To metoder for kolesterol berikelse presenteres: anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol for å berike pattedyr vev og celler, og bruk av kolesterolberiket fosfolipid-baserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytes. Disse metodene er instrumentelle for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer i molekylær, cellulær og organfunksjon.
Kolesterol berikelse av pattedyr vev og celler, inkludert Xenopus oocytes som brukes til å studere cellefunksjon, kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder. Her beskriver vi to viktige tilnærminger som brukes til dette formålet. Først beskriver vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av cyclodextrin mettet med kolesterol ved hjelp av cerebralarterier (vev) og hippocampal nevroner (celler) som eksempler. Denne tilnærmingen kan brukes til alle typer vev, celler eller cellelinjer. En alternativ tilnærming for kolesterol berikelse innebærer bruk av lav tetthet lipoprotein (LDL). Fordelen med denne tilnærmingen er at den bruker en del av det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen. Men mens cyclodextrin tilnærming kan brukes til å berike noen celletype interesse med kolesterol, er LDL-tilnærmingen begrenset til celler som uttrykker LDL-reseptorer (f.eks. leverceller, benmargsavledede celler som blodleukocytter og vevmakrofager), og nivået av berikelse avhenger av konsentrasjonen og mobiliteten til LDL-reseptoren. Videre inkluderer LDL-partikler andre lipider, så kolesterollevering er ikke spesifikk. For det andre beskriver vi hvordan du beriker Xenopus oocytes med kolesterol ved hjelp av en fosfolipidbasert dispersjon (dvs. liposomer) som inkluderer kolesterol. Xenopus oocytes utgjør et populært heterologøst uttrykksystem som brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. For både cyklodekstrin-basert kolesterolberikelse tilnærming av pattedyrvev (cerebral arterier) og for fosfolipid-basert kolesterol berikelse tilnærming av Xenopus oocytes, viser vi at kolesterol nivåer nå maksimalt etter 5 min inkubasjon. Dette nivået av kolesterol forblir konstant i lengre perioder med inkubasjon (f.eks. 60 min). Sammen gir disse dataene grunnlag for optimaliserte temporale forhold for kolesterolberikelse av vev, celler og Xenopus oocytter for funksjonelle studier som tar sikte på å avhøre virkningen av kolesterolberikelse.
Kolesterol, en stor cellulær lipid, spiller mange kritiske funksjonelle og strukturelle roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Fra å regulere plasmamembranens fysiske egenskaper til å sikre cellelevedyktighet, vekst, spredning og fungerer som et signal- og forløpermolekyl i en mengde biokjemiske veier, er kolesterol en viktig komponent som er nødvendig for normal celle- og organfunksjon. Som et resultat resulterer kolesterolmangel i alvorlige fysiske misdannelser og en rekke lidelser. På den annen side er selv en liten økning i kolesterol over fysiologiske nivåer (2-3x) cytotoksisk1,2,10 og har vært forbundet med utvikling av lidelser, inkludertkardiovaskulære 11,12,13 og nevrodegenerative sykdommer14,15,16,17. Dermed, for å avhøre de kritiske funksjonene til kolesterol og for å bestemme effekten av endringer i kolesterolnivåer, er forskjellige tilnærminger som endrer innholdet av kolesterol i vev, celler og Xenopus oocytter utviklet.
Endring av kolesterolnivåer i pattedyrvev og celler
Flere tilnærminger kan utnyttes for å redusere nivåene av kolesterol i vev og celler18. En tilnærming innebærer deres eksponering for statiner oppløst i lipoprotein-mangelfull serum for å hemme HMG-CoA reduktase, som styrer frekvensen av kolesterolsyntese19,20. Men, disse kolesterolsenkende legemidler også hemme dannelsen av ikke-sterol produkter langs mevalonatbanen. Derfor legges en liten mengde mevalonat for å tillate dannelsen av disse produktene21 og forbedre spesifisiteten til denne tilnærmingen. En annen tilnærming for å redusere kolesterolnivået innebærer bruk av β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerene har et internt hydrofobt hulrom med en diameter som samsvarer med størrelsen på steroler22, noe som letter utvinning av kolesterol fra celler, og dermed tømme dem fra deres innfødte kolesterolinnhold23. Et eksempel er 2-hydroksypropyl-β-cykloderxtrin (HPβCD), et preklinisk stoff som for tiden testes for behandling av Niemann-Pick type C-sykdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolsk lidelse preget av lysosomal kolesterollagring24. Nivået av kolesteroluttømming avhenger av det spesifikke derivatet som brukes. For eksempel, HPβCD trekker kolesterol med en lavere kapasitet enn metylert derivat, metyl-β-cyclodextrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Spesielt kan imidlertid β-cyklodekkliner også trekke ut andre hydrofobe molekyler i tillegg til kolesterol, noe som deretter kan resultere i uspesifikke effekter31. I motsetning til uttømming kan celler og vev spesifikt berikes med kolesterol gjennom behandling med β-cykloderklatrin som har vært forutmettet med kolesterol23. Denne tilnærmingen kan også brukes som en kontroll for spesifisiteten av β-cyclodextrins som brukes til kolesterol uttømming31. Uttømming av kolesterol fra vev og celler er grei og kan oppnås ved å utsette cellene i 30-60 min til 5 mM MβCD oppløst i mediet som brukes til lagring av cellene. Denne tilnærmingen kan resultere i en 50% reduksjon i kolesterolinnhold (f.eks. i hippocampale nevroner32, rotte cerebralarterier33). På den annen side er det mer komplisert å forberede β-cyclodextrin-kolesterolkomplekset for kolesterolberikelse av vev og celler, og vil bli beskrevet i protokollseksjonen.
En alternativ tilnærming til berikende vev og celler ved hjelp av β-cyclodextrin mettet med kolesterol innebærer bruk av LDL, som er avhengig av LDL reseptorer uttrykt i vev / celler18. Mens denne tilnærmingen gir fordelen av å bruke det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen, har den flere begrensninger. For det første kan ikke vev og celler som ikke uttrykker LDL-reseptoren berikes ved hjelp av denne tilnærmingen. For det andre inneholder LDL-partikler andre lipider i tillegg til kolesterol. Spesielt består LDL av proteinet ApoB100 (25 %) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglycerols34. Dermed er levering av kolesterol via LDL-partikler ikke-spesifikk. For det tredje kan prosentandelen av økning i kolesterolinnhold ved LDL i vev og celler som uttrykker LDL-reseptoren være betydelig lavere enn økningen observert ved hjelp av cyklodekstrin mettet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere studie, berikelse av gnager cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterte i bare en 10-15% økning i kolesterolnivåer35. I motsetning resulterte berikelse av disse arteriene med cyclodextrin mettet med kolesterol som beskrevet i protokollseksjonen,& gt; 50% økning i kolesterolinnholdet (se Representative Results seksjon, figur 1).
Endring av kolesterolnivåer i Xenopus oocytes
Xenopus oocytes utgjør et heterologøst uttrykksystem som vanligvis brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. Tidligere studier har vist at kolesterolet til fosfolipid molar forholdet i Xenopus oocytes er 0,5 ± 0,136. På grunn av dette iboende høye nivået av kolesterol, er det utfordrende å øke innholdet av kolesterol i dette systemet, men kan oppnås ved hjelp av dispersjoner laget av membranfolipider og kolesterol. Fosfolipidene som vi har valgt for dette formålet, ligner på de som brukes til å danne kunstige planar lipidbilag og inkluderer L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrevet i protokollseksjonen. Denne tilnærmingen kan resultere i > 50% økning i kolesterolinnhold (Se Representative Results seksjon, Figur 2).
En alternativ tilnærming til berikende Xenopus oocytes med fosfolipid-baserte dispersjoner innebærer bruk av cyklodextrin mettet med kolesterol, som ligner på måten vev og celler er beriket. Vi har imidlertid funnet denne tilnærmingen til å være av lav reproduserbarhet og effektivitet, med et gjennomsnitt på ~ 25% økning i kolesterolinnhold. Dette skyldes muligens den ulike lastekapasiteten til disse to tilnærmingene (se avsnittet Representative Results, figur 3). I motsetning har det blitt vist at bruk av cyklodekstrin for å tømme kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% reduksjon i kolesterolinnhold36.
Her fokuserer vi på kolesterol berikelse av pattedyrvev og celler gjennom bruk av cyklodxtrin mettet med kolesterol, og av Xenopus oocytter ved hjelp av liposomer. Begge tilnærminger kan utnyttes for å avgrense effekten av økte nivåer av kolesterol på proteinfunksjon. Mekanismene for kolesterolmodulering av proteinfunksjon kan innebære direkte interaksjoner8 og/eller indirekte effekter9. Når kolesterol påvirker proteinfunksjon via direkte interaksjoner, er effekten av en økning i kolesterolnivået på proteinaktivitet sannsynligvis uavhengig av celletype, uttrykkssystem eller berikelsestilnærming. For eksempel brukte vi disse to tilnærmingene for å bestemme effekten av kolesterol på G-protein gated innover rette kalium (GIRK) kanaler uttrykt i atriemyocytter37, hippocampal nevroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytes32,37. Resultatene oppnådd i disse studiene var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i amfibier oocytes kolesterol upregulated GIRK kanalfunksjon (se Representative Resultater seksjon, Figur 4,for hippocampal nevroner og tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytes). Videre var observasjonene gjort i disse studiene også i samsvar med resultatene av studier utført i atriemyocytter37,40 og hippocampal nevroner32,38 nylig isolert fra dyr utsatt for et høyt kolesterol diett40. Spesielt, kolesterol berikelse av hippocampal nevroner ved hjelp av MβCD reversert effekten av atorvastatin terapi som brukes for å løse virkningen av høyt kolesterol diett både på kolesterolnivåer og GIRK funksjon38. I andre studier undersøkte vi effekten av mutasjoner på kolesterolfølsomheten til den indre korrigering av kaliumkanalen Kir2.1 ved hjelp av både Xenopus oocytes og HEK293 celler41. Igjen var effekten av mutasjonene på følsomheten til kanalen lik i de to systemene.
Anvendelsene av begge berikelsesmetoder for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer på molekylær, cellulær og organfunksjon er mange. Spesielt er bruk av cyclodextrin-kolesterolkomplekser for å berike celler og vev svært vanlig i stor grad på grunn av spesifisiteten. Nylige eksempler på denne tilnærmingen inkluderer bestemmelse av virkningen av kolesterol på HERG kanalaktivering og underliggende mekanismer42, oppdagelsen av at kolesterol aktiverer G protein koblet reseptor Glattet for å fremme Hedgehog signaliserer43, og identifisering av rollen av kolesterol i stamcelle biomekanikk og adipogenese gjennom membran-assosiert linker proteiner44. I vårt eget arbeid benyttet vi pattedyrvevberikelse med MβCD:kolesterolkompleks for å studere effekten av kolesterolberikelse på grunnleggende funksjon og den farmakologiske profilen til kalsium- og spenningsinngjerdede kanaler med stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulær glatt muskel35,45,46. I andre studier brukte vi fosfolipidbasert dispersjonstilnærming for berikende Xenopus oocytter med kolesterol for å bestemme rollene til forskjellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhet41,47,48,49, samt å bestemme antatt kolesterol bindende steder i disse kanalene32,50,51.
Metoder for å berike pattedyrvev og celler og Xenopus oocytter med kolesterol utgjør et kraftig verktøy for å undersøke effekten av forhøyede kolesterolnivåer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks proteiner), og på cellulær og organfunksjon. I denne artikkelen har vi beskrevet to komplementære tilnærminger som letter slike studier. Først beskrev vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Vi viste at i cerebr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og av National Institute of Health R01 gir AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).
Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
KCl | Fisher | P217 | |
Trizma base | Sigma | T6066 | |
HEPES | Corning | 61-034-RO | |
MgCl2 | Fisher | M33 | |
NaCl | Fisher | S271 | |
KH2PO4 | Fisher | P285 | |
MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
EDTA | VWR | E177 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
Blood Gas Tank | nexAir | ||
NaOH | Fisher | S318 | |
1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
Chloroform | Fisher | C298 | |
Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
96 well plate | Sigma | BR781602 | |
N2 gas | nexAir | ||
Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
TritonX | Fisher | BP151-100 | |
Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
DMSO | Fisher | BP231 | |
Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
DI H2O | University DI source | ||
ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
KimWipes | Fisher | 06-666A | |
pH probe | Sartorus | py-p112s | |
pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
Timer | Fisher | 02-261-840 | |
Steno book | Staples | 163485 |