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Biochemistry

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60734
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Summary

Dois métodos de enriquecimento do colesterol são apresentados: a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol para enriquecer tecidos e células de mamíferos, e o uso de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol (lipossos) para enriquecer os oócitos xenopus. Esses métodos são fundamentais para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos.

Abstract

O enriquecimento de colesterol de tecidos e células de mamíferos, incluindo os oócitos xenopus usados para estudar a função celular, pode ser realizado usando uma variedade de métodos. Aqui, descrevemos duas abordagens importantes usadas para este fim. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando ciclodextrina saturada com colesterol usando artérias cerebrais (tecidos) e neurônios hipocampais (células) como exemplos. Esta abordagem pode ser usada para qualquer tipo de tecido, células ou linhas celulares. Uma abordagem alternativa para o enriquecimento do colesterol envolve o uso de lipoproteína de baixa densidade (LDL). A vantagem dessa abordagem é que ela usa parte do maquinário de homeostase natural da célula. No entanto, considerando que a abordagem da ciclodextrina pode ser aplicada para enriquecer qualquer tipo de interesse celular com colesterol, a abordagem lDL é limitada a células que expressam receptores LDL (por exemplo, células hepáticas, células derivadas da medula óssea, como leucócitos sanguíneos e macrófagos teciduais), e o nível de enriquecimento depende da concentração e da mobilidade do receptor LDL. Além disso, as partículas de LDL incluem outros lipídios, por isso a entrega de colesterol não é específica. Em segundo lugar, descrevemos como enriquecer os oócitos de Xenopus com colesterol usando uma dispersão à base de fosfolipídeos (ou seja, liposóficos) que inclui colesterol. Os oócitos xenopus constituem um popular sistema de expressão heteróloga usado para estudar a função celular e proteica. Tanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de ciclodextrina do tecido mamífero (artérias cerebrais) quanto para a abordagem de enriquecimento de colesterol à base de fosfolipídeos de oócitos xenopus, demonstramos que os níveis de colesterol atingem um máximo após 5 min de incubação. Esse nível de colesterol permanece constante durante longos períodos de incubação (por exemplo, 60 min). Juntos, esses dados fornecem a base para condições temporais otimizadas para o enriquecimento de colesterol de tecidos, células e oócitos de Xenopus para estudos funcionais que visam interrogar o impacto do enriquecimento do colesterol.

Introduction

O colesterol, um dos principais lipídios celulares, desempenha numerosos papéis funcionais e estruturais críticos1,,2,,3,4,5,,66,7,,8,9. Desde a regulação das propriedades físicas da membrana plasmática até a garantia da viabilidade celular, crescimento, proliferação e servindo como uma molécula de sinalização e precursora em uma infinidade de vias bioquímicas, o colesterol é um componente imperativo necessário para a função normal de células e órgãos. Como resultado, a deficiência de colesterol resulta em malformações físicas graves e uma variedade de distúrbios. Por outro lado, mesmo um pequeno aumento do colesterol acima dos níveis fisiológicos (2-3x) é citotóxico1,2,10 e tem sido associado ao desenvolvimento de distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares11,,12,,13 e neurodegenerativas14,,15,16,17. Assim, para interrogar as funções críticas do colesterol e determinar o efeito das mudanças nos níveis de colesterol, foram desenvolvidas diferentes abordagens que alteram o conteúdo do colesterol em tecidos, células e oócitos xenopus.

Alteração dos níveis de colesterol em tecidos e células de mamíferos
Várias abordagens podem ser aproveitadas para diminuir os níveis de colesterol nos tecidos e células18. Uma abordagem envolve sua exposição a estatinas dissolvidas no soro lipoproteína-deficiente para inibir a redução do HMG-CoA, que controla a taxa de síntese de colesterol19,20. No entanto, essas drogas que reduzem o colesterol também inibem a formação de produtos não-esterol ao longo do caminho mevalonato. Portanto, uma pequena quantidade de mevalonato é adicionada para permitir a formação desses produtos21 e aumentar a especificidade dessa abordagem. Outra abordagem para a diminuição dos níveis de colesterol envolve o uso de β-ciclodextrinas. Estes monômeros glucopyranose possuem uma cavidade hidrofóbica interna com diâmetro que corresponde ao tamanho dos esteróis22, o que facilita a extração de colesterol das células, esgotando-os de seu teor de colesterol nativo23. Um exemplo é a 2-hidroxipropipil-β-ciclodextrina (HPβCD), uma droga pré-clínica atualmente sendo testada para o tratamento da doença de Niemann-Pick tipo C, uma desordem metabólica fatal geneticamente herdada caracterizada pelo armazenamento de colesterol lysossomal24. O nível de esgotamento do colesterol depende do derivado específico utilizado. Por exemplo, o HPβCD extrai colesterol com uma capacidade menor do que o derivado metilado, metil-β-ciclodextrina (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Notavelmente, no entanto, β-ciclodextrinas também podem extrair outras moléculas hidrofóbicas além do colesterol, o que pode resultar em efeitos inespecíficos31. Em contraste com o esgotamento, as células e tecidos podem ser especificamente enriquecidos com colesterol através do tratamento com β-ciclodextrina que foi pré-saturada com colesterol23. Esta abordagem também pode ser usada como um controle para a especificidade das β-ciclodextrinas utilizadas para o esgotamento do colesterol31. O esgotamento do colesterol de tecidos e células é simples e pode ser alcançado expondo as células de 30-60 min a 5 mM MβCD dissolvido no meio usado para armazenar as células. Essa abordagem pode resultar em uma redução de 50% no teor de colesterol (por exemplo, em neurônios hipocampais32, artérias cerebrais de ratos33). Por outro lado, preparar o complexo β-ciclodextrina-colesterol para o enriquecimento de colesterol de tecidos e células é mais complexo, e será descrito na seção de protocolo.

Uma abordagem alternativa para enriquecer tecidos e células que utilizam β-ciclodextrina saturada com colesterol envolve o uso de LDL, que se baseia em receptores LDL expressos nos tecidos/células18. Embora essa abordagem ofereça a vantagem de usar o maquinário de homeostase de colesterol natural da célula, ele tem várias limitações. Em primeiro lugar, tecidos e células que não expressam o receptor LDL não podem ser enriquecidos usando esta abordagem. Em segundo lugar, as partículas de LDL contêm outros lipídios, além do colesterol. Especificamente, o LDL é composto pela proteína ApoB100 (25%) e os seguintes lipídios (75%): ~6-8% colesterol, ~45-50% éster de cholesteryl, ~18-24% fosfolipídios e ~4-8% triacilglicerols34. Assim, a entrega de colesterol através de partículas LDL é inespecífica. Em terceiro lugar, o percentual de aumento do teor de colesterol por LDL em tecidos e células que expressam o receptor LDL pode ser significativamente menor do que o aumento observado usando ciclodextrina saturada de colesterol. Por exemplo, em um estudo anterior, o enriquecimento de artérias cerebrais de roedores com colesterol via LDL resultou em apenas um aumento de 10-15% nos níveis de colesterol35. Em contrapartida, o enriquecimento dessas artérias com ciclodextrina saturada com colesterol conforme descrito na seção de protocolo resultou em aumento de >50% no teor de colesterol (Ver Seção Resultados Representativos, Figura 1).

Alteração dos níveis de colesterol nos oócitos xenopus
Os oócitos de xenopus constituem um sistema de expressão heterólogo comumente usado para estudar a função celular e proteica. Estudos anteriores mostraram que a razão do colesterol para o molar fosfolipídeo nos oócitos xenopus é de 0,5 ± 0,136. Devido a esse alto nível intrínseco de colesterol, o aumento do teor de colesterol neste sistema é desafiador, mas pode ser alcançado usando dispersões feitas de fosfolipídeos de membrana e colesterol. Os fosfolipídios que escolhemos para este fim são semelhantes aos utilizados para formar bicamadas lipídicas planares artificiais e incluem L-α-fosphatidyletanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), conforme descrito na seção de protocolo. Essa abordagem pode resultar em >50% de aumento no teor de colesterol (Ver seção Resultados Representativos, Figura 2).

Uma abordagem alternativa para enriquecer os oócitos xenopus com dispersões à base de fosfolipídeos envolve o uso de ciclodextrina saturada com colesterol, que é semelhante à maneira como tecidos e células são enriquecidos. No entanto, descobrimos que essa abordagem é de baixa reprodutibilidade e eficiência, com um aumento médio de ~25% no teor de colesterol. Isso possivelmente se deve à capacidade de carga diferente dessas duas abordagens (Ver seção Resultados Representativos, Figura 3). Em contraste, foi demonstrado que o uso de ciclodextrina para esgotar o colesterol dos oócitos xenopus pode resultar em uma redução de ~40% no teor de colesterol36.

Aqui, focamos no enriquecimento do colesterol de tecidos e células de mamíferos através da aplicação de ciclodextrina saturada de colesterol, e de oócitos xenopus usando liposomos. Ambas as abordagens podem ser aproveitadas para delinear o efeito do aumento dos níveis de colesterol na função proteica. Os mecanismos de modulação do colesterol da função proteica podem envolver interações diretas8 e/ou efeitos indiretos9. Quando o colesterol afeta a função proteica através de interações diretas, o efeito de um aumento nos níveis de colesterol na atividade proteica é provavelmente independente do tipo celular, sistema de expressão ou abordagem de enriquecimento. Por exemplo, utilizamos essas duas abordagens para determinar o efeito do colesterol nos canais de potássio retificador interiormente (GIRK) da proteína G expressos em miócitos atrial37, neurônios hipocampais32,38, HEK29339 células, e xenopus oócitos32,37. Os resultados obtidos nestes estudos foram consistentes: em todos os três tipos de células mamíferas e em oócitos anfíbios a função de canal girk upregulated (ver seção Resultados Representativos, Figura 4, para neurônios hipocampais e os experimentos correspondentes em oócitos xenopus). Além disso, as observações feitas nesses estudos também foram consistentes com os resultados de estudos realizados em miócitos atrial37,40 e neurônios hipocampais32,38 recém-isolados de animais submetidos a uma dieta de colesterol elevado40. Notavelmente, o enriquecimento do colesterol de neurônios hipocampais usando MβCD reverteu o efeito da terapia atorvastatina usada para lidar com o impacto da dieta de colesterol alto tanto nos níveis de colesterol quanto na função GIRK38. Em outros estudos, investigou-se o efeito das mutações na sensibilidade ao colesterol do canal de potássio kir2.1 retificador interiormente usando tanto os oócitos de Xenopus quanto as células HEK29341. Novamente, o efeito das mutações na sensibilidade do canal foi semelhante nos dois sistemas.

As aplicações de ambos os métodos de enriquecimento para determinar o impacto de níveis elevados de colesterol na função molecular, celular e de órgãos são numerosas. Em particular, o uso de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer células e tecidos é muito comum em grande parte devido à sua especificidade. Exemplos recentes dessa abordagem incluem a determinação do impacto do colesterol na ativação do canal HERG e nos mecanismos subjacentes42, a descoberta de que o colesterol ativa o receptor acoplado à proteína G suavizado para promover a sinalização de Hedgehog43, e a identificação do papel do colesterol na biomecânica das células-tronco e na adipogênese através das proteínas de ligação associadas à membrana44. Em nosso próprio trabalho, utilizamos o enriquecimento de tecido mamífero com o complexo mβCD:colesterol para estudar o efeito do enriquecimento do colesterol na função básica e o perfil farmacológico dos canais de cálcio e tensão-gated de grande condutância (BK, MaxiK) no músculo liso vascular35,45,46. Em outros estudos, utilizou-se a abordagem de dispersão baseada em fosfolipíptos para enriquecer oócitos de Xenopus com colesterol para determinar os papéis de diferentes regiões em Kir2.1 e girk na sensibilidade ao colesterol41,47,48,49, bem como para determinar locais de ligação de colesterol putativo nesses canais32,50,51.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais com animais foram realizados no Centro de Ciênciada da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC). O cuidado com os animais e os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da UTHSC, instituição credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais de Laboratório Internacional.

1. Enriquecimento de tecidos e células utilizando metil-β-ciclodextrina saturada com colesterol

NOTA: O protocolo de enriquecimento do colesterol abaixo é adequado para tecidos, células e linhas celulares. Como exemplo, descrevemos os passos realizados para enriquecer as artérias cerebrais de mamíferos. Os resultados representativos são fornecidos tanto para as artérias cerebrais(Figura 1) quanto para os neurônios(Figura 4).

  1. Preparação de MβCD saturado com colesterol
    1. Pesar 0,064 g de MβCD e dissolvê-lo em um frasco contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma concentração final de 5 mM MβCD. Mexa a solução com uma barra de agitação para garantir que o MβCD esteja totalmente dissolvido.
    2. Pesar 0,0024 g de colesterol em pó e adicioná-lo ao mesmo frasco para obter uma concentração de colesterol de 0,63 mM. Em seguida, mexa a solução vigorosamente. Use uma espátula para quebrar o maior número possível de pedaços de colesterol (alguns pedaços permanecerão até a incubação).
    3. Cubra o frasco com pelo menos duas camadas de filme de parafina e agite lentamente (~30 oscilações/min) em um banho de água de 37 °C durante a noite. Este passo é crítico.
    4. Depois de 8-16 horas, resfrie a solução para a temperatura ambiente (RT) e, em seguida, filtre-a através de um filtro de seringa de poliethersulfone de 0,22 μm em uma garrafa de vidro.
      NOTA: Para atingir diferentes concentrações de colesterol em solução, ajuste as quantidades de colesterol e MβCD por proporção simples. É importante manter a razão MβCD:colesterol molar em 8:1 para obter saturação do portador de metil-β-ciclodextrina com colesterol. A solução que enriquece o colesterol pode ser usada imediatamente ou ao longo de vários dias se armazenada a 4 °C. No entanto, a capacidade de enriquecer o colesterol diminui com o tempo à medida que os agregados de colesterol aparecem, e a solução se torna nebulosa.
  2. Tratamento de artérias cerebrais com MβCD saturado com colesterol
    1. Eutanie um rato Sprague Dawley (250-300 g) colocando-o em uma câmara com 2% de isoflurano. Em seguida, decapite o rato anestesiado usando uma guilhotina afiada ou um grande par de tesouras afiadas.
      NOTA: Se realizar esses procedimentos regularmente, é útil desenvolver um cronograma para afiação da guilhotina. Além disso, um par separado de tesouras deve ser dedicado para a decapitação de roedores. A decapitação de roedores é um procedimento terminal; portanto, os instrumentos não devem ser estéreis. A limpeza com água com sabão após cada uso é suficiente.
    2. Posicione a cabeça do rato voltada para a frente, longe do pesquisador. Coloque a parte pontiaguda de um par de tesouras de tamanho médio entre o crânio e o tronco cerebral, e corte lateralmente em ambos os lados.
    3. Use fórceps para abrir o crânio superior puxando para cima na base do crânio onde os cortes laterais foram feitos e remover cuidadosamente o cérebro. Certifique-se de cortar os nervos ópticos que seguram o cérebro dentro do crânio.
    4. Coloque o cérebro em um béquer com PBS no gelo após a remoção.
      NOTA: O cérebro pode ser armazenado no gelo por 4-6 h a 4 °C.
    5. Em um ambiente não estéril, transfira o cérebro de rato para uma tigela de dissecção encerada com PBS suficiente para submergir. Fixar o cérebro para evitar que ele se mova.
      NOTA: A etapa 1.2.5 pode ser realizada no RT se realizada rapidamente. Caso contrário, precisa ser feito no gelo.
    6. Use pinças afiadas e pequenas tesouras cirúrgicas para dissecar as artérias cerebrais e seus ramos que formam o Círculo de Willis na base do cérebro o microscópio em PBS em RT. Seja gentil ao dissecar para garantir que o tecido da artéria não seja esticado ou cortado. Este passo é crítico.
    7. Enxágüe brevemente os segmentos da artéria (até 1 cm de comprimento) em PBS em uma placa de poço de 96 ou em um prato de 35 mm para remover o sangue restante e, em seguida, coloque-os por 10 min em suficiente da solução enriquecedora de colesterol (preparada na etapa 1.1) para cobrir todos os segmentos da artéria. Use uma placa de 35 mm se houver uma grande quantidade de solução enriquecedora de colesterol e uma placa de 96 poços se as artérias forem pequenas ou se houver uma escassez de solução enriquecedora de colesterol.
      NOTA: A mesma abordagem pode ser usada para enriquecer outros tecidos e células com colesterol usando um tempo de incubação de 60 min. Por exemplo, esta abordagem tem sido usada anteriormente para o enriquecimento de colesterol de artérias cerebrais de camundongos35,45, neurônios hipocampais32, miócitos atrial37, e HEK 293 células39. O tempo mínimo de incubação precisa ser determinado para cada tecido ou tipo celular com base na validação do enriquecimento do colesterol em diferentes pontos de tempo com um ensaio sensível ao colesterol (por exemplo, a determinação bioquímica da quantidade de colesterol no tecido por coloração com o corante de fluorescência sensível ao colesterol filipin).
  3. Manche o tecido da artéria com o corínio de fluorescência sensível a esteróides para determinar quaisquer alterações nos níveis de colesterol.
    NOTA: Na seção Resultados Representativos, demonstramos os resultados de duas abordagens para avaliar as mudanças nos níveis de colesterol: um ensaio bioquímico realizado através da aplicação de um kit à base de colesterol disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) e a coloração com o corante de fluorescência sensível a esteróides filipin. A primeira abordagem pode ser realizada seguindo as instruções do fabricante. O protocolo para esta última abordagem é fornecido abaixo.
    1. Usando uma garrafa fresca de pó de filipina, prepare uma solução de estoque de 10 mg/mL em sulfóxido de dimetila (DMSO). Este passo é crítico.
      NOTA: A solução resultante é sensível à luz. Se bem preparado, a solução de estoque de filipinas é amarelada. Algum pó de filipin pode grudar na tampa da garrafa. Por isso, é importante enxaguar a garrafa e a tampa com solvente DMSO para reter toda a quantidade de filipino. Uma vez preparado, o estoque de filipin deve ser usado dentro de vários dias. Filipin perde completamente sua capacidade de fluorescência após 5 dias, mesmo quando armazenado no escuro a -20 °C.
    2. Remova os segmentos da artéria da solução enriquecedora de colesterol e lave-os 3x com PBS por 5 min.
    3. Fixar os segmentos da artéria em 4% de paraformaldeído por 15 min no gelo.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é sensível à luz. Portanto, o trabalho deve ser realizado no escuro.
    4. Coloque os segmentos da artéria em 0,5% triton em PBS em RT por 10 min para permeabilizar o tecido e facilitar a penetração do corantes.
    5. Lave os segmentos da artéria 3x com PBS por 5 min em um shaker. Este passo é crítico.
      NOTA: Quando o Tritão foi completamente lavado, não deve haver bolhas na superfície da solução PBS.
    6. Diluir a solução de estoque de filipino em PBS para uma concentração final de 25 μg/mL. Remova as artérias da solução PBS e coloque-as na solução de filipina diluída por 1 h no escuro. Este passo é crítico.
    7. Lave a filipina enxaguando os segmentos da artéria 3x com PBS por 5 min em um shaker. Este passo é crítico.
    8. Enxágüe brevemente os segmentos da artéria com água destilada, absorva o líquido excessivo com um guardanapo de papel e monte as artérias em um escorregador usando mídia de montagem comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
    9. Cubra a artéria com um deslizamento de cobertura evitando rolar ou torcer a artéria e coloque as lâminas para secar em uma área escura em RT por 24 h.
    10. Depois que a mídia de montagem secar, sele as bordas do deslizamento de cobertura com esmalte claro e deixe o esmalte secar por 10-15 min. Armazene as lâminas no escuro a -20 °C.
    11. Equilibre os slides para RT antes da imagem.
    12. Imagem do tecido com um microscópio de fluorescência ou um leitor de fluorescência com o conjunto de excitação em 340-380 nm e emissão em 385-470 nm.
      ATENÇÃO: Filipinofotobleaches rapidamente; assim, as amostras devem ser imagens prontamente.

2. Enriquecimento de oócitos de xenopus usando dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidas com colesterol (liposóis)

  1. Elaboração de soluções
    1. Para preparar uma solução de colesterol, dissolva 10 mg de colesterol em pó em 1 mL de clorofórmio em um copo ou garrafa de vidro de 10 mL. Transfira a solução para uma garrafa de vidro tampada de 1,5 mL.
      ATENÇÃO: Tendo em vista a toxicidade e a rápida evaporação do clorofórmio, trabalhe na capa e mantenha os reagentes no gelo.
    2. Prepare um KCl de 150 mM, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 tampão para fosfolipóides enriquecidos com colesterol. Para isso, dissolva-se em um frasco erlenmeyer 5,5905 g de KCl e 0,6057 g de Tris em água duplamente destilada para um volume total de 0,5 L. Em outro frasco, dissolva 5,5905 g de KCl e 1,19155 g de HEPES em água duplamente destilada para um volume total de 0,5 L. Misture as duas soluções em um frasco erlenmeyer de 1 L e ajuste o pH para 7,4 com HCl.
      NOTA: Armazene a solução Resultante de 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES a 4 °C.
    3. Para preparar o tampão de oócito pré-médio ND96 (baixo K+, ca baixo2+), combine 1 mL de 2 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 45,5 mL de 2 M NaCl e 5 mL de 1/1 M NaOH-HEPES em um frasco de 1 L Erlenmeyer. Adicione 900 mL de água dupla destilada e ajuste o pH para 7,4 com HCl. Transfira a solução para um cilindro de 1 L e leve o volume para 1 L com água duplamente destilada. Em seguida, adicione 1,8 mL de 1 M CaCl2 e filtre a solução.
      NOTA: Pequenas variações nas relações entre os componentes utilizados para fazer uma solução ND96 não parecem ser críticas para o enriquecimento do colesterol, possivelmente porque a solução ND96 não é usada durante a etapa de enriquecimento em si, mas para armazenamento. Um exemplo é uma solução de 1 L que tem uma concentração ligeiramente menor de íons de sódio e cloreto, e é feita combinando 2 mL de 1 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 82,5 mL de 1 M NaCl, 5 mL de 1 M HEPES, e 1,8 mL de 1 M CaCl2 (Ca2+ é omitido para obter uma solução ca2+ livre). Ajuste o pH da solução para 7.4 com NaOH. Armazene a solução de cultura oocyte ND96 resultante a 4 °C por até 1 mês.
  2. Preparação da dispersão à base de fosfolipídeos com liposomos de colesterol
    1. Em um tubo de vidro de 12 mL, combine 200 μL de cada uma das seguintes soluções lipídicas dissolvidas de clorofórmio de 10 mg/mL: L-α-fosphatidyletanolamina, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfo-l-serine, e colesterol.
    2. Evapore o clorofórmio na capa para secar lentamente um fluxo de nitrogênio. Este passo é crítico.
    3. Suspender os lipídios em 800 μL de solução tamponada composta por 150 mM KCl e 10 mM Tris-HEPES em pH = 7,4, e cobrir com filme de parafina.
    4. Sonicate suavemente a 80 kHz por 10 min até formar uma mistura leitosa. Este passo é crítico.
      ATENÇÃO: Ao sondar, a dispersão no tubo de vidro deve vibrar suavemente, formando pequenas ondas. Gotas de dispersão não devem estar pulando dentro do tubo.
  3. Enriquecendo oócitos de Xenopus com colesterol
    NOTA: Os ovários contendo oócitos de sapos podem ser obtidos a partir de duas fontes: Primeiro, os sapos fêmeas Xenopus laevis podem ser alojados com o propósito de cirurgia interna. Este procedimento deve ser aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais. Em segundo lugar, ovários inteiros podem ser comprados de fornecedores comerciais. Como alternativa para comprar ou isolar ovários inteiros e, em seguida, digeri-los conforme descrito nas etapas 2.3.1-2.3.4, os oócitos individuais estão disponíveis comercialmente para compra. Se estes últimos forem utilizados, as etapas 2.3.1-2.3.4 podem ser ignoradas.
    1. Mantenha os ovários recém-obtidos a ~14 °C em uma solução ND96. Nessas condições, os ovários podem ser armazenados por até 1 semana.
    2. Para obter oócitos individuais, interrompa o saco ovariano em vários lugares usando fórceps afiados. Coloque os pedaços de ovário em uma placa de 60 mm, com 5 mL de Ca2+-free ND96 complementado com colagem de 0,5 mg/mL. Agite um agitador orbital a 60 oscilações/min por 15 min no RT.
      NOTA: Esta etapa garantirá a digestão do saco ovariano. Para preservar a atividade enzimática, evite armazenar colagem contendo ND96 por longos períodos de tempo (>1 h). Até mesmo um breve armazenamento deve ser realizado a temperaturas frias abaixo de 15 °C.
    3. Usando uma pipeta de transferência com uma ponta larga, pipeta vigorosamente a solução contendo oócitos para cima e para baixo aproximadamente 5-10x para separar oócitos individuais. Nesta etapa, a solução ficará escura.
    4. Enxágüe rapidamente os oócitos com OÓcitos Ca2+sem ND96 até que a solução se torne transparente.
    5. Transfira os oócitos individuais para a solução ND-96 contendo Ca2+suplementada com 2 mg/mL de gentamicina usando uma pipeta de transferência com uma ponta estreita.
      NOTA: Esta etapa é essencial quando é necessário armazenar os oócitos. Os oócitos individuais podem ser armazenados em uma incubadora por vários dias a 14-17 °C. No entanto, os oócitos mortos que são esbranquiçados devem ser removidos pelo menos uma vez por dia para evitar a contaminação da solução com produtos químicos tóxicos.
    6. Transfira 90 μL da dispersão à base de fosfolipídeos enriquecida com colesterol em um poço de uma placa de poço de 96.
    7. Transfira até seis oócitos do meio ND96 para o poço com o mínimo de médio possível. Este passo é crítico.
      ATENÇÃO: Não exponha os oócitos ao ar durante a transferência para manter os oócitos intactos.
    8. Coloque a placa de 96 poços em um rotor de plataforma tridimensional para fornecer um pequeno movimento orbital aos oócitos na célula por 5-10 min.
    9. Adicione uma gota de ND96 no poço e transfira os oócitos enriquecidos com colesterol da placa de 96 poços para uma placa de 35 mm com ND96 para uso imediato. Este passo é crítico.
    10. Use um kit à base de colesterol disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais)para avaliar as alterações nos níveis de colesterol seguindo as instruções do fabricante.

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Representative Results

O uso da ciclodextrina saturada de colesterol como meio de enriquecer tecidos e células com colesterol está bem estabelecido. Aqui, primeiro demonstramos a aplicação desta abordagem amplamente utilizada para enriquecer artérias cerebrais de ratos com colesterol usando MβCD saturado com colesterol. A Figura 1A mostra um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral e demonstra o aumento dependente da concentração na fluorescência associada à filipina obtida sobre o enriquecimento tecidual com concentrações crescentes de colesterol variando de 6,25 μM-6,25 mM por 1 h. Quantificação correspondente dos dados de imagem é representada na Figura 1B. Notavelmente, o aumento dos níveis de colesterol 2h após o período de incubação de 1h foi de ~50% do aumento observado imediatamente após o tratamento com o complexo de colesterol MβCD:colesterol. Como a Figura 1C demonstra para a amostra tratada com colesterol de 0,625 mM por 1 h, estudos funcionais utilizando os tecidos tratados precisam ser realizados o mais rapidamente possível após a conclusão do enriquecimento do colesterol. Além disso, enquanto um tempo de incubação de 1 h é comumente usado para enriquecer tecidos e células com colesterol usando esta abordagem, 5 min de incubação é geralmente suficiente para alcançar um aumento estatisticamente significativo no teor de colesterol da artéria cerebral, conforme determinado por um ensaio bioquímico à base de colesterol oxidase, conforme descrito na Figura 1D. O aumento do teor de colesterol permaneceu no mesmo nível quando o tempo de incubação foi aumentado para 60 min(Figura 1D).

A eficácia dos liposomos enriquecidos com colesterol como meio de enriquecer os oócitos xenopus com colesterol é demonstrada na Figura 2A-C. Embora não tenha sido observada alteração significativa nos níveis de colesterol no controle de dispersões baseadas em fosfolipídeos sem colesterol(Figura 2A),os níveis de colesterol aumentaram significativamente após apenas 5 minutos de tratamento com as dispersões à base de fosfolipídeos que incluíam colesterol, e permaneceram no mesmo nível quando o tempo de incubação foi aumentado para 60 min(Figura 2B). Um efeito semelhante foi observado em dois lotes diferentes de oócitos que foram obtidos de dois sapos. Notavelmente, no entanto, tanto os níveis iniciais de colesterol quanto a mudança no teor de colesterol variaram entre os dois lotes: no lote 1, a concentração inicial de colesterol foi de 64 μg de colesterol por mg de proteína, enquanto a concentração inicial no lote 2 foi de 45 μg de colesterol por mg de proteína, que é ~70% dos níveis iniciais de colesterol no lote 1. Após um tratamento de 60 min, a concentração de colesterol no lote 1 foi de 124 μg de colesterol por mg de proteína, enquanto no lote 2 foi de 67 μg de colesterol por mg de proteína. Assim, enquanto a concentração de colesterol aumentou em mais de ~90% no lote 1, aumentou em ~50% no lote 2. No entanto, o aumento substancial dos níveis de colesterol em ambos os lotes fornece meios para investigar o efeito de um aumento dos níveis de colesterol sobre a função das proteínas expressas neste sistema de expressão heteróloga. Além disso, a abordagem de dispersão baseada em fosfolipídeos para enriquecer óócitos xenopus com colesterol parece ser mais eficaz do que a aplicação de ciclodextrina saturada com colesterol, como feito em tecidos e células. Como a Figura 3 demonstra, a aplicação de complexos ciclodextrina-colesterol para enriquecer oócitos usando ciclodextrina de 5mM resultou em um aumento médio de apenas ~25% nos níveis de colesterol.

A eficácia da abordagem baseada em ciclodextrina para células enriquecedoras também é demonstrada em neurônios recém-isolados da região CA1 do hipocampo (Figura 4A). Como a Figura 4B mostra, a incubação dos neurônios em MβCD saturado com colesterol por 60 min resultou em aumento de mais de 2x nos níveis de colesterol, conforme determinado pela fluorescência associada à filipina. Usando esta abordagem, testamos o efeito do aumento do colesterol nos canais GIRK expressos em neurônios hipocampais. Como a Figura 4C demonstra, essa mudança nos níveis de colesterol resultou em um aumento significativo nas correntes GIRK. Da mesma forma, testamos o efeito do enriquecimento do colesterol na subunidade GIRK primária expressa no cérebro, GIRK2, usando o sistema de expressão heólogo xenopus oócitos. Para isso, superexpressamos GIRK2^ (GIRK2_E152D), um mutante poro de GIRK2 que aumenta sua expressão e atividade de membrana52 em oócitos xenopus, e enriqueceu os oócitos com colesterol por 60 min usando a abordagem de dispersão baseada em fosfolipídeos. Como demonstram as Figuras 4D-F, o aumento dos níveis de colesterol resultou em um aumento significativo nas correntes semelhante ao efeito do aumento dos níveis de colesterol nos neurônios na função do canal GIRK. Esses dados demonstram ainda a eficácia, consistência e utilidade das duas abordagens descritas acima para determinar o impacto do aumento dos níveis de colesterol na atividade proteica e na função celular.

Figure 1
Figura 1: Enriquecimento representativo de artérias cerebrais de ratos com colesterol utilizando metil-β-ciclodextrina saturada de colesterol. (A) Um exemplo de uma camada muscular lisa da artéria cerebral com imagem demonstrando o aumento dependente da concentração na fluorescência associada à filipina obtida sobre o enriquecimento tecidual com concentrações crescentes de colesterol variando de 6,25 μM-6,25 mM por 1 h.(B)Quantificação dos dados de imagem em (A). A medição da intensidade de fluorescência de toda a imagem foi realizada utilizando-se a função incorporada "Measurement" em software comercial. Em cada concentração de colesterol, ≥3 imagens foram coletadas de artérias que foram colhidas de doadores de animais separados. Para cada concentração de colesterol, os dados são apresentados como o erro médio ± padrão. ( C) Níveis de colesterol nos segmentos de camada muscular lisa da artéria cerebral imediatamente após um período de incubação de 1h com colesterol 0,625 mM e 3 h subsequenteao início do tratamento (ou seja, 1 h de incubação seguido de 2h na PBS). (D) Dependência dos níveis de colesterol no tempo de incubação determinado por um ensaio bioquímico à base de colesterol oxidase. Uma diferença significativa é indicada por um asterisco (*p ≤ 0,05). Painéis(A) (concentrações de colesterol 0 mM-0,625 mM),(B)e(C) foram modificados a partir de North et al.45. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Enriquecimento representativo de óócitos xenopus com colesterol usando liposóis. (A) Mudança dobrada nos níveis de colesterol de controle Os oócitos xenopus incubados em liposóis livres de colesterol por 5-60 min. (B) Alteração dobrada nos níveis de colesterol de oócitos xenopus incubados em liposomos enriquecidos com colesterol por 5-60 min. A barra de controle retratada refere-se à incubação em liposomos livres de colesterol por 5 min e é mostrada como uma comparação. (C) Comparação do efeito do enriquecimento do colesterol de dois lotes diferentes de óócitos xenopus usando liposomos enriquecidos com colesterol por 5 e 60 min. Uma diferença significativa é indicada por um asterisco (*p ≤ 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Enriquecimento representativo de óócitos xenopus com colesterol usando metil-β-ciclodextrina saturada de colesterol. (A) Mudança dobrada nos níveis de colesterol de controle Os oócitos xenopus incubados no controle da mídia ND96 por 5-60 min.(B) Alterações dobradas nos níveis de colesterol dos oócitos xenopus incubados em MβCD saturados de colesterol por 5-60 min. A barra de controle retratada refere-se à incubação em meios de controle por 5 min e é mostrada como uma comparação. Uma diferença significativa é indicada por um asterisco (*p ≤ 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Exemplos representativos de estudos de enriquecimento do colesterol na função proteica em células e oócitos xenopus: o impacto do colesterol na proteína G retificando internamente os canais de potássio. (A) Sinal de fluorescência associado à filipina do neurônio piramidal CA1 hipocampal de ratos em controle (esquerda) versus colesterol enriquecido (direita). (B) Dados sumários de sinais de fluorescência associados à filipina obtidos a partir de neurônios piramidais ca1 recém-isolados de controle e enriquecidos com colesterol. O enriquecimento do colesterol foi obtido pela incubação dos neurônios em MβCD saturado com colesterol por 1 h (n = 12-14). ( C) Curva de corrente iônica (I)-tensão (V) representando o efeito do enriquecimento do colesterol conforme descrito em (B) nas correntes GIRK em neurônios hipocampais da região CA1. (D) Traços representativos que mostram o efeito do enriquecimento do colesterol usando liposomos à base de fosfolipídeos enriquecidos com colesterol em GIRK2^ (GIRK2_E152D) expressos em óócitos xenopus a -80 mV e +80 mV. (E) Dados resumidos de(D)a -80 mV (n = 6-9). Uma diferença significativa é indicada por um asterisco (*p ≤ 0,05). As subfiguras(B-E) foram modificadas a partir de Bukiya et al.32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Métodos para enriquecer tecidos e células de mamíferos e oócitos xenopus com colesterol constituem uma poderosa ferramenta para investigar o efeito de níveis elevados de colesterol em espécies moleculares individuais, em sistemas macromoleculares complexos (por exemplo, proteínas), e na função celular e de órgãos. Neste artigo, descrevemos duas abordagens complementares que facilitam tais estudos. Primeiro, descrevemos como enriquecer tecidos e células com colesterol usando MβCD saturado com colesterol. Demonstramos que nos segmentos de artérias cerebrais, essa abordagem resultou em um aumento de ~50% nos níveis de colesterol. Além disso, em um estudo recente, mostramos que a mesma abordagem leva a um aumento de mais de 2x no teor de colesterol em neurônios hipocampais da região ca1. Em contraste, no entanto, empregar essa abordagem como um meio de enriquecer os oócitos xenopus resultou em apenas ~25% de aumento no teor de colesterol em oócitos xenopus. Assim, para enriquecer os oócitos xenopus, desenvolvemos uma abordagem de dispersão baseada em fosfolipídeos que resulta consistentemente em pelo menos ~50% de aumento nos níveis de colesterol. É possível que a vantagem dessa abordagem para enriquecer os oócitos xenopus decorre de uma capacidade de carga aumentada em comparação com a capacidade de carga da abordagem do complexo mβCD:colesterol. Também é possível que, embora a abordagem do complexo de colesterol MβCD seja otimizada para enriquecer tecidos e células, uma otimização adicional do protocolo é necessária para melhorar sua aplicação para enriquecer os oócitos de Xenopus.

A dispersão à base de fosfolipídeos usada para enriquecer oócitos xenopus com colesterol inclui dois lipídios que são amplamente usados para criar bicamadas lipídicas planares (i.e., L-α-fosphatidyletanolamina e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gliero-3-phospho-l-serine). No entanto, em um estudo anterior, foi demonstrado que os oócitos xenopus também poderiam ser enriquecidos usando colesterol de liposomos que incluíam fosfatidalina e colina36. Este método resultou em um aumento da relação colesterol/fosfolipídeo molar na membrana plasmática de 0,5 ± 0,1 para 0,9 ± 0,1 com um percentual médio de enriquecimento de 71%. Esse percentual médio de enriquecimento é muito semelhante ao nível médio de aumento do teor de colesterol que observamos (~70,5%), sugerindo que a escolha dos fosfolipóides usados para formar a dispersão não é fundamental para enriquecer os oócitos xenopus com colesterol usando essa abordagem.

Cada protocolo descrito envolve várias etapas críticas. Depois de preparar uma mistura de MβCD:colesterol em uma razão molar de 8:1 para garantir a saturação de MβCD com colesterol, é fundamental cobrir o frasco com pelo menos duas camadas de filme de parafina e defini-lo em um banho de água de 37 °C lentamente agitado durante a noite. Ao dissecar tecidos para o tratamento do colesterol é importante ser gentil para garantir que o tecido não seja esticado ou cortado. Depois de permeabilizar o tecido para facilitar a penetração do tine, é fundamental lavar completamente os segmentos de tecido na PBS. A coloração de tecido na fillipin precisa ser realizada no escuro, e a fillipin precisa ser meticulosamente lavada após a coloração ser concluída. Ao preparar dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidas com colesterol, é fundamental garantir que a dispersão no tubo de vidro vibra suavemente, formando pequenas ondas, para evitar a separação do colesterol da dispersão. Para o tratamento de colesterol de oócitos xenopus, é importante transferir os oócitos do meio ND96 para o poço com a dispersão à base de fosfolipídeos enriquecido com o mínimo de meio possível enquanto não expõe os oócitos ao ar para manter os oócitos intactos. É importante notar que devido à maquinaria intrínseca em tecidos, células e oócitos xenopus, os níveis de colesterol podem se equilibrar e, em seguida, voltar aos seus níveis originais ao longo do tempo. Consequentemente, estudos funcionais precisam ser realizados imediatamente após o tempo de incubação. Aqui, temos demonstrado essa noção em artérias cerebrais enriquecidas com colesterol, mostrando que o aumento dos níveis de colesterol 2h após um período de incubação de 1h foi aproximadamente metade do aumento observado imediatamente após o período de incubação.

Apesar de seguir os passos críticos descritos acima, vários desafios podem surgir. Por exemplo, um aumento nos níveis de colesterol pode não ser observado após o tratamento enriquecedor de colesterol. Se este for o caso, pode ser necessário aumentar a concentração de colesterol na mídia que enriquece o colesterol. O mesmo se aplica ao enriquecimento de colesterol de tecidos, células e oócitos xenopus. No entanto, na preparação de tratamentos utilizando a abordagem do complexo de Colesterol MβCD, a quantidade de MβCD deve ser aumentada com o aumento da concentração de colesterol para manter uma razão molar 8:1 com o colesterol. Além disso, pode ser necessário preparar uma solução fresca que enriquece o colesterol, pois o colesterol tende a precipitar-se fora da solução, e a solução perde sua eficiência enriquecedora de colesterol. Após o enriquecimento do colesterol, é possível que um sinal de filipinnão seja observado. Se este for o caso, pode ser necessário usar um pó fresco de filipin para preparar um novo estoque e repetir o experimento. A fluorescência de Filipin diminui rapidamente, e a solução de estoque não pode ser armazenada por mais de vários dias. Uma limitação da coloração de filipina é que parece reconhecer esteróides além do colesterol. Por exemplo, recentemente demonstramos um aumento do sinal de fluorescência associado à filipina nas artérias cerebrais de ratos após o enriquecimento com coprostanol45. Assim, os resultados da coloração de filipina devem ser interpretados com cautela e, na dúvida, devem ser empregadas abordagens alternativas para corroborar os resultados. Uma possibilidade seria realizar um ensaio bioquímico através da aplicação de um kit comercialmente disponível à base de colesterol à base de oxidase.

Em resumo, as abordagens apresentadas são muito eficazes para alcançar o enriquecimento do colesterol próximo ou superior a 50%. De fato, a abordagem mβCD:complexo de colesterol que resulta em ~50% nos níveis de colesterol nas artérias cerebrais é muito mais eficiente do que usar LDL para enriquecer esses tecidos, o que resulta em um mero aumento de ~10% no colesterol35. O mesmo se aplica à aplicação de dispersões à base de fosfolipídeos enriquecidas com colesterol (lipossomos) para enriquecer os oócitos xenopus. Como descrito acima, essa abordagem resulta consistentemente em um aumento de pelo menos 50% nos níveis de colesterol. É importante ressaltar que essas duas abordagens para o enriquecimento do colesterol são resultados de rendimento in vitro comparáveis com o aumento do colesterol obtido submetendo os animais a uma dieta de colesterol alto32,37,40,53,54. Além disso, em contraste com as dietas de colesterol alto de semanas, as abordagens in vitro requerem apenas alguns minutos de tempo de incubação para alcançar um aumento estatisticamente significativo e estável no nível de colesterol.

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Disclosures

Dr. A. M. Dopico é um funcionário federal especial, em tempo de meio período e atual membro do Conselho Consultivo Nacional sobre Abuso de Álcool e Alcoolismo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por um Fundo de Desenvolvimento de Cientistas (11SDG5190025) da American Heart Association (para A.R.-D.), e pelo National Institute of Health R01 concede AA-023764 (para A.N.B.), e HL-104631 e R37 AA-11560 (para A.M.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioquímica Edição 157 enriquecimento do colesterol lipídios complexo ciclodextrina-colesterol dispersão liposóficos fosfolipídios lipoproteína de baixa densidade LDL neurônios artérias cerebrais oócitos xenopus, canais de potássio
Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos <em>xenopus</em> com colesterol
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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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