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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60734
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Summary

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Abstract

Cholesterin-Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen, einschließlich Xenopus-Oozyten, die zur Untersuchung der Zellfunktion verwendet werden, kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden. Hier beschreiben wir zwei wichtige Ansätze, die zu diesem Zweck verwendet werden. Zunächst beschreiben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem man Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, mit Zerebralen arterienden (Gewebe) und Hippocampus-Neuronen (Zellen) als Beispiele anreichert. Dieser Ansatz kann für jede Art von Gewebe, Zellen oder Zelllinien verwendet werden. Ein alternativer Ansatz für die Cholesterinanreicherung beinhaltet die Verwendung von Low-Density-Lipoprotein (LDL). Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es einen Teil der natürlichen CholesterinHomöostase-Maschinerie der Zelle verwendet. Während jedoch der Cyclodextrin-Ansatz angewendet werden kann, um jede Zellart des Interesses mit Cholesterin zu bereichern, ist der LDL-Ansatz auf Zellen beschränkt, die LDL-Rezeptoren exprimieren (z. B. Leberzellen, Knochenmark-abgeleitete Zellen wie Blutleukozyten und Gewebemakrophagen), und der Grad der Anreicherung hängt von der Konzentration und der Mobilität des LDL-Rezeptors ab. Darüber hinaus enthalten LDL-Partikel andere Lipide, so dass die Cholesterinabgabe unspezifisch ist. Zweitens beschreiben wir, wie Xenopus-Oozyten mit Cholesterin angereichert werden können, indem man eine phospholipidbasierte Dispersion (d. h. Liposomen) verwendet, die Cholesterin enthält. Xenopus Oozyten bilden ein beliebtes heterologes Expressionssystem, das zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Sowohl für den Cyclodextrin-basierten Cholesterinanreicherungsansatz von Säugetiergewebe (Zerebralenarterien) als auch für den phospholipidbasierten Cholesterinanreicherungsansatz von Xenopus Oozyten zeigen wir, dass der Cholesterinspiegel nach 5 min Inkubation ein Maximum erreicht. Dieser Cholesterinspiegel bleibt während längerer Inkubationszeiten (z.B. 60 min) konstant. Zusammen bilden diese Daten die Grundlage für optimierte zeitliche Bedingungen für die Cholesterinanreicherung von Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten für funktionelle Studien, die darauf abzielen, die Auswirkungen der Cholesterinanreicherung zu hinterfragen.

Introduction

Cholesterin, ein wichtiges zelluläres Lipid, spielt zahlreiche kritische funktionelle und strukturelle Rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Von der Regulierung der physikalischen Eigenschaften der Plasmamembran bis hin zur Sicherstellung der Zelllebensfähigkeit, des Wachstums, der Proliferation und der Funktion als Signal- und Vorläufermolekül in einer Vielzahl biochemischer Bahnen ist Cholesterin ein zwingender Bestandteil, der für die normale Zell- und Organfunktion notwendig ist. Als Ergebnis, Cholesterinmangel führt zu schweren körperlichen Fehlbildungen und eine Vielzahl von Störungen. Auf der anderen Seite, auch eine kleine Erhöhung des Cholesterins über physiologischen Niveaus (2-3x) ist zytotoxisch1,2,10 und wurde mit der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf11,12,13 und neurodegenerative Erkrankungen14,15,16,17verbunden. Um die kritischen Funktionen des Cholesterins zu hinterfragen und die Wirkung von Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die den Cholesteringehalt in Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten verändern.

Veränderung des Cholesterinspiegels in Säugetiergeweben und -zellen
Mehrere Ansätze können genutzt werden, um den Cholesterinspiegel in Geweben und Zellen18zu senken. Ein Ansatz beinhaltet ihre Exposition gegenüber Statinen, die in Lipoprotein-defizigem Serum gelöst werden, um HMG-CoA-Reduktase zu hemmen, die die Rate der Cholesterinsynthesesteuert 19,20. Jedoch, Diese Cholesterin senkenden Medikamente hemmen auch die Bildung von Nicht-Sterol-Produkte entlang der Mevalonat-Weg. Daher wird eine kleine Menge Mevalonat hinzugefügt, um die Bildung dieser Produkte zu ermöglichen21 und die Spezifität dieses Ansatzes zu verbessern. Ein weiterer Ansatz zur Senkung des Cholesterinspiegels beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrinen. Diese Glucopyranose-Monomere besitzen eine interne hydrophobe Höhle mit einem Durchmesser, der der Größe der Sterole22entspricht, was die Extraktion von Cholesterin aus Zellen erleichtert und sie dadurch von ihrem nativen Cholesteringehalt23erschöpft. Ein Beispiel ist 2-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HP-CD), ein präklinisches Medikament, das derzeit zur Behandlung der Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit getestet wird, einer genetisch vererbten tödlichen Stoffwechselstörung, die durch lysosomale Cholesterinspeicherung gekennzeichnet ist24. Der Grad des Cholesterinmangels hängt von dem verwendeten spezifischen Derivat ab. Zum Beispiel extrahiert HP-CD Cholesterin mit einer geringeren Kapazität als das methylierte Derivat, Methyl-A-Cyclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Vor allem aber können neben Cholesterin auch andere hydrophobe Moleküle extrahiert werden, die dann zu unspezifischen Wirkungen führen können31. Im Gegensatz zur Erschöpfung können Zellen und Gewebe durch die Behandlung mit dem mit Cholesterin23vorgesättigten A-Cyclodextrin gezielt mit Cholesterin angereichert werden. Dieser Ansatz kann auch als Kontrolle für die Spezifität von ,,Cyclodextrinen" verwendet werden, die für den Cholesterinmangel verwendet werden31. Der Abbau von Cholesterin aus Geweben und Zellen ist einfach und kann erreicht werden, indem die Zellen für 30-60 min bis 5 mM M'CD in dem Medium, das für die Lagerung der Zellen verwendet wird, gelöst werden. Dieser Ansatz kann zu einer 50%igen Abnahme des Cholesteringehalts führen (z.B. in Hippocampus-Neuronen32, Rattenhirnarterien33). Auf der anderen Seite ist die Vorbereitung des "Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexes" für die Cholesterinanreicherung von Gewebe und Zellen komplexer und wird im Protokollabschnitt beschrieben.

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit mit Cholesterin gesättigtem X-Cyclodextrin beinhaltet die Verwendung von LDL, das auf LDL-Rezeptoren beruht, die in den Geweben/Zellen18exprimiert werden. Während dieser Ansatz bietet den Vorteil der Verwendung der natürlichen Cholesterin Homöostase Maschinerie der Zelle, Es hat mehrere Einschränkungen. Erstens können Gewebe und Zellen, die den LDL-Rezeptor nicht ausdrücken, mit diesem Ansatz nicht angereichert werden. Zweitens enthalten LDL-Partikel neben Cholesterin auch andere Lipide. Insbesondere besteht LDL aus dem Protein ApoB100 (25%) und die folgenden Lipide (75%): 6-8% Cholesterin, 45-50% Cholesterylester, 18-24% Phospholipide und 4-8% Triacylglycerole34. Daher ist die Abgabe von Cholesterin über LDL-Partikel unspezifisch. Drittens kann der prozentuale Anstieg des Cholesteringehalts durch LDL in Geweben und Zellen, die den LDL-Rezeptor ausdrücken, signifikant niedriger sein als der Mit dem Cholesteringehalt beobachtete Anstieg. Zum Beispiel, in einer früheren Studie, Anreicherung von Nagetier Hirnarterien mit Cholesterin über LDL führte nur zu einem 10-15% Anstieg des Cholesterinspiegels35. Im Gegensatz dazu führte die Anreicherung dieser Arterien mit Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie im Protokollabschnitt beschrieben, zu einer >50%igen Erhöhung des Cholesteringehalts (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten
Xenopus Oozyten bilden ein heterologes Expressionssystem, das häufig zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cholesterin-Zu-Phospholipid-Molaren-Verhältnis in Xenopus-Oozyten 0,5 x 0,136beträgt. Aufgrund dieses intrinsischen hohen Cholesterinspiegels ist die Erhöhung des Cholesterinspiegels in diesem System eine Herausforderung, kann aber mit Dispersionen aus Membranphospholipiden und Cholesterin erreicht werden. Die Phospholipide, die wir für diesen Zweck gewählt haben, ähneln denen, die zur Bildung künstlicher planarer Lipid-Doppelschichten verwendet werden, und umfassen L-A-Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), wie im Protokollabschnitt beschrieben. Dieser Ansatz kann zu >50% Anstieg des Cholesteringehalts führen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit phospholipidbasierten Dispersionen beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, was der Art und Weise ähnelt, wie Gewebe und Zellen angereichert werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieser Ansatz von geringer Reproduzierbarkeit und Effizienz ist, mit einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts um 25 %. Dies ist möglicherweise auf die unterschiedliche Belastbarkeit dieser beiden Ansätze zurückzuführen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3). Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Cyclodextrin, um Cholesterin aus Xenopus Oozyten zu erschöpfen, zu einer Abnahme des Cholesteringehalts um 40 % führen kann36.

Hier konzentrieren wir uns auf die Cholesterinanreicherung von Säugetiergeweben und -zellen durch die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, und von Xenopus Oozyten mit Liposomen. Beide Ansätze können genutzt werden, um die Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels auf die Proteinfunktion abzuleiten. Die Mechanismen der Cholesterinmodulation der Proteinfunktion können direkte Wechselwirkungen8 und/oder indirekte Effektebeinhalten 9. Wenn Cholesterin die Proteinfunktion über direkte Wechselwirkungen beeinflusst, ist die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Proteinaktivität wahrscheinlich unabhängig vom Zelltyp, Expressionssystem oder Anreicherungsansatz. Zum Beispiel nutzten wir diese beiden Ansätze, um die Wirkung von Cholesterin auf G-Protein-Gated-Innen-Rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRK) zu bestimmen, ausgedrückt in Vorhoffnden Myozyten37, Hippocampus-Neuronen32,38, HEK29339 Zellen und Xenopus-Oozyten 32,37. Die in diesen Studien erzielten Ergebnisse waren konsistent: in allen drei Arten von Säugetierzellen und in Amphibien-Oozyten wurde die GIRK-Kanalfunktion von Cholesterin hochreguliert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4, für Hippocampus-Neuronen und die entsprechenden Experimente in Xenopus-Oozyten). Darüber hinaus stimmten die in diesen Studien gemachten Beobachtungen auch mit den Ergebnissen von Studien überein, die an den Vorhofmyozyten37,40 und hippocampalneuronen32,38 frisch isoliert von Tieren, die einer hohen Cholesterindiät ausgesetztwaren, 40durchgeführt wurden. Bemerkenswert ist, dass die Cholesterinanreicherung von Hippocampus-Neuronen mit M-CD die Wirkung der Atorvastatin-Therapie, die zur Bekämpfung der Auswirkungen der hohen Cholesterin-Diät sowohl auf den Cholesterinspiegel als auch auf die GIRK-Funktionverwendetwird, umkehrte. In anderen Studien untersuchten wir die Wirkung von Mutationen auf die Cholesterinempfindlichkeit des nach innen korrigierenden Kaliumkanals Kir2.1 mit Xenopus-Oozyten und HEK293-Zellen41. Auch hier war die Wirkung der Mutationen auf die Empfindlichkeit des Kanals in den beiden Systemen ähnlich.

Die Anwendungen beider Anreicherungsmethoden zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinspiegel auf die Molekular-, Zell- und Organfunktion sind zahlreich. Insbesondere die Verwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Zellen und Geweben ist aufgrund seiner Spezifität sehr häufig. Jüngste Beispiele für diesen Ansatz sind die Bestimmung der Auswirkungen von Cholesterin auf herG-Kanalaktivierung und zugrunde liegende Mechanismen42, die Entdeckung, dass Cholesterin aktiviert die G-Protein gekoppelt Rezeptor Geglättet, um Hedgehog Signalisierung43zu fördern , und die Identifizierung der Rolle von Cholesterin in Stammzell Biomechanik und Adipogenese durch Membran-assoziierte Linker Proteine44. In unserer eigenen Arbeit nutzten wir die Anreicherung von Säugetiergewebe mit dem M-CD:Cholesterin-Komplex, um die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die Grundfunktion und das pharmakologische Profil von Kalzium- und Spannungskanälen großer Leitfähigkeit (BK, MaxiK) im vaskulären Glattmuskel35,45,46zuuntersuchen. In anderen Studien verwendeten wir den Phospholipid-basierten Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin, um die Rollen verschiedener Regionen in Kir2.1- und GIRK-Kanälen in der Cholesterinempfindlichkeit41,47,48,49, sowie zur Bestimmung vermeintlicher Cholesterinbindungsstellen in diesen Kanälen32,50,51zubestimmen.

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Protocol

Alle experimentellen Eingriffe mit Tieren wurden am University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) durchgeführt. Die Pflege von Tieren und Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des UTHSC überprüft und genehmigt, einer Einrichtung, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert ist.

1. Anreicherung von Geweben und Zellen mit methyl--cyclodextrin gesättigt mit Cholesterin

HINWEIS: Das nachfolgende Cholesterinanreicherungsprotokoll ist für Gewebe, Zellen und Zelllinien geeignet. Als Beispiel beschreiben wir die Schritte zur Bereicherung der Hirnarterien von Säugetieren. Repräsentative Ergebnisse werden sowohl für hirnarteriende (Abbildung 1) als auch für Neuronen(Abbildung 4) bereitgestellt.

  1. Zubereitung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD
    1. Wiegen Sie 0,064 g M-CD und lösen Sie es in einem Kolben, der 10 ml Phosphat-gepufferte Saline-Lösung (PBS) enthält, um eine Endkonzentration von 5 mM M-CD zu erhalten. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab, um sicherzustellen, dass die M-CD vollständig aufgelöst ist.
    2. Wiegen Sie 0,0024 g Cholesterinpulver und fügen Sie es in den gleichen Kolben, um eine 0,63 mM Cholesterinkonzentration zu erhalten. Dann rühren Sie die Lösung kräftig. Verwenden Sie einen Spachtel, um so viele Cholesterin-Stücke wie möglich zu brechen (einige Brocken bleiben bis zur Inkubation).
    3. Den Kolben mit mindestens zwei Schichten Paraffinfolie bedecken und langsam schütteln (30 Schwingungen/min) in einem 37 °C Wasserbad über Nacht schütteln. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    4. Nach 8-16 h die Lösung auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen und dann durch einen 0,22 m Polyethersulfonspritzenfilter in eine Glasflasche filtern.
      ANMERKUNG: Um unterschiedliche Cholesterinkonzentrationen in Lösung zu erreichen, passen Sie die Mengen von Cholesterin und M-CD durch einfache Proportion. Es ist wichtig, das Molarenverhältnis von M-CD:Cholesterin bei 8:1 beizubehalten, um eine Sättigung des Methyl-Cyclodextrin-Trägers mit Cholesterin zu erhalten. Die cholesterinanreicherende Lösung kann bei 4 °C sofort oder über mehrere Tage verwendet werden. Jedoch, die Cholesterin-anreichernde Fähigkeit sinkt im Laufe der Zeit, wenn die Cholesterinaggregate erscheinen, und die Lösung wird trüb.
  2. Behandlung von Hirnarterien mit Cholesterin gesättigten M-CD
    1. Euthanisieren Sie eine Sprague Dawley Ratte (250-300 g), indem Sie sie in eine Kammer mit 2% Isofluran geben. Enthaupten Sie dann die anästhesierte Ratte mit einer scharfen Guillotine oder einer großen scharfen Schere.
      HINWEIS: Wenn Sie diese Verfahren regelmäßig durchführen, ist es sinnvoll, einen Zeitplan für die Guillotineschärfung zu entwickeln. Außerdem sollte eine separate Schere für die Enthauptung von Nagetieren vorgesehen sein. Die Enthauptung von Nagetieren ist ein terminales Verfahren; Daher müssen die Instrumente nicht steril sein. Die Reinigung mit Seifenwasser nach jedem Gebrauch ist ausreichend.
    2. Positionieren Sie den Kopf der Ratte nach vorne, weg vom Forscher. Legen Sie den spitzen Teil einer mittelgroßen Schere zwischen schädel- und hirnstamm und schneiden Sie seitlich auf beiden Seiten.
    3. Verwenden Sie Zangen, um den oberen Schädel zu hebeln, indem Sie auf der Basis des Schädels nach oben ziehen, wo die seitlichen Schnitte gemacht wurden, und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn. Achten Sie darauf, die optischen Nerven zu schneiden, die das Gehirn im Schädel halten.
    4. Legen Sie das Gehirn in einen Becher mit PBS auf Eis nach der Entfernung.
      HINWEIS: Das Gehirn kann auf Eis für 4-6 h bei 4 °C gespeichert werden.
    5. In einer nicht sterilen Umgebung übertragen Sie das Rattenhirn in eine gewachste Sezierschale mit genügend PBS, um es unter Wasser zu setzen. Pin das Gehirn nach unten, um es von der Bewegung zu halten.
      HINWEIS: Schritt 1.2.5 kann bei RT durchgeführt werden, wenn es schnell durchgeführt wird. Andernfalls muss es auf Eis gemacht werden.
    6. Verwenden Sie scharfe Zangen und kleine chirurgische Scheren, um die Zerebralparese und ihre Zweige zu sezieren, die den Kreis von Willis an der Basis des Gehirns unter dem Mikroskop in PBS bei RT bilden. Seien Sie sanft beim Sezieren, um sicherzustellen, dass das Arteriengewebe nicht gedehnt oder geschnitten wird. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    7. Spülen Sie die Arteriensegmente (bis zu 1 cm lang) in PBS entweder in einer 96-Well-Platte oder in einer 35-mm-Schale kurz ab, um das übrig gebliebene Blut zu entfernen, und legen Sie sie dann 10 min in genügend Cholesterin anreichernde Lösung (in Schritt 1.1) auf, um die gesamten Arteriensegmente abzudecken. Verwenden Sie eine 35-mm-Schale, wenn es eine ausreichende Menge an Cholesterin-anreichernden Lösung und eine 96-Well-Platte, wenn die Arterien klein sind oder wenn es einen Mangel an Cholesterin-anreichernde Lösung.
      HINWEIS: Derselbe Ansatz kann verwendet werden, um andere Gewebe und Zellen mit Cholesterin mit einer Inkubationszeit von 60 min zu bereichern. Zum Beispiel wurde dieser Ansatz zuvor für die Cholesterinanreicherung von Maus-Hirnarterien35,45, Hippocampus-Neuronen32, Vorhof-Myozyten37und HEK 293 Zellen39verwendet. Die minimale Inkubationszeit muss für jeden Gewebe- oder Zelltyp bestimmt werden, basierend auf der Validierung der Cholesterinanreicherung zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem cholesterinempfindlichen Assay (z.B. die biochemische Bestimmung der Cholesterinmenge im Gewebe durch Färbung mit dem cholesterinempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff filipin).
  3. Färben Sie das Arteriengewebe mit dem Steroid-sensitiven Fluoreszenz Farbstoff filipin, um Veränderungen im Cholesterinspiegel zu bestimmen.
    HINWEIS: Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse zeigen wir die Ergebnisse von zwei Ansätzen zur Bewertung von Veränderungen des Cholesterinspiegels: einem biochemischen Test, der durch die Anwendung eines kommerziell erhältlichen Cholesterinoxidase-basierten Kits durchgeführt wird (siehe Tabelle der Materialien) und Der Färbung mit dem steroidempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff Filipin. Der erste Ansatz kann durch Befolgen der Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Das Protokoll für den letztgenannten Ansatz ist unten aufgeführt.
    1. Mit einer frischen Flasche Filipinpulver eine 10 mg/ml-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereiten. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      HINWEIS: Die resultierende Lösung ist lichtempfindlich. Bei richtiger Vorbereitung ist die filipin Stocklösung gelblich. Etwas filipin Pulver kann auf der Flaschenkappe kleben. Daher ist es wichtig, die Flasche und den Verschluss mit DMSO Lösungsmittel zu spülen, um die gesamte Menge an Filipin zu behalten. Nach der Herstellung muss der filipin eiserne Bestand innerhalb von mehreren Tagen verwendet werden. Filipin verliert seine Fluoreszenzfähigkeit nach 5 Tagen vollständig, selbst wenn es im Dunkeln bei -20 °C gelagert wird.
    2. Entfernen Sie die Arteriensegmente aus der cholesterinanreichernden Lösung und waschen Sie sie 3x mit PBS für 5 min.
    3. Fixieren Sie die Arteriensegmente in 4% Paraformaldehyd für 15 min auf Eis.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist lichtempfindlich. Daher müssen die Arbeiten im Dunkeln durchgeführt werden.
    4. Legen Sie die Arteriensegmente in 0,5% Triton in PBS bei RT für 10 min, um das Gewebe zu permeabilisieren und die Penetration von Farbstoffen zu erleichtern.
    5. Waschen Sie die Arteriensegmente 3x mit PBS für 5 min auf einem Shaker. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      HINWEIS: Wenn der Triton vollständig ausgewaschen wurde, sollte es keine Blasen auf der Oberfläche der PBS-Lösung geben.
    6. Verdünnen Sie die filipin Stocklösung in PBS auf eine Endkonzentration von 25 g/ml. Entfernen Sie die Arterien aus der PBS-Lösung und legen Sie sie in die verdünnte filipin Lösung für 1 h im Dunkeln. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    7. Waschen Sie den Filipin aus, indem Sie die Arteriensegmente 3x mit PBS für 5 min auf einem Shaker ausspülen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    8. Spülen Sie die Arteriensegmente kurz mit destilliertem Wasser, absorbieren Sie übermäßige Flüssigkeit mit einer Papierserviette und montieren Sie die Arterien mit handelsüblichen Montagemedien auf einem Dia (siehe Tabelle der Materialien).
    9. Bedecken Sie die Arterie mit einem Deckelschlupf, um das Rollen oder Verdrehen der Arterie zu vermeiden, und stellen Sie die Dias in einem dunklen Bereich bei RT für 24 h zum Trocknen auf.
    10. Nachdem das Montagemedium trocknet, die Abdeckungsrutschkanten mit klarem Nagellack versiegeln und den Nagellack 10-15 min trocknen lassen. Die Dias im Dunkeln bei -20 °C lagern.
    11. Stellen Sie die Dias vor der Bildgebung auf RT ab.
    12. Stellen Sie das Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenzleser mit der Anregung simm 340-380 nm und der Emission bei 385-470 nm dar.
      VORSICHT: Filipin Photobleaches schnell; Daher müssen Proben zeitnah abgebildet werden.

2. Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen)

  1. Vorbereitung von Lösungen
    1. Um eine Vorratslösung von Cholesterin vorzubereiten, lösen Sie 10 mg Cholesterinpulver in 1 ml Chloroform in einem 10 ml Glasbecher oder einer Flasche auf. Übertragen Sie die Lösung in eine 1,5 ml gekappte Glasflasche.
      VORSICHT: In Anbetracht der Toxizität und schnellen Verdunstung von Chloroform, in der Haube arbeiten und Reagenzien auf Eis halten.
    2. Bereiten Sie einen 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 Puffer für cholesterinangereicherte Phospholipide vor. Um dies zu tun, in einem Erlenmeyerkolben 5,5905 g KCl und 0,6057 g Tris in doppeldestilliertem Wasser auf insgesamt 0,5 l Volumen auflösen. In einem anderen Kolben 5,5905 g KCl und 1,19155 g HEPES in doppeldestilliertem Wasser auf insgesamt 0,5 l Volumen auflösen. Mischen Sie die beiden Lösungen in einem 1 L Erlenmeyer Kolben zusammen und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
      HINWEIS: Bewahren Sie die resultierende 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES Lösung bei 4 °C auf.
    3. Zur Vorbereitung nd96 vor-mittlerer Eizelle Kultivierung (niedrige K+, low Ca2+) Puffer, kombinieren 1 ml von 2 M KCl, 1 ml von 1 M MgCl2, 45,5 ml von 2 M NaCl, und 5 ml von 1/1 M NaOH-HEPES in einem 1 L Erlenmeyer Kolben. 900 ml doppeldestilliertes Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen. Die Lösung auf einen 1 L-Zylinder übertragen und das Volumen mit doppeldestilliertem Wasser auf 1 L bringen. Fügen Sie dann 1,8 ml von 1 M CaCl2 hinzu und filtern Sie die Lösung.
      HINWEIS: Leichte Abweichungen in den Verhältnissen zwischen den Komponenten, die zur Herstellung einer ND96-Lösung verwendet werden, scheinen für die Cholesterinanreicherung nicht entscheidend zu sein, möglicherweise weil die ND96-Lösung nicht während des Anreicherungsschritts selbst, sondern zur Lagerung verwendet wird. Ein Beispiel ist eine 1 L-Lösung, die eine etwas niedrigere Konzentration von Natrium- und Chloridionen aufweist und durch die Kombination von 2 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2, 82,5 ml von 1 M NaCl, 5 ml 1 M HEPES und 1,8 ml 1 M CaCl2 (Ca2+ wird weggelassen, um eine Ca2+ freie Lösung zu erhalten) hergestellt wird. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 7,4 ein. Bewahren Sie die resultierende ND96-Eizellen-Kultivierungslösung bis zu 1 Monat bei 4 °C auf.
  2. Herstellung der Phospholipid-basierten Dispersion mit Cholesterin-Liposomen
    1. Kombinieren Sie in einem 12 ml Glasrohr jeweils 200 l der folgenden 10 mg/ml chloroformgelösten Lipidlösungen: L-Phosphatidylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Sn-Glycero-3-Phospho-l-Serin und Cholesterin.
    2. Verdampfen Sie die Chloroform in der Haube, um langsam unter einem Stickstoffstrom zu trocknen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    3. Die Lipide in 800 l gepufferter Lösung, bestehend aus 150 mM KCl und 10 mM Tris-HEPES bei pH = 7,4, aufsetzen und mit Paraffinfolie abdecken.
    4. 10 min lang sanft bei 80 kHz beschallen, bis sich eine milchige Mischung bildet. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      VORSICHT: Beim Beschallen sollte die Dispersion im Glasrohr sanft vibrieren und kleine Wellen bilden. Dispersionstropfen sollten nicht innerhalb des Rohres springen.
  3. Xenopus-Oozyten mit Cholesterin anreichern
    HINWEIS: Frosch-Oozyten-haltige Eierstöcke können aus zwei Quellen bezogen werden: Erstens können Xenopus laevis weibliche Frösche zum Zwecke der hausinternen Chirurgie untergebracht werden. Dieses Verfahren muss vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung genehmigt werden. Zweitens können ganze Eierstöcke bei kommerziellen Lieferanten erworben werden. Als Alternative zum Kauf oder der Isolierung ganzer Eierstöcke und deren anschließende Verdauung, wie in den Schritten 2.3.1-2.3.4 beschrieben, sind einzelne Eizellen kommerziell erhältlich. Wenn letztere verwendet werden, können die Schritte 2.3.1-2.3.4 übersprungen werden.
    1. Bewahren Sie die frisch erhaltenen Eierstöcke bei 14 °C in einer ND96-Lösung auf. Unter diesen Bedingungen können die Eierstöcke bis zu 1 Woche gelagert werden.
    2. Um einzelne Eizellen zu erhalten, stören Sie den Eierstocksack an mehreren Stellen mit scharfen Zangen. Legen Sie die Eierstöcke in eine 60 mm Platte, mit 5 ml Ca2+-frei ND96 ergänzt mit 0,5 mg/ml Kollagenase. Schütteln Sie auf einem Orbital-Shaker bei 60 Schwingungen/min für 15 min bei RT.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird die Verdauung des Eierstocksacks sicherstellen. Um die enzymatische Aktivität zu erhalten, vermeiden Sie die Lagerung von Kollagennase, die ND96 enthält, über einen längeren Zeitraum (>1 h). Auch eine kurze Lagerung sollte bei kühlen Temperaturen unter 15 °C erfolgen.
    3. Mit einer Transferpipette mit breiter Spitze, kräftig Pipetten die Eizelle-haltige Lösung nach oben und unten ca. 5-10x, um einzelne Eizellen zu trennen. In diesem Schritt wird die Lösung dunkel.
    4. Spülen Sie die Eizellen schnell mit Ca2+-free ND96, bis die Lösung transparent wird.
    5. Übertragen Sie einzelne Eizellen auf Ca2+-haltige ND-96 Lösung, ergänzt mit 2 mg/ml Gentamicin mit einer Transferpipette mit einer schmalen Spitze.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, wenn es notwendig ist, die Eizellen zu speichern. Einzelne Eizellen können mehrere Tage bei 14-17 °C in einem Inkubator gelagert werden. Tote Eizellen, die weißlich sind, müssen jedoch mindestens einmal täglich entfernt werden, um eine Kontamination der Lösung mit giftigen Chemikalien zu vermeiden.
    6. Übertragen Sie 90 l der cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersion in einen Brunnen einer 96-Well-Platte.
    7. Übertragen Sie bis zu sechs Eizellen vom ND96 Medium in den Brunnen mit so wenig Medium wie möglich. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      VORSICHT: Setzen Sie die Eizellen während des Transfers nicht der Luft aus, um die Eizellen intakt zu halten.
    8. Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf einem dreidimensionalen Plattformrotator, um eine kleine Orbitalbewegung zu den Eizellen in der Zelle für 5-10 min zu liefern.
    9. Fügen Sie einen Tropfen ND96 in den Brunnen und übertragen Sie die cholesterinangereicherten Eizellen von der 96 Well Platte auf eine 35 mm Platte mit ND96 für den sofortigen Gebrauch. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    10. Verwenden Sie ein handelsübliches Cholesterinoxidase-basiertes Kit (siehe Tabelle der Materialien), um Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bewerten, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.

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Representative Results

Die Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem Cyclodextrin als Mittel zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit Cholesterin ist etabliert. Hier zeigen wir zunächst die Anwendung dieses weit verbreiteten Ansatzes zur Anreicherung von Rattenhirnarterien mit Cholesterin unter Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD. Abbildung 1zeigt ein Beispiel für eine abgebildete zerebrale Arterie glatte Muskelschicht und zeigt die konzentrationsabhängige Zunahme der filipinassoziierten Fluoreszenz, die bei Gewebeanreicherung mit steigenden Cholesterinkonzentrationen von 6,25 m-6,25 mM für 1 h erreicht wird. Entsprechende Quantifizierung der bildgebenden Daten ist in Abbildung 1Bdargestellt. Bemerkenswert ist, dass der Anstieg des Cholesterinspiegels 2 h nach der 1 h Inkubationszeit 50% des Anstiegs betrug, der unmittelbar nach der Behandlung mit dem M-CD:cholesterin-Komplex beobachtet wurde. Wie Abbildung 1C für die mit 0,625 mM Cholesterin für 1 h behandelte Probe zeigt, müssen Funktionsstudien mit den behandelten Geweben so schnell wie möglich nach Abschluss der Cholesterinanreicherung durchgeführt werden. Darüber hinaus, während eine 1 h Inkubationszeit wird häufig verwendet, um Gewebe und Zellen mit Cholesterin mit diesem Ansatz zu bereichern, 5 min inkubation ist in der Regel ausreichend, um eine statistisch signifikante Erhöhung der zerebralen Arterie Cholesteringehalt zu erreichen, wie durch ein Cholesterin Oxidase-basierte biochemische Assay bestimmt, wie in Abbildung 1Ddargestellt . Der Anstieg des Cholesteringehalts blieb auf dem gleichen Niveau, als die Inkubationszeit auf 60 min erhöht wurde(Abbildung 1D).

Die Wirksamkeit von cholesterinangereicherten Liposomen als Mittel zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin wird in Abbildung 2A-Cgezeigt. Während keine signifikante Veränderung des Cholesterinspiegels in der Kontrolle Phospholipid-basierte Dispersionen ohne Cholesterin beobachtet wurde (Abbildung 2A), stieg der Cholesterinspiegel nach nur 5 min Behandlung mit den Phospholipid-basierten Dispersionen, die Cholesterin enthielten, signifikant an und blieb auf dem gleichen Niveau, als die Inkubationszeit auf 60 min erhöht wurde (Abbildung 2B). Ein ähnlicher Effekt wurde in zwei verschiedenen Chargen von Eizellen beobachtet, die von zwei Fröschen gewonnen wurden. Bemerkenswert ist jedoch, dass sowohl die anfänglichen Cholesterinwerte als auch die Veränderung des Cholesteringehalts zwischen den beiden Chargen variierten: In Charge 1 betrug die Anfangskonzentration des Cholesterins 64 g Cholesterin pro mg Protein, während die Anfangskonzentration in Charge 2 45 g Cholesterin pro mg Protein betrug, was 70 % des ursprünglichen Cholesterinspiegels in Charge 1 entspricht. Nach einer 60-min-Behandlung betrug die Cholesterinkonzentration in Charge 1 124 g Cholesterin pro mg Protein, während es in Charge 2 67 g Cholesterin pro mg Protein war. Während also die Cholesterinkonzentration in Charge 1 um über 90 % stieg, erhöhte sie sich in Charge 2 um 50 %. Dennoch bietet der erhebliche Anstieg des Cholesterinspiegels in beiden Chargen die Möglichkeit, die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Funktion von Proteinen zu untersuchen, die in diesem heterologen Expressionssystem exprimiert werden. Darüber hinaus scheint der Phospholipid-basierte Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin effektiver zu sein als die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie es in Geweben und Zellen geschieht. Wie Abbildung 3 zeigt, führte die Anwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Eizellen mit 5mM Cyclodextrin zu einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesterinspiegels um nur 25 %.

Die Wirksamkeit des Cyclodextrin-basierten Ansatzes zur Anreicherung von Zellen wird auch in Neuronen nachgewiesen, die frisch aus der CA1-Region des Hippocampus isoliert sind (Abbildung 4A). Wie Abbildung 4B zeigt, führte die Inkubation der Neuronen in der mit Cholesterin gesättigten M-CD für 60 min zu einem über 2-fachen Anstieg des Cholesterinspiegels, der durch die filipinassoziierte Fluoreszenz bestimmt wurde. Mit diesem Ansatz testeten wir die Wirkung des Cholesterinanstiegs auf GIRK-Kanäle, ausgedrückt in Hippocampus-Neuronen. Wie Abbildung 4C zeigt, führte diese Veränderung des Cholesterinspiegels zu einem signifikanten Anstieg der GIRK-Ströme. In ähnlicher Weise testeten wir die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die primäre GIRK-Untereinheit, ausgedrückt im Gehirn, GIRK2, mit dem xenopus oocytes heterologen Expressionssystem. Zu diesem Zweck haben wir GIRK2( GIRK2_E152D) überwogen, eine Porenmutante von GIRK2, die ihre Membranexpression und -aktivität52 in Xenopus-Oozyten erhöht und die Eizellen mit Cholesterin für 60 min angereichert hat, indem sie den phospholipidbasierten Dispersionsansatz verwendet. Wie die Abbildungen 4D-F zeigen, führte der Anstieg des Cholesterinspiegels zu einem signifikanten Anstieg der Ströme ähnlich der Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels in Neuronen auf die GIRK-Kanalfunktion. Diese Daten zeigen ferner die Wirksamkeit, Konsistenz und Nützlichkeit der beiden oben beschriebenen Ansätze zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinwerte auf die Proteinaktivität und die Zellfunktion.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Anreicherung der zerebralen Arterien der Ratte mit Cholesterin unter Verwendung von Methyl-Paradextrin, gesättigt mit Cholesterin. (A) Ein Beispiel für eine abgebildete glatte Muskelschicht der Zerebrale Arterie, die den konzentrationsabhängigen Anstieg der bei der Gewebeanreicherung gewonnenen filipinassoziierten Fluoreszenz mit zunehmenden Cholesterinkonzentrationen von 6,25 m-6,25 mM für 1 h demonstriert. (B) Quantifizierung der bildgebenden Daten in (A). Die Fluoreszenzintensitätsmessung des gesamten Bildes wurde mit der integrierten "Messfunktion" in kommerzieller Software durchgeführt. Bei jeder Cholesterinkonzentration wurden 3 Bilder von Arterien gesammelt, die von separaten Tierspendern geerntet wurden. Für jede Cholesterinkonzentration werden die Daten als mittlerer Standardfehler dargestellt. (C) Cholesterinspiegel in hirnglatten Muskelschichtsegmenten unmittelbar nach einer 1 h Inkubationszeit mit 0,625 mM Cholesterin und 3 h nach Beginn der Behandlung (d. h. 1 h Inkubation gefolgt von 2 h in PBS). (D) Abhängigkeit des Cholesterinspiegels von der Inkubationszeit, die durch einen biochemischen Cholesterinoxidase-basierten Assay bestimmt wird. Ein signifikanter Unterschied wird durch ein Sternchen angezeigt (*p x 0,05). Die Panels (A) (Cholesterinkonzentrationen 0 mM-0,625 mM), (B) und (C) wurden von North et al.45geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin mit Liposomen. (A) Falten Änderung des Cholesterinspiegels der Kontrolle Xenopus Oozyten in cholesterinfreien Liposomen für 5-60 min inkubiert. (B) Falten Änderung des Cholesterinspiegels von Xenopus Oozyten in cholesterinangereicherten Liposomen für 5-60 min inkubiert. Der abgebildete Kontrollbalken bezieht sich auf die Inkubation in cholesterinfreien Liposomen für 5 min und wird als Vergleich dargestellt. (C) Vergleich der Wirkung der Cholesterinanreicherung von zwei verschiedenen Chargen von Xenopus Oozyten mit cholesterinangereicherten Liposomen für 5 und 60 min. Ein signifikanter Unterschied wird durch ein Sternchen angezeigt (*p x 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin unter Verwendung von Methyl-Paradextrin, gesättigt mit Cholesterin. (A) Falten Änderung des Cholesterinspiegels der Kontrolle Xenopus Oozyten inkubiert in der Kontrolle ND96 Medien für 5-60 min. (B) Falten Änderung des Cholesterinspiegels von Xenopus Oozyten inkubiert in M-CD mit Cholesterin für 5-60 min gesättigt. Die abgebildete Kontrollleiste bezieht sich auf die Inkubation in Kontrollmedien für 5 min und wird als Vergleich dargestellt. Ein signifikanter Unterschied wird durch ein Sternchen angezeigt (*p x 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Beispiele für Studien zur Cholesterinanreicherung auf die Proteinfunktion in Zellen und Xenopus-Oozyten: die Auswirkungen des Cholesterins auf G-Protein, das nach innen die Kaliumkanäle rektifiziert. (A) Filipin-assoziiertes Fluoreszenzsignal des Hippocampus CA1 Pyramidenneuron von Ratten auf Kontrolle (links) versus cholesterinangereichert (rechts). (B) Zusammenfassung der Daten von filipinassoziierten Fluoreszenzsignalen, die aus Kontroll- und Cholesterin angereicherten frisch isolierten Hippocampus-PYRAMIDenneuronen gewonnen wurden. Die Cholesterinanreicherung wurde durch inkubation der Neuronen in der mit Cholesterin gesättigten M-CD für 1 h (n = 12-14) erreicht. (C) Ionenstrom (I)-Spannung(V)-Kurve, die die Wirkung der Cholesterinanreicherung darstellt, wie inB) beschrieben, auf GIRK-Ströme in Hippocampus-Neuronen aus der CA1-Region. (D) Repräsentative Spuren, die die Wirkung der Cholesterinanreicherung mit cholesterinangereichertem Phospholipid-basierten Liposomen auf GIRK2 (GIRK2_E152D) zeigen, ausgedrückt in Xenopus-Oozyten bei -80 mV und +80 mV. (E) Zusammenfassungsdaten von (D) bei -80 mV (n = 6-9). Ein signifikanter Unterschied wird durch ein Sternchen angezeigt (*p x 0,05). Die Unterfiguren (B-E) wurden von Bukiya et al.32geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Methoden zur Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin bilden ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinwerte auf einzelne molekulare Arten, auf komplexe makromolekulare Systeme (z. B. Proteine) und auf die Zell- und Organfunktion. In diesem Beitrag haben wir zwei komplementäre Ansätze beschrieben, die solche Studien erleichtern. Zuerst beschrieben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem wir mit Cholesterin gesättigte M-CD verwenden. Wir haben gezeigt, dass dieser Ansatz in zerebralen Arteriensegmenten zu einem Anstieg des Cholesterinspiegels um 50 % führte. Darüber hinaus haben wir in einer aktuellen Studie gezeigt, dass derselbe Ansatz zu einem über 2-fachen Anstieg des Cholesteringehalts in Hippocampus-Neuronen aus der CA1-Region führt. Im Gegensatz dazu führte der Einsatz dieses Ansatzes als Mittel zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten jedoch nur zu einem Anstieg des Cholesteringehalts von 25 % in Xenopus-Oozyten. So haben wir für die Anreicherung von Xenopus Oozyten einen phospholipidbasierten Dispersionsansatz entwickelt, der konsequent zu einem Anstieg des Cholesterinspiegels um mindestens 50 % führt. Es ist möglich, dass der Vorteil dieses Ansatzes zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten auf eine erhöhte Belastbarkeit im Vergleich zur Belastbarkeit des komplexen Ansatzes von M-CD:cholesterin zurückzuführen ist. Es ist auch möglich, dass der komplexe Ansatz von M-CD:cholesterin zwar für die Anreicherung von Geweben und Zellen optimiert ist, aber eine weitere Optimierung des Protokolls erforderlich ist, um seine Anwendung zur Anreicherung von Xenopus Oozyten zu verbessern.

Die auf Phospholipid basierende Dispersion, die zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin verwendet wird, enthält zwei Lipide, die weit verbreitet sind, um planare Lipid-Doppelschichten zu erzeugen (z. B. L-A-Phosphatidylethanolamin und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-phospho-l-serin). Jedoch, in einer früheren Studie, Es wurde gezeigt, dass Xenopus Oozyten auch mit Cholesterin aus Liposomen angereichert werden konnte, die Phosphatidylcholin und Cholat36enthalten. Diese Methode führte zu einer Erhöhung des Cholesterin/Phospholipid-Molaren-Verhältnisses in der Plasmamembran von 0,5 x 0,1 auf 0,9 bis 0,1 bei einem durchschnittlichen Anreicherungsanteil von 71 %. Dieser durchschnittliche Prozentsatz der Anreicherung ist sehr ähnlich dem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts, den wir beobachtet haben (70,5 %), was darauf hindeutet, dass die Wahl der Phospholipide, die zur Bildung der Dispersion verwendet werden, nicht entscheidend für die Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin mit diesem Ansatz ist.

Jedes beschriebene Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Nach der Zubereitung einer M-CD:Cholesterin-Mischung im Molarenverhältnis von 8:1, um die Sättigung von M-CD mit Cholesterin zu gewährleisten, ist es wichtig, den Kolben mit mindestens zwei Schichten Paraffinfolie zu bedecken und ihn über Nacht in ein langsam schüttelndes 37 °C-Wasserbad zu stellen. Bei der Zersebung von Geweben für die Cholesterinbehandlung ist es wichtig, sanft zu sein, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht gedehnt oder geschnitten wird. Nach der Durchlässigkeit des Gewebes, um die Penetration von Farbstoffen zu erleichtern, ist es wichtig, die Gewebesegmente in PBS gründlich zu waschen. Gewebefärbung in Fillipin muss im Dunkeln durchgeführt werden, und das Fillipin muss akribisch ausgewaschen werden, nachdem die Färbung abgeschlossen ist. Bei der Herstellung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen ist es wichtig sicherzustellen, dass die Dispersion im Glasrohr sanft vibriert und kleine Wellen bildet, um eine Trennung des Cholesterins von der Dispersion zu vermeiden. Für die Cholesterinbehandlung von Xenopus-Oozyten ist es wichtig, die Eizellen vom ND96-Medium mit der cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersion mit so wenig Medium wie möglich in den Brunnen zu übertragen, ohne die Eizellen der Luft auszusetzen, um die Eizellen intakt zu halten. Es ist wichtig zu beachten, dass aufgrund der intrinsischen Maschinen in Geweben, Zellen, und Xenopus Oozyten, Cholesterinspiegel gleichgewichtieren können, und dann wieder auf ihr ursprüngliches Niveau im Laufe der Zeit. Daher müssen Funktionsstudien unmittelbar nach der Inkubationszeit durchgeführt werden. Hier haben wir diese Vorstellung in mit Cholesterin angereicherten Hirnarterien nachgewiesen, was zeigt, dass der Anstieg des Cholesterinspiegels 2 h nach einer 1 h Inkubationszeit ungefähr die Hälfte des Anstiegs betrug, der unmittelbar nach der Inkubationszeit beobachtet wurde.

Trotz der oben beschriebenen kritischen Schritte können mehrere Herausforderungen auftreten. Zum Beispiel, ein Anstieg des Cholesterinspiegels kann nicht nach der Cholesterin-anreichernden Behandlung beobachtet werden. Wenn dies der Fall ist, kann es notwendig sein, die Konzentration von Cholesterin in den cholesterinanreichernden Medien zu erhöhen. Das gleiche gilt für Cholesterin-Anreicherung von Geweben, Zellen, und Xenopus Oozyten. Jedoch, bei der Vorbereitung von Behandlungen mit dem M-CD: Cholesterin-Komplex-Ansatz, sollte die Menge an M-CD mit der Erhöhung der Cholesterinkonzentration erhöht werden, um ein 8:1 Molar-Verhältnis mit Cholesterin zu erhalten. Zusätzlich kann es notwendig sein, eine frische Cholesterin-anreichernde Lösung vorzubereiten, da Cholesterin dazu neigt, aus der Lösung herauszufallen, und die Lösung verliert ihre cholesterinanreicherende Effizienz. Nach der Cholesterinanreicherung ist es möglich, dass ein filipin Signal nicht beobachtet wird. Wenn dies der Fall ist, kann es notwendig sein, ein frisches Filipinpulver zu verwenden, um einen neuen Vorrat zuzubereiten und das Experiment zu wiederholen. Die philippinische Fluoreszenz nimmt schnell ab, und die Stammlösung kann nicht mehr als mehrere Tage gelagert werden. Eine Einschränkung der filipin Färbung ist, dass es scheint, Steroide andere als Cholesterin zu erkennen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem eine Zunahme des filipin-assoziierten Fluoreszenzsignals in den zerebralen Arterien der Ratte nach der Anreicherung mit Coprostanol45nachgewiesen. Daher sollten filipin Färbung Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, und im Zweifelsfall sollten alternative Ansätze verwendet werden, um die Ergebnisse zu bestätigen. Eine Möglichkeit wäre, einen biochemischen Test durch die Anwendung eines kommerziell erhältlichen Cholesterinoxidase-basierten Kits durchzuführen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Ansätze sehr effektiv sind, um eine Cholesterinanreicherung von nahezu oder über 50 % zu erreichen. In der Tat, die M-CD: Cholesterin-Komplex-Ansatz, der zu einem 50% in Cholesterinspiegel in Hirnarterien führt, ist viel effizienter als die Verwendung von LDL, um diese Gewebe zu bereichern, was zu einem bloßen Anstieg des Cholesterins um 10 % führt35. Dasselbe gilt für die Anwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Wie oben beschrieben, führt dieser Ansatz konsequent zu mindestens 50% Anstieg des Cholesterinspiegels. Wichtig ist, dass diese beiden Ansätze zur Cholesterinanreicherung in vitro Ergebnisse liefern, die mit dem Cholesterinanstieg vergleichbar sind, der durch die Unterwerfung der Tiere auf eine diätete Ernährung mit hohem Cholesterinspiegel32,37,40,53,54erzielt wird. Darüber hinaus benötigen In-vitro-Ansätze im Gegensatz zu wochenlangen Diäten mit hohem Cholesterinspiegel nur wenige Minuten Inkubationszeit, um einen statistisch signifikanten und stabilen Anstieg des Cholesterinspiegels zu erreichen.

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Disclosures

Dr. A. M. Dopico ist ein sonderbeschäftigter, Teilzeit-Bundesangestellter und derzeitiges Mitglied des Nationalen Beirats für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Scientist Development Grant (11SDG5190025) der American Heart Association (zu A.R.-D.) und durch das National Institute of Health R01 Zuschüsse AA-023764 (bis A.N.B.) und HL-104631 und R37 AA-11560 (bis A.M.D.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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References

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Biochemie Ausgabe 157 Cholesterinanreicherung Lipide Cyclodextrin-Cholesterin-Komplex Dispersion Liposomen Phospholipide Low-Density-Lipoprotein LDL Neuronen Hirnarterien Xenopus-Oozyten, Kaliumkanäle
Anreicherung von Säugetiergeweben und <em>Xenopus-Oozyten</em> mit Cholesterin
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Slayden, A., North, K., Bisen, S.,… More

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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