Två metoder för kolesterol anrikning presenteras: tillämpningen av cyclodextrin mättad med kolesterol för att berika däggdjur vävnader och celler, och användningen av kolesterol-berikade fosfolipid-baserade dispersioner (liposomer) för att berika Xenopus äggceller. Dessa metoder är avgörande för att bestämma effekterna av förhöjda kolesterolnivåer i molekylär, cellulär, och organfunktion.
Kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler, inklusive Xenopus oocyter som används för att studera cellfunktion, kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika metoder. Här beskriver vi två viktiga metoder som används för detta ändamål. Först beskriver vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med hjälp av cyklodextrin mättad med kolesterol med hjälp av cerebrala artärer (vävnader) och hippocampus nervceller (celler) som exempel. Denna metod kan användas för alla typer av vävnad, celler eller cellinjer. Ett alternativt tillvägagångssätt för kolesterolanrikning innebär användning av lipoprotein med låg densitet (LDL). Fördelen med detta tillvägagångssätt är att den använder en del av den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen. Cyklodextrinmetoden kan dock användas för att berika alla celltyper av intresse med kolesterol, är LDL-metoden begränsad till celler som uttrycker LDL-receptorer (t.ex. leverceller, benmärgsbaserade celler såsom blod leukocyter och vävnadsmakrofager) och anrikningsnivån beror på koncentrationen och rörligheten hos LDL-receptorn. Dessutom, LDL partiklar inkluderar andra lipider, så kolesterol leverans är ospecificerad. För det andra beskriver vi hur man berikar Xenopus oocyter med kolesterol med hjälp av en fosfolipid-baserad dispersion (dvs. liposomer) som innehåller kolesterol. Xenopus oocyter utgör ett populärt heterologt uttryckssystem som används för att studera cell- och proteinfunktion. För både cyclodextrin-baserade kolesterol anrikning strategi av däggdjur vävnad (cerebrala artärer) och för fosfolipid-baserade kolesterol anrikning strategi Xenopus oocyter, visar vi att kolesterolnivåerna når en maximal efter 5 min inkubation. Denna nivå av kolesterol förblir konstant under längre perioder av inkubation (t.ex. 60 min). Tillsammans, dessa data utgör grunden för optimerade tidsmässiga förhållanden för kolesterol anrikning av vävnader, celler, och Xenopus oocyter för funktionella studier som syftar till att ifrågasätta effekterna av kolesterol anrikning.
Kolesterol, en stor cellulär lipid, spelar många kritiska funktionella och strukturella roller1,2,3,4,5,6,7,8,9. Från att reglera de fysiska egenskaperna hos plasmamembranet till att säkerställa cellens livskraft, tillväxt, spridning, och fungerar som en signalering och prekursor molekyl i en uppsjö av biokemiska vägar, kolesterol är en absolut nödvändigt komponent som krävs för normal cell och organfunktion. Som ett resultat, kolesterolbrist resulterar i allvarliga fysiska missbildningar och en mängd olika sjukdomar. Å andra sidan, även en liten ökning av kolesterol över fysiologiska nivåer (2-3x) är cytotoxiska1,2,10 och har associerats med utvecklingen av sjukdomar, inklusive hjärt-1111,12,13 och neurodegenerativa sjukdomar14,15,16,17. Således, att förhöra de kritiska funktionerna av kolesterol och att bestämma effekten av förändringar i kolesterolnivåer, olika metoder som ändrar innehållet av kolesterol i vävnader, celler, och Xenopus äggceller har utvecklats.
Ändring av kolesterolnivåer i däggdjursvävnader och celler
Flera metoder kan utnyttjas för att minska nivåerna av kolesterol i vävnader och celler18. Ett tillvägagångssätt innebär deras exponering för statiner upplöst i lipoprotein-saknas serum för att hämma HMG-CoA reduktas, som styr graden avkolesterolsyntes 19,20. Emellertid, dessa kolesterolsänkande läkemedel hämmar också bildandet av icke-sterol produkter längs mevalonat vägen. Därför tillsätts en liten mängd mevalonat för att möjliggöra bildandet av dessa produkter21 och öka specificiteten i detta tillvägagångssätt. Ett annat tillvägagångssätt för att minska kolesterolnivåerna innebär användning av β-cyklodextrins. Dessa glucopyranose monomers har en intern hydrofoba hålighet med en diameter som matchar storleken på steroler22, vilket underlättar utvinning av kolesterol från celler, vilket bryter dem från deras inhemska kolesterolhalt23. Ett exempel är 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), ett prekliniskt läkemedel som för närvarande testas för behandling av Niemann-Pick typ C sjukdom, en genetiskt ärftlig dödlig metabolisk störning som kännetecknas av lysosomal kolesterol lagring24. Nivån av kolesterol utarmning beror på den specifika derivat som används. HPβCD extraherar till exempel kolesterol med lägre kapacitet än det metylerade derivatet, metyl-β-cyklodextrin (MβCD)24,,25,,26,27,28,29,30. Särskilt kan dock β-cyklodextrins också extrahera andra hydrofoba molekyler utöver kolesterol, vilket sedan kan resultera i ospecifika effekter31. I motsats till utarmning, celler och vävnader kan vara särskilt berikas med kolesterol genom behandling med β-cyclodextrin som har förmätits med kolesterol23. Detta tillvägagångssätt kan också användas som en kontroll för specificiteten hos β-cyklodextris som används för kolesterolutarmning31. Utarmning av kolesterol från vävnader och celler är enkel och kan uppnås genom att exponera cellerna i 30-60 min till 5 mM MβCD upplöst i det medium som används för att lagra cellerna. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en 50% minskning av kolesterolhalten (t.ex. i hippocampus nervceller32, råtta cerebrala artärer33). Å andra sidan, förbereda β-cyclodextrin-kolesterol komplex för kolesterol anrikning av vävnad och celler är mer komplex, och kommer att beskrivas i protokollet avsnitt.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att berika vävnader och celler med β-cyklodextrin mättad med kolesterol innebär användning av LDL, som är beroende av LDL-receptorer uttryckta i vävnaderna/cellerna18. Även om detta tillvägagångssätt erbjuder fördelen av att använda den naturliga kolesterol homeostas maskiner i cellen, det har flera begränsningar. För det första kan vävnader och celler som inte uttrycker LDL-receptorn inte berikas med hjälp av denna metod. För det andra innehåller LDL-partiklar andra lipider utöver kolesterol. Specifikt består LDL av proteinet ApoB100 (25%) och följande lipider (75%): ~6-8% kolesterol, ~45-50% cholesteryl ester, ~18-24% fosfolipider, och ~4-8% triacylglycerols34. Således är leverans av kolesterol via LDL-partiklar ospecifik. För det tredje, andelen ökning av kolesterolhalten av LDL i vävnader och celler som uttrycker LDL-receptorn kan vara betydligt lägre än den ökning som observerats med cyklodextrin mättad med kolesterol. Till exempel, i en tidigare studie, anrikning av gnagare cerebrala artärer med kolesterol via LDL resulterade i endast en 10-15% ökning av kolesterolnivåer35. Däremot resulterade anrikning av dessa artärer med cyklodextrin mättad med kolesterol enligt beskrivningen i protokollavsnittet i >50% ökning av kolesterolhalten (se avsnittet Representativa resultat, figur 1).
Ändring av kolesterolnivåer i Xenopus oocyter
Xenopus oocyter utgör ett heterologt uttryckssystem som vanligen används för att studera cell- och proteinfunktion. Tidigare studier har visat att kolesterolet till fosfolipid molar förhållandet i Xenopus oocyter är 0,5 ± 0,136. På grund av denna inneboende höga nivå av kolesterol, öka innehållet av kolesterol i detta system är utmanande, men kan uppnås med hjälp av dispersioner gjorda av membran fosfolipider och kolesterol. Fosfolipiderna som vi har valt för detta ändamål liknar dem som används för att bilda konstgjorda plana lipidbilager och inkluderar L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrivs i protokollet avsnitt. Detta tillvägagångssätt kan resultera i en ökning av kolesterolhalten på >50 % (se avsnittet Representativa resultat, figur 2).
En alternativ metod för att berika Xenopus oocyter med fosfolipid-baserade dispersioner innebär användning av cyklodextrin mättad med kolesterol, vilket liknar hur vävnader och celler berikas. Vi har dock funnit detta tillvägagångssätt vara av låg reproducerbarhet och effektivitet, med ett genomsnitt på ~ 25% ökning av kolesterolhalten. Detta beror möjligen på de olika lastkapaciteten hos dessa två metoder (se avsnittet Representativa resultat, figur 3). Däremot har det visat sig att använda cyclodextrin att tömma kolesterol från Xenopus oocyter kan resultera i en ~ 40% minskning av kolesterolhalten36.
Här fokuserar vi på kolesterolanrikning av däggdjursvävnader och celler genom tillämpning av cyklodextrin mättad med kolesterol, och av Xenopus oocyter med liposomer. Båda metoderna kan utnyttjas för att avgränsa effekten av ökade nivåer av kolesterol på proteinfunktion. Mekanismerna för kolesterolmodulering av proteinfunktion kan innebära direkta interaktioner8 och/eller indirekta effekter9. När kolesterol påverkar proteinfunktion via direkta interaktioner, effekten av en ökning av kolesterolnivåer på proteinaktivitet är sannolikt oberoende av celltyp, uttryckssystem, eller anrikning strategi. Till exempel använde vi dessa två metoder för att bestämma effekten av kolesterol på G-protein gated inåt korrigera kalium (GIRK) kanaler uttryckt i förmaksflimmermyocyter 37, hippocampus nervceller32,38, HEK29339 celler, och Xenopus oocyter32,37. De resultat som erhölls i dessa studier var konsekventa: i alla tre typerna av däggdjursceller och i amfibiska äggceller kolesterol upregulated GIRK kanal funktion (se representativa resultat avsnitt, figur 4, för hippocampus nervceller och motsvarande experiment i Xenopus äggceller). Dessutom var de observationer som gjorts i dessa studier också överensstämmer med resultaten av studier som utförts i förmaksflimmermyocyter 37,40 och hippocampus nervceller32,38 nyligen isolerade från djur som utsätts för en hög kolesterol diet40. Särskilt kolesterol anrikning av hippocampus nervceller med MβCD vände effekten av atorvastatin terapi som används för att ta itu med effekterna av det höga kolesterolet kost både på kolesterolnivåer och GIRK funktion38. I andra studier undersökte vi effekten av mutationer på kolesterolkänsligheten hos den inåtriktade reterbara kaliumkanalen Kir2.1 med både Xenopus oocyter och HEK293-celler41. Återigen var effekten av mutationerna på känsligheten i kanalen liknande i de två systemen.
Tillämpningarna av både anrikningsmetoder för att bestämma effekten av förhöjda kolesterolnivåer på molekylära, cellulära och organfunktion är många. I synnerhet är användningen av cyklodextrin-kolesterol komplex för att berika celler och vävnader mycket vanligt till stor del på grund av dess specificitet. Senaste exemplen på detta tillvägagångssätt är fastställandet av effekterna av kolesterol på HERG kanalaktivering och underliggande mekanismer42, upptäckten att kolesterol aktiverar G proteinkopplade receptorn utjämnas för att främja Igelkott signalering43, och identifiering av den roll som kolesterol i stamceller biomekanik och adipogenesis genom membran-associerade länkare proteiner44. I vårt eget arbete använde vi anrikning av däggdjursvävnad med MβCD:kolesterolkomplex för att studera effekten av kolesterolanrikning på grundläggande funktion och den farmakologiska profilen av kalcium- och spänningsgated kanaler av stor ledning (BK, MaxiK) i kärlmustatur35,,45,46. I andra studier använde vi fosfolipid-baserade dispersion strategi för att berika Xenopus oocyter med kolesterol för att bestämma roller i olika regioner i Kir2.1 och GIRK kanaler i kolesterol känslighet41,47,48,49, samt att bestämma förmodade kolesterol bindande platser i dessa kanaler32,,50,51.
Metoder för att berika däggdjursvävnader och däggdjursceller och Xenopus-oocyter med kolesterol utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka effekten av förhöjda kolesterolnivåer på enskilda molekylära arter, på komplexa makromolekylära system (t.ex. proteiner) och på cellulära och organiska funktion. I detta dokument har vi beskrivit två kompletterande metoder som underlättar sådana studier. Först beskrev vi hur man berikar vävnader och celler med kolesterol med MβCD mättad med kolester…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Scientist Development Grant (11SDG5190025) från American Heart Association (till A.R.-D.), och av National Institute of Health R01 bidrag AA-023764 (till A.N.B.), och HL-104631 och R37 AA-11560 (till A.M.D).
Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
KCl | Fisher | P217 | |
Trizma base | Sigma | T6066 | |
HEPES | Corning | 61-034-RO | |
MgCl2 | Fisher | M33 | |
NaCl | Fisher | S271 | |
KH2PO4 | Fisher | P285 | |
MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
EDTA | VWR | E177 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
Blood Gas Tank | nexAir | ||
NaOH | Fisher | S318 | |
1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
Chloroform | Fisher | C298 | |
Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
96 well plate | Sigma | BR781602 | |
N2 gas | nexAir | ||
Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
TritonX | Fisher | BP151-100 | |
Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
DMSO | Fisher | BP231 | |
Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
DI H2O | University DI source | ||
ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
KimWipes | Fisher | 06-666A | |
pH probe | Sartorus | py-p112s | |
pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
Timer | Fisher | 02-261-840 | |
Steno book | Staples | 163485 |