מייבש המדיה ההרכבה, לאטום את קצות שמיכות עם לק ברור לק, ולהשאיר את לק לק יבש עבור 10-15 דקות. אחסן את השקופיות בחשיכה ב-20 ° c.
- העבר את השקופיות ל-RT לפני הדמיה.
- תמונה הרקמה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית או קורא זריחה עם עירור להגדיר ב 340-380 nm ופליטה ב 385-470 nm.
התראה: פיליפין מבלבנה במהירות; לכן, דגימות צריך להיות בתמונה באופן מיידי.
- באמצעות בקבוק טרי של אבקה פיליפין, להכין פתרון 10 מ"ג/mL במלאי diמתיל סולפוקסיד (DMSO). שלב זה הוא קריטי.
2. העשרת הקספוס האוציטים באמצעות דיספרסיות מבוססות פוספוליפיד מועשר בכולסטרול (ליפוזומים)
- הכנת פתרונות
- כדי להכין פתרון מניות של כולסטרול, לפזר 10 מ"ג של אבקת כולסטרול 1 מ ל של כלורופורם בגביע מזכוכית 10 mL או בקבוק. להעביר את הפתרון לתוך בקבוק זכוכית 1.5 mL הכתיר.
התראה: לאור רעילות ואידוי מהירה של כלורופורם, עבודה במכסה המנוע ולשמור ריאגנטים על הקרח. - הכן 150 mM KCl, 10 מ"מ טריס-HEPES, pH = 7.4 המאגר עבור פוספוליפידים כולסטרול מועשר. כדי לעשות זאת, לפזר בקבוקון Erlenmeyer אייר 5.5905 g של KCl ו 0.6057 g של טריס במים כפולים מזוקקים לסכום כולל של 0.5 L נפח. בבקבוקון אחר, לפזר 5.5905 g של KCl ו 1.19155 g של HEPES במים כפולים מזוקקים לסכום כולל של 0.5 L נפח. לערבב את שני הפתרונות יחד בבקבוקון 1 L Erlenmeyer, ולהתאים את ה-pH כדי 7.4 עם HCl.
הערה: אחסן את התוצאה המתקבלת 150 mM KCl, 10 מ"מ הפתרון טריס-HEPES ב 4 ° c. - כדי להכין ND96 טרום בינוני מראש בינונית (K+, נמוך Ca2 +) מאגר, לשלב 1 מ ל 2 m Kcl, 1 מ ל 1 m mgcl2, 45.5 Ml של 2 m הנאל, ו 5 מ ל של 1/1 M naoh-Hepes בבקבוקון 1 L ' erlenmeyer אייר. הוסף 900 mL כפול מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH כדי 7.4 עם HCl. העבר את הפתרון לצילינדר 1 L והבא את הנפח ל 1 ל' עם מים כפולים מזוקקים. ואז להוסיף 1.8 mL של 1 M CaCl2 ולסנן את הפתרון.
הערה: שינויים קלים ביחסי הגודל בין המרכיבים המשמשים לביצוע פתרון ND96 לא נראים קריטיים להעשרת כולסטרול, אולי משום שהפתרון הND96 אינו משמש במהלך השלב העשרה עצמו אלא לאחסון. דוגמה היא פתרון L 1 בעל ריכוז מעט נמוך יותר של יוני נתרן וכלוריד, והוא מורכב על ידי שילוב של 2 מ ל 1 M KCl, 1 מ ל 1 M MgCl2, 82.5 ml של 1 m הנאגל, 5 מ ל 1 מ' hepes, ו 1.8 ml של 1 m cacl2 (Ca2 + מושמט כדי לקבל Ca2 + פתרון חינם). להתאים את ה-pH של הפתרון כדי 7.4 עם NaOH. לאחסן את הפתרון המתקבל ND96 oocyte culturing ב 4 ° צ' עד 1 חודש.
- כדי להכין פתרון מניות של כולסטרול, לפזר 10 מ"ג של אבקת כולסטרול 1 מ ל של כלורופורם בגביע מזכוכית 10 mL או בקבוק. להעביר את הפתרון לתוך בקבוק זכוכית 1.5 mL הכתיר.
- הכנת הנפיצה מבוססי פוספוליפיד עם ליפוזומים כולסטרול
- בתוך שפופרת זכוכית 12 מ ל, לשלב 200 μL של כל אחד מתוך 10 מ"ג/mL כלורופורם-מומס פתרונות השומנים המומסים: L-α-פוספולידילתנולאמין, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-גליקו-3-פוספהו-אל-סרין, וכולסטרול.
- להתנדף את הכלורופורם במכסה המנוע להתייבש לאט תחת זרם של חנקן. שלב זה הוא קריטי.
- להשעות את השומנים ב 800 μL של פתרון באגירה המורכב של 150 mM KCl ו 10 מ"מ טריס-HEPES ב-pH = 7.4, ולכסות עם הסרט פרפין.
- Sonicate בעדינות על 80 kHz עבור 10 דקות עד תערובת חלבי נוצרת. שלב זה הוא קריטי.
התראה: כsonicating, הפיזור בצינור הזכוכית צריך לרטוט בעדינות, להרכיב גלים קטנים. טיפות של פיזור לא צריך להיות קופץ בתוך הצינור.
- העשרה קספוס מעשיר עם כולסטרול
הערה: הצפרדע oocyte המכילים שחלות ניתן לקבל משני מקורות: First, Xenopus לאואיי צפרדעים נקבה ניתן לאכסן למטרת ניתוח בבית. הליך זה חייב להיות מאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש. שנית, שחלות שלמות ניתן לרכוש מספקים מסחריים. כחלופה לרכישת או בידוד שחלות שלמות ולאחר מכן לעכל אותם כפי שמתואר בשלבים 2.3.1-2.3.4, oocytes הפרט זמינים מסחרית לרכישה. אם נעשה שימוש בשני האחרונים, ניתן לדלג על שלבים 2.3.1-2.3.4.- שמור על השחלות הטריות שהושגו ב-~ 14 ° c בתמיסה ND96. בתנאים אלה, ניתן לאחסן את השחלות עד לשבוע אחד.
- כדי להשיג oocytes הפרט, לשבש את שק השחלות במקומות מרובים באמצעות מלקחיים חדים. מניחים את גושי השחלה לתוך צלחת 60 מ"מ, עם 5 מ ל של Ca2 +-חינם ND96 בתוספת עם 0.5 Mg/mL הקולגן. לנער על שייקר מסלולית ב 60 תנודות/דקות עבור 15 דקות ב RT.
הערה: צעד זה יבטיח את העיכול של שק השחלות. כדי לשמר את הפעילות האנזימטית, הימנע מאחסון הקולגן המכיל ND96 לפרקי זמן ארוכים (> 1 h). יש לבצע גם אחסון קצר בטמפרטורות מגניבות של פחות מ-15 ° c. - באמצעות פיפטה העברה עם טיפ רחב, במרץ מאוד הפתרון oocyte המכיל למעלה ולמטה כ 5-10x להפריד oocytes הפרט. בשלב זה, הפתרון יהפוך לכהה.
- במהירות לשטוף את oocytes עם Ca2 +-ND96 חינם עד הפתרון הופך שקוף.
- העברת oocytes בודדים ל-Ca2 +-המכיל את הפתרון ND-96 בתוספת עם 2 מ"ג/mL של gentamicin באמצעות פיפטה העברה עם קצה צר.
הערה: שלב זה חיוני כאשר יש צורך לאחסן את האוציטים. האוציטים בודדים ניתן לאחסן בחממה במשך כמה ימים ב 14-17 ° c. עם זאת, oocytes מת כי הם לבנבן חייב להסירו לפחות פעם ביום כדי למנוע זיהום של הפתרון עם כימיקלים רעילים. - העבר 90 μL של מועשר בכולסטרול פוספוליפיד זרחן לתוך הבאר אחד של 96 צלחת הבאר.
- העברה עד שש oocytes מן ND96 בינונית לבאר עם מדיום קטן ככל האפשר. שלב זה הוא קריטי.
התראה: אין לחשוף את האוציטים לאוויר במהלך ההעברה כדי לשמור על האוסטציטים ללא פגע. - מקום צלחת 96 היטב על מסובבי תלת מימדי פלטפורמה לספק תנועה מסלולית קטנה כדי oocytes בתא עבור 5-10 דקות.
- הוסף טיפה של ND96 לתוך הבאר, ולהעביר את כולסטרול מועשר oocytes מ 96 צלחת הבאר לצלחת 35 מ"מ עם ND96 לשימוש מיידי. שלב זה הוא קריטי.
- השתמש בערכה מסחרית כולסטרול אוקסידאז (ראה טבלת חומרים) כדי להעריך שינויים ברמות הכולסטרול על ידי ביצוע הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש cyclodextrin רווי כולסטרול כאמצעי להעשרת רקמות ותאים עם כולסטרול הוא מבוסס היטב. כאן, אנו הראשונים להדגים את היישום של גישה זו בשימוש נרחב להעשרת עורקים מוחין החולדה עם כולסטרול באמצעות MβCD רווי בכולסטרול. איור 1מראה דוגמה של שכבת השריר החלקה של עורק מוחין ומדגים את העלייה התלויה בריכוז הקרינה הקשורה הפיליפין שהושג על העשרה רקמות עם ריכוזי הגוברת של כולסטרול החל מ-6.25 Μm-6.25 mM עבור 1 h. הקוונפיקציה המקבילה של נתוני ההדמיה מתוארת באיור 1B. בעיקר, להגדיל את רמות הכולסטרול 2 h לאחר תקופת הדגירה 1 h היה ~ 50% של הגידול נצפתה מיד לאחר הטיפול עם MβCD: כולסטרול קומפלקס. כמו איור 1ג מדגים עבור המדגם שטופלו 0.625 mM כולסטרול 1 h, מחקרים פונקציונליים באמצעות הרקמות המטופל צריך להתבצע בהקדם האפשרי לאחר העשרה כולסטרול הושלמה. יתר על כן, בעוד 1 h הדגירה זמן משמש בדרך כלל כדי להעשיר את הרקמות והתאים עם כולסטרול באמצעות גישה זו, 5 דקות של דגירה הוא בדרך כלל מספיק כדי להשיג עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בתוכן כולסטרול מוחין עורק כפי שנקבע על ידי האוקסידאז מבוססי כולסטרול ביוכימיים, כפי שמתואר באיור 1D הגידול בתוכן כולסטרול נשאר באותה רמה כאשר זמן הדגירה הוגדלה כדי 60 דקות (איור 1ד).
האפקטיביות של ליפוזומים כולסטרול מועשר כאמצעי להעשיר Xenopus oocytes עם כולסטרול הוא הפגינו באיור 2א-ג. בעוד שום שינוי משמעותי נצפתה ברמות כולסטרול בקרת פוספוליפיד שליטה מבוססי הדיספרסיות חסר כולסטרול (איור 2א), רמות כולסטרול גדל באופן משמעותי לאחר רק 5 דקות של טיפול עם מפזרים פוספוליפיד המבוסס כולסטרול, ונשאר באותה רמה כאשר זמן הדגירה הוגדלה כדי 60 דקות (איור 2B) השפעה דומה נצפתה בשתי קבוצות שונות של אוציטים שהתקבלו משני צפרדעים. בעיקר, עם זאת, הן רמות הראשונית של כולסטרול ואת השינוי בתוכן כולסטרול מגוונת בין שתי הקבוצות: באצווה 1, הריכוז הראשוני של כולסטרול היה 64 μg של כולסטרול ל-mg של חלבון, בעוד הריכוז הראשוני באצווה 2 היה 45 μg של כולסטרול לכל מ ג של חלבון, אשר ~ 70% של רמות ה בעקבות טיפול 60 דקות, הריכוז של כולסטרול באצווה 1 היה 124 μg של כולסטרול לכל mg של חלבון, ואילו באצווה 2 זה היה 67 μg של כולסטרול לכל מ ג של חלבון. כך, בעוד ריכוז של כולסטרול גדל על ידי מעל ~ 90% באצווה 1, זה גדל על ידי ~ 50% באצווה 2. עם זאת, העלייה הניכרת ברמות הכולסטרול בשתי הקבוצות מספקת את האמצעים לחקור את ההשפעה של עלייה ברמות הכולסטרול על הפונקציה של חלבונים המתבטאת במערכת הביטוי הטרוולוגי. יתר על כן, הגישה המבוססת פוספוליפיד מבוסס פיזור עבור העשרת Xenopus oocytes עם כולסטרול נראה יעיל יותר מאשר היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול כפי שנעשה ברקמות ובתאים. כמו איור 3 מדגים, יישום של מתחמי cyclodextrin-כולסטרול כדי להעשיר oocytes באמצעות Cyclodextrin 5mm הביא ממוצע של רק ~ 25% עלייה ברמות הכולסטרול.
האפקטיביות של גישה מבוססת cyclodextrin עבור תאים מעשיר מומחש גם בנוירונים טרי מבודדים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס (איור 4א). כמו איור 4B מראה, דגירה של הנוירונים בMβCD רווי כולסטרול עבור 60 דקות הביא מעל 2x להגדיל את רמות הכולסטרול כפי שנקבע על ידי הקרינה הקשורה הפיליפינים. באמצעות גישה זו, בדקנו את ההשפעה של הגידול בכולסטרול על ערוצי GIRK המתבטאת נוירונים היפוקמאל. כמו איור 4C מדגים, שינוי זה ברמות הכולסטרול הביא לעלייה משמעותית זרמים girk. באופן דומה, בדקנו את ההשפעה של העשרה כולסטרול על יחידת המשנה של גירק העיקרי ביטא במוח, GIRK2, באמצעות מערכת הביטוי Xenopus הטרוולוגי. כדי לעשות זאת, אנחנו overexpressed ^ (GIRK2_E152D), מוטציה נקבובית של GIRK2 המגביר את הביטוי הממברנה שלה ואת הפעילות52 ב xenopus oocytes, ומועשר oocytes עם כולסטרול 60 דקות באמצעות הגישה הנפיצה פוספוליפיד מבוסס פיזור. כאיורים 4D-F להפגין, את העלייה ברמות הכולסטרול הביא לעלייה משמעותית בזרמים דומים להשפעה של רמות הכולסטרול המוגבר בנוירונים על פונקציית ערוץ girk. נתונים אלה מדגימים עוד יותר את היעילות, את העקביות ואת כלי השירות של שתי הגישות המתוארות לעיל לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול המוגבר על פעילות החלבונים ותפקוד הסלולר.
איור 1: העשרת הנציגים של עורקים מוחין עם כולסטרול באמצעות מתיל-β-cyclodextrin רווי בכולסטרול. (א) דוגמה של שכבת השריר החלקה עורק המוח להפגין את העלייה תלוי הריכוז הקשורים ביותר הפיליפינים הקשורות להגדלת העור עם ריכוזים הגוברת של כולסטרול החל מ6.25 μm-6.25 mM עבור 1 h. (ב) כימות של נתוני ההדמיה ב (א). מדידת העוצמה הפלואורסצנטית של התמונה כולה בוצעה באמצעות הפונקציה "מדידה" מובנית בתוכנה מסחרית. בכל ריכוז כולסטרול, ≥ 3 תמונות נאספו מעורקים שנקטפו מתורמים נפרדים של בעלי חיים. עבור כל ריכוז כולסטרול, נתונים מוצגים כשגיאה ממוצע ± סטנדרטי. (ג) רמות כולסטרול בעורק מוחין חלק שכבת שריר מקטעים מיד לאחר תקופת דגירה 1 h עם כולסטרול 0.625 מ"מ, ו 3 h לאחר תחילת הטיפול (כלומר, 1 h של דגירה ואחריו 2 h ב PBS). (ד) התלות של רמות הכולסטרול על זמן הדגירה כפי שנקבע על ידי שיטת כולסטרול המבוססת על אוקסידאז ביוכימית. הבדל משמעותי מצוין על-ידי כוכבית (* p ≤ 0.05). פאנלים (A) (ריכוזיכולסטרול0 מ"מ-0.625 mm), (ב), ו (ג) שונו מ צפון ואח '45. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העשרת הנציגים של קסנפוס אוציטים עם כולסטרול באמצעות ליפוזומים. (A) שינוי מקפליםברמות כולסטרול של שליטה xenopus oocytes מודב ב ליפוזומים ללא כולסטרול עבור 5-60 דקות. (ב) שינוי מקפלים ברמות הכולסטרול של xenopus oocytes בתוך כולסטרול-מועשר ליפוזומים עבור 5-60 דקות. סרגל הבקרה המתואר מתייחס לדגירה של ליפוזומים ללא כולסטרול עבור 5 דקות והוא מוצג כהשוואה. (ג) השוואת ההשפעה של העשרת כולסטרול של שתי קבוצות שונות של xenopus oocytes באמצעות ליפוזומים כולסטרול מועשר עבור 5 ו 60 דקות. הבדל משמעותי מצוין על-ידי כוכבית (* p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: העשרת הנציגים של קסנפוס אוציטים עם כולסטרול באמצעות מתיל-β-cyclodextrin רווי בכולסטרול. (A) שינוי מקפליםברמות כולסטרול של שליטה xenopus oocytes מודב בקרת ND96 מדיה עבור 5-60 min. (ב) שינוי מקפלים ברמות הכולסטרול של xenopus oocytes ב MβCD רווי כולסטרול עבור 5-60 דקות. סרגל הבקרה המתואר מתייחס לדגירה במדיית הבקרה עבור 5 דקות ומוצג כהשוואה. הבדל משמעותי מצוין על-ידי כוכבית (* p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמאות מייצגות של מחקרים של העשרה כולסטרול על תפקוד החלבון בתאים ו Xenopus oocytes: ההשפעה של כולסטרול ב-G-חלבון מבפנים לתקן את ערוצי האשלגן. (א) פיליפין-משויך האות הפלואורסצנטית של היפוקמאל CA1 של תא העצב מפני חולדות על השליטה (משמאל) לעומת כולסטרול מועשר (מימין). (ב) נתוני סיכום של אותות זריחה הקשורים פיליפין שהושגו מתוך שליטה וכולסטרול-מועשר הCA1 מבודדים היפוקמאל ונוירונים. העשרה כולסטרול הושגה על ידי הדגירה של הנוירונים ב MβCD רווי בכולסטרול עבור 1 h (n = 12-14). (ג) עקומת הזרם הנוכחי (ה)-מתח (V) המתאר את ההשפעה של העשרה כולסטרול כמתואר ב (ב) על הזרמים של גינק בנוירונים היפוקמאל מהאזור CA1. (ד) עקבות נציג המראים את ההשפעה של העשרה כולסטרול באמצעות כולסטרול מועשר פוספוליפיד זרחן מבוססי ליפוזומים על GIRK2 ^ (GIRK2_E152D) הביע xenopus oocytes ב-80 mV ו + 80 mV. (ה) נתוני סיכום של (ד) ב-80 mV (n = 6-9). הבדל משמעותי מצוין על-ידי כוכבית (* p ≤ 0.05). תת דמויות (ב-E) שונו מ Bukiya ואח '.32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים ו Xenopus oocytes עם כולסטרול מהווים כלי רב עוצמה לחקירת ההשפעה של רמות כולסטרול גבוהות על מינים מולקולריים בודדים, על מערכות macromolecular מורכבות (למשל, חלבונים), ועל תפקוד הסלולר והעוגב. במאמר זה, תיארנו שתי גישות משלימות המקלות על מחקרים כאלה. ראשית, תיארנו כיצד להעשיר רקמות ותאים עם כולסטרול באמצעות MβCD רווי בכולסטרול. הדגמנו כי במקטעי עורק מוחין, גישה זו הביאה לעלייה של ~ 50% ברמות הכולסטרול. יתר על כן, במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי הגישה זהה מוביל מעל 2x להגדיל את תכולת הכולסטרול בנוירונים היפוקמאל מהאזור CA1. לעומת זאת, עם זאת, העסקת גישה זו כאמצעי להעשיר Xenopus oocytes הביא רק ~ 25% להגדיל את תכולת כולסטרול ב xenopus oocytes. לפיכך, עבור העשרת המוני Xenopus , פיתחנו הגישה פיזור פוספוליפיד מבוססת הגורם בעקביות לפחות ~ 50% להגדיל את רמות הכולסטרול. ייתכן כי היתרון של גישה זו עבור העשרת האוציטים מעשירה הנובע מקיבולת טעינה משופרת בהשוואה ליכולת הטעינה של MβCD: גישה מורכבת של כולסטרול. ייתכן גם כי בעוד MβCD: גישה מורכבת כולסטרול הוא אופטימיזציה עבור העשרת רקמות ותאים, אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול נדרש כדי לשפר את היישום שלו להעשרת Xenopus oocytes.
הפיזור מבוססי פוספוליפיד המשמש להעשרת Xenopus oocytes עם כולסטרול כולל שני שומנים המשמשים באופן נרחב כדי ליצור bilayers שומנים מישורי (כלומר, L-α-פוספולידילטהולאואמין ו 1-palmitoyl-2-אולאואיל-sn-גליקו-3-פואהו-ל-סרין עם זאת, במחקר מוקדם יותר, זה הוכח כי Xenopus oocytes יכול גם להיות מועשר באמצעות כולסטרול מליפוזומים שכללו פוספולידיליולין ו המרה36. שיטה זו הביאה לעלייה ביחס הכולסטרול/פוספוליפיד טוחנת בקרום פלזמה מ 0.5 ± 0.1 ל 0.9 ± 0.1 עם אחוז ממוצע של העשרה של 71%. האחוז הממוצע הזה של העשרה דומה מאוד לרמה הממוצעת של הגידול בתוכן כולסטרול שצפינו (~ 70.5%), מציע כי הבחירה של פוספוליפידים המשמש ליצירת הפיזור אינה קריטית להעשרת Xenopus oocytes עם כולסטרול באמצעות גישה זו.
כל פרוטוקול המתואר כרוך במספר שלבים קריטיים. לאחר הכנת MβCD: תערובת כולסטרול ביחס טוחנת 8:1 כדי להבטיח את הרוויה של MβCD עם כולסטרול, זה קריטי כדי לכסות את הבקבוקון עם לפחות שתי שכבות של הסרט פרפין ולהגדיר את זה באיטיות רועדת 37 באמבט מים במשך הלילה. כאשר מבתר רקמות לטיפול בכולסטרול חשוב להיות עדין כדי להבטיח כי הרקמה לא נמתח או לחתוך. לאחר החדרת הרקמה כדי להקל על חדירת צבע, זה קריטי לשטוף ביסודיות את מגזרי הרקמה ב-PBS. מכתים רקמות ב fillipin צריך להתבצע בחושך, ואת fillipin צריך להיות השטף בקפדנות לאחר הצביעת הושלמה. בעת הכנת כולסטרול מועשר פוספוליפיד מבוסס זרחן, זה קריטי כדי להבטיח את הפיזור בצינור זכוכית רוטט בעדינות, יוצרים גלים קטנים, כדי למנוע הפרדה של הכולסטרול מן הפיזור. עבור טיפול כולסטרול של Xenopus oocytes, חשוב להעביר את oocytes מן ND96 בינונית כדי היטב עם הפיזור מועשר פוספוליפיד הכולסטרול זרחן עם מדיום קטנה ככל האפשר בעוד לא חושף את oocytes לאוויר כדי לשמור את oocytes שלמים. חשוב לציין כי בשל המנגנון הפנימי של רקמות, תאים, ו Xenopus oocytes, רמות כולסטרול עשוי להיות שולי, ולאחר מכן לחזור לרמות המקוריות שלהם לאורך זמן. כתוצאה מכך, מחקרים פונקציונליים צריכים להתבצע מיד לאחר זמן הדגירה. כאן, הדגמנו את הרעיון הזה בעורקים מוחין מועשר בכולסטרול, מראה כי העלייה ברמות הכולסטרול 2 h לאחר תקופת דגירה 1 h היה כמחצית של העלייה נצפתה מיד לאחר תקופת הדגירה.
למרות שלאחר הצעדים הקריטיים המתוארים לעיל, עלולים להתעורר מספר אתגרים. לדוגמה, גידול ברמות הכולסטרול לא ניתן לצפות בעקבות הטיפול מעשיר כולסטרול. אם זהו המקרה, ייתכן שיהיה צורך להגביר את ריכוז הכולסטרול במדיה העשירה בכולסטרול. כנ ל לגבי העשרת כולסטרול של רקמות, תאים ו- Xenopus oocytes. עם זאת, בהכנת טיפולים באמצעות MβCD: גישה מורכבת כולסטרול, כמות MβCD צריך להיות מוגבר עם הגידול בריכוז כולסטרול כדי לשמור על יחס טוחנת 8:1 עם כולסטרול. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להכין פתרון חדש להעשרת כולסטרול, משום שכולסטרול נוטה לזרז את הפתרון, והפתרון מאבד את היעילות המעשירה את הכולסטרול שלה. בעקבות העשרה כולסטרול, ייתכן שהאות הפיליפין לא יוצג. אם זהו המקרה, ייתכן שיהיה צורך להשתמש באבקת פיליפין טרייה כדי להכין מלאי חדש ולחזור על הניסוי. הזריחה הפיליפין יורדת במהירות, ואין אפשרות לאחסן את פתרון המניה במשך יותר ממספר ימים. מגבלה אחת של כתמים פיליפין היא כי נראה לזהות סטרואידים אחרים מאשר כולסטרול. לדוגמא, לאחרונה הדגמנו עלייה באות הזריחה המשויכת לפיליפין בעורקים המוחית של החולדה בעקבות העשרתה45. לפיכך, יש לפרש את תוצאות הצביעת בזהירות, וכאשר בספק, גישות חלופיות צריכות להיות מועסקים כדי לאמת את התוצאות. אפשרות אחת תהיה לבצע הערכה ביוכימית דרך יישום של ערכת כולסטרול מסחרית זמין אוקסידאז.
לסיכום, הגישות המוצגות יעילים מאוד בהשגת העשרת כולסטרול של קרוב או חריגה 50%. אכן, MβCD: גישה מורכבת כולסטרול התוצאות ~ 50% ברמות כולסטרול בעורקים מוחין הוא הרבה יותר יעיל מאשר באמצעות LDL להעשיר את הרקמות האלה, אשר התוצאות בלבד ~ 10% להגדיל כולסטרול35. כנ ל לגבי היישום של כולסטרול מועשר פוספוליפיד זרחן מבוססי מפזרים (ליפוזומים) כדי להעשיר Xenopus oocytes. כמתואר לעיל, גישה זו בעקביות תוצאות לפחות 50% עלייה ברמות הכולסטרול. חשוב מכך, שתי גישות אלה עבור העשרה כולסטרול תוצאות התשואה מחוץ לבית הגידול המקבילה עם הגדלת כולסטרול המתקבל על ידי החוצה את החיות לדיאטה כולסטרול גבוה32,37,40,53,54. יתר על כן, בניגוד דיאטה כולסטרול גבוה במשך שבועות, בגישות חוץ גופית דורשים רק כמה דקות של זמן דגירה להגיע לעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית ויציבה ברמת הכולסטרול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד ר א. מ. דופיקו הוא מיוחד, במשרה חלקית, עובד פדרלי החבר הנוכחי של המועצה המייעצת הלאומית על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק פיתוח מדען (11SDG5190025) מאיגוד הלב האמריקני (ל-ar-D.), ועל ידי המכון הלאומי של בריאות R01 מענקים AA-023764 (כדי A.N.B.), ו-HL-104631 ו R37 AA-11560 (ל-M. D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
References
- Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
- Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
- Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
- Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
- Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
- Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
- Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
- Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
- Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
- Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
- Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
- Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
- Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
- Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
- Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
- Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
- Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
- Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
- Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
- López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
- Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
- Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
- Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
- Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
- Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
- Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
- Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
- Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
- Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
- Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
- Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
- Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
- Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
- Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
- Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
- Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
- Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
- Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
- Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
- Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
- Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
- North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
- Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
- Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
- Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
- Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
- Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).
