Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Anrikning av däggdjursvävnader och Xenopus Oocyter med kolesterol

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60734
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Summary

Två metoder för kolesterol anrikning presenteras: tillämpningen av cyclodextrin mättad med kolesterol för att berika däggdjur vävnader och celler, och användningen av kolesterol-berikade fosfolipid-baserade dispersioner (liposomer) för att berika Xenopus äggceller. Dessa metoder är avgörande för att bestämma effekterna av förhöjda kolesterolnivåer i molekylär, cellulär, och organfunktion.

Abstract

Kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler, inklusive Xenopus oocyter som används för att studera cellfunktion, kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika metoder. Här beskriver vi två viktiga metoder som används för detta ändamål. Först beskriver vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med hjälp av cyklodextrin mättad med kolesterol med hjälp av cerebrala artärer (vävnader) och hippocampus nervceller (celler) som exempel. Denna metod kan användas för alla typer av vävnad, celler eller cellinjer. Ett alternativt tillvägagångssätt för kolesterolanrikning innebär användning av lipoprotein med låg densitet (LDL). Fördelen med detta tillvägagångssätt är att den använder en del av den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen. Cyklodextrinmetoden kan dock användas för att berika alla celltyper av intresse med kolesterol, är LDL-metoden begränsad till celler som uttrycker LDL-receptorer (t.ex. leverceller, benmärgsbaserade celler såsom blod leukocyter och vävnadsmakrofager) och anrikningsnivån beror på koncentrationen och rörligheten hos LDL-receptorn. Dessutom, LDL partiklar inkluderar andra lipider, så kolesterol leverans är ospecificerad. För det andra beskriver vi hur man berikar Xenopus oocyter med kolesterol med hjälp av en fosfolipid-baserad dispersion (dvs. liposomer) som innehåller kolesterol. Xenopus oocyter utgör ett populärt heterologt uttryckssystem som används för att studera cell- och proteinfunktion. För både cyclodextrin-baserade kolesterol anrikning strategi av däggdjur vävnad (cerebrala artärer) och för fosfolipid-baserade kolesterol anrikning strategi Xenopus oocyter, visar vi att kolesterolnivåerna når en maximal efter 5 min inkubation. Denna nivå av kolesterol förblir konstant under längre perioder av inkubation (t.ex. 60 min). Tillsammans, dessa data utgör grunden för optimerade tidsmässiga förhållanden för kolesterol anrikning av vävnader, celler, och Xenopus oocyter för funktionella studier som syftar till att ifrågasätta effekterna av kolesterol anrikning.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulär lipid, spelar många kritiska funktionella och strukturella roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Från att reglera de fysiska egenskaperna hos plasmamembranet till att säkerställa cellens livskraft, tillväxt, spridning, och fungerar som en signalering och prekursor molekyl i en uppsjö av biokemiska vägar, kolesterol är en absolut nödvändigt komponent som krävs för normal cell och organfunktion. Som ett resultat, kolesterolbrist resulterar i allvarliga fysiska missbildningar och en mängd olika sjukdomar. Å andra sidan, även en liten ökning av kolesterol över fysiologiska nivåer (2-3x) är cytotoxiska1,2,10 och har associerats med utvecklingen av sjukdomar, inklusive hjärt-1111,12,13 och neurodegenerativa sjukdomar14,15,16,17. Således, att förhöra de kritiska funktionerna av kolesterol och att bestämma effekten av förändringar i kolesterolnivåer, olika metoder som ändrar innehållet av kolesterol i vävnader, celler, och Xenopus äggceller har utvecklats.

Ändring av kolesterolnivåer i däggdjursvävnader och celler
Flera metoder kan utnyttjas för att minska nivåerna av kolesterol i vävnader och celler18. Ett tillvägagångssätt innebär deras exponering för statiner upplöst i lipoprotein-saknas serum för att hämma HMG-CoA reduktas, som styr graden avkolesterolsyntes 19,20. Emellertid, dessa kolesterolsänkande läkemedel hämmar också bildandet av icke-sterol produkter längs mevalonat vägen. Därför tillsätts en liten mängd mevalonat för att möjliggöra bildandet av dessa produkter21 och öka specificiteten i detta tillvägagångssätt. Ett annat tillvägagångssätt för att minska kolesterolnivåerna innebär användning av β-cyklodextrins. Dessa glucopyranose monomers har en intern hydrofoba hålighet med en diameter som matchar storleken på steroler22, vilket underlättar utvinning av kolesterol från celler, vilket bryter dem från deras inhemska kolesterolhalt23. Ett exempel är 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), ett prekliniskt läkemedel som för närvarande testas för behandling av Niemann-Pick typ C sjukdom, en genetiskt ärftlig dödlig metabolisk störning som kännetecknas av lysosomal kolesterol lagring24. Nivån av kolesterol utarmning beror på den specifika derivat som används. HPβCD extraherar till exempel kolesterol med lägre kapacitet än det metylerade derivatet, metyl-β-cyklodextrin (MβCD)24,,25,,26,27,28,29,30. Särskilt kan dock β-cyklodextrins också extrahera andra hydrofoba molekyler utöver kolesterol, vilket sedan kan resultera i ospecifika effekter31. I motsats till utarmning, celler och vävnader kan vara särskilt berikas med kolesterol genom behandling med β-cyclodextrin som har förmätits med kolesterol23. Detta tillvägagångssätt kan också användas som en kontroll för specificiteten hos β-cyklodextris som används för kolesterolutarmning31. Utarmning av kolesterol från vävnader och celler är enkel och kan uppnås genom att exponera cellerna i 30-60 min till 5 mM MβCD upplöst i det medium som används för att lagra cellerna. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en 50% minskning av kolesterolhalten (t.ex. i hippocampus nervceller32, råtta cerebrala artärer33). Å andra sidan, förbereda β-cyclodextrin-kolesterol komplex för kolesterol anrikning av vävnad och celler är mer komplex, och kommer att beskrivas i protokollet avsnitt.

Ett alternativt tillvägagångssätt för att berika vävnader och celler med β-cyklodextrin mättad med kolesterol innebär användning av LDL, som är beroende av LDL-receptorer uttryckta i vävnaderna/cellerna18. Även om detta tillvägagångssätt erbjuder fördelen av att använda den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen, det har flera begränsningar. För det första kan vävnader och celler som inte uttrycker LDL-receptorn inte berikas med hjälp av denna metod. För det andra innehåller LDL-partiklar andra lipider utöver kolesterol. Specifikt består LDL av proteinet ApoB100 (25%) och följande lipider (75%): ~6-8% kolesterol, ~45-50% cholesteryl ester, ~18-24% fosfolipider, och ~4-8% triacylglycerols34. Således är leverans av kolesterol via LDL-partiklar ospecifik. För det tredje, andelen ökning av kolesterolhalten av LDL i vävnader och celler som uttrycker LDL-receptorn kan vara betydligt lägre än den ökning som observerats med cyklodextrin mättad med kolesterol. Till exempel, i en tidigare studie, anrikning av gnagare cerebrala artärer med kolesterol via LDL resulterade i endast en 10-15% ökning av kolesterolnivåer35. Däremot resulterade anrikning av dessa artärer med cyklodextrin mättad med kolesterol enligt beskrivningen i protokollavsnittet i >50% ökning av kolesterolhalten (se avsnittet Representativa resultat, figur 1).

Ändring av kolesterolnivåer i Xenopus oocyter
Xenopus oocyter utgör ett heterologt uttryckssystem som vanligen används för att studera cell- och proteinfunktion. Tidigare studier har visat att kolesterolet till fosfolipid molar förhållandet i Xenopus oocyter är 0,5 ± 0,136. På grund av denna inneboende höga nivå av kolesterol, öka innehållet av kolesterol i detta system är utmanande, men kan uppnås med hjälp av dispersioner gjorda av membran fosfolipider och kolesterol. Fosfolipiderna som vi har valt för detta ändamål liknar dem som används för att bilda konstgjorda plana lipidbilager och inkluderar L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrivs i protokollet avsnitt. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en ökning av kolesterolhalten på >50 % (se avsnittet Representativa resultat, figur 2).

En alternativ metod för att berika Xenopus oocyter med fosfolipid-baserade dispersioner innebär användning av cyklodextrin mättad med kolesterol, vilket liknar hur vävnader och celler berikas. Vi har dock funnit detta tillvägagångssätt vara av låg reproducerbarhet och effektivitet, med ett genomsnitt på ~ 25% ökning av kolesterolhalten. Detta beror möjligen på de olika lastkapaciteten hos dessa två metoder (se avsnittet Representativa resultat, figur 3). Däremot har det visat sig att använda cyclodextrin att tömma kolesterol från Xenopus oocyter kan resultera i en ~ 40% minskning av kolesterolhalten36.

Här fokuserar vi på kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler genom tillämpning av cyklodextrin mättad med kolesterol, och av Xenopus oocyter med liposomer. Båda metoderna kan utnyttjas för att avgränsa effekten av ökade nivåer av kolesterol på proteinfunktion. Mekanismerna för kolesterolmodulering av proteinfunktion kan innebära direkta interaktioner8 och/eller indirekta effekter9. När kolesterol påverkar proteinfunktion via direkta interaktioner, effekten av en ökning av kolesterolnivåer på proteinaktivitet är sannolikt oberoende av celltyp, uttryckssystem, eller anrikning strategi. Till exempel använde vi dessa två metoder för att bestämma effekten av kolesterol på G-protein gated inåt korrigera kalium (GIRK) kanaler uttryckt i förmaksflimmermyocyter 37, hippocampus nervceller32,38, HEK29339 celler, och Xenopus oocyter32,37. De resultat som erhölls i dessa studier var konsekventa: i alla tre typerna av däggdjursceller och i amfibiska äggceller kolesterol upregulated GIRK kanal funktion (se representativa resultat avsnitt, figur 4, för hippocampus nervceller och motsvarande experiment i Xenopus äggceller). Dessutom var de observationer som gjorts i dessa studier också överensstämmer med resultaten av studier som utförts i förmaksflimmermyocyter 37,40 och hippocampus nervceller32,38 nyligen isolerade från djur som utsätts för en hög kolesterol diet40. Särskilt kolesterol anrikning av hippocampus nervceller med MβCD vände effekten av atorvastatin terapi som används för att ta itu med effekterna av det höga kolesterolet kost både på kolesterolnivåer och GIRK funktion38. I andra studier undersökte vi effekten av mutationer på kolesterolkänsligheten hos den inåtriktade reterbara kaliumkanalen Kir2.1 med både Xenopus oocyter och HEK293-celler41. Återigen var effekten av mutationerna på känsligheten i kanalen liknande i de två systemen.

Tillämpningarna av både anrikningsmetoder för att bestämma effekten av förhöjda kolesterolnivåer på molekylära, cellulära och organfunktion är många. I synnerhet är användningen av cyklodextrin-kolesterol komplex för att berika celler och vävnader mycket vanligt till stor del på grund av dess specificitet. Senaste exemplen på detta tillvägagångssätt är fastställandet av effekterna av kolesterol på HERG kanalaktivering och underliggande mekanismer42, upptäckten att kolesterol aktiverar G proteinkopplade receptorn utjämnas för att främja Igelkott signalering43, och identifiering av den roll som kolesterol i stamceller biomekanik och adipogenesis genom membran-associerade länkare proteiner44. I vårt eget arbete använde vi anrikning av däggdjursvävnad med MβCD:kolesterolkomplex för att studera effekten av kolesterolanrikning på grundläggande funktion och den farmakologiska profilen av kalcium- och spänningsgated kanaler av stor ledning (BK, MaxiK) i kärlmustatur35,,45,46. I andra studier använde vi fosfolipid-baserade dispersion strategi för att berika Xenopus oocyter med kolesterol för att bestämma roller i olika regioner i Kir2.1 och GIRK kanaler i kolesterol känslighet41,47,48,49, samt att bestämma förmodade kolesterol bindande platser i dessa kanaler32,,50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella försök med djur utfördes vid University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Skötsel av djur och försöksprotokoll har granskats och godkänts av UTHSC:s kommitté för djurvård och användning, som är en institution som ackrediterats av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Anrikning av vävnader och celler med metyl-β-cyklodextrin mättat med kolesterol

OBS: Kolesterolanrikning protokollet nedan är lämplig för vävnader, celler och cellinjer. Som ett exempel beskriver vi de steg som utförs för att berika däggdjur cerebrala artärer. Representativa resultat ges för både hjärnartärer (figur 1) och nervceller (figur 4).

  1. Beredning av MβCD mättad med kolesterol
    1. Väg 0,064 g MβCD och lös upp den i en kolv som innehåller 10 ml fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS) för att uppnå en slutlig koncentration på 5 mM MβCD. Rör om lösningen med en omrörstång för att säkerställa att MβCD är helt upplöst.
    2. Väg 0,0024 g kolesterolpulver och tillsätt det i samma kolv för att få en 0,63 mM kolesterolkoncentration. Rör sedan om lösningen kraftigt. Använd en spatel för att bryta upp så många kolesterol bitar som möjligt (vissa bitar kommer att förbli tills inkubation).
    3. Täck kolven med minst två lager paraffinfilm och skaka långsamt (~30 svängningar/min) i ett 37 °C vattenbad över natten. Det här steget är kritiskt.
    4. Efter 8-16 timmar, kyl lösningen till rumstemperatur (RT) och filtrera den sedan genom ett 0,22 μm polyetersulfonsprutanfilter i en glasflaska.
      OBS: För att nå olika kolesterolkoncentrationer i lösningen, justera mängden av både kolesterol och MβCD med enkel proportion. Det är viktigt att bibehålla MβCD:kolesterol molar förhållandet vid 8:1 för att få mättnad av metyl-β-cyclodextrin bärare med kolesterol. Den kolesterolberikande lösningen kan användas omedelbart eller under flera dagar om den förvaras vid 4 °C. Emellertid, kolesterol-berikande förmåga minskar med tiden som kolesterol aggregat visas, och lösningen blir grumlig.
  2. Behandling av cerebrala artärer med MβCD mättad med kolesterol
    1. Avliva en Sprague Dawley råtta (250-300 g) genom att placera den i en kammare med 2% isofluran. Halshugg sedan den sövda råttan med hjälp av en vass giljotin eller en stor vass sax.
      OBS: Om du utför dessa procedurer regelbundet är det användbart att utveckla ett schema för giljotinsvässning. Dessutom bör en separat sax ägnas åt gnagare halshuggning. Gnagare halshuggning är ett terminalförfarande; Instrumenten behöver därför inte vara sterila. Rengöring med tvålvatten efter varje användning är tillräcklig.
    2. Placera råttans huvud vänd framåt, bort från forskaren. Placera den spetsiga delen av en medelstor sax mellan skallen och hjärnstammen, och skär i sidled på båda sidor.
    3. Använd pincett för att bända upp skallen öppen genom att dra upp på basen av skallen där laterala nedskärningar gjordes och försiktigt ta bort hjärnan. Se till att skära de optiska nerver som håller hjärnan i skallen.
    4. Lägg hjärnan i en bägare med PBS på is efter avlägsnande.
      OBS: Hjärnan kan förvaras på is i 4-6 h vid 4 °C.
    5. I en nonsterile miljö överföra råtta hjärnan till en vaxad dissekering skål med tillräckligt PBS att dränka den. Nåla fast hjärnan för att förhindra att den rör sig.
      OBS: Steg 1.2.5 kan utföras på RT om den utförs snabbt. Annars måste det göras på is.
    6. Använd vassa pincett och små kirurgiska saxar för att dissekera hjärnartärerna och deras grenar som bildar Circle of Willis vid basen av hjärnan under mikroskopet i PBS på RT. Var försiktig när du dissekerar för att säkerställa att artärvävnaden inte sträcks eller skärs. Det här steget är kritiskt.
    7. Skölj kort artärsegmenten (upp till 1 cm långa) i PBS antingen i en 96-brunnsplatta eller i en 35 mm-skål för att ta bort överblivet blod och placera dem sedan i 10 minuter i tillräckligt hög av den kolesterolberikande lösningen (beredd i steg 1.1) för att täcka hela artärsegmenten. Använd en 35 mm maträtt om det finns en riklig mängd kolesterolberikande lösning och en 96 väl platta om artärerna är små eller om det finns en brist på kolesterol-berikande lösning.
      OBS: Samma metod kan användas för att berika andra vävnader och celler med kolesterol med hjälp av en 60 min inkubationstid. Till exempel, detta tillvägagångssätt har tidigare använts för kolesterol anrikning av mus cerebrala artärer35,45, hippocampus nervceller32, förmaksflimmermyocyter 37, och HEK 293 celler39. Den minimala inkubationstiden måste bestämmas för varje vävnad eller celltyp baserat på validering av kolesterolanrikning vid olika tidpunkter med en kolesterolkänslig analys (t.ex. den biokemiska bestämningen av mängden kolesterol i vävnaden genom att färga med det kolesterolkänsliga fluorescensfärgämnet filipin).
  3. Färg artärvävnaden med steroid-känsliga fluorescens färgämne filipin att bestämma eventuella förändringar i kolesterolnivåer.
    OBS: I avsnittet Representativa resultat visar vi resultaten av två metoder för att bedöma förändringar i kolesterolnivåer: en biokemisk analys som utförs genom tillämpning av en kommersiellt tillgänglig kolesteroloxidas-baserade kit (se Tabell över material) och färgning med steroid-känsliga fluorescens färgämne filipin. Den första metoden kan utföras genom att följa tillverkarens anvisningar. Protokollet för det senare tillvägagångssättet finns nedan.
    1. Med hjälp av en ny flaska filipinpulver, bered en 10 mg/ml-stamlösning i dimetylsulfaoxid (DMSO). Det här steget är kritiskt.
      Den resulterande lösningen är ljuskänslig. Om den bereds på rätt sätt är filipin-stamlösningen gulaktig. Vissa filipin pulver kan hålla sig till locket. Därför är det viktigt att skölja flaskan och locket med DMSO lösningsmedel för att behålla hela mängden filipin. När det väl har förberetts måste filipinbeståndet användas inom några dagar. Filipin förlorar helt sin fluorescens förmåga efter 5 dagar, även när lagras i mörkret vid -20 °C.
    2. Ta bort artärsegmenten från den kolesterolberikande lösningen och tvätta dem 3x med PBS i 5 min.
    3. Fixa artärsegmenten i 4% paraformaldehyd i 15 min på is.
      VARNING: Paraformaldehyd är ljuskänslig. Därför måste arbetet utföras i mörker.
    4. Placera artärsegmenten i 0,5% Triton i PBS vid RT i 10 min för att permeabilisera vävnaden och underlätta färgpenetration.
    5. Tvätta artärsegmenten 3x med PBS i 5 min på en shaker. Det här steget är kritiskt.
      OBS: När Triton har tvättats ut helt bör det inte finnas några bubblor på pbs-lösningens yta.
    6. Späd filipinlagerlösningen i PBS till en slutlig koncentration på 25 μg/ml. Ta bort artärerna bildar PBS-lösningen och placera dem i den utspädda filipinlösningen för 1 h i mörker. Det här steget är kritiskt.
    7. Tvätta ut filipin genom att skölja artärsegmenten 3x med PBS i 5 min på en shaker. Det här steget är kritiskt.
    8. Skölj artärsegmenten en kort stund med destillerat vatten, absorbera överdriven vätska med en pappersservett och montera artärerna på en rutschkana med hjälp av kommersiellt tillgängliga monteringsmedier (se Tabell över material).
    9. Täck artären med ett täckslip undvika rullande eller vridning av artären och ställ in bilderna att torka i ett mörkt område på RT för 24 h.
    10. Efter monteringsmediet torkar, försegla täckglaskanterna med klart nagellack och låt nagellacket torka i 10-15 min. Förvara rutschbanorna i mörker vid -20 °C.
    11. Balansera bilderna till RT före avbildning.
    12. Bild vävnaden med fluorescensmikroskop eller fluorescensläsare med excitationen inställd på 340-380 nm och utsläpp vid 385-470 nm.
      VARNING: Filipin fotobleaches snabbt; prover måste därför avbildas omgående.

2. Anrikning av Xenopus oocyter med kolesterolberikade fosfolipidbaserade dispersioner (liposomer)

  1. Förberedelse av lösningar
    1. För att förbereda en stamlösning av kolesterol, lös 10 mg kolesterolpulver i 1 ml kloroform i en 10 ml glasbägare eller flaska. Överför lösningen till en 1,5 ml-täckt glasflaska.
      VARNING: Med tanke på kloroformens toxicitet och snabba avdunstning, arbeta i huven och förvara reagenser på is.
    2. Förbered en 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 buffert för kolesterolberikade fosfolipider. Lös upp 5,5905 g KCl och 0,6057 g Tris i dubbeldestillerat vatten i en Erlenmeyerkolv med 5,5905 g KCl och 0,6057 g Tris i dubbeldestillerat vatten. Lös upp 5,5905 g KCl och 1,19155 g HEPES i dubbeldestillerat vatten i en annan kolv till totalt 0,5 L volym. Blanda ihop de två lösningarna i en 1 L Erlenmeyerkolv och justera pH-värdet till 7,4 med HCl.
      OBS: Förvara den resulterande 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES-lösningen vid 4 °C.
    3. För att förbereda ND96 pre-medium oocyte odling (låg K+, låg Ca2 +) buffert, kombinera 1 mL av 2 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2, 45,5 ml 2 M NaCl, och 5 ml 1/1 M NaOH-HEPES i en 1 L Erlenmeyer kolv. Tillsätt 900 ml dubbeldestillerat vatten och justera pH-värdet till 7,4 med HCl. Överför lösningen till en 1 L cylinder och för volymen till 1 L med dubbeldestillerat vatten. Tillsätt sedan 1,8 ml 1 M CaCl2 och filtrera lösningen.
      OBS: Små variationer i förhållandet mellan de komponenter som används för att göra en ND96-lösning verkar inte vara avgörande för kolesterolanrikning, möjligen eftersom ND96-lösningen inte används under anrikningssteget själv utan för lagring. Ett exempel är en 1 L-lösning som har en något lägre koncentration av natrium- och kloridjoner, och görs genom att kombinera 2 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2, 82,5 ml 1 M NaCl, 5 ml 1 M HEPES och 1,8 ml 1 M CaCl2 (Ca2+ utelämnas för att få en Ca2 + fri lösning). Justera lösningens pH-kort till 7.4 med NaOH. Förvara den resulterande ND96 äggcellsodlingslösningen vid 4 °C i upp till 1 månad.
  2. Beredning av fosfolipidbaserad dispersion med kolesterolliposomer
    1. I ett 12 ml glasrör, kombinera 200 μL av var och en av följande 10 mg/ml kloroform-upplösta lipidlösningar: L-α-fosfatidyletanolamin, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine och kolesterol.
    2. Avdunsta kloroformen i huven för att torka långsamt under en ström av kväve. Det här steget är kritiskt.
    3. Suspendera lipiderna i 800 μL buffrad lösning bestående av 150 mM KCl och 10 mM Tris-HEPES vid pH = 7.4 och täck med paraffinfilm.
    4. Sonicate försiktigt på 80 kHz i 10 min tills en mjölkaktig blandning bildas. Det här steget är kritiskt.
      VARNING: Vid ljudbehandling ska dispersionen i glasröret vibrera försiktigt och bilda små vågor. Droppar av dispersion bör inte hoppa i röret.
  3. Berikande Xenopus oocyter med kolesterol
    OBS: Frog äggstockar som innehåller äggstockar kan erhållas från två källor: För det första, Xenopus laevis kvinnliga grodor kan inhysas för intern kirurgi. Detta förfarande måste godkännas av kommittén för institutionsvård och användning av djurhållning. För det andra kan hela äggstockar köpas från kommersiella leverantörer. Som ett alternativ till att köpa eller isolera hela äggstockar och sedan smälta dem som beskrivs i steg 2.3.1-2.3.4, enskilda äggceller finns kommersiellt för köp. Om det senare används kan steg 2.3.1-2.3.4 hoppas över.
    1. Förvara de nybakade äggstockarna vid ~14 °C i en ND96-lösning. Under dessa förhållanden kan äggstockarna lagras i upp till 1 vecka.
    2. För att få individuella äggceller, störa äggstockssäcken på flera ställen med hjälp av vassa pincett. Placera äggstockarna bitar i en 60 mm platta, med 5 ml Ca2 +-fri ND96 kompletteras med 0,5 mg /mL kollagena. Skaka på en orbital shaker vid 60 svängningar / min i 15 min på RT.
      OBS: Detta steg kommer att säkerställa matsmältningen av äggstockssäcken. För att bevara enzymatisk aktivitet, undvik att lagra kollagenas som innehåller ND96 under längre tidsperioder (>1 h). Även kort förvaring bör utföras vid svala temperaturer under 15 °C.
    3. Med hjälp av en överföringspipette med en bred spets, kraftigt pipett den äggcellshaltiga lösningen upp och ner ca 5-10x för att separera enskilda äggceller. I det här steget blir lösningen mörk.
    4. Skölj snabbt äggcellerna med Ca2+-fri ND96 tills lösningen blir transparent.
    5. Överför enskilda äggceller till Ca2+-innehållande ND-96-lösning kompletterad med 2 mg/ml gentamicin med hjälp av en överföringspipette med en smal spets.
      OBS: Detta steg är viktigt när det är nödvändigt att lagra äggceller. Enskilda äggceller kan förvaras i en inkubator i flera dagar vid 14-17 °C. Döda äggceller som är vitaktiga måste dock avlägsnas minst en gång om dagen för att undvika kontaminering av lösningen med giftiga kemikalier.
    6. Överför 90 μL av den kolesterolberikade fosfolipidbaserad dispersionen till en brunn av en 96-brunnsplatta.
    7. Överför upp till sex äggceller från ND96-mediet till brunnen med så lite medium som möjligt. Det här steget är kritiskt.
      VARNING: Utsätt inte äggcellerna för luften under överföringen för att hålla äggcellerna intakta.
    8. Placera 96 väl plattan på en tredimensionell plattform rotator för att ge en liten omloppsbanor rörelse till äggceller i cellen i 5-10 min.
    9. Tillsätt en droppe ND96 i brunnen, och överför kolesterolberikade äggceller från 96 väl plattan till en 35 mm platta med ND96 för omedelbar användning. Det här steget är kritiskt.
    10. Använd ett kommersiellt tillgängligt kolesteroloxidasbaserat kit (se materialförteckning)för att bedöma förändringar i kolesterolnivåer genom att följa tillverkarens anvisningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användningen av cyklodextrin mättad med kolesterol som ett sätt att berika vävnader och celler med kolesterol är väl etablerad. Här visar vi först tillämpningen av denna allmänt använda metoden för berika råtta cerebrala artärer med kolesterol med hjälp av MβCD mättad med kolesterol. Figur 1A visar ett exempel på ett avbildad cerebralt artär glatt muskelskikt och visar den koncentrationsberoende ökningen av filipin-associerad fluorescens som erhålls vid vävnadsanrikning med ökande koncentrationer av kolesterol från 6,25 μM-6,25 mM för 1 h. Motsvarande kvantifiering av bildframställningsdata avbildas i figur 1B. Noterbart är att ökningen av kolesterolnivåerna 2 h efter inkubationstiden på 1 h var ~50% av ökningen som observerades omedelbart efter behandlingen med MβCD:kolesterolkomplexet. Som framgår av figur 1C för det prov som behandlats med 0,625 mM-kolesterol i 1 h måste funktionella studier med de behandlade vävnaderna utföras så snart som möjligt efter det att kolesterolberikningen har slutförts. Dessutom, medan en 1 h inkubationstid används ofta för att berika vävnader och celler med kolesterol med hjälp av denna metod, 5 min inkubation är vanligtvis tillräckligt för att uppnå en statistiskt signifikant ökning av cerebrala artär kolesterol innehåll som bestäms av en kolesterol oxidas-baserade biokemiska analys, som skildras i figur 1D. Ökningen av kolesterolhalten låg kvar på samma nivå när inkubationstiden höjdes till 60 min (figur 1D).

Effektiviteten av kolesterolberikade liposomer som ett sätt att berika Xenopus oocyter med kolesterol visas i figur 2A-C. Även om ingen signifikant förändring observerades i kolesterolnivåer i kontroll fosfolipid-baserade dispersioner saknar kolesterol (Figur 2A), kolesterolnivåer ökade betydligt efter endast 5 min behandling med fosfolipid-baserade dispersioner som inkluderade kolesterol, och förblev på samma nivå när inkubationstiden höjdes till 60 min (Figur 2B). En liknande effekt observerades i två olika partier av äggceller som erhölls från två grodor. Särskilt, dock, både de ursprungliga nivåerna av kolesterol och förändringen i kolesterolhalten varierade mellan de två partierna: i parti 1, den ursprungliga koncentrationen av kolesterol var 64 μg kolesterol per mg protein, medan den ursprungliga koncentrationen i sats 2 var 45 μg kolesterol per mg protein, vilket är ~ 70% av de ursprungliga nivåerna av kolesterol i sats 1. Efter en 60 min behandling var koncentrationen av kolesterol i sats 1 124 μg kolesterol per mg protein, medan det i sats 2 var 67 μg kolesterol per mg protein. Således, medan koncentrationen av kolesterol ökade med över ~ 90% i sats 1, ökade den med ~ 50% i sats 2. Ändå ger den betydande ökningen av kolesterolnivåer i båda partierna möjlighet att undersöka effekten av en ökning av kolesterolnivåerna på funktionen av proteiner uttryckt i detta heterologa uttryckssystem. Dessutom verkar fosfolipid-baserade dispersion strategi för berika Xenopus oocyter med kolesterol vara effektivare än tillämpningen av cyclodextrin mättad med kolesterol som görs i vävnader och celler. Som figur 3 visar, tillämpning av cyclodextrin-kolesterol komplex att berika äggceller med 5mM cyclodextrin resulterade i ett genomsnitt på endast ~ 25% ökning av kolesterolnivåer.

Effektiviteten av den cyklodextrinbaserade metoden för berikande celler visas också i nervceller som nyligen isolerats från CA1-regionen i hippocampus (figur 4A). Som figur 4B visar, inkubation av nervceller i MβCD mättad med kolesterol för 60 min resulterade i över 2x ökning av kolesterolnivåer som bestäms av filipin-associerade fluorescens. Med hjälp av detta tillvägagångssätt testade vi effekten av ökningen av kolesterol på GIRK-kanaler uttryckta i hippocampus nervceller. Som figur 4C visar, denna förändring i kolesterolnivåer resulterade i en betydande ökning av GIRK strömmar. På samma sätt testade vi effekten av kolesterol anrikning på den primära GIRK underavdelning uttryckt i hjärnan, GIRK2, med hjälp av Xenopus oocytes heterologa uttryck system. För detta ändamål överuttryckte vi GIRK2^ (GIRK2_E152D), en pormutant av GIRK2 som ökar dess membranuttryck och aktivitet52 i Xenopus oocyter, och berikade äggcellerna med kolesterol i 60 min med fosfolipidbaserad dispersionsmetod. Som figur 4D-F visar, ökningen av kolesterolnivåer resulterade i en betydande ökning av strömmar liknar effekten av ökade kolesterolnivåer i nervceller på GIRK kanal funktion. Dessa data visar ytterligare effektiviteten, konsekvensen och nyttan av de två metoder som beskrivs ovan för att bestämma effekterna av ökade kolesterolnivåer på proteinaktivitet och cellulär funktion.

Figure 1
Figur 1: Representativ anrikning av råtta cerebrala artärer med kolesterol med metyl-β-cyclodextrin mättad med kolesterol. (A)Ett exempel på ett avbildad cerebralt artär glatt muskulaturskikt som visar den koncentrationsberoende ökningen av filipin-associerad fluorescens som erhålls vid vävnadsanrikning med ökande koncentrationer av kolesterol från 6,25 μM-6,25 mM för 1 h. (B) Kvantifiering av bilddata i (A). Fluorescensintensitetsmätning av hela bilden utfördes med hjälp av den inbyggda "Measurement"-funktionen i kommersiell programvara. Vid varje kolesterolkoncentration samlades ≥3 bilder från artärer som skördades från separata djurdonatorer. För varje kolesterolkoncentration presenteras data som medelvärdet ± standardfel. (C)Kolesterolnivåer i cerebral artär glatt muskulatur lager segment omedelbart efter en 1 h inkubationstid med 0,625 mM kolesterol, och 3 h efter början av behandlingen (dvs. 1 h inkubation följt av 2 h i PBS). (D)Beroende av kolesterolnivåer på inkubationstiden som bestäms av en kolesteroloxidasbaserad biokemisk analys. En signifikant skillnad indikeras av en asterisk (*p ≤ 0,05). Paneler(A)(kolesterolkoncentrationer 0 mM-0,625 mM),(B)och(C)har modifierats från nord o.a.45. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativ anrikning av Xenopus oocyter med kolesterol med hjälp av liposomer. (A)Vik förändring i kolesterolnivåer av kontroll Xenopus oocyter inkuberade i kolesterolfria liposomer för 5-60 min. (B) Vik förändring i kolesterolnivåer av Xenopus oocyter inkuberas i kolesterol-berikade liposomer för 5-60 min. Den avbildade kontrollbaren refererar till inkubation i kolesterolfria liposomer i 5 min och visas som en jämförelse. C)Jämförelse av effekten av kolesterolanrikning av två olika partier Xenopus oocyter med kolesterolberikade liposomer i 5 och 60 min. En signifikant skillnad indikeras av en asterisk (*p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativ anrikning av Xenopus oocyter med kolesterol med metyl-β-cyklodextrin mättat med kolesterol. (A)Vik förändring i kolesterolnivåer av kontroll Xenopus oocyter inkuberade i kontroll ND96 media för 5-60 min. (B) Vik förändring i kolesterolnivåer av Xenopus oocyter inkuberas i MβCD mättad med kolesterol för 5-60 min. Den avbildade kontrollfältet refererar till inkubation i kontrollmedia i 5 min och visas som en jämförelse. En signifikant skillnad indikeras av en asterisk (*p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa exempel på studier av kolesterolanrikning på proteinfunktion i celler och Xenopus-oocyter: kolesterolets inverkan på G-protein inåt och rea potassiumkanaler. (A) Filipin-associerade fluorescens signal hippocampus CA1 pyramidal neuron från råttor på kontroll (vänster) kontra kolesterol-berikade (höger). (B)Sammanfattande data av filipin-associerade fluorescens signaler som erhållits från kontroll och kolesterol-berikade nyligen isolerade hippocampus CA1 pyramidala nervceller. Kolesterol anrikning uppnåddes genom inkubera nervceller i MβCD mättad med kolesterol för 1 h (n = 12-14). (C) Jonström (I)-spänning(V) kurva som skildrar effekten av kolesterol anrikning som beskrivs i (B) på GIRK strömmar i hippocampus nervceller från CA1 regionen. D) Representativa spår som visar effekten av kolesterolanrikning med kolesterolberikad fosfolipidbaserade liposomer på GIRK2^ (GIRK2_E152D) uttryckta i Xenopus oocyter vid -80 mV och +80 mV. (E)Sammanfattande uppgifter om(D)vid -80 mV (n = 6-9). En signifikant skillnad indikeras av en asterisk (*p ≤ 0,05). Underfigurer (B-E) har ändrats från Bukiya et al.32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder för att berika däggdjursvävnader och däggdjursceller och Xenopus-oocyter med kolesterol utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka effekten av förhöjda kolesterolnivåer på enskilda molekylära arter, på komplexa makromolekylära system (t.ex. proteiner) och på cellulära och organiska funktion. I detta dokument har vi beskrivit två kompletterande metoder som underlättar sådana studier. Först beskrev vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med MβCD mättad med kolesterol. Vi visade att i cerebral artär segment, resulterade detta tillvägagångssätt i en ökning med ~ 50% i kolesterolnivåer. Dessutom, i en färsk studie, Vi visade att samma tillvägagångssätt leder till en över 2x ökning av kolesterolhalten i hippocampus nervceller från CA1 regionen. Däremot, med hjälp av detta tillvägagångssätt som ett sätt att berika Xenopus äggceller resulterade i endast ~ 25% ökning av kolesterolhalten i Xenopus äggceller. Således, för att berika Xenopus oocyter, vi har utvecklat en fosfolipid-baserad dispersion strategi som konsekvent resulterar i minst ~ 50% ökning av kolesterolnivåer. Det är möjligt att fördelen med detta tillvägagångssätt för att berika Xenopus oocyter härrör från en förbättrad lastkapacitet jämfört med lastkapaciteten hos MβCD:cholesterol complex-metoden. Det är också möjligt att medan MβCD: kolesterol komplexa metoden är optimerad för berikande vävnader och celler, krävs ytterligare optimering av protokollet för att förbättra dess tillämpning för att berika Xenopus oocyter.

Den fosfolipidbaserade dispersion som används för att berika Xenopus oocyter med kolesterol innehåller två lipider som ofta används för att skapa plana lipidbilayers (dvs. L-α-fosfatidyletanolamin och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Emellertid, i en tidigare studie, Det visades att Xenopus äggceller kan också berikas med kolesterol från liposomer som inkluderade fosfatidylkolin och kola36. Denna metod resulterade i en ökning av förhållandet kolesterol/fosfolipid molar i plasmamembranet från 0,5 ± 0,1 till 0,9 ± 0,1 med en genomsnittlig anrikningsprocent på 71 %. Denna genomsnittliga andel anrikning är mycket lik den genomsnittliga nivån av ökning av kolesterolinnehåll som vi observerade (~ 70,5%), vilket tyder på att valet av fosfolipider som används för att bilda spridningen är inte avgörande för att berika Xenopus äggceller med kolesterol med hjälp av denna metod.

Varje protokoll som beskrivs innehåller flera kritiska steg. Efter att ha förberett en MβCD:kolesterol blandning på en 8:1 molar förhållande för att säkerställa mättnad av MβCD med kolesterol, är det viktigt att täcka kolven med minst två lager paraffinfilm och ställa in den i en långsamt skakar 37 °C vattenbad över natten. Vid dissekering av vävnader för kolesterolbehandling är det viktigt att vara skonsam för att säkerställa att vävnaden inte sträcks eller skärs. Efter permeabilisering av vävnaden för att underlätta färgpenetration, är det viktigt att noggrant tvätta vävnadssegmenten i PBS. Vävnad färgning i fillipin måste utföras i mörkret, och fillipin måste noggrant tvättas ut efter färgning är klar. Vid beredning av kolesterolberikade fosfolipidbaserade dispersioner är det viktigt att se till att spridningen i glasröret vibrerar försiktigt och bildar små vågor, för att undvika separation av kolesterolet från spridningen. För kolesterolbehandling av Xenopus oocyter är det viktigt att överföra äggcellerna från ND96-mediet till brunnen med den kolesterolberikade fosfolipidbaserade dispersionen med så lite medium som möjligt utan att utsätta äggcellerna för luft för att hålla oocyterna intakta. Det är viktigt att notera att på grund av den inneboende maskineri i vävnader, celler, och Xenopus äggceller, kolesterolnivåer kan jämvikt, och sedan återgå till sina ursprungliga nivåer över tiden. Följaktligen måste funktionella studier utföras omedelbart efter inkubationstiden. Här har vi visat detta begrepp i cerebrala artärer berikade med kolesterol, visar att ökningen av kolesterolnivåer 2 h efter en 1 h inkubationstid var ungefär hälften av den ökning som observerats omedelbart efter inkubationstiden.

Trots att de kritiska stegen beskrivs ovan kan det uppstå flera utmaningar. Till exempel, en ökning av kolesterolnivåer kan inte observeras efter kolesterolberikande behandling. Om så är fallet kan det vara nödvändigt att öka koncentrationen av kolesterol i kolesterolberikande media. Detsamma gäller kolesterolanrikning av vävnader, celler och Xenopus oocyter. Vid beredning av behandlingar med MβCD:kolesterolkomplex metod bör dock mängden MβCD ökas med ökningen av kolesterolkoncentrationen för att upprätthålla ett 8:1 molförhållande med kolesterol. Dessutom, Det kan vara nödvändigt att förbereda en ny kolesterol-berikande lösning, eftersom kolesterol tenderar att fälla ut ur lösningen, och lösningen förlorar sin kolesterolberikande effektivitet. Efter kolesterolanrikning är det möjligt att en filipinsignal inte kommer att observeras. Om så är fallet kan det vara nödvändigt att använda ett färskt filipinpulver för att förbereda ett nytt lager och upprepa experimentet. Filipinfluorescensen minskar snabbt och stamlösningen kan inte lagras på mer än flera dagar. En begränsning av filipin färgning är att det verkar känna igen steroider än kolesterol. Till exempel har vi nyligen visat en ökning av filipin-associerade fluorescens signal i råtta cerebrala artärer efter anrikning med coprostanol45. Således bör filipin färgning resultat tolkas med försiktighet, och när du är osäker, alternativa metoder bör användas för att bekräfta resultaten. En möjlighet skulle vara att utföra en biokemisk analys genom tillämpning av en kommersiellt tillgänglig kolesterol oxidas-baserade kit.

Sammanfattningsvis är de presenterade metoderna mycket effektiva för att uppnå kolesterolanrikning på nära eller över 50 %. Faktum är att MβCD: kolesterol komplex metod som resulterar i ~ 50% i kolesterolnivåer i cerebrala artärer är mycket effektivare än att använda LDL för att berika dessa vävnader, vilket resulterar i en ren ~ 10% ökning av kolesterol35. Detsamma gäller tillämpningen av kolesterolberikade fosfolipidbaserade dispersioner (liposomer) för att berika Xenopus oocyter. Som beskrivits ovan, detta tillvägagångssätt resulterar konsekvent i minst en 50% ökning av kolesterolnivåer. Viktigt, dessa två metoder för kolesterol anrikning in vitro avkastning resultat som är jämförbara med kolesterolökning erhålls genom att utsätta djuren för en hög kolesterol diet32,37,40,53,54. Dessutom, i motsats till veckor långa höga kolesterol dieter, in vitro-metoder kräver bara några minuter av inkubationstid för att nå en statistiskt signifikant och steady-state ökning av kolesterolnivån.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr A. M. Dopico är en speciell, deltid, federal anställd och nuvarande medlem av The National Advisory Council on Alcohol Abuse and Alcoholism.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) från American Heart Association (till A.R.-D.), och av National Institute of Health R01 bidrag AA-023764 (till A.N.B.), och HL-104631 och R37 AA-11560 (till A.M.D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Tags

Biokemi kolesterolanrikning lipider cyklodextrin-kolesterol komplex dispersion liposomer fosfolipider low-density lipoprotein LDL nervceller cerebrala artärer Xenopus oocyter kaliumkanaler
Anrikning av däggdjursvävnader och <em>Xenopus</em> Oocyter med kolesterol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slayden, A., North, K., Bisen, S.,… More

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter