Summary

העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

שתי שיטות של העשרה כולסטרול מוצגים: היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים, ואת השימוש של פוספוליפיד זרחן מועשר מבוססי מפזרים (ליפוזומים) כדי להעשיר Xenopus oocytes. שיטות אלה הן אינסטרומנטלי לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב.

Abstract

העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מיונקים, כולל Xenopus oocytes המשמשים ללימוד תפקוד התא, ניתן לבצע באמצעות מגוון שיטות. כאן אנו מתארים שתי גישות חשובות המשמשות למטרה זו. ראשית, אנו מתארים כיצד להעשיר רקמות ותאים עם כולסטרול באמצעות cyclodextrin רווי כולסטרול באמצעות עורקים מוחין (רקמות) ו נוירונים היפוקמאל (תאים) כדוגמאות. גישה זו יכולה לשמש עבור כל סוג של רקמות, תאים, או קווי תאים. גישה חלופית להעשרה כולסטרול כרוכה בשימוש בליפרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). היתרון של גישה זו הוא כי היא משתמשת בחלק ממנגנון הומאוסטזיס טבעי של הכולסטרול של התא. עם זאת, בעוד הגישה cyclodextrin ניתן להחיל להעשיר כל סוג תא של עניין עם כולסטרול, גישה LDL מוגבל לתאים המבטאים קולטני LDL (למשל, תאי הכבד, מח עצם נגזר תאים כגון לוקיציטים דם ומקרופאגים רקמות), ואת רמת העשרה תלוי בריכוז וניידות של קולטן LDL. יתר על כן, חלקיקי LDL כוללים שומנים אחרים, כך משלוח כולסטרול הוא לא ספציפי. שנית, אנו מתארים כיצד להעשיר Xenopus oocytes עם כולסטרול באמצעות הפיזור פוספוליפיד מבוסס (כלומר, ליפוזומים) הכולל כולסטרול. קסנפוס אוציטים מהווה מערכת הטרוולוגי פופולרית המשמשת ללימוד תאים וחלבונים. הן הגישה הcyclodextrin המבוססת על כולסטרול של רקמת היונקים (עורקים מוחית) ועל הגישה המבוססת פוספוליפיד כולסטרול של Xenopus oocytes, אנו מדגימים כי רמות הכולסטרול להגיע למקסימום הבא 5 דקות של דגירה. רמה זו של כולסטרול נשאר קבוע במהלך תקופות ממושכות של דגירה (למשל, 60 דקות). יחד, נתונים אלה לספק את הבסיס עבור תנאים הזמני אופטימיזציה עבור העשרה כולסטרול של רקמות, תאים, ו Xenopus oocytes למחקרים פונקציונליים שמטרתה חקירת ההשפעה של העשרה כולסטרול.

Introduction

כולסטרול, השומנים הסלולר העיקריים, משחק תפקידים קריטיים מבניים רבים1,2,3,4,5,6,7,8,9. מתוך ויסות התכונות הפיזיות של קרום הפלזמה כדי להבטיח את הכדאיות התאית, צמיחה, התפשטות, והגשה כמולקולה איתות ו קודמן בשפע של מסלולים ביוכימיים, כולסטרול הוא רכיב חיוני הכרחי תאים תא נורמלי הפונקציה. כתוצאה מכך, חוסר כולסטרול תוצאות מומים פיזיים חמורים מגוון רחב של הפרעות. מצד שני, אפילו עלייה קטנה בכולסטרול מעל רמות פיזיולוגיות (2-3x) הוא ציטוטוקסי11,2,10 והוא נקשר עם פיתוח של הפרעות, כולל לב וכלי דם11,12,13 מחלות נוירוניווניות14,15,16,17. כך, כדי לחקור את הפונקציות הקריטיות של כולסטרול כדי לקבוע את ההשפעה של שינויים ברמות הכולסטרול, גישות שונות המשנות את התוכן של כולסטרול ברקמות, תאים, ו- Xenopus oocytes פותחו.

שינוי ברמות הכולסטרול ברקמות ובתאים של היונקים
מספר גישות ניתן לרתום כדי להקטין את רמות הכולסטרול ברקמות ובתאים18. גישה אחת כרוכה החשיפה שלהם כדי סטטינים התפרקה ליפופרוטאין סרום לקויה לעכב hmg-CoA רדוקטאז, אשר שולטת על שיעור סינתזה כולסטרול19,20. עם זאת, אלה תרופות הפחתת כולסטרול גם לעכב את היווצרות של מוצרים שאינם sterol לאורך השביל mevalonate. לכן, כמות קטנה של mevalonate מתווסף כדי לאפשר היווצרות של מוצרים אלה21 ולשפר את הספציפיות של גישה זו. גישה נוספת להפחתת רמות הכולסטרול כרוכה בשימוש בβ-ציקלודטרינים. אלה ונומרים מונודורים בעלי חלל הידרופובי פנימי עם קוטר המתאים לגודל של תחום ה סטרולים22, אשר מקלה על החילוץ של כולסטרול מתאים, ובכך מכלה אותם מתוכן כולסטרול יליד שלהם23. דוגמה היא 2-הידרוקסיל-β-cyclodextrin (HPβCD), תרופה פרה-קלינית הנבדקת כיום לטיפול במחלת מחלת הבחור הנימן, הפרעת מטבולית קטלנית תורשתית המאופיינת באחסון כולסטרול ליזוזומבית24. רמת המחסור בכולסטרול תלויה בנגזרת הספציפית שבשימוש. לדוגמה, HPβCD מחלצת כולסטרול בקיבולת נמוכה יותר מאשר הנגזרת המתיל, הβ-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. בעיקר, עם זאת, β-ציקלודטרינים יכולים גם לחלץ מולקולות הידרופובי אחרים בנוסף לכולסטרול, אשר עשוי לגרום להשפעות שאינן ספציפיות31. בניגוד דלדול, תאים ורקמות יכול להיות מועשר במיוחד עם כולסטרול באמצעות הטיפול עם β-cyclodextrin כי כבר presaturated עם כולסטרול23. גישה זו יכולה לשמש גם כשליטה על הספציפיות של β-ציקלודטרינים המשמשים למחסור בכולסטרול31. דלדול כולסטרול מן הרקמות והתאים הוא פשוט יכול להיות מושגת על ידי חשיפת התאים עבור 30-60 דקות כדי 5 mM MβCD מומס במדיום המשמש לאחסון התאים. גישה זו יכולה לגרום לירידה של 50% בתוכן כולסטרול (למשל, ב נוירונים בהיפוקמפוס32, העורקים המוח מוחין33). מצד שני, הכנת מורכבות β-cyclodextrin-כולסטרול עבור העשרת כולסטרול של רקמות ותאים מורכבים יותר, והוא יתואר בסעיף הפרוטוקול.

גישה חלופית להעשרת רקמות ותאים באמצעות β-cyclodextrin רווי כולסטרול כרוך בשימוש LDL, אשר מסתמך על קולטני LDL המבוטא ברקמות/תאים18. בעוד גישה זו מציעה את היתרון של שימוש במנגנון הומאוסטזיס כולסטרול טבעי של התא, יש לו מספר מגבלות. ראשית, רקמות ותאים שאינם מבטאים את קולטן ה-LDL לא ניתן להעשיר באמצעות גישה זו. שנית, חלקיקי LDL מכילים שומנים אחרים בנוסף לכולסטרול. באופן ספציפי, LDL מורכב חלבון ApoB100 (25%) ואת השומנים הבאים (75%): ~ 6-8% כולסטרול, ~ 45-50% cholesteryl אסתר, ~ 18-24% פוספוליפידים, ו ~ 4-8% triacylglycerols34. כך, משלוח של כולסטרול באמצעות חלקיקי LDL הוא לא ספציפי. שלישית, אחוז העלייה בתוכן כולסטרול על-ידי LDL ברקמות ובתאים המבטאים את קולטן ה-LDL עשוי להיות נמוך באופן משמעותי מהעלייה שנצפתה באמצעות cyclodextrin רווי בכולסטרול. למשל, במחקר הקודם, העשרה של עורקים מוחין מכרסמים עם כולסטרול דרך LDL הביא רק 10-15% עלייה ברמות הכולסטרול35. לעומת זאת, העשרת העורקים הללו עם cyclodextrin רווי כולסטרול כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול הביאו לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגים, איור 1).

שינוי של רמות כולסטרול בקסנפוס אוציטים
קסנפוס אוציטים מהווים מערכת ביטוי הטרוולוגי המשמשת בדרך כלל לחקר תאי וחלבון. מחקרים מוקדמים הראו כי הכולסטרול ליחס פוספוליפיד טוחנת ב Xenopus oocytes הוא 0.5 ± 0.136. בשל רמה גבוהה פנימית של כולסטרול, הגדלת התוכן של כולסטרול במערכת זו הוא מאתגר, עדיין ניתן להשיג באמצעות דיספרסיות ממברנה פוספוליפידים וכולסטרול. פוספוליפידים כי בחרנו למטרה זו דומים לאלה המשמשים ליצירת השומנים מישורי מלאכותי bilayers וכוללים L-α-פוספולידילטנולטואמין (האפיפיור) ו-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-פוספאו-L-סרין (פופס), כמתואר בסעיף הפרוטוקול. גישה זו יכולה לגרום לעלייה של > 50% בתכולת הכולסטרול (ראה סעיף תוצאות מייצגות, איור 2).

גישה חלופית כדי להעשיר Xenopus מועשר עם מפזרים פוספוליפיד זרחן כרוך בשימוש של cyclodextrin רווי כולסטרול, אשר דומה הרקמות והתאים מועשרים. עם זאת, מצאנו את הגישה הזאת כדי להיות בלתי מנוצחת ויעילות נמוכה, עם ממוצע של ~ 25% עלייה בתוכן כולסטרול. ייתכן שהדבר נובע מיכולת הטעינה השונה של שתי גישות אלה (ראה סעיף ‘ תוצאות מייצגות ‘, איור 3). לעומת זאת, זה הוכח כי באמצעות cyclodextrin כדי לרוקן את הכולסטרול מ Xenopus oocytes יכול לגרום ~ 40% ירידה בתוכן כולסטרול36.

כאן, אנו מתמקדים העשרה כולסטרול של רקמות ותאים באמצעות היישום של cyclodextrin רווי כולסטרול, ו Xenopus אוציטים באמצעות ליפוזומים. שתי הגישות ניתן לרתום כדי להתוות את ההשפעה של רמות גבוהות של כולסטרול על תפקוד החלבון. המנגנונים של אפנון כולסטרול של פונקציית חלבון עשויים לכלול אינטראקציות ישירות8 ו/או אפקטים עקיפים9. כאשר הכולסטרול משפיע על תפקוד החלבון באמצעות אינטראקציות ישירות, ההשפעה של גידול ברמות הכולסטרול על פעילות החלבון היא כנראה עצמאית של סוג התא, מערכת הביטוי, או גישה העשרה. לדוגמה, אנו מנוצל שתי גישות אלה כדי לקבוע את ההשפעה של כולסטרול ב-G-חלבון מגודרת בתוכו אשלגן (girk) ערוצים מבוטא פרפור מייציטים37, היפוקמוניות נוירונים32,38, HEK29339 תאים, ו xenopus oocytes32,37. התוצאות שהתקבלו במחקרים אלה היו עקביים: בכל שלושת הסוגים של התאים המיונקים ובתוך הכולסטרול האמפיבי הכולסטרול של הערוץ (ראה מדור תוצאות נציג, איור 4, עבור נוירונים היפוקמאל והניסויים המתאימים xenopus oocytes). יתר על כן, תצפיות שנעשו במחקרים אלה היו גם עקבי עם תוצאות המחקרים שבוצעו ב פרפור מייציטים37,40 ו היפוקמאל נוירונים32,38 מבודדים טרי מבעלי חיים נתון דיאטה כולסטרול גבוה40. בעיקר, העשרה כולסטרול של נוירונים היפוקמאל באמצעות MβCD הפך את ההשפעה של טיפול atorvastatin המשמש לטיפול ההשפעה של הדיאטה הכולסטרול הגבוה הן על רמות כולסטרול ו-GIRK פונקציה38. במחקרים אחרים, חקרנו את ההשפעה של מוטציות על רגישות כולסטרול של מבפנים לתקן אשלגן לתקן את קיר 2.1 באמצעות שניהם Xenopus oocytes ו HEK293 תאים41. שוב, השפעת המוטציות על רגישות הערוץ הייתה דומה בשתי המערכות.

היישומים של שתי שיטות העשרה לקביעת ההשפעה של רמות הכולסטרול הגבוהות בתפקוד המולקולרי, הסלולר והעוגב הם רבים. בפרט, השימוש של מתחמי cyclodextrin-כולסטרול כדי להעשיר את התאים והרקמות הוא נפוץ מאוד בעיקר בשל הייחוד שלה. דוגמאות אחרונות של גישה זו כוללות את קביעת ההשפעה של כולסטרול על הפעלת ערוץ HERG ומנגנונים הבסיסי42, גילוי כי כולסטרול מפעיל את חלבון G מצמידים קולטן Smoothened כדי לקדם קיפוד איתות43, ואת הזיהוי של התפקיד של כולסטרול בביומכניקה של תא גזע ו אדיפוגנזה באמצעות רפידת מקשר הקשורים חלבונים44. בעבודתנו שלנו, אנו מנוצלים העשרה רקמות המסיביות עם MβCD: קומפלקס כולסטרול כדי ללמוד את ההשפעה של העשרה כולסטרול על הפונקציה הבסיסית ואת פרופיל פרמקולוגית של סידן, מתח מגודרת ערוצים של מוליכות גדולה (BK, מקסימינק) בשריר חלק וסקולרית35,45,46. במחקרים אחרים, השתמשנו הגישה מבוססי פוספוליפיד מבוסס פיזור עבור מעשיר xenopus של הכולסטרול עם כולסטרול כדי לקבוע את התפקידים של אזורים שונים ב-קיר 2.1 ו-girk של הרגישות כולסטרול41,47,48,49, כמו גם כדי לקבוע אתרים כולסטרול בכבלים הללו בערוצים אלה32,50,51.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים עם בעלי חיים בוצעו באוניברסיטת טנסי במרכז למדעי הבריאות (UTHSC). הטיפול של בעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של UTHSC, אשר הוא מוסד מוכר על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בחיות מעבדה הבינלאומי. 1. העשרת רקמות …

Representative Results

השימוש cyclodextrin רווי כולסטרול כאמצעי להעשרת רקמות ותאים עם כולסטרול הוא מבוסס היטב. כאן, אנו הראשונים להדגים את היישום של גישה זו בשימוש נרחב להעשרת עורקים מוחין החולדה עם כולסטרול באמצעות MβCD רווי בכולסטרול. איור 1מראה דוגמה של שכבת השריר החלקה של…

Discussion

שיטות כדי להעשיר את רקמות היונקים ואת התאים ו Xenopus oocytes עם כולסטרול מהווים כלי רב עוצמה לחקירת ההשפעה של רמות כולסטרול גבוהות על מינים מולקולריים בודדים, על מערכות macromolecular מורכבות (למשל, חלבונים), ועל תפקוד הסלולר והעוגב. במאמר זה, תיארנו שתי גישות משלימות המקלות על מחקרים כאלה. ראשית, ת…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק פיתוח מדען (11SDG5190025) מאיגוד הלב האמריקני (ל-ar-D.), ועל ידי המכון הלאומי של בריאות R01 מענקים AA-023764 (כדי A.N.B.), ו-HL-104631 ו R37 AA-11560 (ל-M. D).

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1135 (2019).
  9. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration?. Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer’s disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage?. Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A., Kumar, S. A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. , 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Play Video

Cite This Article
Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

View Video