To metoder til kolesterol berigelse præsenteres: anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol til at berige pattedyr væv og celler, og brugen af kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersioner (liposomer) til at berige Xenopus oocytter. Disse metoder er medvirkende til at bestemme virkningen af forhøjede kolesterolniveauer i molekylære, cellulære, og organfunktion.
Kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler, herunder Xenopus oocytter anvendes til at studere cellefunktion, kan opnås ved hjælp af en række forskellige metoder. Her beskriver vi to vigtige tilgange, der anvendes til dette formål. Først beskriver vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol ved hjælp af cerebrale arterier (væv) og hippocampale neuroner (celler) som eksempler. Denne fremgangsmåde kan bruges til enhver type væv, celler eller cellelinjer. En alternativ tilgang til kolesterol berigelse indebærer brug af low-density lipoprotein (LDL). Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det bruger en del af den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen. Mens cyclodextrin-metoden kan anvendes til at berige enhver celletype af interesse med kolesterol, er LDL-metoden dog begrænset til celler, der udtrykker LDL-receptorer (f.eks. leverceller, knoglemarvsafledte celler såsom blodleukocytter og vævsmakrofager), og graden af berigelse afhænger af koncentrationen og mobiliteten af LDL-receptoren. Endvidere, LDL partikler omfatter andre lipider, så kolesterol levering er uspecifik. For det andet, Vi beskriver, hvordan man berigeR Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af en fosfolipid-baseret dispersion (dvs. liposomer), der omfatter kolesterol. Xenopus oocytter udgør et populært heterologt udtrykssystem, der anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. For både cyclodextrin-baserede kolesterol berigelse tilgang pattedyr væv (cerebral arterier) og for fosfolipid-baserede kolesterol berigelse tilgang af Xenopus oocytter, viser vi, at kolesterolniveauer nå et maksimum efter 5 min inkubation. Dette niveau af kolesterol forbliver konstant i længere perioder med inkubation (f.eks. 60 min). Tilsammen danner disse data grundlag for optimerede tidsmæssige betingelser for kolesterolberigelse af væv, celler og Xenopus oocytter til funktionelle undersøgelser, der har til formål at afhøre virkningen af kolesterolberigelse.
Kolesterol, en stor cellulære lipid, spiller mange kritiske funktionelle og strukturelle roller1,2,,3,,4,,5,,6,,7,8,9. Fra regulering af plasmamembranens fysiske egenskaber til sikring af cellernes levedygtighed, vækst, spredning og tjener som et signal- og forløbermolekyle i et væld af biokemiske veje, er kolesterol en nødvendig komponent, der er nødvendig for normal celle- og organfunktion. Som et resultat, kolesterolmangel resulterer i alvorlige fysiske misdannelser og en række lidelser. På den anden side, selv en lille stigning i kolesterol over fysiologiske niveauer (2-3x) er cytotoksisk1,,2,,10 og har været forbundet med udviklingen af lidelser, herunder hjerte-kar-1111,12,13 og neurodegenerative sygdomme14,15,16,17. Således, at afhøre de kritiske funktioner af kolesterol og til at bestemme effekten af ændringer i kolesterolniveauer, forskellige tilgange, der ændrer indholdet af kolesterol i væv, celler, og Xenopus oocytter er blevet udviklet.
Ændring af kolesterolniveauer i pattedyrvæv og -celler
Flere tilgange kan udnyttes til at nedsætte niveauet af kolesterol i væv og celler18. En tilgang indebærer deres eksponering for statiner opløst i lipoprotein-mangelfuld serum til at hæmme HMG-CoA reduktase, som styrer antallet af kolesterol syntese19,20. Men, disse kolesterolsænkende lægemidler hæmmer også dannelsen af ikke-sterol produkter langs mevalonat e pathway. Derfor tilsættes en lille mængde mevalonat for at gøre det muligt at danne disse produkter21 og forbedre specificiteten af denne fremgangsmåde. En anden tilgang til faldende kolesterolniveauer indebærer brug af β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerer besidder en intern hydrofob hulrum med en diameter, der matcher størrelsen af steroler22, som letter udvinding af kolesterol fra celler, og dermed nedbryder dem fra deres oprindelige kolesterolindhold23. Et eksempel er 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), et præklinisk lægemiddel, der i øjeblikket testes til behandling af Niemann-Pick type C-sygdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolisk lidelse karakteriseret ved lysosomal kolesterolopbevaring24. Niveauet af kolesterol udtynding afhænger af den specifikke afledte anvendes. 25,26,27,28,29HPβCD udtrækker24,f.eks.,30 Især, dog, β-cyclodextrins kan også udtrække andre hydrofobe molekyler ud over kolesterol, som derefter kan resultere i uspecifikke virkninger31. I modsætning til udtynding, celler og væv kan specifikt beriget med kolesterol gennem behandling med β-cyclodextrin, der er blevet præmættet med kolesterol23. Denne fremgangsmåde kan også anvendes som en kontrol for specificiteten af β-cyclodextrin, der anvendes til kolesterol udtynding31. Udtømning af kolesterol fra væv og celler er ligetil og kan opnås ved at udsætte cellerne i 30-60 min til 5 mM MβCD opløst i det medium, der anvendes til opbevaring af cellerne. Denne fremgangsmåde kan resultere i en 50% fald i kolesterolindholdet (f.eks i hippocampal neuroner32, rotte cerebral arterier33). På den anden side, forberedelse af β-cyclodextrin-kolesterol kompleks for kolesterol berigelse af væv og celler er mere kompleks, og vil blive beskrevet i protokollen afsnit.
En alternativ tilgang til berigelse af væv og celler ved hjælp af β-cyclodextrin mættet med kolesterol indebærer brug af LDL, som er afhængig af LDL-receptorer udtrykt i væv / celler18. Mens denne tilgang giver den fordel, at bruge den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen, det har flere begrænsninger. For det første kan væv og celler, der ikke udtrykker LDL-receptoren, ikke beriges ved hjælp af denne fremgangsmåde. For det andet, LDL partikler indeholder andre lipider ud over kolesterol. Ldl består specifikt af proteinet ApoB100 (25%) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglyceroler34. Således levering af kolesterol via LDL partikler er uspecifik. For det tredje, den procentdel af stigningen i kolesterol indhold af LDL i væv og celler, der udtrykker LDL receptor kan være betydeligt lavere end stigningen observeret ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere undersøgelse, berigelse af gnaver cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterede i kun en 10-15% stigning i kolesterolniveauer35. I modsætning hertil resulterede berigelse af disse arterier med cyclodextrin mættet med kolesterol som beskrevet i protokolafsnittet i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 1).
Ændring af kolesterolniveauer i Xenopus oocytter
Xenopus oocytter udgør et heterologt ekspressionssystem, der almindeligvis anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. Tidligere undersøgelser har vist, at kolesterol til fosfolipid molære forholdet i Xenopus oocytter er 0,5 ± 0,136. På grund af denne iboende højt niveau af kolesterol, øge indholdet af kolesterol i dette system er udfordrende, men kan opnås ved hjælp af dispersioner fremstillet af membran fosfolipider og kolesterol. De fosfolipider, som vi har valgt til dette formål, svarer til dem, der anvendes til dannelse af kunstige planar lipid bilag og omfatter L-α-phosphatidylethanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), som beskrevet i afsnittet protokol. Denne fremgangsmåde kan resultere i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 2).
En alternativ tilgang til berigelse af Xenopus oocytter med fosfolipid-baserede dispersioner indebærer brug af cyclodextrin mættet med kolesterol, hvilket svarer til den måde væv og celler er beriget. Men vi har fundet denne tilgang til at være af lav reproducerbarhed og effektivitet, med et gennemsnit på ~ 25% stigning i kolesterolindholdet. Dette skyldes muligvis disse to tilganges forskellige lasteevne (se afsnittet repræsentative resultater, figur 3). I modsætning hertil har det vist sig, at ved hjælp af cyclodextrin at nedbryder kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% fald i kolesterolindhold36.
Her fokuserer vi på kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler gennem anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol, og af Xenopus oocytter ved hjælp af liposomer. Begge tilgange kan udnyttes til at afgrænse effekten af forhøjede niveauer af kolesterol på protein funktion. Mekanismerne for kolesterolmodulering af proteinfunktion kan omfatte direkte interaktioner8 og/eller indirekte virkninger9. Når kolesterol påvirker protein funktion via direkte interaktioner, effekten af en stigning i kolesterolniveauer på protein aktivitet er sandsynligvis uafhængig af celletype, ekspressionssystem, eller berigelse tilgang. For eksempel, Vi udnyttede disse to tilgange til at bestemme effekten af kolesterol på G-protein gated indadrettekalium (GIRK) kanaler udtrykt i atriemyocytter37, hippocampal neuroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytter32,37. Resultaterne af disse undersøgelser var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i padderoocytter kolesterol upregulated GIRK kanalfunktion (se repræsentant resultater afsnit, Figur 4, for hippocampal neuroner og de tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytter). Endvidere, observationerne i disse undersøgelser var også i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelser udført i atriemyocytter37,40 og hippocampal neuroner32,38 frisk isoleret fra dyr udsat for en høj kolesterol kost40. Især kolesterol berigelse af hippocampal neuroner ved hjælp af MβCD vendt effekten af atorvastatin terapi anvendes til at løse virkningen af højt kolesteroltal kost både på kolesteroltallet og GIRK funktion38. I andre undersøgelser undersøgte vi effekten af mutationer på kolesterolfølsomheden af den indadvendte korrigere kaliumkanal Kir2.1 ved hjælp af både Xenopus oocytter og HEK293 celler41. Igen var mutationernes virkning på kanalens følsomhed ens i de to systemer.
Anvendelserne af begge berigelse metoder til bestemmelse af virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på molekylære, cellulære, og organfunktion er talrige. Især er brugen af cyclodextrin-kolesterol komplekser til at berige celler og væv meget almindeligt i vid udstrækning på grund af dens specificitet. Nylige eksempler på denne tilgang omfatter bestemmelse af virkningen af kolesterol på HERG kanal aktivering og underliggende mekanismer42, opdagelsen af, at kolesterol aktiverer G-protein koblet receptor glattet til at fremme Pindsvin signalering43, og identifikation af den rolle, kolesterol i stamceller biomekanik og adipogenesis gennem membran-associerede linker proteiner44. I vores eget arbejde, vi udnyttede pattedyr væv berigelse med MβCD: kolesterol kompleks til at studere effekten af kolesterol berigelse på grundlæggende funktion og farmakologisk profil af calcium- og spænding-gated kanaler af stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulære glatte muskel35,45,46. I andre undersøgelser, Vi brugte fosfolipid-baserede dispersion tilgang til at berige Xenopus oocytter med kolesterol til at bestemme rollerne af forskellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhed41,47,48,49, samt at bestemme formodede kolesterol bindende steder i disse kanaler32,50,51.
Metoder til berigelse af pattedyrvæv og -celler og Xenopus oocytter med kolesterol udgør et effektivt redskab til at undersøge virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks. proteiner) og på celle- og organfunktion. I dette dokument har vi beskrevet to komplementære tilgange, der letter sådanne undersøgelser. Først beskrev vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af MβCD mættet med kolesterol. Vi vi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og af National Institute of Health R01 tilskud AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).
Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
KCl | Fisher | P217 | |
Trizma base | Sigma | T6066 | |
HEPES | Corning | 61-034-RO | |
MgCl2 | Fisher | M33 | |
NaCl | Fisher | S271 | |
KH2PO4 | Fisher | P285 | |
MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
EDTA | VWR | E177 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
Blood Gas Tank | nexAir | ||
NaOH | Fisher | S318 | |
1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
Chloroform | Fisher | C298 | |
Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
96 well plate | Sigma | BR781602 | |
N2 gas | nexAir | ||
Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
TritonX | Fisher | BP151-100 | |
Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
DMSO | Fisher | BP231 | |
Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
DI H2O | University DI source | ||
ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
KimWipes | Fisher | 06-666A | |
pH probe | Sartorus | py-p112s | |
pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
Timer | Fisher | 02-261-840 | |
Steno book | Staples | 163485 |