Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60734
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Summary

To metoder for kolesterol berikelse presenteres: anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol for å berike pattedyr vev og celler, og bruk av kolesterolberiket fosfolipid-baserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytes. Disse metodene er instrumentelle for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer i molekylær, cellulær og organfunksjon.

Abstract

Kolesterol berikelse av pattedyr vev og celler, inkludert Xenopus oocytes som brukes til å studere cellefunksjon, kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder. Her beskriver vi to viktige tilnærminger som brukes til dette formålet. Først beskriver vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av cyclodextrin mettet med kolesterol ved hjelp av cerebralarterier (vev) og hippocampal nevroner (celler) som eksempler. Denne tilnærmingen kan brukes til alle typer vev, celler eller cellelinjer. En alternativ tilnærming for kolesterol berikelse innebærer bruk av lav tetthet lipoprotein (LDL). Fordelen med denne tilnærmingen er at den bruker en del av det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen. Men mens cyclodextrin tilnærming kan brukes til å berike noen celletype interesse med kolesterol, er LDL-tilnærmingen begrenset til celler som uttrykker LDL-reseptorer (f.eks. leverceller, benmargsavledede celler som blodleukocytter og vevmakrofager), og nivået av berikelse avhenger av konsentrasjonen og mobiliteten til LDL-reseptoren. Videre inkluderer LDL-partikler andre lipider, så kolesterollevering er ikke spesifikk. For det andre beskriver vi hvordan du beriker Xenopus oocytes med kolesterol ved hjelp av en fosfolipidbasert dispersjon (dvs. liposomer) som inkluderer kolesterol. Xenopus oocytes utgjør et populært heterologøst uttrykksystem som brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. For både cyklodekstrin-basert kolesterolberikelse tilnærming av pattedyrvev (cerebral arterier) og for fosfolipid-basert kolesterol berikelse tilnærming av Xenopus oocytes, viser vi at kolesterol nivåer nå maksimalt etter 5 min inkubasjon. Dette nivået av kolesterol forblir konstant i lengre perioder med inkubasjon (f.eks. 60 min). Sammen gir disse dataene grunnlag for optimaliserte temporale forhold for kolesterolberikelse av vev, celler og Xenopus oocytter for funksjonelle studier som tar sikte på å avhøre virkningen av kolesterolberikelse.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulær lipid, spiller mange kritiske funksjonelle og strukturelle roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Fra å regulere plasmamembranens fysiske egenskaper til å sikre cellelevedyktighet, vekst, spredning og fungerer som et signal- og forløpermolekyl i en mengde biokjemiske veier, er kolesterol en viktig komponent som er nødvendig for normal celle- og organfunksjon. Som et resultat resulterer kolesterolmangel i alvorlige fysiske misdannelser og en rekke lidelser. På den annen side er selv en liten økning i kolesterol over fysiologiske nivåer (2-3x) cytotoksisk1,2,10 og har vært forbundet med utvikling av lidelser, inkludertkardiovaskulære 11,12,13 og nevrodegenerative sykdommer14,15,16,17. Dermed, for å avhøre de kritiske funksjonene til kolesterol og for å bestemme effekten av endringer i kolesterolnivåer, er forskjellige tilnærminger som endrer innholdet av kolesterol i vev, celler og Xenopus oocytter utviklet.

Endring av kolesterolnivåer i pattedyrvev og celler
Flere tilnærminger kan utnyttes for å redusere nivåene av kolesterol i vev og celler18. En tilnærming innebærer deres eksponering for statiner oppløst i lipoprotein-mangelfull serum for å hemme HMG-CoA reduktase, som styrer frekvensen av kolesterolsyntese19,20. Men, disse kolesterolsenkende legemidler også hemme dannelsen av ikke-sterol produkter langs mevalonatbanen. Derfor legges en liten mengde mevalonat for å tillate dannelsen av disse produktene21 og forbedre spesifisiteten til denne tilnærmingen. En annen tilnærming for å redusere kolesterolnivået innebærer bruk av β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerene har et internt hydrofobt hulrom med en diameter som samsvarer med størrelsen på steroler22, noe som letter utvinning av kolesterol fra celler, og dermed tømme dem fra deres innfødte kolesterolinnhold23. Et eksempel er 2-hydroksypropyl-β-cykloderxtrin (HPβCD), et preklinisk stoff som for tiden testes for behandling av Niemann-Pick type C-sykdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolsk lidelse preget av lysosomal kolesterollagring24. Nivået av kolesteroluttømming avhenger av det spesifikke derivatet som brukes. For eksempel, HPβCD trekker kolesterol med en lavere kapasitet enn metylert derivat, metyl-β-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Spesielt kan imidlertid β-cyklodekkliner også trekke ut andre hydrofobe molekyler i tillegg til kolesterol, noe som deretter kan resultere i uspesifikke effekter31. I motsetning til uttømming kan celler og vev spesifikt berikes med kolesterol gjennom behandling med β-cykloderklatrin som har vært forutmettet med kolesterol23. Denne tilnærmingen kan også brukes som en kontroll for spesifisiteten av β-cyclodextrins som brukes til kolesterol uttømming31. Uttømming av kolesterol fra vev og celler er grei og kan oppnås ved å utsette cellene i 30-60 min til 5 mM MβCD oppløst i mediet som brukes til lagring av cellene. Denne tilnærmingen kan resultere i en 50% reduksjon i kolesterolinnhold (f.eks. i hippocampale nevroner32, rotte cerebralarterier33). På den annen side er det mer komplisert å forberede β-cyclodextrin-kolesterolkomplekset for kolesterolberikelse av vev og celler, og vil bli beskrevet i protokollseksjonen.

En alternativ tilnærming til berikende vev og celler ved hjelp av β-cyclodextrin mettet med kolesterol innebærer bruk av LDL, som er avhengig av LDL reseptorer uttrykt i vev / celler18. Mens denne tilnærmingen gir fordelen av å bruke det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen, har den flere begrensninger. For det første kan ikke vev og celler som ikke uttrykker LDL-reseptoren berikes ved hjelp av denne tilnærmingen. For det andre inneholder LDL-partikler andre lipider i tillegg til kolesterol. Spesielt består LDL av proteinet ApoB100 (25 %) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglycerols34. Dermed er levering av kolesterol via LDL-partikler ikke-spesifikk. For det tredje kan prosentandelen av økning i kolesterolinnhold ved LDL i vev og celler som uttrykker LDL-reseptoren være betydelig lavere enn økningen observert ved hjelp av cyklodekstrin mettet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere studie, berikelse av gnager cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterte i bare en 10-15% økning i kolesterolnivåer35. I motsetning resulterte berikelse av disse arteriene med cyclodextrin mettet med kolesterol som beskrevet i protokollseksjonen,& gt; 50% økning i kolesterolinnholdet (se Representative Results seksjon, figur 1).

Endring av kolesterolnivåer i Xenopus oocytes
Xenopus oocytes utgjør et heterologøst uttrykksystem som vanligvis brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. Tidligere studier har vist at kolesterolet til fosfolipid molar forholdet i Xenopus oocytes er 0,5 ± 0,136. På grunn av dette iboende høye nivået av kolesterol, er det utfordrende å øke innholdet av kolesterol i dette systemet, men kan oppnås ved hjelp av dispersjoner laget av membranfolipider og kolesterol. Fosfolipidene som vi har valgt for dette formålet, ligner på de som brukes til å danne kunstige planar lipidbilag og inkluderer L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrevet i protokollseksjonen. Denne tilnærmingen kan resultere i > 50% økning i kolesterolinnhold (Se Representative Results seksjon, Figur 2).

En alternativ tilnærming til berikende Xenopus oocytes med fosfolipid-baserte dispersjoner innebærer bruk av cyklodextrin mettet med kolesterol, som ligner på måten vev og celler er beriket. Vi har imidlertid funnet denne tilnærmingen til å være av lav reproduserbarhet og effektivitet, med et gjennomsnitt på ~ 25% økning i kolesterolinnhold. Dette skyldes muligens den ulike lastekapasiteten til disse to tilnærmingene (se avsnittet Representative Results, figur 3). I motsetning har det blitt vist at bruk av cyklodekstrin for å tømme kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% reduksjon i kolesterolinnhold36.

Her fokuserer vi på kolesterol berikelse av pattedyrvev og celler gjennom bruk av cyklodxtrin mettet med kolesterol, og av Xenopus oocytter ved hjelp av liposomer. Begge tilnærminger kan utnyttes for å avgrense effekten av økte nivåer av kolesterol på proteinfunksjon. Mekanismene for kolesterolmodulering av proteinfunksjon kan innebære direkte interaksjoner8 og/eller indirekte effekter9. Når kolesterol påvirker proteinfunksjon via direkte interaksjoner, er effekten av en økning i kolesterolnivået på proteinaktivitet sannsynligvis uavhengig av celletype, uttrykkssystem eller berikelsestilnærming. For eksempel brukte vi disse to tilnærmingene for å bestemme effekten av kolesterol på G-protein gated innover rette kalium (GIRK) kanaler uttrykt i atriemyocytter37, hippocampal nevroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytes32,37. Resultatene oppnådd i disse studiene var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i amfibier oocytes kolesterol upregulated GIRK kanalfunksjon (se Representative Resultater seksjon, Figur 4,for hippocampal nevroner og tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytes). Videre var observasjonene gjort i disse studiene også i samsvar med resultatene av studier utført i atriemyocytter37,40 og hippocampal nevroner32,38 nylig isolert fra dyr utsatt for et høyt kolesterol diett40. Spesielt, kolesterol berikelse av hippocampal nevroner ved hjelp av MβCD reversert effekten av atorvastatin terapi som brukes for å løse virkningen av høyt kolesterol diett både på kolesterolnivåer og GIRK funksjon38. I andre studier undersøkte vi effekten av mutasjoner på kolesterolfølsomheten til den indre korrigering av kaliumkanalen Kir2.1 ved hjelp av både Xenopus oocytes og HEK293 celler41. Igjen var effekten av mutasjonene på følsomheten til kanalen lik i de to systemene.

Anvendelsene av begge berikelsesmetoder for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer på molekylær, cellulær og organfunksjon er mange. Spesielt er bruk av cyclodextrin-kolesterolkomplekser for å berike celler og vev svært vanlig i stor grad på grunn av spesifisiteten. Nylige eksempler på denne tilnærmingen inkluderer bestemmelse av virkningen av kolesterol på HERG kanalaktivering og underliggende mekanismer42, oppdagelsen av at kolesterol aktiverer G protein koblet reseptor Glattet for å fremme Hedgehog signaliserer43, og identifisering av rollen av kolesterol i stamcelle biomekanikk og adipogenese gjennom membran-assosiert linker proteiner44. I vårt eget arbeid benyttet vi pattedyrvevberikelse med MβCD:kolesterolkompleks for å studere effekten av kolesterolberikelse på grunnleggende funksjon og den farmakologiske profilen til kalsium- og spenningsinngjerdede kanaler med stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulær glatt muskel35,45,46. I andre studier brukte vi fosfolipidbasert dispersjonstilnærming for berikende Xenopus oocytter med kolesterol for å bestemme rollene til forskjellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhet41,47,48,49, samt å bestemme antatt kolesterol bindende steder i disse kanalene32,50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer med dyr ble utført ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Omsorg for dyr og eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee of the UTHSC, som er en institusjon akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Berikelse av vev og celler ved hjelp av metyl-β-cykloderkstrin mettet med kolesterol

MERK: Kolesterolberikelsesprotokollen nedenfor er egnet for vev, celler og cellelinjer. Som et eksempel beskriver vi trinnene utført for berikende pattedyrcerebrale arterier. Representative resultater er gitt for både cerebrale arterier (figur 1) og nevroner (figur 4).

  1. Fremstilling av MβCD mettet med kolesterol
    1. Vei 0,064 g MβCD og oppløs den i en kolbe som inneholder 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 mM MβCD. Rør oppløsningen med en rørestang for å sikre at MβCD er fullstendig oppløst.
    2. Vei 0,0024 g kolesterolpulver og legg det til samme kolbe for å oppnå en 0,63 mM kolesterolkonsentrasjon. Rør deretter løsningen kraftig. Bruk en slikkepott for å bryte opp så mange kolesterolbiter som mulig (noen biter vil forbli til inkubasjon).
    3. Dekk kolben med minst to lag parafinfilm og rist sakte (~ 30 svingninger / min) i et 37 ° C vannbad over natten. Dette trinnet er kritisk.
    4. Etter 8-16 timer kjøler du oppløsningen til romtemperatur (RT), og deretter filtrerer du den gjennom et filter på 0,22 μm polyethersulfon i en glassflaske.
      MERK: For å nå forskjellige kolesterolkonsentrasjoner i løsningen, juster mengden ei mengde både kolesterol og MβCD med enkel proporsjon. Det er viktig å opprettholde MβCD:kolesterol molar forholdet på 8:1 for å få metning av metyl-β-cyclodextrin bærer med kolesterol. Den kolesterolberikende løsningen kan brukes umiddelbart eller i løpet av flere dager hvis den lagres ved 4 °C. Imidlertid avtar den kolesterolberikende evnen over tid etter hvert som kolesterolaggregatene vises, og løsningen blir overskyet.
  2. Behandling av cerebrale arterier med MβCD mettet med kolesterol
    1. Euthanize en Sprague Dawley rotte (250-300 g) ved å plassere den i et kammer med 2% isoflurane. Deretter halshugger den bedøvede rotten ved hjelp av en skarp giljotin eller en stor skarp saks.
      MERK: Hvis du utfører disse prosedyrene regelmessig, er det nyttig å utvikle en tidsplan for giljotinsliping. Også en egen saks bør være dedikert til gnagerhalshugging. Gnagerhalshugging er en terminal prosedyre; derfor trenger instrumentene ikke å være sterile. Rengjøring med såpevann etter hver bruk er tilstrekkelig.
    2. Plasser rottens hode vendt fremover, vekk fra forskeren. Plasser den spisse delen av en mellomstor saks mellom skallen og hjernestammen, og kutt sidelengs på begge sider.
    3. Bruk tang til å lirke den øverste skallen åpen ved å trekke opp på bunnen av skallen der lateralkutt ble gjort og forsiktig fjerne hjernen. Pass på å kutte de optiske nervene som holder hjernen i skallen.
    4. Sett hjernen i et beger med PBS på is etter fjerning.
      MERK: Hjernen kan oppbevares på is i 4-6 timer ved 4 °C.
    5. I et ikke-sterilt miljø overføre rottehjernen til en vokset disseksjonbolle med nok PBS til å senke den. Fest hjernen ned for å hindre at den beveger seg.
      MERK: Trinn 1.2.5 kan utføres på RT hvis det utføres raskt. Ellers må det gjøres på is.
    6. Bruk skarpe tang og liten kirurgisk saks for å dissekere hjernearteriene og deres grener som danner Circle of Willis ved foten av hjernen under mikroskopet i PBS ved RT. Vær forsiktig når du dissekerer for å sikre at arterievevet ikke strekkes eller kuttes. Dette trinnet er kritisk.
    7. Skyll arteriesegmentene kort (opptil 1 cm lange) i PBS enten i en 96 brønnplate eller i en 35 mm tallerken for å fjerne rester av blod, og plasser dem deretter i 10 minutter i nok av den kolesterolberikende løsningen (tilberedt i trinn 1.1) for å dekke hele arteriesegmentene. Bruk en 35 mm tallerken hvis det er en god mengde kolesterolberikende løsning og en 96 brønnplate hvis arteriene er små eller hvis det er mangel på kolesterolberikende løsning.
      MERK: Den samme tilnærmingen kan brukes til å berike andre vev og celler med kolesterol ved hjelp av en 60 min inkubasjonstid. For eksempel har denne tilnærmingen tidligere blitt brukt til kolesterol berikelse av mus cerebral arterier35,45, hippocampal nevroner32, atriemyocytter37, og HEK 293 celler39. Den minimale inkubasjonstiden må bestemmes for hver vev eller celletype basert på validering av kolesterolberikelse på forskjellige tidspunkter med en kolesterolsensitiv analyse (f.eks. den biokjemiske bestemmelseen av mengden kolesterol i vevet ved å farge med kolesterolfølsom fluorescensfargefilipin).
  3. Beis arterievevet med steroid-sensitive fluorescensfargefilipin for å bestemme eventuelle endringer i kolesterolnivået.
    MERK: I representative resultater delen, Vi viser resultatene av to tilnærminger for å vurdere endringer i kolesterol nivåer: en biokjemisk analyse utført gjennom anvendelsen av en kommersielt tilgjengelig kolesterol oksidase-basert kit (se Tabell over materialer) og farging med steroid-sensitive fluorescens farge filipin. Den første tilnærmingen kan utføres ved å følge produsentens instruksjoner. Protokollen for sistnevnte tilnærming er gitt nedenfor.
    1. Bruk en fersk flaske filipinpulver til å lage en 10 mg/ml lageroppløsning i dimetylsulfoksid (DMSO). Dette trinnet er kritisk.
      MERK: Den resulterende løsningen er lysfølsom. Hvis den er riktig forberedt, er den filipine lageroppløsningen gulaktig. Noe filipinpulver kan feste seg til flaskehetten. Derfor er det viktig å skylle flasken og hetten med DMSO-løsningsmiddel for å beholde hele mengden filipin. Når den er klargjort, må filipinlager brukes innen flere dager. Filipin mister helt sin fluorescensevne etter 5 dager, selv når den lagres i mørket ved -20 °C.
    2. Fjern arteriesegmentene fra den kolesterolberikende løsningen og vask dem 3x med PBS i 5 min.
    3. Fest arteriesegmentene i 4% paraformaldehyd i 15 min på is.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyd er lysfølsomt. Derfor må arbeidet utføres i mørket.
    4. Plasser arteriesegmentene i 0,5% Triton i PBS ved RT i 10 min for å permeabilize vevet og lette dye penetrasjon.
    5. Vask arteriesegmentene 3x med PBS i 5 min på en shaker. Dette trinnet er kritisk.
      MERK: Når Triton er helt vasket ut, bør det ikke være noen bobler på overflaten av PBS-løsningen.
    6. Fortynn den filipine lageroppløsningen i PBS til en endelig konsentrasjon på 25 μg/ml. Fjern arteriene danner PBS-løsningen og plasser dem i den fortynnede filipinoppløsningen i 1 t i mørket. Dette trinnet er kritisk.
    7. Vask ut filipinved å skylle arteriesegmentene 3x med PBS i 5 min på en shaker. Dette trinnet er kritisk.
    8. Skyll arteriesegmentene kort med destillert vann, absorber overdreven væske med et papirserviett, og monter arteriene på et lysbilde ved hjelp av kommersielt tilgjengelige monteringsmedier (se Materialtabellen).
    9. Dekk arterien med en dekkslip unngå å rulle eller vridning av arterien og sett lysbildene til tørk i et mørkt område ved RT i 24 timer.
    10. Etter at monteringsmediet tørker, forsegler dekselet slip kantene med klar neglelakk, og la neglelakken tørke i 10-15 min. Oppbevar lysbildene i mørket ved -20 °C.
    11. Likevekten lysbildene til RT før bildebehandling.
    12. Bilde vevet med et fluorescensmikroskop eller en fluorescensleser med eksitasjonsatt til 340-380 nm og utslipp på 385-470 nm.
      FORSIKTIG: Filipin fotoblekemidler raskt; dermed må prøvene avbildes raskt.

2. Berikelse av Xenopus oocytter ved hjelp av kolesterolberikede fosfolipidbaserte dispersjoner (liposomer)

  1. Utarbeidelse av løsninger
    1. For å forberede en lagerløsning av kolesterol, oppløs 10 mg kolesterolpulver i 1 ml kloroform i et 10 ml glassbeger eller flaske. Overfør løsningen til en 1,5 ml avkortet glassflaske.
      FORSIKTIG: I lys av toksisitet og rask fordampning av kloroform, arbeid i hetten og hold reagenspå is.
    2. Forbered en 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 buffer for kolesterolberikede fosfolipider. For å gjøre dette, oppløs i en Erlenmeyer kolbe 5.5905 g KCl og 0.6057 g tris i dobbeltdestillert vann til totalt 0,5 L volum. I en annen kolbe oppløses 5.5905 g KCl og 1.19155 g HEPES i dobbeltdestillert vann til totalt 0,5 l volum. Bland de to løsningene sammen i en 1 L Erlenmeyer-kolbe, og juster pH til 7,4 med HCl.
      MERK: Oppbevar den resulterende 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES-oppløsningen ved 4 °C.
    3. For å forberede ND96 pre-medium oocyte kuling (lav K+, lav Ca2 +) buffer, kombinere 1 ml av 2 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2, 45,5 ml av 2 M NaCl, og 5 ml 1/1 M NaOH-HEPES i en 1 L Erlenmeyer kolbe. Tilsett 900 ml dobbeltdestillert vann og juster pH til 7,4 med HCl. Overfør løsningen til en 1 L-sylinder og bring volumet til 1 L med dobbeltdestillert vann. Deretter legger du til 1,8 ml 1 M CaCl2 og filtrerer løsningen.
      MERK: Små variasjoner i forholdet mellom komponentene som brukes til å lage en ND96-løsning, ser ikke ut til å være avgjørende for kolesterolberikelse, muligens fordi ND96-løsningen ikke brukes under selve berikelsestrinnet, men for lagring. Et eksempel er en 1 L-løsning som har en litt lavere konsentrasjon av natrium- og kloridioner, og er laget ved å kombinere 2 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2,82,5 ml 1 M NaCl, 5 ml 1 M HEPES og 1,8 ml 1 M CaCl2 (Ca2+ utelates for å oppnå en Ca2 + fri løsning). Juster pH-løsningen til 7,4 med NaOH. Oppbevar den resulterende ND96 oocyte kulingsløsningen ved 4 °C i opptil 1 måned.
  2. Utarbeidelse av fosfolipid-basert dispersjon med kolesterol liposomer
    1. I et 12 ml glassrør, kombiner 200 μL av hver av følgende 10 mg/ml kloroformoppløste lipidoppløsninger: L-α-fosphatidyletanolamin, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfor-l-serin og kolesterol.
    2. Fordamp kloroformen i hetten for å tørke sakte under en strøm av nitrogen. Dette trinnet er kritisk.
    3. Suspender lipidene i 800 μL bufret oppløsning bestående av 150 mM KCl og 10 mM Tris-HEPES ved pH = 7,4, og dekk med parafinfilm.
    4. Sonicatforsiktig ved 80 kHz i 10 min til en melkeaktig blanding dannes. Dette trinnet er kritisk.
      FORSIKTIG: Ved sonikering skal spredningen i glassrøret vibrere forsiktig og danne små bølger. Dråper dispersjon bør ikke hoppe i røret.
  3. Berikende Xenopus oocytes med kolesterol
    MERK: Froskoocyteholdige eggstokker kan fås fra to kilder: For det første kan Xenopus laevis kvinnelige frosker plasseres med det formål å operere internt. Denne prosedyren må godkjennes av institutional Animal Care and Use Committee. For det andre kan hele eggstokkene kjøpes fra kommersielle leverandører. Som et alternativ til å kjøpe eller isolere hele eggstokkene og deretter fordøye dem som beskrevet i trinn 2.3.1-2.3.4, individuelle oocytes er tilgjengelig kommersielt for kjøp. Hvis sistnevnte brukes, kan trinn 2.3.1-2.3.4 hoppes over.
    1. Oppbevar de nyoppnådde eggstokkene ved ~14 °C i en ND96-løsning. Under disse forholdene kan eggstokkene lagres i opptil 1 uke.
    2. For å oppnå individuelle oocytter, forstyrre ovariesekken på flere steder ved hjelp av skarpe tang. Legg eggstokkbitene i en 60 mm plate, med 5 ml Ca2+-fri ND96 supplert med 0,5 mg/ml kollagennase. Rist på en orbital shaker ved 60 svingninger / min i 15 min på RT.
      MERK: Dette trinnet vil sikre fordøyelsen av ovariesekken. For å bevare enzymatisk aktivitet, unngå lagring av kollagennase som inneholder ND96 i lengre perioder (> 1 h). Selv kort lagring bør utføres ved kjølige temperaturer på under 15 °C.
    3. Ved hjelp av en overføringspipette med en bred spiss, pipette den oocyteholdige oppløsningen opp og ned ca. 5-10x for å skille individuelle oocytter. På dette trinnet vil løsningen bli mørk.
    4. Skyll raskt oocytes med Ca2 +-fri ND96 til løsningen blir gjennomsiktig.
    5. Overfør individuelle oocytter til Ca2+-inneholdende ND-96 løsning supplert med 2 mg/ml gentamicin ved hjelp av en overføringspipette med en smal spiss.
      MERK: Dette trinnet er viktig når det er nødvendig å lagre oocytes. Individuelle oocytter kan lagres i en inkubator i flere dager ved 14-17 °C. Imidlertid må døde oocytter som er hvitaktige fjernes minst en gang om dagen for å unngå forurensning av løsningen med giftige kjemikalier.
    6. Overfør 90 μL av den kolesterolberikede fosfolipid-baserte dispersjonen til en brønn av en 96 brønnplate.
    7. Overfør opptil seks oocytter fra ND96-mediet til brønnen med så lite medium som mulig. Dette trinnet er kritisk.
      FORSIKTIG: Ikke utsett oocytter for luften under overføringen for å holde oocytes intakt.
    8. Plasser 96 brønnplaten på en tredimensjonal plattformrotator for å gi en liten orbital bevegelse til oocytter i cellen i 5-10 min.
    9. Legg til en dråpe ND96 i brønnen, og overfør kolesterolberikede oocytter fra 96-brønnplaten til en 35 mm plate med ND96 for umiddelbar bruk. Dette trinnet er kritisk.
    10. Bruk et kommersielt tilgjengelig kolesteroloksidasebasert sett (se Materialtabellen) for å vurdere endringer i kolesterolnivået ved å følge produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruken av cyclodextrin mettet med kolesterol som et middel for berikende vev og celler med kolesterol er godt etablert. Her demonstrerer vi først anvendelsen av denne mye brukte tilnærmingen for å berike rottecerebralarterier med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Figur 1A viser et eksempel på et avbildet cerebral arterie glatt muskellag og demonstrerer den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin-assosiert fluorescens oppnådd ved vevberikelse med økende konsentrasjoner av kolesterol fra 6,25 μM-6,25 mM for 1 h. Tilsvarende kvantifisering av bildedata er avbildet i figur 1B. Spesielt var økningen i kolesterolnivåer 2 h etter 1 h inkubasjonsperioden ~ 50% av økningen observert umiddelbart etter behandlingen med MβCD: kolesterolkompleks. Som figur 1C demonstrerer for prøven behandlet med 0,625 mM kolesterol i 1 h, må funksjonelle studier ved hjelp av det behandlede vevet utføres så snart som mulig etter at kolesterolberikelsen er fullført. Videre, mens en 1 h inkubasjonstid vanligvis brukes til å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av denne tilnærmingen, er 5 min inkubasjon vanligvis tilstrekkelig til å oppnå en statistisk signifikant økning i cerebral arteriekolesterolinnhold som bestemmes av en kolesteroloksidasebasert biokjemisk analyse, som avbildet i figur 1D. Økningen i kolesterolinnholdet forble på samme nivå når inkubasjonstiden ble økt til 60 min (Figur 1D).

Effektiviteten av kolesterolberikede liposomer som et middel for å berike Xenopus oocytes med kolesterol er demonstrert i figur 2A-C. Mens ingen signifikant endring ble observert i kolesterolnivåer i kontroll fosfolipidbaserte dispersjoner som mangler kolesterol (Figur 2A),økte kolesterolnivået betydelig etter bare 5 min behandling med fosfolipidbaserte dispersjoner som inkluderte kolesterol, og forble på samme nivå når inkubasjonstiden ble økt til 60 min (figur 2B). En lignende effekt ble observert i to forskjellige grupper av oocytter som ble hentet fra to frosker. Spesielt varierte imidlertid både de første nivåene av kolesterol og endringen i kolesterolinnhold blant de to batchene: i batch 1 var den første konsentrasjonen av kolesterol 64 μg kolesterol per mg protein, mens den første konsentrasjonen i batch 2 var 45 μg kolesterol per mg protein, som er ~ 70% av de første nivåene av kolesterol i batch 1. Etter en 60 min behandling var konsentrasjonen av kolesterol i batch 1 1 124 μg kolesterol per mg protein, mens det i batch 2 var 67 μg kolesterol per mg protein. Dermed, mens konsentrasjonen av kolesterol økte med over ~ 90% i batch 1, økte den med ~ 50% i batch 2. Likevel gir den betydelige økningen i kolesterolnivået i begge partier midler til å undersøke effekten av en økning i kolesterolnivåer på proteinfunksjonen uttrykt i dette heterologøse uttrykkssystemet. Videre synes fosfolipidbasert dispersjonstilnærming for berikende Xenopus oocytter med kolesterol å være mer effektiv enn anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol som gjort i vev og celler. Som figur 3 demonstrerer, førte anvendelse av cyclodextrin-kolesterolkomplekser for å berike oocytter ved hjelp av 5mM cyclodextrin i et gjennomsnitt på bare ~ 25% økning i kolesterolnivået.

Effektiviteten av cyclodextrin-basert tilnærming for berikende celler er også demonstrert i nevroner som er nyisolert fra CA1-regionen i hippocampus (Figur 4A). Som figur 4B viser, inkubasjon av nevronene i MβCD mettet med kolesterol i 60 min resulterte i over 2x økning i kolesterolnivåer som bestemmes av filipin-assosiert fluorescens. Ved hjelp av denne tilnærmingen testet vi effekten av økningen i kolesterol på GIRK-kanaler uttrykt i hippocampale nevroner. Som figur 4C viser, resulterte denne endringen i kolesterolnivået i en betydelig økning i GIRK-strømmer. På samme måte testet vi effekten av kolesterolberikelse på den primære GIRK-underenheten uttrykt i hjernen GIRK2, ved hjelp av Xenopus oocytes heterologous expression system. For dette formål overuttrykte vi GIRK2 ^ (GIRK2_E152D), en poremutant av GIRK2 som øker membranuttrykket og aktiviteten52 i Xenopus oocytter, og beriket oocytter med kolesterol i 60 min ved hjelp av fosfolipidbasert dispersjonstilnærming. Som figur 4D-F viser, økningen i kolesterolnivåer resulterte i en betydelig økning i strømmer som ligner på effekten av økt kolesterol nivåer i nevroner på GIRK kanalfunksjon. Disse dataene viser videre effektiviteten, konsistensen og nytten av de to tilnærmingene som er beskrevet ovenfor for å bestemme virkningen av økt kolesterolnivå på proteinaktivitet og cellulær funksjon.

Figure 1
Figur 1: Representativ berikelse av rottecerebrale arterier med kolesterol ved hjelp av metyl-β-cykloderkstrin mettet med kolesterol. (A) Et eksempel på et avbildet cerebral arterie glatt muskellag som viser den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin-assosiert fluorescens oppnådd ved vevberikelse med økende konsentrasjoner av kolesterol fra 6,25 μM-6,25 mM for 1 h. (B) Kvantifisering av bildedata i (A). Fluorescensintensitetsmåling av hele bildet ble utført ved hjelp av den innebygde "Måling"-funksjonen i kommersiell programvare. Ved hver kolesterolkonsentrasjon ble ≥3 bilder samlet inn fra arterier som ble høstet fra separate dyredonorer. For hver kolesterolkonsentrasjon presenteres data som gjennomsnittlig ± standardfeil. (C) Kolesterolnivåer i cerebral arterie glatt muskellag segmenter umiddelbart etter en 1 h inkubasjon periode med 0,625 mM kolesterol, og 3 timer etter begynnelsen av behandlingen (dvs. 1 t inkubasjon etterfulgt av 2 h i PBS). (D) Avhengighet av kolesterolnivåer på inkubasjonstiden som bestemmes av en kolesteroloksidasebasert biokjemisk analyse. En signifikant forskjell indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Paneler (A) (kolesterolkonsentrasjoner 0 mM-0,625 mM), (B) og (C) er modifisert fra Nord et al.45. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativ berikelse av Xenopus oocytter med kolesterol ved hjelp av liposomer. (A) Fold endring i kolesterol nivåer av kontroll Xenopus oocytes inkubert i kolesterol-frie liposomer i 5-60 min. (B) Fold endring i kolesterol nivåer av Xenopus oocytes inkubert i kolesterol-beriket liposomer i 5-60 min. Den avbildet kontrollbar refererer til inkubasjon i kolesterolfrie liposomer i 5 min og er vist som en sammenligning. (C) Sammenligning av effekten av kolesterol berikelse av to forskjellige grupper av Xenopus oocytes ved hjelp av kolesterolberikede liposomer i 5 og 60 min. En signifikant forskjell indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ berikelse av Xenopus oocytes med kolesterol ved hjelp av metyl-β-cykloderxtrin mettet med kolesterol. (A) Fold endring i kolesterol nivåer av kontroll Xenopus oocytes inkubert i kontroll ND96 media for 5-60 min. (B) Fold endring i kolesterol nivåer av Xenopus oocytes inkubert i MβCD mettet med kolesterol i 5-60 min. Den avbildet kontrolllinjen refererer til inkubasjon i kontrollmedier i 5 min og vises som en sammenligning. En signifikant forskjell indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative eksempler på studier av kolesterolberikelse på proteinfunksjon i celler og Xenopus oocytter: virkningen av kolesterol på G-protein innover rette kaliumkanaler. (A) Filipin-assosiert fluorescenssignal av hippocampal CA1 pyramidal neuron fra rotter på kontroll (venstre) versus kolesterolberiket (høyre). (B) Sammendragsdata av filipin-assosierte fluorescenssignaler hentet fra kontroll og kolesterolberiket nyisolerte hippocampal CA1 pyramidale nevroner. Kolesterol berikelse ble oppnådd ved å inkubere nevronene i MβCD mettet med kolesterol i 1 h (n = 12-14). (C) Ionic strøm (I)-spenning (V) kurve som viser effekten av kolesterol berikelse som beskrevet i (B) på GIRK strømmer i hippocampal nevroner fra CA1-regionen. (D) Representative spor som viser effekten av kolesterol berikelse ved hjelp av kolesterolberiket fosfolipid-baserte liposomer på GIRK2 ^ (GIRK2_E152D) uttrykt i Xenopus oocytes på -80 mV og +80 mV. (E) Sammendragsdata av (D) ved -80 mV (n = 6-9). En signifikant forskjell indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Subfigures (B-E) er endret fra Bukiya et al.32. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder for å berike pattedyrvev og celler og Xenopus oocytter med kolesterol utgjør et kraftig verktøy for å undersøke effekten av forhøyede kolesterolnivåer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks proteiner), og på cellulær og organfunksjon. I denne artikkelen har vi beskrevet to komplementære tilnærminger som letter slike studier. Først beskrev vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Vi viste at i cerebralarterie segmenter resulterte denne tilnærmingen i en økning på ~ 50% i kolesterolnivåer. Videre viste vi i en nylig studie at den samme tilnærmingen fører til en over 2x økning i kolesterolinnhold i hippocampale nevroner fra CA1-regionen. I motsetning, men ved hjelp av denne tilnærmingen som et middel for å berike Xenopus oocytes resulterte i bare ~ 25% økning i kolesterolinnhold i Xenopus oocytes. Dermed, for berikende Xenopus oocytes, har vi utviklet en fosfolipid-basert dispersjon tilnærming som konsekvent resulterer i minst ~ 50% økning i kolesterolnivåer. Det er mulig at fordelen med denne tilnærmingen for å berike Xenopus oocytes stammer fra en forbedret lastekapasitet sammenlignet med lastekapasiteten til MβCD: kolesterolkompleks tilnærming. Det er også mulig at mens MβCD: kolesterol kompleks tilnærming er optimalisert for berikende vev og celler, ytterligere optimalisering av protokollen er nødvendig for å forbedre sin søknad for berikende Xenopus oocytes.

Fosfolipid-basert dispersjon som brukes til å berike Xenopus oocytes med kolesterol inkluderer to lipider som er mye brukt til å lage planar lipid bilayers (dvs. L-α-fosphatidylethanolamine og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fospho-l-serin). Men i en tidligere studie ble det vist at Xenopus oocytes også kunne berikes ved hjelp av kolesterol fra liposomer som inkluderte fosfatidylkolin og kolat36. Denne metoden resulterte i en økning i kolesterol/fosfolipidmolarforholdet i plasmamembranen fra 0,5 ± 0,1 til 0,9 ± 0,1 med en gjennomsnittlig prosentandel av berikelse på 71%. Denne gjennomsnittlige prosentandelen av berikelse er svært lik gjennomsnittlig nivå av økning i kolesterolinnhold som vi observerte (~ 70,5%), noe som tyder på at valget av fosfolipider som brukes til å danne spredningen, ikke er avgjørende for å berike Xenopus oocytter med kolesterol ved hjelp av denne tilnærmingen.

Hver protokoll som beskrives, omfatter flere kritiske trinn. Etter å ha forberedt en MβCD: kolesterolblanding på et 8:1 molar-forhold for å sikre metning av MβCD med kolesterol, er det avgjørende å dekke kolben med minst to lag parafinfilm og sette den i et sakte risting 37 °C vannbad over natten. Ved dissekering av vev for kolesterolbehandling er det viktig å være forsiktig for å sikre at vevet ikke strekkes eller kuttes. Etter permeabilizing vevet for å lette dye penetrasjon, er det avgjørende å grundig vaske vevsegmenter i PBS. Vevsfarging i fillipin må utføres i mørket, og fillipinmå omhyggelig vaskes ut etter at farsfargen er fullført. Når du forbereder kolesterolberikede fosfolipidbaserte dispersjoner, er det avgjørende å sikre at spredningen i glassrøret vibrerer forsiktig, danner små bølger, for å unngå separasjon av kolesterolet fra spredningen. For kolesterolbehandling av Xenopus oocytter er det viktig å overføre oocytter fra ND96-mediet til brønnen med kolesterolberiket fosfolipidbasert dispersjon med så lite medium som mulig, samtidig som de ikke utsetter oocytter til luft for å holde oocytes intakt. Det er viktig å merke seg at på grunn av det indre maskineriet i vev, celler og Xenopus oocytter, kolesterolnivåer kan likevekt, og deretter gå tilbake til sine opprinnelige nivåer over tid. Følgelig må funksjonelle studier utføres umiddelbart etter inkubasjonstiden. Her har vi vist denne forestillingen i cerebrale arterier beriket med kolesterol, som viser at økningen i kolesterolnivåer 2 h etter en 1 h inkubasjonsperiode var omtrent halvparten av økningen observert umiddelbart etter inkubasjonsperioden.

Til tross for at det er viktige skritt som er beskrevet ovenfor, kan det oppstå flere utfordringer. For eksempel kan det hende at en økning i kolesterolnivået ikke observeres etter kolesterolberikende behandling. Hvis dette er tilfelle, kan det være nødvendig å øke konsentrasjonen av kolesterol i kolesterolberikende medier. Det samme gjelder for kolesterol berikelse av vev, celler og Xenopus oocytes. Men ved fremstilling av behandlinger ved hjelp av MβCD: kolesterolkompleks tilnærming, bør mengden MβCD økes med økningen i kolesterolkonsentrasjon for å opprettholde et 8:1 molar-forhold med kolesterol. I tillegg kan det være nødvendig å forberede en frisk kolesterolberikende løsning, fordi kolesterol har en tendens til å utløse ut av løsningen, og løsningen mister sin kolesterolberikende effektivitet. Etter kolesterolberikelse er det mulig at et filipinsignal ikke vil bli observert. Hvis dette er tilfelle, kan det være nødvendig å bruke et ferskt filipinpulver for å forberede et nytt lager og gjenta eksperimentet. Filipin fluorescens avtar raskt, og lagerløsningen kan ikke lagres i mer enn flere dager. En begrensning av filipin farging er at det synes å gjenkjenne steroider annet enn kolesterol. For eksempel har vi nylig vist en økning i det filipin-assosierte fluorescenssignalet i rottecerebralarterier etter berikelse med coprostanol45. Dermed bør filipin farging resultater tolkes med forsiktighet, og når du er i tvil, bør alternative tilnærminger brukes til å bekrefte resultatene. En mulighet ville være å utføre en biokjemisk analyse gjennom anvendelsen av et kommersielt tilgjengelig kolesteroloksidasebasert sett.

Oppsummert er de presenterte tilnærmingene svært effektive for å oppnå kolesterolberikelse av nær eller overstiger 50%. Faktisk er MβCD: kolesterolkompleks tilnærming som resulterer i ~ 50% i kolesterolnivåer i cerebrale arterier mye mer effektiv enn å bruke LDL til å berike disse vevene, noe som resulterer i bare ~ 10% økning i kolesterol35. Det samme gjelder anvendelsen av kolesterolberikede fosfolipidbaserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytter. Som beskrevet ovenfor, denne tilnærmingen resulterer konsekvent i minst en 50% økning i kolesterolnivåer. Viktigere, disse to tilnærminger for kolesterol berikelse in vitro yield resultater som er sammenlignbare med kolesterol økning oppnådd ved å utsette dyrene til et høyt kolesterol diett32,37,40,53,54. Videre, i motsetning til uker lange høyt kolesterol dietter, in vitro tilnærminger krever bare noen få minutter med inkubasjon tid for å nå en statistisk signifikant og steady-state økning i kolesterolnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. A. M. Dopico er en spesiell, deltid, føderal ansatt og nåværende medlem av The National Advisory Council on Alcohol Abuse and Alcoholism.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og av National Institute of Health R01 gir AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Tags

Biokjemi kolesterol berikelse lipider cyklodextrin-kolesterol kompleks dispersjon liposomer fosfolipider lav tetthet lipoprotein LDL nevroner cerebralarterier Xenopus oocytes kaliumkanaler
Berikelse av pattedyrvev og <em>Xenopus</em> oocytter med kolesterol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slayden, A., North, K., Bisen, S.,… More

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter