Summary
콜레스테롤 농축의 두 가지 방법이 제시된다 : 포유류 조직과 세포를 풍부하게하기 위해 콜레스테롤포화 사이클로 덱스트린의 응용 프로그램, 그리고 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산의 사용 (리포좀) 제노푸스 oocytes을 풍부하게. 이 방법은 분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 도구, 세포, 그리고 장기 기능.
Abstract
세포 기능을 연구하는 데 사용되는 제노푸스 난모세포를 포함한 포유류 조직 및 세포의 콜레스테롤 농축은 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 여기서는 이 용도로 사용되는 두 가지 중요한 접근 방식을 설명합니다. 첫째, 우리는 대뇌 동맥을 사용하여 콜레스테롤로 포화 사이클로 덱스트린을 사용하여 콜레스테롤과 조직과 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 (조직) 및 해마 뉴런 (세포) 예로. 이 접근법은 모든 유형의 조직, 세포 또는 세포주에 사용될 수 있다. 콜레스테롤 농축을 위한 다른 접근은 저밀도 지단백 (LDL)의 사용을 관련시킵니다. 이 접근법의 장점은 세포의 천연 콜레스테롤 항상성 기계의 일부를 사용한다는 것입니다. 그러나, 사이클로덱스트린 접근법은 콜레스테롤로 관심있는 모든 세포 유형을 풍부하게 하기 위해 적용될 수 있는 반면, LDL 접근법은 LDL 수용체(예를 들어, 간 세포, 혈액 백혈구 및 조직 대식세포와 같은 골수 유래 세포)를 발현하는 세포로 제한되며, 농축 수준은 LDL 수용체의 농도 및 이동성에 달려 있다. 또한, LDL 입자는 다른 지질을 포함, 그래서 콜레스테롤 전달은 비특이적. 둘째, 우리는 콜레스테롤을 포함하는 인지질 계 분산 (즉, 리포솜)을 사용하여 콜레스테롤로 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 방법을 설명합니다. 제노푸스 난모세포는 세포 및 단백질 기능을 연구하는 데 사용되는 인기 있는 이종 발현 시스템을 구성합니다. 포유류 조직의 사이클로덱스트린 기반 콜레스테롤 농축 접근법(대뇌 동맥)과 제노푸스 난모세포의 인지질 기반 콜레스테롤 농축 접근법모두, 우리는 콜레스테롤 수치가 배양 후 최대 5분까지 도달한다는 것을 보여줍니다. 콜레스테롤의 이 수준은 잠복기의 연장된 기간 도중 일정하게 남아 있습니다 (예를 들면, 60 분). 이 데이터는 함께 콜레스테롤 농축의 영향을 심문하는 것을 목표로 하는 기능적 연구를 위해 조직, 세포 및 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 농축을 위한 최적화된 시간적 조건에 대한 기초를 제공합니다.
Introduction
콜레스테롤, 주요 세포 지질, 수많은 중요 한 기능 및 구조적 역할을 한다1,,2,,3,,44,5,,6,,7,,8,,9. 혈장 막의 물리적 특성을 조절하는 것에서부터 세포 생존력, 성장, 증식, 그리고 생화학적 경로의 과다에서 신호 및 전구체 분자역할을 하는 것까지, 콜레스테롤은 정상적인 세포 및 장기 기능에 필수적인 구성 요소입니다. 결과적으로, 콜레스테롤 결핍은 가혹한 물리적 기형 및 무질서의 각종 귀착됩니다. 한편, 생리적 수준(2-3x)을 초과하는 콜레스테롤의 작은 증가도 세포독성1,,2,,10 및 심혈관11,12, 13및13 신경퇴행성 질환14,,15,,16,,17을포함하는 질환의 발달과 연관되어 있다., 따라서, 콜레스테롤의 중요한 기능을 심문하고 콜레스테롤 수치의 변화의 효과를 결정하기 위해, 조직, 세포 및 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤의 함량을 변화시키는 다른 접근법이 개발되었다.
포유류 조직 및 세포에 있는 콜레스테롤 수치의 변경
몇몇 접근은 조직과 세포에 있는 콜레스테롤의 수준을 감소시키기 위하여 이용될 수 있습니다18. 1개의 접근은 콜레스테롤 합성19,,20의비율을 통제하는 HMG CoA 환원효소를 억제하기 위하여 지단백질 결핍 혈청에 용해된 스타틴에 그들의 노출을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 콜레스테롤 낮추는 약물 또한 mevalonate 통로 따라 비 스테롤 제품의 형성을 억제. 따라서, 소량의 메발로네이트(mevalonate)가 첨가되어 이들제품(21)의 형성을 허용하고 이러한 접근법의 특이성을 강화한다. 콜레스테롤 수치를 감소시키는 또 다른 접근은 β-cyclodextrins의 사용을 관련시킵니다. 이러한 글루카피라노스 단량체는 스테롤(22)의크기와 일치하는 직경의 내부 소수성 공동을 가지고 있어 세포에서 콜레스테롤을 추출하여 기본 콜레스테롤 함량23에서고갈시됩니다. 일례로 는 2-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPβCD)이 있으며, 현재 니만-픽 타입 C질환의 치료를 위해 시험중인 전임상 약물로, 리소좀 콜레스테롤 저장을 특징으로 하는 유전적 유전적 치명적인 대사장애(24)이다. 콜레스테롤 고갈의 수준은 사용된 특정 유도체에 달려 있습니다. 예를 들어, HPβCD는 메틸화 유도체보다 낮은 용량을 가진 콜레스테롤을 추출하며, 메틸-β-시클로덱스트린(MβCD)24,,25,,26,,27,,28,,29,,30. 특히, 그러나, β-cyclodextrins는 또한 콜레스테롤 이외에 그밖 소수성 분자를 추출할 수 있습니다, 그 때 비특이적인 효력31귀착될 수 있는. 고갈과는 대조적으로, 세포와 조직은 콜레스테롤23로포화 된 β-cyclodextrin치료를 통해 콜레스테롤을 구체적으로 풍부하게 할 수 있습니다. 이러한 접근법은 또한 콜레스테롤고갈(31)에사용되는 β-사이클로덱스트린의 특이성에 대한 대조군으로서 사용될 수 있다. 조직 및 세포로부터의 콜레스테롤 고갈은 간단하고 세포를 저장하는 데 사용되는 배지에 용해된 30-60분 내지 5 mMMMMMΒCD에 대한 세포를 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 50% 감소할 수 있습니다(예를 들어, 해마 뉴런32,쥐 대뇌 동맥33). 한편, 조직 및 세포의 콜레스테롤 농축을 위한 β-사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 준비하는 것은 더 복잡하고, 프로토콜 섹션에서 설명될 것이다.
콜레스테롤포화 β-cyclodextrin를 사용하여 조직 과 세포를 풍부하게하는 대안 적인 접근은 조직/세포에 표현된 LDL 수용체에 의존하는 LDL의 사용을 관련시킵니다18. 이 접근법은 세포의 천연 콜레스테롤 항상성 기계를 사용하는 이점을 제공하지만, 몇 가지 한계가 있다. 첫째, LDL 수용체를 발현하지 않는 조직 및 세포는 이 접근법을 사용하여 농축될 수 없다. 둘째, LDL 입자는 콜레스테롤 이외에 다른 지질을 포함. 구체적으로, LDL은 단백질 아포B100 100(25%)으로 구성된다. 및 다음 지질 (75 %): ~ 6-8 % 콜레스테롤, ~ 45-50 % 콜레스테릴 에스테르, ~ 18-24 % 인지질, 및 ~ 4-8 % 트리 아실 글리세롤34. 따라서, LDL 입자를 통한 콜레스테롤의 전달은 비특이적이다. 셋째, LDL 수용체를 발현하는 조직 및 세포에서 LDL에 의한 콜레스테롤 함량 증가의 비율은 콜레스테롤포화 사이클로덱스트린을 사용하여 관찰된 증가보다 현저히 낮을 수 있다. 예를 들어, 이전 연구에서, LDL을 통해 콜레스테롤설치류 대뇌 동맥의 농축만 결과 10-15% 콜레스테롤 수치에 증가35. 대조적으로, 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 콜레스테롤포화사이클로덱스트린을 가진 이들 동맥의 농축은 콜레스테롤 함량의 >50% 증가를 초래하였다(대표 결과 섹션, 그림 1참조).
제노푸스 난소에서 콜레스테롤 수치의 변화
제노푸스 난모세포는 세포 및 단백질 기능을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 이종 발현 시스템을 구성합니다. 이전 연구는 제노푸스 난모세포에서 인지질 대구치 비율에 콜레스테롤이 0.5 ±0.136임을보여주었다. 콜레스테롤의 이 본질적인 높은 수준으로 인해, 이 시스템에서 콜레스테롤의 내용을 증가 하는 것은 도전, 아직 막 인지질과 콜레스테롤에서 만든 분산을 사용 하 여 달성 될 수 있다. 우리가 이 목적을 위해 선택한 인지질은 인공 평면 지질 이중층을 형성하기 위해 사용된 것과 유사하며 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 L-α-phosphatidyleolamine (POPE) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-phopho-l-serine (POPS)를 포함합니다. 이 접근법은 콜레스테롤 함량이 >50% 증가할 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 2참조).
인지질 기반 분산으로 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 대체 접근법은 조직과 세포가 농축되는 방식과 유사한 콜레스테롤로 포화 된 사이클로 덱스트린을 사용하는 것을 포함합니다. 그러나, 우리는 낮은 재현성과 효율성의 이 접근이, 콜레스테롤 내용에 있는 ~25% 증가의 평균으로 찾아냈습니다. 이는 이러한 두 가지 접근 방식의 로딩 용량이 다르기 때문일 수 있습니다(대표 결과 섹션, 그림 3참조). 대조적으로, 제노푸스 난모세포에서 콜레스테롤을 고갈시키기 위하여 cyclodextrin를 사용하여 콜레스테롤 내용에서 ~40% 감소귀착될 수 있다는 것을 보여주었습니다36.
여기에서는 콜레스테롤로 포화된 사이클로덱스트린과 리포좀을 이용한 제노푸스 난모세포의 적용을 통해 포유류 조직과 세포의 콜레스테롤 농축에 초점을 맞추고 있습니다. 두 접근 은 단백질 기능에 콜레스테롤의 증가 된 수준의 효과 설명 하기 위해 활용 될 수 있다. 단백질 기능의 콜레스테롤 변조의 메커니즘은 직접적인 상호 작용을 포함 할 수있다8 및 / 또는 간접 효과9. 콜레스테롤이 직접적인 상호 작용을 통해 단백질 기능에 영향을 미칠 때, 단백질 활동에 대한 콜레스테롤 수치의 증가의 효과는 세포 유형, 발현 시스템 또는 농축 접근법과 는 무관합니다. 예를 들어, 이러한 두 가지 접근법을 활용하여 심방 근세포37,해마 뉴런32,,38,HEK29339 세포, 제노푸스 난모세포32,,37로발현된 내측 정류 칼륨(GIRK) 채널에 대한 콜레스테롤의 효과를 결정하였다. 이러한 연구에서 얻은 결과는 일관되었다: 포유류 세포의 모든 세 가지 유형과 양서류 콜레스테롤 upregulated GIRK 채널 기능 (참조 대표 결과 섹션, 그림 4,해마 뉴런 및 제노푸스 oocytes에 해당 실험). 더욱이, 이들 연구에서 이루어진 관찰은 또한 심방 근세포37,,40 및 해마 뉴런32,,38마리가 고콜레스테롤 식이요법을 행한 동물로부터 신선하게 분리된 연구 결과와 일치하였다.40 특히, MβCD를 이용한 해마 뉴런의 콜레스테롤 농축은 콜레스테롤 수치와 GIRK 기능 모두에 높은 콜레스테롤 식이요법의 영향을 해결하는 데 사용되는 아토르바스타틴 치료의 효과를 역전시켰다38. 다른 연구에서는, 우리는 제노푸스 난모세포와 HEK293 세포41을모두 사용하여 내적으로 정류칼륨 채널 Kir2.1의 콜레스테롤 감도에 돌연변이의 효력을 조사했습니다. 다시, 채널의 감도에 대한 돌연변이의 효과는 두 시스템에서 유사하였다.
분자에 높은 콜레스테롤 수치의 영향을 결정 하기 위한 두 농축 방법의 응용 프로그램, 세포, 그리고 장기 기능 은 수많은. 특히, 세포와 조직을 풍부하게 하기 위해 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체의 사용은 그 특이성 때문에 크게 일반적이다. 이러한 접근법의 최근 예로는 HERG 채널 활성화 및 기본 메커니즘에 대한 콜레스테롤의 영향의 측정42,고슴도치 신호전달을촉진하기 위해 스무딩된 G 단백질 결합 수용체를 활성화시키는 발견, 및 줄기 세포 생체역학 및 포막 관련 링커 단백질을 통한 지방형성에서콜레스테롤의 역할의 식별44. 우리 자신의 연구에서, 우리는 MβCD와 포유류 조직 농축을 활용 :콜레스테롤 복합체는 혈관 평활근35, 45,46에서 칼슘의 기본 기능 및 전압 게이트 채널의 약리학적 프로필과 칼슘의 약리학적 프로필에 대한 콜레스테롤 농축의 효과를 연구하기 위해35,45,,46. 다른 연구에서는 콜레스테롤을 가진 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위한 인지질 계 분산 접근법을 사용하여 콜레스테롤 민감도41,,47,,48,,49에서KirK 채널에서 다른 부위의 역할을 결정하고 이들 채널에서 콜레스테롤 결합 부위를 결정할 뿐만 아니라32,50,,51.,
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Protocol
동물과 모든 실험 절차는 테네시 대학 건강 과학 센터에서 수행되었다 (UTHSC). 동물 및 실험 프로토콜의 관리는 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회의 인가 기관인 UTHSC의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 콜레스테롤포화 메틸β-사이클로덱스트린을 사용하는 조직및 세포의 농축
참고: 아래 콜레스테롤 농축 프로토콜은 조직, 세포 및 세포주에 적합합니다. 예를 들어, 우리는 포유류 대뇌 동맥을 풍부하게하기 위해 수행 된 단계를 설명합니다. 대표적인 결과는 대뇌동맥(도 1)과뉴런 모두에 대해 제공된다(도4).
- 콜레스테롤포화 MβCD의 준비
- MβCD 0.064 g의 무게를 측정하고 인산완충식염수(PBS) 용액 10 mL을 함유하는 플라스크에 용해하여 5 mmMMβCD의 최종 농도를 얻었다. MβCD가 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 저어주면 용액을 저어줍니다.
- 콜레스테롤 분말 0.0024 g의 무게와 0.63 mM 콜레스테롤 농도를 얻기 위해 동일한 플라스크에 추가. 그런 다음 용액을 힘차게 저어줍니다. 주걱을 사용하여 가능한 한 많은 콜레스테롤 덩어리를 분해하십시오 (일부 덩어리는 배양 될 때까지 유지됩니다).
- 플라스크를 적어도 두 겹의 파라핀 필름으로 덮고 밤새 37°C 수조에서 천천히(~30회 진동/분) 흔들어 줍니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 8-16 시간 후, 실온 (RT)에 용액을 냉각 한 다음 0.22 μm polyethersulfone 주사기 필터를 통해 유리 병에 걸러내십시오.
참고: 용액에서 다른 콜레스테롤 농도에 도달하려면 콜레스테롤과 MβCD의 양을 간단한 비율로 조정하십시오. MβCD:콜레스테롤 어금니 비율을 8:1로 유지하여 콜레스테롤이 있는 메틸 β-사이클로덱스트린 담체의 포화도를 얻는 것이 중요합니다. 콜레스테롤 을 풍부하게 하는 용액은 4°C에서 저장하는 경우에 즉시 또는 며칠의 과정을 통해 사용될 수 있습니다. 그러나 콜레스테롤 농축 능력은 시간이 지남에 따라 콜레스테롤 응집체가 나타나고 해결책이 흐려집니다.
- 콜레스테롤포화 MβCD를 가진 대뇌 동맥의 처리
- 스프라그 도울리 쥐(250-300 g)를 2% 이소플루란으로 챔버에 넣음으로써 안락사시한다. 그런 다음 날카로운 기요틴이나 큰 날카로운 가위를 사용하여 마취 된 쥐를 참수하십시오.
참고 : 정기적으로 이러한 절차를 수행하는 경우, 기요틴 선명에 대한 일정을 개발하는 것이 유용합니다. 또한 별도의 가위 쌍은 설치류 참수에 전념해야합니다. 설치류 참수하는 말단 절차입니다. 따라서 계측기는 멸균될 필요가 없습니다. 사용 후 비눗물로 청소하는 것으로 충분합니다. - 쥐의 머리를 연구원으로부터 멀리 떨어진 전방으로 향합니다. 중간 크기의 가위 쌍의 뾰족한 부분을 두개골과 뇌간 사이에 놓고 양쪽을 옆으로 자른다.
- 집게를 사용하여 측면 절단이 이루어진 두개골 의 기저부에서 위로 당겨 서 상단 두개골을 열고 조심스럽게 뇌를 제거하십시오. 두개골 내의 뇌를 잡고 있는 광학 신경을 잘라야 합니다.
- 제거 후 얼음에 PBS와 비커에 뇌를 넣어.
참고 : 뇌는 4 °C에서 4-6 시간 동안 얼음에 저장할 수 있습니다. - 비멸균 환경에서 쥐의 뇌를 충분한 PBS가 있는 왁스 처리 된 해부 그릇에 옮기고 침수합니다. 뇌를 고정하여 움직이지 않도록 합니다.
참고: 1.2.5단계는 RT에서 신속하게 수행할 수 있습니다. 그렇지 않으면 얼음에서 수행해야합니다. - 날카로운 집게와 작은 수술 가위를 사용하여 대뇌 동맥과 그 가지를 해부하여 RT의 PBS에서 현미경으로 뇌의 기저부에 윌리스의 원을 형성하는 그들의 가지를 해부하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.
- PBS에서 동맥 분절(최대 1cm 길이)을 96웰 플레이트 또는 35mm 접시에 담아 남은 혈액을 제거한 다음, 콜레스테롤 을 풍부하게 하는 용액(1.1단계에서 제조됨)을 10분 동안 충분히 하여 전체 동맥 분절을 덮습니다. 콜레스테롤 을 풍부하게 하는 용액이 충분하거나 동맥이 작거나 콜레스테롤 을 풍부하게 하는 해결책이 부족한 경우 96 웰 플레이트가 있는 경우 35mm 접시를 사용하십시오.
참고 : 동일한 접근 법은 60 분 배양 시간을 사용하여 콜레스테롤과 다른 조직과 세포를 풍부하게하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 접근법은 이전에 마우스 대뇌 동맥35, 45,,45해마 뉴런32,심방 근세포37,및 HEK 293 세포39의콜레스테롤 농축에 사용되어 왔다. 최소 인큐베이션 시간은 콜레스테롤에 민감한 분석법(예를 들어, 콜레스테롤에 민감한 형광 염료 필리핀으로 염색함으로써 조직 내 콜레스테롤의 양을 생화학적 결정)으로 다른 시점에서 콜레스테롤 농축의 유효성을 검사하는 것에 기초하여 각 조직 또는 세포 유형에 대해 결정되어야 한다.
- 스프라그 도울리 쥐(250-300 g)를 2% 이소플루란으로 챔버에 넣음으로써 안락사시한다. 그런 다음 날카로운 기요틴이나 큰 날카로운 가위를 사용하여 마취 된 쥐를 참수하십시오.
- 콜레스테롤 수치에 있는 어떤 변경을 결정하기 위하여 스테로이드 에 민감한 형광 염료 필리핀으로 동맥 조직을 얼룩.
참고: 대표적인 결과 섹션에서는 콜레스테롤 수치의 변화를 평가하기 위한 두 가지 접근법의 결과를 보여줍니다: 시판되는 콜레스테롤 산화다제 기반 키트(재료 표참조)의 적용을 통해 수행된 생화학 적 분석및 스테로이드에 민감한 형광 염료 필리핀으로 염색하는 생화학 분석. 첫 번째 방법은 제조업체의 지침에 따라 수행할 수 있습니다. 후자의 접근 방식에 대한 프로토콜은 아래에 제공됩니다.- 신선한 필리핀 분말 병을 사용하여 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 10 mg / mL 스톡 솔루션을 준비하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.
참고: 결과 솔루션은 빛에 민감합니다. 올바르게 준비하면 필리핀 스톡 솔루션이 황색입니다. 일부 필리핀 분말은 병 뚜껑에 달라 붙을 수 있습니다. 따라서, 전체 양의 필리핀을 유지하기 위해 DMSO 용매로 병과 캡을 헹군 것이 중요합니다. 일단 준비되면, 필리핀 주식은 며칠 이내에 사용해야합니다. 필리핀은 -20°C에서 어둠 속에서 보관하는 경우에도 5일 후에 형광 능력을 완전히 상실합니다. - 콜레스테롤 을 풍부하게하는 용액에서 동맥 세그먼트를 제거하고 5 분 동안 PBS로 3 x 씻어.
- 동맥 분들을 4% 파라포름알데히드에 얼음에 15분 동안 고정시다.
주의: 파라포름알데히드는 빛에 민감합니다. 따라서, 작업은 어둠 속에서 수행되어야한다. - 동맥 세그먼트를 RT에서 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 10 분 동안 배치하여 조직을 침투시키고 염료 침투를 촉진합니다.
- 쉐이커에서 5분 동안 PBS로 동맥 세그먼트를 3x 세척합니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
참고 : 트리톤이 완전히 씻겨 나면 PBS 용액의 표면에 거품이 없어야합니다. - PBS의 필리핀 스톡 용액을 25 μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. PBS 용액을 형성하는 동맥을 제거하고 어둠 속에서 1 시간 동안 희석 된 필리핀 용액에 넣습니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 셰이커에서 5분 동안 PBS로 동맥 세그먼트를 3x 헹구어 필리핀을 씻어내줍니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 증류수로 동맥 분절을 간략하게 헹구고 종이 냅킨으로 과도한 액체를 흡수하고 시판되는 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 동맥을장착합니다(재료 표 참조).
- 동맥의 압연 또는 비틀림을 피하면서 커버 슬립으로 동맥을 덮고 RT의 어두운 부위에서 24 시간 동안 건조하도록 슬라이드를 설정합니다.
- 마운팅 매체가 건조된 후 커버슬립 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하고 매니큐어를 10-15분 동안 건조시도록 두십시오.
- 이미징 전에 슬라이드를 RT에 평형화합니다.
- 340-380 nm로 설정된 여기및 385-470 nm에서 방출된 형광 현미경 또는 형광 판독기를 가진 조직을 상시화한다.
주의: 필리핀 광표백제; 따라서 샘플을 즉시 이미지화해야 합니다.
- 신선한 필리핀 분말 병을 사용하여 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 10 mg / mL 스톡 솔루션을 준비하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.
2. 콜레스테롤이 풍부한 인지질 계 분산액을 사용한 제노푸스 난모세포의 농축 (리포좀)
- 솔루션 준비
- 콜레스테롤의 재고 용액을 준비하려면 10 mL 유리 비커 또는 병에 클로로폼 1 mL에 콜레스테롤 분말 10 mg을 녹입니다. 용액을 1.5 mL 뚜껑이 있는 유리 병으로 옮김.
주의 : 클로로 포름의 독성과 급속한 증발을 고려하여 후드에서 작동하고 얼음에 시약을 유지하십시오. - 콜레스테롤이 풍부한 인지질에 대해 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7.4 버퍼를 준비합니다. 이렇게 하려면, 에를렌마이어 플라스크 5.5905 g의 KCl과 0.6057 g의 트리스를 이중 증류수에 총 0.5L 부피로 녹입니다. 또 다른 플라스크에서는 KCl 5.5905 g과 HEPES 1.19155 g을 이중 증류수에 총 0.5L 부피로 용해시면 됩니다. 두 가지 솔루션을 1L Erlenmeyer 플라스크에 함께 혼합하고 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
참고: 생성된 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES 용액을 4 °C에 보관하십시오. - ND96 프리 미디엄 oocyte 배양 (낮은 K+, 낮은Ca2 +) 버퍼를 준비하려면, 1 ML KCl의 1 mL, 1 M MgCl2의1 mL, 2 M NaCl의 45.5 mL, 1 L Erlenmeyer 플라스크에 1/1 M NaOH-HEPES의 5 mL을 결합합니다. 900 mL 이중 증류수를 추가하고 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 그런 다음 1M CaCl2의 1.8 mL를 추가하고 용액을 필터링합니다.
참고: ND96 용액을 만드는 데 사용되는 성분 간의 비율의 약간의 변화는 콜레스테롤 농축에 중요하지 않은 것으로 보이며, 아마도 ND96 용액은 농축 단계 자체 에서 사용되지 않고 저장을 위해 사용되지 않기 때문일 수 있습니다. 예를 들어 나트륨 및 염화물 이온의 농도가 약간 낮은 1 L 용액은 1 M KCl의 2 mL, 1 MMgCl2의 1 mL, 1 M NaCl의 82.5 mL, 5 mL의 1 MCACl 2 및 1 M CaCl2의 1.8 mL을 결합하여 만들어집니다(Ca2+는무료 용액을 얻기 위해 생략됩니다).2+ NaOH를 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조정합니다. 생성된 ND96 난모세포 배양 액을 최대 1개월 동안 4°C에 보관합니다.
- 콜레스테롤의 재고 용액을 준비하려면 10 mL 유리 비커 또는 병에 클로로폼 1 mL에 콜레스테롤 분말 10 mg을 녹입니다. 용액을 1.5 mL 뚜껑이 있는 유리 병으로 옮김.
- 콜레스테롤 리포솜을 가진 인지질 기지를 둔 분산의 준비
- 12 mL 유리 튜브에, 다음 10 mg/mL 클로로포름 용해 지질 용액의 각각 200 μL을 결합: L-α-포스파티딜레탄올라민, 1-팔미토일-2-올레오일-스네글리세로-3-인-l-세린, 및 콜레스테롤.
- 후드의 클로로포름을 증발하여 질소 스트림 하에서 천천히 건조시다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 150 mM KCl 및 10 mM Tris-HEPES로 구성된 완충액의 800 μL에서 지질을 pH = 7.4에서 중단하고 파라핀 필름으로 덮습니다.
- 유백색 혼합물이 형성될 때까지 80 kHz에서 10 분 동안 부드럽게 초음파 처리하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.
주의 : 초음파 처리 할 때 유리 튜브의 분산이 부드럽게 진동하여 작은 파도를 형성해야합니다. 분산 방울은 튜브 내에서 점프해서는 안됩니다.
- 콜레스테롤을 가진 제노푸스 난모세포 풍부
참고 : 개구리 oocyte 함유 난소는 두 가지 소스에서 얻을 수 있습니다 : 첫째, 제노푸스 laevis 여성 개구리는 사내 수술의 목적을 위해 보관 할 수 있습니다. 이 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야 합니다. 둘째, 전체 난소는 상업 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. 전체 난소를 구입하거나 격리한 다음 단계 2.3.1-2.3.4에 설명된 대로 소화하는 대신, 개별 난모세포는 상업적으로 구매할 수 있습니다. 후자를 사용하는 경우 2.3.1-2.3.4 단계를 건너뛸 수 있습니다.- 갓 얻은 난소를 ND96 용액에서 ~14°C로 유지합니다. 이러한 조건하에서 난소는 최대 1 주 동안 저장할 수 있습니다.
- 개별 난모를 얻으려면 날카로운 집게를 사용하여 여러 곳에서 난소 낭을 방해하십시오. 난소 덩어리를 60mm 플레이트에 넣고 5 mL의 Ca2+-free ND96을 0.5 mg/mL 콜라게나아제로 보충합니다. RT에서 15분 동안 60진동/분에서 궤도 셰이커를 흔들어 주세요.
참고 :이 단계는 난소 낭의 소화를 보장합니다. 효소 활성을 보존하려면 ND96이 함유된 콜라게나아제(>1 시간)를 장기간 보관하지 마십시오. 15°C 미만의 시원한 온도에서도 짧은 보관을 수행해야 합니다. - 넓은 팁이 있는 전사 피펫을 사용하여, oocyte 함유 용액을 약 5-10배 위아래로 활발하게 파이펫하여 개별 난모세포를 분리한다. 이 단계에서 는 솔루션이 어두워집니다.
- 용액이 투명해질 때까지 Ca2+-free ND96으로 oocytes를 빠르게 헹구십시오.
- 좁은 팁이 있는 전사 피펫을 사용하여 젠타미신 2 mg/mL로 보충된 ND-96 용액을 함유한 개별 난모세포를 Ca2+로 옮깁니다.
참고: 이 단계는 난모세포를 저장해야 할 때 필수적입니다. 개별 난모세포는 14-17°C에서 며칠 동안 인큐베이터에 보관할 수 있다. 그러나, 희끄무레한 죽은 oocytes는 독성 화학 물질로 용액의 오염을 피하기 위해 적어도 하루에 한 번 제거해야합니다. - 콜레스테롤이 풍부한 인지질 기반 분산액의 90 μL을 96 웰 플레이트의 한 우물로 옮김.
- 가능한 한 적은 매체로 ND96 배지에서 우물로 최대 6 개의 난모체를 옮깁니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
주의: 전이 중에 난모세포가 공기에 노출되지 않도록 하여 난모세포가 손상되지 않도록 하십시오. - 96웰 플레이트를 3차원 플랫폼 회전자 상에 배치하여 5-10분 동안 세포의 난모세포에 작은 궤도 운동을 제공한다.
- ND96 한 방울을 웰에 넣고 콜레스테롤이 풍부한 oocytes를 96 웰 플레이트에서 ND96이 있는 35mm 플레이트로 옮기면 즉시 사용할 수 있습니다. 이 단계는 매우 중요합니다.
- 시판되는 콜레스테롤 산화제 기반 키트(재료 표참조)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 콜레스테롤 수치의 변화를 평가하십시오.
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Representative Results
콜레스테롤조직과 콜레스테롤을 가진 세포를 풍부하게 하기 위한 수단으로 콜레스테롤포화 사이클로덱스트린의 사용은 잘 확립되어 있습니다. 여기에서, 우리는 먼저 콜레스테롤포화MβCD를 사용하여 콜레스테롤을 가진 쥐 대뇌 동맥을 풍부하게 하기 위한 이 널리 이용되는 접근의 응용을 보여줍니다. 도 1A는 이미지화된 대뇌 동맥 평활근 층의 예를 나타내고 1시간 동안 6.25 μM-6.25 mM에 이르는 콜레스테롤의 농도가 증가함에 따라 조직 농축시 얻어진 필리핀 관련 형광의 농도 의존적 증가를 나타내고, 이미징 데이터의 상응하는 정량화는 도 1B에도시되어 있다. 특히, 1시간 배양 기간 후 콜레스테롤 수치의 증가가 ~50% 증가하여 MβCD:콜레스테롤 복합체로 치료 직후 관찰되었다. 그림 1C가 1 시간 동안 0.625 mM 콜레스테롤로 처리 된 샘플에 대해 입증했듯이, 처리 된 조직을 이용한 기능적 연구는 콜레스테롤 농축이 완료 된 후 가능한 한 빨리 수행되어야합니다. 더욱이, 1시간 배양 시간은 일반적으로 이 접근법을 사용하여 콜레스테롤을 가진 조직 및 세포를 풍부하게 하기 위하여 이용되는 동안, 배양의 5 분은 그림 1D에도시된 바와 같이 콜레스테롤 산화제 기지를 둔 생화학적인 분석에 의해 결정된 것과 같이 대뇌 동맥 콜레스테롤 함량에 있는 통계적으로 유의한 증가를 달성하기위하여 일반적으로 충분하다. 인큐베이션 시간이 60분으로 증가했을 때 콜레스테롤 함량의 증가는 동일한 수준으로 유지되었다(도1D).
콜레스테롤과 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하는 수단으로 콜레스테롤이 풍부한 리포좀의 효과는 도 2A-C에서입증된다. 콜레스테롤이 결여된 대조군 인지질계 분산액에서 콜레스테롤 수치에서 유의한 변화가 관찰되지는않았지만(도 2A),콜레스테롤을 포함하는 인지질계 분산액을 치료한 지 5분 만에 콜레스테롤 수치가 유의하게 증가하였고, 인립지성 분산시간이 60분으로 증가했을 때와 같은 수준으로 유지되었다(도2B). 유사한 효과는 두 개구리로부터 수득된 난모세포의 두 가지 다른 배치에서 관찰되었다. 특히, 콜레스테롤의 초기 수준과 콜레스테롤 함량의 변화는 두 배치 사이에서 다양: 배치 1에서, 콜레스테롤의 초기 농도는 단백질의 mg 당 콜레스테롤의 64 μg, 반면 배치 2의 초기 농도는 단백질의 mg 당 콜레스테롤의 45 μg, 이는 ~70% 일괄 처리에서 콜레스테롤의 초기 수준. 60 분 처리 후, 배치 1의 콜레스테롤 농도는 단백질 mg 당 콜레스테롤 124 μg인 반면, 배치 2에서는 단백질 mg 당 콜레스테롤 67 μg이었습니다. 따라서, 콜레스테롤의 농도는 배치 1에서 ~90% 이상 증가한 반면, 배치 2에서는 ~50% 증가하였다. 그럼에도 불구 하 고, 두 배치에서 콜레스테롤 수치에 상당한 증가 이 종으로 발현 된 단백질의 기능에 콜레스테롤 수치 증가의 효과 조사 하는 수단을 제공 합니다. 또한, 콜레스테롤과 제노푸스 난모세포를 풍부하게하기위한 인지질 기반 분산 접근법은 조직과 세포에서 수행된 것처럼 콜레스테롤로 포화 된 사이클로 덱스트린의 적용보다 더 효과적일 것으로 보인다. 그림 3에서 알 수 있듯이, 5mMcyclodextrin을 사용하여 난모세포를 풍부하게 하기 위해 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 적용하면 콜레스테롤 수치가 평균 ~25% 증가했습니다.
세포를 풍부하게 하기 위한 사이클로덱스트린 기반 접근법의 효과는 또한 해마의 CA1 영역으로부터 신선하게 단리된 뉴런에서도 입증된다(도4A). 그림 4B에서 알 수 있듯이, 60 분 동안 콜레스테롤포화MβCD에 있는 뉴런의 배양은 필리핀 관련 형광에 의해 결정된 바와 같이 콜레스테롤 수치의 2배 이상 증가귀착되었다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 해 마 뉴런에서 발현 GIRK 채널에 콜레스테롤 증가의 효과 테스트. 그림 4C에서 알 수 있듯이, 콜레스테롤 수치의 이러한 변화는 GIRK 전류의 현저한 증가를 초래했습니다. 유사하게, 우리는 제노푸스 난모세포 이종 발현 시스템을 사용하여 뇌에서 발현되는 1차 GIRK 소단위에 대한 콜레스테롤 농축효과를 시험했다. 이를 위해 제노푸스 난소에서 막 발현 및활성(52)을 증가시키는 GIRK2의 모공 돌연변이인 GIRK2^(GIRK2_E152D)를 과발화하고, 인지질 기반 분산 접근법을 사용하여 60분 동안 콜레스테롤로 난모세포를 풍부하게 하였다. 도면 4D-F가 입증한 바와 같이, 콜레스테롤 수치의 증가는 GIRK 채널 기능에 대한 뉴런의 콜레스테롤 수치 증가 효과와 유사한 전류의 현저한 증가를 초래했다. 이러한 데이터는 단백질 활동 및 세포 기능에 대한 콜레스테롤 수치 증가의 영향을 결정하기 위해 위에서 설명한 두 가지 접근법의 효과, 일관성 및 유용성을 더욱 입증합니다.
그림 1: 콜레스테롤포화메틸β-사이클로덱스트린을 이용한 콜레스테롤을 가진 쥐 대뇌 동맥의 대표적인 농축. (a)1시간 동안 6.25 μM-6.25 mM에 이르는 콜레스테롤농도증가와 함께 조직 농축시에 얻어진 필리핀 관련 형광의 농도 의존적 증가를 보여주는 상화상 대뇌 동맥 평활근 층의 예(A)에서이미징 데이터의 정량화.A 전체 이미지의 형광 강도 측정은 상용 소프트웨어에 내장된 "측정" 기능을 사용하여 수행되었다. 각 콜레스테롤 농도에서≥ 3 이미지는 별도의 동물 기증자로부터 수확된 동맥에서 수집되었습니다. 각 콜레스테롤 농도에 대해 데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. (C)대뇌 동맥 평활근 층 의 콜레스테롤 수치는 0.625 mM 콜레스테롤을 가진 1 시간 배양 기간 직후, 및 3 h 후의 치료 (즉, 배양 1 시간 및 PBS에서 2 시간). (D)콜레스테롤 옥시다아제 기반 생화학 적 분석에 의해 결정된 바와 같이 배양 시간에 콜레스테롤 수치의 의존성. 별표(*p ≤ 0.05)로 유의한 차이가 표시됩니다. 패널(A)(콜레스테롤 농도 0 mM-0.625 mM),(B)및(C)북부 외45에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 리포좀을 사용한 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 난모세포의 대표적인 농축. (A) 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치를 5-60분 동안 배양한 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치를 5-60분 동안 배양하였다.B 도시된 대조군 바는 5분 동안 콜레스테롤이 없는 리포좀에서 배양을 의미하며 비교로 나타난다. (C)콜레스테롤이 풍부한 리포좀을 사용하여 제노푸스 난모세포의 두 가지 다른 배치의 콜레스테롤 농축 효과를 5 및 60분 동안 비교하였다. 별표(*p ≤ 0.05)로 유의한 차이가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 콜레스테롤포화메틸β-사이클로덱스트린을 이용한 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 난모세포의 대표적인 농축. (A)대조군 ND96 에서 배양된 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치의 변화를 5-60분 동안 대조군으로 배양하였다.(B)MβCD에서 배양된 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 수치의 변화는 5-60분 동안 콜레스테롤포화를 이하였다. 도시된 대조군 막대는 5분 동안 대조군 매체에서 배양을 지칭하고 비교로서 도시된다. 별표(*p ≤ 0.05)로 유의한 차이가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포와 제노푸스 난모세포의 단백질 기능에 대한 콜레스테롤 농축 연구의 대표적인 예: 내적으로 칼륨 채널을 정류하는 G 단백질에 대한 콜레스테롤의 영향. (A)필리핀 관련 형광 신호의 해 마 CA1 피라미드 뉴런 대조에 쥐에서 (왼쪽) 대 콜레스테롤 농축 (오른쪽). (B)필리핀 관련 형광 신호의 요약 데이터는 대조군 및 콜레스테롤이 풍부하게 농축된 갓 고립된 해마 CA1 피라미드 뉴런으로부터 수득하였다. 콜레스테롤 풍부화는 1 시간 동안 콜레스테롤로 포화 된 MβCD에서 뉴런을 배양함으로써 달성되었습니다 (n = 12-14). (C)이온 전류(I)-전압(V) 곡선은 CA1 영역에서 해마 뉴런에서 의 GIRK 전류에(B)에기재된 바와 같이 콜레스테롤 농축의 효과를 나타남에 관한 것이다. (D)콜레스테롤이 풍부한 인지질계 리포좀을 이용한 콜레스테롤 농축 효과를 보여주는 대표적인 트레이스^(GIRK2_E152D)는 제노푸스 난모세포에서 -80 mV 및 +80 mV로 발현된다. (e)-80 mV (n = 6-9)에서(D)의요약 데이터. 별표(*p ≤ 0.05)로 유의한 차이가 표시됩니다. 부키야 외32에서서브피규어(B-E)가 수정되었습니다.B-E 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
포유류 조직과 세포를 풍부하게하는 방법과 콜레스테롤과 제노푸스 난모세포는 개별 분자 종에 높은 콜레스테롤 수치의 효과를 조사하기위한 강력한 도구를 구성, 복잡한 거대 분자 시스템에 (예를 들어, 단백질), 세포와 장기 기능에. 이 논문에서는, 우리는 그 같은 연구 결과를 촉진하는 2개의 상보적인 접근을 기술했습니다. 첫째, 우리는 콜레스테롤포화 MβCD를 사용하여 콜레스테롤로 조직과 세포를 풍부하게하는 방법을 설명했습니다. 우리는 대뇌 동맥 세그먼트에서, 이 접근은 콜레스테롤 수치에 있는 ~50%의 증가 귀착되었다는 것을 설명했습니다. 게다가, 최근 연구에서, 우리는 동일한 접근이 CA1 지역에서 해마 뉴런에 있는 콜레스테롤 내용에 있는 2 배 이상 증가로 이끌어 낸다는 것을 보여주었습니다. 대조적으로, 그러나, 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하는 수단으로 이 접근을 채택하는 것은 제노푸스 난모세포에 있는 콜레스테롤 내용에 있는 단지 ~ 25% 증가 귀착되었습니다. 따라서, 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위해, 우리는 콜레스테롤 수치의 최소 ~50% 증가를 일관되게 초래하는 인지질 기반 분산 접근법을 개발했습니다. 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위한 이 접근법의 장점은 MβCD:콜레스테롤 복합 접근법의 로딩 용량에 비해 향상된 로딩 용량에서 비롯될 수 있다. MβCD:콜레스테롤 복합접근법이 조직과 세포를 풍부하게 하기 위해 최적화되어 있는 동안, 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하기 위한 적용을 개선하기 위해 프로토콜의 추가 최적화가 요구될 수도 있다.
콜레스테롤을 가진 제노푸스 oocytes를 풍부하게 하기 위하여 이용된 인지질 기지를 둔 분산은 평면 지질 이중층을 만들기 위하여 널리 이용되는 2개의 지질을 포함합니다 (즉, L-α-phosphatidylethanolamine 및 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-sinspho-l-sinine). 그러나, 이전 연구에서, 그것은 또한 포스 파 디 딜 콜린과 cholate 를 포함 하는 리포좀에서 콜레스테롤을 사용 하 여 제노푸스 oocytes 풍부 수 표시 되었다36. 이 방법은 혈장 막에서 콜레스테롤 / 인지질 대구치 비율이 0.5 ± 0.1에서 0.9 ± 0.1로 증가시키고 평균 농축 비율은 71 %로 증가했습니다. 농축의 이 평균 백분율은 우리가 관찰한 콜레스테롤 함량증가의 평균 수준(~70.5%)과 매우 유사하며, 분산을 형성하는 데 사용되는 인지질의 선택이 이 접근법을 사용하여 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 난모세포를 풍부하게 하는 데 는 중요하지 않다는 것을 시사합니다.
설명된 각 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. MβCD:콜레스테롤 혼합물을 8:1 몰 비로 준비한 후, 콜레스테롤과 MβCD의 포화를 보장하기 위해, 플라스크를 적어도 2층의 파라핀 막으로 덮고 밤새 서서히 37°C 수조로 설정하는 것이 중요하다. 콜레스테롤 처리를 위한 조직을 해부할 때 조직이 늘어나거나 절단되지 않다는 것을 확인하기 위하여 온화하게 하는 것이 중요합니다. 염료 침투를 용이하게하기 위해 조직을 투과 한 후, PBS에서 조직 세그먼트를 철저히 세척하는 것이 중요합니다. 필리핀의 티슈 염색은 어둠 속에서 수행되어야하며, 염색이 완료 된 후 필리핀을 꼼꼼하게 씻어 내야합니다. 콜레스테롤이 풍부한 인지질 기반 분산을 준비할 때, 유리 관의 분산이 부드럽게 진동하여 작은 파도를 형성하여 분산에서 콜레스테롤의 분리를 피하는 것이 중요합니다. 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 치료를 위해, 난모세포는 난모세포가 온전하게 유지하도록 공기에 노출시키지 않는 동안 가능한 한 적은 배지로 콜레스테롤이 풍부한 인지질 계 분산으로 ND96 배지에서 웰로 난모세포를 전달하는 것이 중요합니다. 조직, 세포 및 제노푸스 난소의 본질적인 기계로 인해 콜레스테롤 수치가 평형화 될 수 있으며 시간이 지남에 따라 원래 수준으로 돌아갈 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 기능적 연구는 배양 시간 직후에 수행될 필요가 있다. 여기에서, 우리는 콜레스테롤이 풍부하게 된 대뇌 동맥에서 이 개념을 입증했습니다, 1 시간 잠복기 후에 콜레스테롤 수치2 시간의 증가가 잠복기 직후에 관찰된 증가의 대략 반이었다는 것을 보여주었습니다.
위에서 설명한 중요한 단계를 따르기에도 불구하고 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 콜레스테롤 수치의 증가 콜레스테롤 을 풍부 하 게 치료 다음 관찰 되지 않을 수 있습니다. 이 경우 콜레스테롤 을 풍부하게하는 매체에서 콜레스테롤 농도를 증가시킬 필요가있을 수 있습니다. 같은 조직, 세포, 그리고 제노푸스 난모세포의 콜레스테롤 농축에 적용됩니다. 그러나, MβCD:콜레스테롤 복합접근법을 이용한 치료법의 제조에서, 콜레스테롤 농도의 증가와 함께 MβCD의 양은 콜레스테롤과 8:1 몰 비를 유지하기 위해 증가되어야 한다. 또한, 콜레스테롤이 용액에서 침전하는 경향이 있고, 해결책은 콜레스테롤을 풍부하게 하는 효율성을 분실하기 때문에 신선한 콜레스테롤 풍부하게 하는 해결책을 준비하는 것이 필요할 지도 모릅니다. 콜레스테롤 농축 후 필리핀 신호가 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 새로운 재고를 준비하고 실험을 반복하기 위해 신선한 필리핀 분말을 사용해야 할 수도 있습니다. 필리핀 형광은 빠르게 감소하고, 재고 솔루션은 며칠 이상 저장할 수 없습니다. 필리핀 염색의 한 가지 제한은 콜레스테롤 이외의 스테로이드를 인식 하는 것 같다. 예를 들면, 우리는 최근에 coprostanol45를가진 농축 다음 쥐 대뇌 동맥에 있는 필리핀 관련형 형광 신호에 있는 증가를 설명했습니다. 따라서 필리핀 염색 결과는 신중하게 해석되어야하며, 의심스러울 때 결과를 확증하기 위해 대체 방법을 사용해야합니다. 한 가지 가능성은 시판되는 콜레스테롤 옥시다아제 계 키트의 적용을 통해 생화학적 분석을 수행하는 것이다.
요약하면, 제시된 접근은 50%에 가깝거나 초과하는 콜레스테롤 풍부를 달성하는 데 매우 효과적입니다. 실제로, 대뇌 동맥에 있는 콜레스테롤 수치에 있는 ~50%에서 초래하는 MβCD:콜레스테롤 복합적인 접근은 이 조직을 풍부하게 하기 위하여 LDL를 사용하는 것보다 훨씬 더 효율적입니다, 이는 콜레스테롤35에있는 단지 ~10% 증가 초래합니다. 같은 제노푸스 난모세포를 풍부하게하는 콜레스테롤 농축 인지질 기반 분산 (리포솜)의 적용에 적용됩니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이 접근은 일관되게 적어도 50% 콜레스테롤 수치에 있는 증가 결과. 중요한 것은, 이러한 두 가지 접근법은 고콜레스테롤 식이에 동물을 실시하여 얻은 콜레스테롤 증가와 비교할 수 있는 시험관 내 콜레스테롤 농축에 대한 결과물32,,37,,40,,53,,54이다. 더욱이, 주 긴 높은 콜레스테롤 규정식과는 대조적으로, 시험관 내 접근은 콜레스테롤 수준에 있는 통계적으로 유의하고 꾸준한 국가 증가에 도달하기 위하여 잠복기 시간의 단지 몇 분을 요구합니다.
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Disclosures
A. M. Dopico 박사는 알코올 남용 및 알코올 중독에 관한 국가 자문위원회의 특별, 파트 타임, 연방 직원 및 현재 회원입니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 (A.R.-D.)에서 과학자 개발 보조금 (11SDG5190025)에 의해 지원되었다, 건강 R01의 국립 연구소에 의해 AA-023764 (A.N.B.에), HL-104631 및 R37 AA-11560 (A.M.D.에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
References
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- Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
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