Summary

Anrikning av däggdjursvävnader och Xenopus Oocyter med kolesterol

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

Två metoder för kolesterol anrikning presenteras: tillämpningen av cyclodextrin mättad med kolesterol för att berika däggdjur vävnader och celler, och användningen av kolesterol-berikade fosfolipid-baserade dispersioner (liposomer) för att berika Xenopus äggceller. Dessa metoder är avgörande för att bestämma effekterna av förhöjda kolesterolnivåer i molekylär, cellulär, och organfunktion.

Abstract

Kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler, inklusive Xenopus oocyter som används för att studera cellfunktion, kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika metoder. Här beskriver vi två viktiga metoder som används för detta ändamål. Först beskriver vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med hjälp av cyklodextrin mättad med kolesterol med hjälp av cerebrala artärer (vävnader) och hippocampus nervceller (celler) som exempel. Denna metod kan användas för alla typer av vävnad, celler eller cellinjer. Ett alternativt tillvägagångssätt för kolesterolanrikning innebär användning av lipoprotein med låg densitet (LDL). Fördelen med detta tillvägagångssätt är att den använder en del av den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen. Cyklodextrinmetoden kan dock användas för att berika alla celltyper av intresse med kolesterol, är LDL-metoden begränsad till celler som uttrycker LDL-receptorer (t.ex. leverceller, benmärgsbaserade celler såsom blod leukocyter och vävnadsmakrofager) och anrikningsnivån beror på koncentrationen och rörligheten hos LDL-receptorn. Dessutom, LDL partiklar inkluderar andra lipider, så kolesterol leverans är ospecificerad. För det andra beskriver vi hur man berikar Xenopus oocyter med kolesterol med hjälp av en fosfolipid-baserad dispersion (dvs. liposomer) som innehåller kolesterol. Xenopus oocyter utgör ett populärt heterologt uttryckssystem som används för att studera cell- och proteinfunktion. För både cyclodextrin-baserade kolesterol anrikning strategi av däggdjur vävnad (cerebrala artärer) och för fosfolipid-baserade kolesterol anrikning strategi Xenopus oocyter, visar vi att kolesterolnivåerna når en maximal efter 5 min inkubation. Denna nivå av kolesterol förblir konstant under längre perioder av inkubation (t.ex. 60 min). Tillsammans, dessa data utgör grunden för optimerade tidsmässiga förhållanden för kolesterol anrikning av vävnader, celler, och Xenopus oocyter för funktionella studier som syftar till att ifrågasätta effekterna av kolesterol anrikning.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulär lipid, spelar många kritiska funktionella och strukturella roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Från att reglera de fysiska egenskaperna hos plasmamembranet till att säkerställa cellens livskraft, tillväxt, spridning, och fungerar som en signalering och prekursor molekyl i en uppsjö av biokemiska vägar, kolesterol är en absolut nödvändigt komponent som krävs för normal cell och organfunktion. Som ett resultat, kolesterolbrist resulterar i allvarliga fysiska missbildningar och en mängd olika sjukdomar. Å andra sidan, även en liten ökning av kolesterol över fysiologiska nivåer (2-3x) är cytotoxiska1,2,10 och har associerats med utvecklingen av sjukdomar, inklusive hjärt-1111,12,13 och neurodegenerativa sjukdomar14,15,16,17. Således, att förhöra de kritiska funktionerna av kolesterol och att bestämma effekten av förändringar i kolesterolnivåer, olika metoder som ändrar innehållet av kolesterol i vävnader, celler, och Xenopus äggceller har utvecklats.

Ändring av kolesterolnivåer i däggdjursvävnader och celler
Flera metoder kan utnyttjas för att minska nivåerna av kolesterol i vävnader och celler18. Ett tillvägagångssätt innebär deras exponering för statiner upplöst i lipoprotein-saknas serum för att hämma HMG-CoA reduktas, som styr graden avkolesterolsyntes 19,20. Emellertid, dessa kolesterolsänkande läkemedel hämmar också bildandet av icke-sterol produkter längs mevalonat vägen. Därför tillsätts en liten mängd mevalonat för att möjliggöra bildandet av dessa produkter21 och öka specificiteten i detta tillvägagångssätt. Ett annat tillvägagångssätt för att minska kolesterolnivåerna innebär användning av β-cyklodextrins. Dessa glucopyranose monomers har en intern hydrofoba hålighet med en diameter som matchar storleken på steroler22, vilket underlättar utvinning av kolesterol från celler, vilket bryter dem från deras inhemska kolesterolhalt23. Ett exempel är 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), ett prekliniskt läkemedel som för närvarande testas för behandling av Niemann-Pick typ C sjukdom, en genetiskt ärftlig dödlig metabolisk störning som kännetecknas av lysosomal kolesterol lagring24. Nivån av kolesterol utarmning beror på den specifika derivat som används. HPβCD extraherar till exempel kolesterol med lägre kapacitet än det metylerade derivatet, metyl-β-cyklodextrin (MβCD)24,,25,,26,27,28,29,30. Särskilt kan dock β-cyklodextrins också extrahera andra hydrofoba molekyler utöver kolesterol, vilket sedan kan resultera i ospecifika effekter31. I motsats till utarmning, celler och vävnader kan vara särskilt berikas med kolesterol genom behandling med β-cyclodextrin som har förmätits med kolesterol23. Detta tillvägagångssätt kan också användas som en kontroll för specificiteten hos β-cyklodextris som används för kolesterolutarmning31. Utarmning av kolesterol från vävnader och celler är enkel och kan uppnås genom att exponera cellerna i 30-60 min till 5 mM MβCD upplöst i det medium som används för att lagra cellerna. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en 50% minskning av kolesterolhalten (t.ex. i hippocampus nervceller32, råtta cerebrala artärer33). Å andra sidan, förbereda β-cyclodextrin-kolesterol komplex för kolesterol anrikning av vävnad och celler är mer komplex, och kommer att beskrivas i protokollet avsnitt.

Ett alternativt tillvägagångssätt för att berika vävnader och celler med β-cyklodextrin mättad med kolesterol innebär användning av LDL, som är beroende av LDL-receptorer uttryckta i vävnaderna/cellerna18. Även om detta tillvägagångssätt erbjuder fördelen av att använda den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen, det har flera begränsningar. För det första kan vävnader och celler som inte uttrycker LDL-receptorn inte berikas med hjälp av denna metod. För det andra innehåller LDL-partiklar andra lipider utöver kolesterol. Specifikt består LDL av proteinet ApoB100 (25%) och följande lipider (75%): ~6-8% kolesterol, ~45-50% cholesteryl ester, ~18-24% fosfolipider, och ~4-8% triacylglycerols34. Således är leverans av kolesterol via LDL-partiklar ospecifik. För det tredje, andelen ökning av kolesterolhalten av LDL i vävnader och celler som uttrycker LDL-receptorn kan vara betydligt lägre än den ökning som observerats med cyklodextrin mättad med kolesterol. Till exempel, i en tidigare studie, anrikning av gnagare cerebrala artärer med kolesterol via LDL resulterade i endast en 10-15% ökning av kolesterolnivåer35. Däremot resulterade anrikning av dessa artärer med cyklodextrin mättad med kolesterol enligt beskrivningen i protokollavsnittet i >50% ökning av kolesterolhalten (se avsnittet Representativa resultat, figur 1).

Ändring av kolesterolnivåer i Xenopus oocyter
Xenopus oocyter utgör ett heterologt uttryckssystem som vanligen används för att studera cell- och proteinfunktion. Tidigare studier har visat att kolesterolet till fosfolipid molar förhållandet i Xenopus oocyter är 0,5 ± 0,136. På grund av denna inneboende höga nivå av kolesterol, öka innehållet av kolesterol i detta system är utmanande, men kan uppnås med hjälp av dispersioner gjorda av membran fosfolipider och kolesterol. Fosfolipiderna som vi har valt för detta ändamål liknar dem som används för att bilda konstgjorda plana lipidbilager och inkluderar L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrivs i protokollet avsnitt. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en ökning av kolesterolhalten på >50 % (se avsnittet Representativa resultat, figur 2).

En alternativ metod för att berika Xenopus oocyter med fosfolipid-baserade dispersioner innebär användning av cyklodextrin mättad med kolesterol, vilket liknar hur vävnader och celler berikas. Vi har dock funnit detta tillvägagångssätt vara av låg reproducerbarhet och effektivitet, med ett genomsnitt på ~ 25% ökning av kolesterolhalten. Detta beror möjligen på de olika lastkapaciteten hos dessa två metoder (se avsnittet Representativa resultat, figur 3). Däremot har det visat sig att använda cyclodextrin att tömma kolesterol från Xenopus oocyter kan resultera i en ~ 40% minskning av kolesterolhalten36.

Här fokuserar vi på kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler genom tillämpning av cyklodextrin mättad med kolesterol, och av Xenopus oocyter med liposomer. Båda metoderna kan utnyttjas för att avgränsa effekten av ökade nivåer av kolesterol på proteinfunktion. Mekanismerna för kolesterolmodulering av proteinfunktion kan innebära direkta interaktioner8 och/eller indirekta effekter9. När kolesterol påverkar proteinfunktion via direkta interaktioner, effekten av en ökning av kolesterolnivåer på proteinaktivitet är sannolikt oberoende av celltyp, uttryckssystem, eller anrikning strategi. Till exempel använde vi dessa två metoder för att bestämma effekten av kolesterol på G-protein gated inåt korrigera kalium (GIRK) kanaler uttryckt i förmaksflimmermyocyter 37, hippocampus nervceller32,38, HEK29339 celler, och Xenopus oocyter32,37. De resultat som erhölls i dessa studier var konsekventa: i alla tre typerna av däggdjursceller och i amfibiska äggceller kolesterol upregulated GIRK kanal funktion (se representativa resultat avsnitt, figur 4, för hippocampus nervceller och motsvarande experiment i Xenopus äggceller). Dessutom var de observationer som gjorts i dessa studier också överensstämmer med resultaten av studier som utförts i förmaksflimmermyocyter 37,40 och hippocampus nervceller32,38 nyligen isolerade från djur som utsätts för en hög kolesterol diet40. Särskilt kolesterol anrikning av hippocampus nervceller med MβCD vände effekten av atorvastatin terapi som används för att ta itu med effekterna av det höga kolesterolet kost både på kolesterolnivåer och GIRK funktion38. I andra studier undersökte vi effekten av mutationer på kolesterolkänsligheten hos den inåtriktade reterbara kaliumkanalen Kir2.1 med både Xenopus oocyter och HEK293-celler41. Återigen var effekten av mutationerna på känsligheten i kanalen liknande i de två systemen.

Tillämpningarna av både anrikningsmetoder för att bestämma effekten av förhöjda kolesterolnivåer på molekylära, cellulära och organfunktion är många. I synnerhet är användningen av cyklodextrin-kolesterol komplex för att berika celler och vävnader mycket vanligt till stor del på grund av dess specificitet. Senaste exemplen på detta tillvägagångssätt är fastställandet av effekterna av kolesterol på HERG kanalaktivering och underliggande mekanismer42, upptäckten att kolesterol aktiverar G proteinkopplade receptorn utjämnas för att främja Igelkott signalering43, och identifiering av den roll som kolesterol i stamceller biomekanik och adipogenesis genom membran-associerade länkare proteiner44. I vårt eget arbete använde vi anrikning av däggdjursvävnad med MβCD:kolesterolkomplex för att studera effekten av kolesterolanrikning på grundläggande funktion och den farmakologiska profilen av kalcium- och spänningsgated kanaler av stor ledning (BK, MaxiK) i kärlmustatur35,,45,46. I andra studier använde vi fosfolipid-baserade dispersion strategi för att berika Xenopus oocyter med kolesterol för att bestämma roller i olika regioner i Kir2.1 och GIRK kanaler i kolesterol känslighet41,47,48,49, samt att bestämma förmodade kolesterol bindande platser i dessa kanaler32,,50,51.

Protocol

Alla experimentella försök med djur utfördes vid University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Skötsel av djur och försöksprotokoll har granskats och godkänts av UTHSC:s kommitté för djurvård och användning, som är en institution som ackrediterats av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. 1. Anrikning av vävnader och celler med metyl-β-cyklodextrin mättat med kolesterol OBS: Kolesterolanrikning pro…

Representative Results

Användningen av cyklodextrin mättad med kolesterol som ett sätt att berika vävnader och celler med kolesterol är väl etablerad. Här visar vi först tillämpningen av denna allmänt använda metoden för berika råtta cerebrala artärer med kolesterol med hjälp av MβCD mättad med kolesterol. Figur 1A visar ett exempel på ett avbildad cerebralt artär glatt muskelskikt och visar den koncentrationsberoende ökningen av filipin-associe…

Discussion

Metoder för att berika däggdjursvävnader och däggdjursceller och Xenopus-oocyter med kolesterol utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka effekten av förhöjda kolesterolnivåer på enskilda molekylära arter, på komplexa makromolekylära system (t.ex. proteiner) och på cellulära och organiska funktion. I detta dokument har vi beskrivit två kompletterande metoder som underlättar sådana studier. Först beskrev vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med MβCD mättad med kolester…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) från American Heart Association (till A.R.-D.), och av National Institute of Health R01 bidrag AA-023764 (till A.N.B.), och HL-104631 och R37 AA-11560 (till A.M.D).

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1135 (2019).
  9. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. , 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis–an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration?. Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer’s disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage?. Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A., Kumar, S. A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. , 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Play Video

Cite This Article
Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

View Video