Her beskriver vi en enkel og tilgjengelig strategi for visualisering, kvantifisering og kartlegging av immunceller i formalin-faste parafin-innebygde tumorvevseksjoner. Denne metoden kombinerer eksisterende bilde- og digitale analyseteknikker med det formål å utvide multipleksjonsevnen og multiparameteranalysen av bildebehandlingsanalyser.
Immunlandskapet i tumormikromiljøet (TME) er en avgjørende faktor i kreftprogresjon og respons på terapi. Spesielt har tettheten og plasseringen av immunceller i TME viktige diagnostiske og prognostiske verdier. Multiomic profilering av TME har eksponentielt økt vår forståelse av de mange cellulære og molekylære nettverk som regulerer tumorinitiering og progresjon. Disse teknikkene gir imidlertid ikke informasjon om den romlige organiseringen av celler eller cellecelleinteraksjoner. Rimelig, tilgjengelig og lett å utføre multipleksing teknikker som tillater romlig oppløsning av immunceller i vev seksjoner er nødvendig for å utfylle enkelt celle-baserte high-throughput teknologier. Her beskriver vi en strategi som integrerer seriebilde, sekvensiell merking og bildejustering for å generere virtuelle multiparameterlysbilder av hele vevsseksjoner. Virtuelle lysbilder analyseres deretter på en automatisert måte ved hjelp av brukerdefinerte protokoller som muliggjør identifisering, kvantifisering og kartlegging av cellepopulasjoner av interesse. Bildeanalysen er gjort, i dette tilfellet ved hjelp av analysemodulene Tissuealign, Author og HISTOmap. Vi presenterer et eksempel der vi brukte denne strategien med hell til en klinisk prøve, maksimere informasjonen som kan fås fra begrensede vevsprøver og gi et objektivt syn på TME i hele vevsdelen.
Kreftutvikling er et resultat av en flertrinnsprosess som involverer gjensidige interaksjoner mellom ondartede celler og TME. Annet enn tumorceller består TME av ikke-ondartede celler, stromale celler, immuncellepopulasjoner og ekstracellulær matrise (ECM)1. Den romlige organiseringen av de forskjellige cellulære og strukturelle komponentene i tumorvevet og den dynamiske utvekslingen mellom kreft og nærliggende ikke-kreftceller modulerer til slutt tumorprogresjon og respons på terapi2,,3,4. Det har vist seg at immunresponsen hos kreft er spatiotempoally regulert5,6. Ulike immuncellepopulasjoner som infiltrerer neoplastisk lesjon og tilstøtende vev viser karakteristiske romlige distribusjonsmønstre og varierte aktiverings- og differensieringstilstander forbundet med forskjellige funksjoner (f.eks. pro- versus antitumor). Disse forskjellige immunpopulasjonene og deres parametere dreier seg om overtid med svulsten og stromale rom.
Fremveksten av teknologier som tillater encellede multiomics profilering har eksponentielt økt vår forståelse av de mange cellulære og molekylære nettverk som regulerer kreftfremkallende og tumorprogresjon. De fleste enkeltcellebaserte analytiske verktøy med høy gjennomstrømning krever imidlertid vevsforstyrrelser og encellede isolering, noe som resulterer i tap av informasjon om den romlige organiseringen av celler og cellecelleinteraksjoner7. Fordi plasseringen og plasseringen av spesifikke immunceller i TME har diagnostisk og prognostisk verdi, er teknologier som tillater romlig oppløsning et viktig komplement av enkeltcellebaserte immunprofileringsteknikker.
Tradisjonelt har bildeteknikker som immunohistochemistry (IHC) og multipleks immunofluorescens (mIF) vært begrenset til et lite antall biomarkører som kan visualiseres samtidig. Denne begrensningen har hindret studien av spatiotemporal dynamikken i tumor-infiltrerende immunceller, som vanligvis er definert av flere fenotypisk markører. Nylige fremskritt innen bildebehandling og analytiske verktøy har utvidet mulighetene for multipleksing. Nye antistoffbaserte merkingsteknologier som histo-cytometri og bildemassecytometri har blitt brukt til å skille opptil 12 og 32 biomarkører, henholdsvis8,9. Massespektrometri bildebehandling, en teknikk som ikke krever merking, har potensial til å bilde tusenvis av biomarkører samtidig i en enkelt vev seksjon10,11. Selv om disse teknikkene allerede har vist stort potensial for å dissekere vevimmunlandskapet i kreft, bruker de svært sofistikert og dyrt utstyr og programvare og er ikke lett tilgjengeligfor de fleste forskere.
Alternativt har multipleksjonsevnen til tradisjonell IHC og mIF blitt utvidet gjennom bruk av seriell bildebehandling, sekvensielle runder med merking og spektral bildebehandling7,,12,,13,,14,15,16. Disse teknikkene genererer flere bilder fra samme eller fra serievevseksjoner som kan konsolideres til virtuelle multiparameterlysbilder ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Som et resultat øker antall markører som kan visualiseres og analyseres samtidig.
Her foreslår vi en strategi for rasjonell utforming av vev multipleks analyser ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser, rimelig mikroskopi utstyr, og brukervennlig programvare (Figur 1). Denne metoden integrerer seriebilde, sekvensiell multipleksmerking, hele vevsavbildning og vevsjustering for å generere virtuelle multiparameterlysbilder som kan brukes til automatisert kvantifisering og kartlegging av immunceller i vevsseksjoner. Ved hjelp av denne strategien opprettet vi en virtuell lysbilde bestående av 11 biomarkører pluss to ofte brukte histologiske flekker: hematoksylin og eosin (H&E) og picrosirius rød (PSR). Flere immuncellepopulasjoner ble identifisert, lokalisert og kvantifisert i forskjellige vevsrom og deres romlige fordeling løst ved hjelp av vevsvarmekart. Denne strategien maksimerer informasjonen som kan oppnås fra begrensede kliniske prøver og gjelder for formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) arkivertvevsprøver, inkludert hele vev, kjerne nål biopsier, og vev mikroarrays. Vi foreslår denne metodikken som en nyttig veiledning for utforming av tilpassede analyser for identifisering, kvantifisering og kartlegging av immuncellepopulasjoner i TME.
Enkle, tilgjengelige og enkle å utføre multipleksingteknikker som tillater romlig oppløsning av immunceller i vevsseksjoner er nødvendig for å kartlegge immunlandskapet i kreft og andre immunologiske lidelser. Her beskriver vi en strategi som integrerer allment tilgjengelige merkings- og digitale analyseteknikker for å utvide multipleksjonsevnen og flerdimensjonal vurdering av bildebehandlingsanalyser12,13,17,19. Farging av tre seriedeler for forskjellige markører, og gjenbruk av seksjoner gjennom stripping og reprobing teknikker, gjorde oss i stand til å visualisere 11 parametere i tillegg til H & E og PSR flekker. Seks bilder fra disse seksjonene ble justert på en automatisert måte ved hjelp av vevjusteringsmodulen. Justeringen var nøyaktig på det enkelte cellenivå for bilder som stammer fra samme del og svært konkordans for bilder som stammer fra nærliggende seksjoner. Virtuell multipleksing gjorde det mulig for oss å bestemme hvordan markører visualisert i en del er romlig knyttet til markører visualisert i en annen sammenhengende del. Mens noen av flekker merket COIer, andre merket TCer, slik at vi kan kvantifisere COI er i de forskjellige TCene. Bruken av programvareverktøy for automatisert kvantifisering av COIer forenklet og akselerert behandling av bilder. Videre ble digital analyse brukt på hele vevsseksjoner i stedet for utvalgte synsfelt, noe som resulterte i en objektiv representasjon av TME. Videre, fordi vevkoordinatene til COI-er ble registrert, var det mulig å generere vevsvarmekart.
Det finnes flere områder i denne protokollen der feilsøking kan være nødvendig. For det første kan dårlig antigenhenting påvirke kvaliteten på mIF, derfor bør typen antigengjenfinningsbuffer og varighet optimaliseres for de spesifikke analyse-/biomarkørforholdene som brukes. For det andre bør typen blokkeringsløsning som brukes tilpasses vev/antigen/arter av primære og sekundære antistoffer. I våre hender, tillegg av 10% totalt serum fra arten der vevet kommer fra blokkerte Fc reseptorer, og dermed redusert uspesifikk antistoff binding. Tilsetning av 10% av serum fra arten de sekundære antistoffene ble reist i ville minimere direkte uspesifikk vedlegg av sekundære antistoffer mot vevsseksjonen. For det tredje er validering av spesifisiteten til de primære og sekundære antistoffene ved hjelp av de riktige positive og negative kontrollene avgjørende. Fjerde, økt autofluorescens i noen kanaler og diffusjon av DAPI ved primær antistoff stripping er også vanlig. For å løse den forbedrede autofluorescensen brukte vi primære/sekundære antistoffpar der det spesifikke signalet hadde intensitetsverdier minst 5x som i bakgrunnen. Til slutt kan noen høy affinitetsantistoffer ikke eluted med vanlige strippingprosedyrer. I dette tilfellet anbefaler vi å bruke slike antistoffer i den siste runden med merking. Brukeren må kanskje prøve forskjellige fargesekvenser for å finne den optimale konfigurasjonen for antistoffene av interesse. Effektiviteten av stripping bør bekreftes før du går videre til en andre eller tredje runde med merking.
Hovedbegrensningen og utfordringen med denne strategien er å finne de riktige kombinasjonene av primære og sekundære fluorescerende antistoffer for markører av interesse. Å finne primære antistoffer oppvokst i forskjellige arter eller med forskjellige isotyper som kan brukes samtidig, er begrenset av det som er kommersielt tilgjengelig. De fleste hele lysbildeskannere er utstyrt med lamper og filtre som tillater bildebehandling maksimalt fem kanaler, og sekundære antistoffer i de riktige artene og høyre fluoroforfor er ikke alltid tilgjengelig. Vi overvant delvis disse begrensningene ved hjelp av serielle flekker og sekvensiell merking. Flere antistoffkombinasjoner må kanskje testes for å komme frem til den beste kombinasjonen for markører av interesse. En annen begrensning er kvaliteten på DAPI farging, fordi stripping og reprobing kan ikke alltid tillate utføre kjernesegmentering.
Vevsjusteringsmodulen krever minimal opplæring og ingen programmeringsferdigheter fra brukerne. Programvaren teoretisk tillater justering av et ubegrenset antall bilder. Imidlertid avhenger presis justering av sammenhengen mellom seksjoner, hvor nærmere seksjoner som er mer histologisk konkordans er mer nøyaktig justert. Vi brukte Forfatter-modulen til VIS for å generere APPer. Grunnleggende kunnskap om bildeanalyse er nødvendig for å lage APPer, men dette er like tilfelle når du bruker annen bildeanalyseprogramvare. De unike fordelene med VIS sammenlignet med annen bildeanalyseprogramvare inkluderer automatisert justering av bilder fra seksjoner utarbeidet ved hjelp av forskjellige metoder (f.eks. IF, histochemistry, IHC). Dette gjør det mulig for kolokaliseringsstudier av flere markører av interesse ved hjelp av virtuell multipleksing. Videre tillater den fleksible og brukervennlige utformingen av APPer brukerspesifikk tilpasning. Automatisert kvantifisering og kartlegging, og muligheten for behandling av hele vevseksjoner, sparer tid og reduserer skjevhet sammenlignet med manuell telling ved visuell inspeksjon.
Denne strategien er et svært nyttig forskningsverktøy for vevimmunologi i sammenheng med kreft og autoimmunitet, men forblir ikke validert for klinisk bruk. Med ytterligere standardisering og validering kan den brukes i fremtiden for flere applikasjoner (f.eks. for å kartlegge immunlandskapet i kreft for å forutsi og overvåke responsen på immunterapeutiske midler). Det kan også tilpasses forskjellige inflammatoriske tilstander (f.eks. inflammatorisk tarmsykdom) for å kombinere patologisk evaluering med prognostiske biomarkører.
De viktigste kritiske trinnene i denne protokollen er effektiviteten/spesifisiteten til merkingen og robustheten til de utformede APPer-ene for tiltenkt bruk eller biomarkør. Derfor er regelmessig validering ved visuell inspeksjon, spesielt ved utforming av en ny APP, avgjørende. Effektiv bruk av flere runder med stripping og frastøting eller ulike typer flekker på samme seksjon er kritiske komponenter og kan være vev eller seksjonsspesifikke. Det er avgjørende å verifisere effektiviteten til slike prosesser før du fortsetter med stor batchanalyse.
Oppsummert tilbyr vi en strategi som maksimerer den kvantitative og romlige informasjonen som kan fås fra verdifulle kliniske vevsprøver. Ressursene, utstyret og kunnskapen som kreves for å implementere denne metodikken er allment tilgjengelig. Vi foreslår denne metodikken som en nyttig veiledning for planlegging av analyser som tar sikte på å identifisere, kvantifisere og kartlegge immuncellepopulasjoner i TME.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker studiedeltakeren. Vi takker Louise Rousseau, koordinator for HBP biobank for utvinning av vevsprøvene og all tilhørende klinisk informasjon. Vi anerkjenner molekylær patologi og cellebildekjerneanlegg ved CRCHUM og Michael Persch fra Visiopharm for utmerket teknisk assistanse. Finansiering: Denne studien ble støttet av tilskudd fra Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec–Santé (FRQS) AIDS og Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI), og Canadian Network on Hepatitt C (CanHepC). CanHepC er finansiert av et felles initiativ fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) og Public Health Agency of Canada. M.F.M. fikk stipend fra Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis og FRQS. T.F. fikk doktorgradsstipend fra CIHR og CanHepC. S.T. har Roger-Des-Groseillers Chair i hepatobiliær og bukspyttkjertel onkologisk kirurgi, Université de Montréal.
Forfatterbidrag: M.F.M. designet, utførte eksperimenter og analyserte data. T.F. designet eksperimenter. A.C-B. teknisk veiledning. G.S. utførte all den patologiske vurderingen av studieemnet og ga innspill på alle de patologiske aspektene. L.M. utførte H&E-farging, optimalisert og utført bildeoppkjøp. M.N.A. utførte PSR-flekken og ga verdifull teknisk inngang. N.B. bidro til bildeanalysen. S.T. er hovedetterforsker for HBP biobank og er ansvarlig for å overvåke den generelle driften av biobanken. Han ga også uvurderlige innspill på alle aspekter av prosjektet og dets kliniske implikasjoner. M.F.M, T.F., og N.H.S. konseptualisert og designet studien. N.H.S. overvåket arbeidet og fikk finansiering. M.F.M., T.F., A.C-B og N.H.S. skrev manuskriptet. Alle forfattere anmeldte og godkjente manuskriptet.
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Ethanol 100% | |||
Electric pressure cooker | Salton | ||
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
FFPE section (4μm) slides | |||
Glycine 0,1 M in PBS | |||
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
Human Serum | Gemini | 22210 | |
Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
Pap pen | abcam | ab2601 | |
PBS | |||
PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Shaking water bath | |||
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
VIS Software | Visiopharm | ||
Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |