Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol
Summary
Se presentan dos métodos de enriquecimiento del colesterol: la aplicación de ciclodextrina saturada con colesterol para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos, y el uso de dispersiones basadas en fosfolípidos enriquecidos con colesterol (liposomas) para enriquecer los ovocitos de Xenopus. Estos métodos son instrumentales para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica.
Abstract
El enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos, incluyendo los ovocitos de Xenopus utilizados para estudiar la función celular, se puede lograr utilizando una variedad de métodos. Aquí, describimos dos enfoques importantes utilizados para este propósito. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y células con colesterol usando ciclodextrina saturada con colesterol usando arterias cerebrales (tejidos) y neuronas hipocampales (células) como ejemplos. Este enfoque se puede utilizar para cualquier tipo de tejido, células o líneas celulares. Un enfoque alternativo para el enriquecimiento del colesterol implica el uso de lipoproteínas de baja densidad (LDL). La ventaja de este enfoque es que utiliza parte de la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula. Sin embargo, mientras que el enfoque de ciclodextrina se puede aplicar para enriquecer cualquier tipo de interés celular con el colesterol, el enfoque LDL se limita a las células que expresan receptores LDL (por ejemplo, células hepáticas, células derivadas de la médula ósea como leucocitos de sangre y macrófagos tisulares), y el nivel de enriquecimiento depende de la concentración y la movilidad del receptor LDL. Además, las partículas de LDL incluyen otros lípidos, por lo que la administración de colesterol no es específica. En segundo lugar, describimos cómo enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol utilizando una dispersión basada en fosfolípidos (es decir, liposomas) que incluye el colesterol. Los ovocitos de xenopus constituyen un popular sistema de expresión hetóloga utilizado para estudiar la función celular y proteica. Tanto para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en ciclodextrina del tejido de mamíferos (arterias cerebrales) como para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en fosfolípidos de los ovocitos de Xenopus, demostramos que los niveles de colesterol alcanzan un máximo de 5 minutos de incubación. Este nivel de colesterol permanece constante durante períodos prolongados de incubación (por ejemplo, 60 min). Juntos, estos datos proporcionan la base para condiciones temporales optimizadas para el enriquecimiento de colesterol de tejidos, células y ovocitos de Xenopus para estudios funcionales destinados a interrogar el impacto del enriquecimiento de colesterol.
Introduction
El colesterol, un lípido celular importante, desempeña numerosos roles funcionales y estructurales críticos1,2,3,4,5,6,7,8,9. Desde la regulación de las propiedades físicas de la membrana plasmática hasta asegurar la viabilidad celular, el crecimiento, la proliferación y servir como una molécula de señalización y precursora en una gran cantidad de vías bioquímicas, el colesterol es un componente imperativo necesario para la función celular y orgánica normal. Como resultado, deficiencia de colesterol resulta en malformaciones físicas graves y una variedad de trastornos. Por otro lado, incluso un pequeño aumento del colesterol por encima de los niveles fisiológicos (2-3x) es citotóxico1,2,10 y se ha asociado con el desarrollo de trastornos, incluyendocardiovasculares 11,12,13 y enfermedades neurodegenerativas14,15,16,17. Por lo tanto, para interrogar las funciones críticas del colesterol y determinar el efecto de los cambios en los niveles de colesterol, se han desarrollado diferentes enfoques que alteran el contenido de colesterol en tejidos, células y ovocitos de Xenopus.
Alteración de los niveles de colesterol en los tejidos y células de los mamíferos
Se pueden aprovechar varios enfoques para disminuir los niveles de colesterol en tejidos y células18. Un enfoque implica su exposición a estatinas disueltas en suero deficiente en lipoproteínas para inhibir la HMG-CoA reductasa, que controla la tasa de síntesis de colesterol19,20. Sin embargo, estos medicamentos para reducir el colesterol también inhiben la formación de productos no esteroles a lo largo de la vía del mevalonato. Por lo tanto, se añade una pequeña cantidad de mevalonato para permitir la formación de estos productos21 y mejorar la especificidad de este enfoque. Otro enfoque para disminuir los niveles de colesterol implica el uso de -ciclosdextrinas. Estos monómeros de glucopranosa poseen una cavidad hidrofóbica interna con un diámetro que coincide con el tamaño de los esteroles22,lo que facilita la extracción de colesterol de las células, agotando así su contenido de colesterol nativo23. Un ejemplo es el 2-hidroxipropil–ciclodextrina (HP-CD), un medicamento preclínico que actualmente se está probando para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, un trastorno metabólico mortal genéticamente heredado caracterizado por el almacenamiento de colesterol lisosomal24. El nivel de agotamiento del colesterol depende del derivado específico utilizado. Por ejemplo, la HP-CD extrae el colesterol con una capacidad inferior a la derivada metilada, metil–ciclodextrina (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. En particular, sin embargo, -ciclosdextrinas también pueden extraer otras moléculas hidrófobas además del colesterol, que luego puede resultar en efectos inespecíficos31. A diferencia del agotamiento, las células y los tejidos se pueden enriquecer específicamente con colesterol a través del tratamiento con la ciclodextrina que ha sido presaturado con colesterol23. Este enfoque también se puede utilizar como un control para la especificidad de las ciclosdextrinas utilizadas para el agotamiento del colesterol31. El agotamiento del colesterol de los tejidos y las células es sencillo y se puede lograr exponiendo las células durante 30-60 min a 5 mM M-CD disuelto en el medio utilizado para almacenar las células. Este enfoque puede resultar en una disminución del 50% en el contenido de colesterol (por ejemplo, en las neuronas del hipocampo32, las arterias cerebrales de rata33). Por otro lado, la preparación del complejo de ciclodextrina-colesterol para el enriquecimiento de colesterol de tejido y células es más compleja, y se describirá en la sección de protocolo.
Un enfoque alternativo para enriquecer los tejidos y las células que utilizan la ciclodextrina saturada con colesterol implica el uso de LDL, que se basa en receptores LDL expresados en los tejidos/células18. Si bien este enfoque ofrece la ventaja de utilizar la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula, tiene varias limitaciones. En primer lugar, los tejidos y células que no expresan el receptor LDL no se pueden enriquecer con este enfoque. En segundo lugar, las partículas de LDL contienen otros lípidos además del colesterol. Específicamente, LDL se compone de la proteína ApoB100 (25%) y los siguientes lípidos (75%): colesterol de 6-8%, éster de colesteryl de 45-50%, fosfolípidos de 18-24% y triacilgliceroles de 4-8%34. Por lo tanto, la administración de colesterol a través de partículas DE LDL es inespecífica. En tercer lugar, el porcentaje de aumento en el contenido de colesterol por LDL en los tejidos y células que expresan el receptor LDL puede ser significativamente menor que el aumento observado utilizando ciclodextrina saturada de colesterol. Por ejemplo, en un estudio anterior, el enriquecimiento de las arterias cerebrales de roedores con colesterol a través de LDL dio lugar a sólo un aumento del 10-15% en los niveles de colesterol35. Por el contrario, el enriquecimiento de estas arterias con ciclodextrina saturada de colesterol como se describe en la sección de protocolo dio lugar a >50% aumento en el contenido de colesterol (Ver sección Resultados Representativos, Figura 1).
Alteración de los niveles de colesterol en los ovocitos de Xenopus
Los ovocitos de xenopus constituyen un sistema de expresión hetólogo comúnmente utilizado para el estudio de la función celular y proteica. Estudios anteriores han demostrado que la relación de colesterol a fosfolípidos molares en los ovocitos de Xenopus es de 0,5 x 0,136. Debido a este alto nivel intrínseco de colesterol, aumentar el contenido de colesterol en este sistema es un reto, sin embargo, se puede lograr utilizando dispersiones hechas de fosfolípidos de membrana y colesterol. Los fosfolípidos que hemos elegido para este fin son similares a los utilizados para la formación de bicapas de lípidos planas artificiales e incluyen L-a-fosfatidiletanolamina (POPE) y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serina (POPS), como se describe en la sección de protocolo. Este enfoque puede resultar en >50% de aumento en el contenido de colesterol (ver sección Resultados representativos, Figura 2).
Un enfoque alternativo para enriquecer los ovocitos de Xenopus con dispersiones basadas en fosfolípidos implica el uso de ciclodextrina saturada de colesterol, que es similar a la forma en que se enriquecen los tejidos y las células. Sin embargo, hemos encontrado que este enfoque es de baja reproducibilidad y eficiencia, con un aumento promedio del 25% en el contenido de colesterol. Esto es posiblemente debido a la diferente capacidad de carga de estos dos enfoques (ver sección Resultados representativos, Figura 3). Por el contrario, se ha demostrado que el uso de ciclodextrina para agotar el colesterol de los ovocitos de Xenopus puede resultar en una disminución del 40% en el contenido de colesterol36.
Aquí, nos centramos en el enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos a través de la aplicación de ciclodextrina saturada de colesterol, y de los ovocitos de Xenopus usando liposomas. Ambos enfoques se pueden aprovechar para delinear el efecto del aumento de los niveles de colesterol en la función proteica. Los mecanismos de modulación del colesterol de la función proteica pueden implicar interacciones directas8 y/o efectos indirectos9. Cuando el colesterol afecta la función proteica a través de interacciones directas, el efecto de un aumento en los niveles de colesterol en la actividad proteica es probablemente independiente del tipo de célula, sistema de expresión, o enfoque de enriquecimiento. Por ejemplo, utilizamos estos dos enfoques para determinar el efecto del colesterol en la proteína G cerrada internamente rectificando los canales de potasio (GIRK) expresados en miocitos auriculares37, neuronas hipocampales32,38, HEK29339 células, y xenopus ovocitos32,37. Los resultados obtenidos en estos estudios fueron consistentes: en los tres tipos de células de mamíferos y en los ovocitos anfibios el colesterol upregulated función del canal GIRK (ver sección Resultados Representativos, Figura 4, para las neuronas del hipocampo y los experimentos correspondientes en ovocitos de Xenopus). Además, las observaciones realizadas en estos estudios también fueron coherentes con los resultados de los estudios realizados en micocitos auriculares37,,40 y neuronas hipocampales32,,38 recién aisladas de animales sometidos a una dieta alta en colesterol40. En particular, el enriquecimiento de colesterol de las neuronas hipocampales que utilizan M-CD revirtió el efecto de la terapia con atorvastatina utilizada para abordar el impacto de la dieta alta en colesterol tanto en los niveles de colesterol como en la funciónGIRK 38. En otros estudios, investigamos el efecto de las mutaciones en la sensibilidad al colesterol del canal de potasio Ki2.1 rectificando internamente Kir2.1 utilizando ambos ovocitos de Xenopus y células HEK29341. Una vez más, el efecto de las mutaciones en la sensibilidad del canal fue similar en los dos sistemas.
Las aplicaciones de ambos métodos de enriquecimiento para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica son numerosas. En particular, el uso de complejos de ciclodextrina-colesterol para enriquecer las células y tejidos es muy común en gran medida debido a su especificidad. Ejemplos recientes de este enfoque incluyen la determinación del impacto del colesterol en la activación del canal HERG y los mecanismos subyacentes42, el descubrimiento de que el colesterol activa el receptor acoplado a la proteína G Suavizado para promover la señalización de erizo43, y la identificación del papel del colesterol en la biomecánica de células madre y la adipogénesis a través de proteínas de vinculador asociadas a la membrana44. En nuestro propio trabajo, utilizamos el enriquecimiento de tejido de mamíferos con el complejo M-CD:colesterol para estudiar el efecto del enriquecimiento de colesterol en la función básica y el perfil farmacológico de los canales de calcio y voltaje cerrados de gran conductancia (BK, MaxiK) en el músculo liso vascular35,,45,,46. En otros estudios, utilizamos el enfoque de dispersión basado en fosfolípidos para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol para determinar las funciones de diferentes regiones en los canales Kir2.1 y GIRK en sensibilidad al colesterol41,,47,48,49, así como para determinar los sitios de unión del colesterol putativo en estos canales32,50,51.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos y los ovocitos de Xenopus con colesterol constituyen una poderosa herramienta para investigar el efecto de los niveles elevados de colesterol en especies moleculares individuales, en sistemas macromoleculares complejos (por ejemplo, proteínas), y en la función celular y de órganos. En este documento, hemos descrito dos enfoques complementarios que facilitan esos estudios. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y las célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una Beca de Desarrollo Científico (11SDG5190025) de la Asociación Americana del Corazón (a A.R.-D.), y por el Instituto Nacional de Salud R01 otorga AA-023764 (a A.N.B.), y HL-104631 y R37 AA-11560 (a A.M.D.).
Materials
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
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