Summary
유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.
Abstract
오르가노이드는 접시의 편리함으로 생리적 과정을 재연하는 자가 조직, 3차원 조직 구조를 제공합니다. 뮤린 유방 동맥은 두 개의 별개의 상피 세포 구획으로 구성되어 있으며, 외부, 수축성 근상피 구획 및 내부, 분비 발광 구획과 같은 서로 다른 기능을 제공합니다. 여기에서, 우리는 이 구획을 포함하는 세포가 유방 선 형태 형성 및 분화에 그들의 개별 적인 혈통 기여를 조사하기 위하여 단리되고 그 때 결합되는 방법을 기술합니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 형광 활성화 세포 선별과 같은 정교한 분리 기술이 필요하지 않습니다. 대신, 우리는 조직을 수확하고 효소적으로 소화하고, 부착 조직 배양 접시에 상피를 씨를 뿌린 다음 차동 트립시니화를 사용하여 ~ 90 % 순도의 발광 세포에서 근상추신을 분리합니다. 세포는 그 때 배양에 있는 10 일 후에 우유를 생성하기 위하여 분화될 수 있는 이중층, 3차원 (3D) organoids로 조직되는 세포외 매트릭스에서 그 때 도금됩니다. 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여는, 세포는 야생 모형 또는 유전으로 조작한 마우스 모형에서 수확될 수 있습니다, 또는 3D 문화 전에 유전으로 조작될 수 있습니다. 이 기술은 발광 또는 근상피 구획에서 특히 유전자 기능의 조사를 허용하는 모자이크 오르가노이드를 생성하는 데 사용될 수 있습니다.
Introduction
유방 선 (MG)는 지방세포가 풍부한 기질 안에 내장 된 나무 와 같은 관 상피 구조입니다. 이중층 덕트 상피는 수축성, 근상피세포(MyoECs) 및 중추세포의 내층, 분비상피세포(LEC)의 외부, 기저층을 포함하며, 중앙 루멘1을둘러싸고 있다. 외부 MyoECs 내부 폐포 LECs에서 우유를 짜내기 위해 계약 하는 동안 수 유 하는 동안, MG 성장 인자 (예를 들어, EGF 와 FGF) 그리고 호르몬 (예를 들어, 프로게스테론, 인슐린, 그리고 prolactin)의 통제 하에 수많은 변화를 겪는다. 이러한 변화는 수유 중 우유를 합성하고 분비하는 특수 구조인 폐포의 분화를 유발합니다1. 유방 상피계는 실험적으로 상피 조직 단편, 세포, 또는 단일 기저 세포가 숙주 유방 지방 패드로 이식되는 기술을 사용하여 조작될 수 있으며, 내인성 유방 parenchyma의 사전 제거, 전체, 기능상피트리2,,3,,4,,5를재구성하기 위해 성장하도록 허용된다. 이식은 강력한 기술이지만, 돌연변이가 초기 배아 치사(E14 이전)를 초래하여 이식 가능한 유방 조개 배의 구조를 방해하는 경우 시간이 많이 걸리고 불가능합니다. 게다가, 조사자는 수시로 계보 제한한 전구 세포에서 파생되는 2개의 다른 구획의 역할을 연구하고 싶습니다. Cre-lox 기술은 MyoECs및 LEC의 차등 유전자 조작을 허용하지만, 이것은 또한 시간과 비용이 많이 드는 사업입니다. 따라서, 1950년대 이후, 조사자들은 유선 조직 구조 및 기능에 관한 질문을 비교적 쉽고 효율적으로 해결하는 방법으로 시험관내 유방 유기체를사용해 왔으며6,7.
1차 유방 상피 세포의 분리 및 배양을 설명하는 초기 프로토콜에서, 연구자들은 플라즈마 혈전과 닭 배아 추출물로 구성된 지하 막 매트릭스(BME)가 접시에서 자란 MG 단편에 필요하다는 것을발견하였다 6. 다음 십년간에서, 세포외 매트릭스(Engelbreth-Holm-Swarm murine 육종 세포에 의해 분비된 EMS, 콜라겐 및 젤리같은 단백질 매트릭스)는 3D 배양을 촉진하고 생체 내 환경7,,8,,9,,10을더 잘 모방하기 위해 개발되었다. 3D 행렬에서 세포를 배양하는 것은 생체 내 생리학적과정9,,10,,11,,12에서이러한 미세환경이 더 나은 모델이라는 여러 기준(형태학, 유전자 발현 및 호르몬 반응성)에 의해 밝혀졌다. 1차 뮤린 세포를 이용한 연구는 오르가노이드의 확장된 유지 및 분화에 필요한 주요 성장 인자 및 모르포겐을확인하였다 13. 이러한 연구는 여기에 제시된 프로토콜에 대한 무대를 설정하고, 인간 유방 세포의 배양을 3D 오르가노이드로, 이는 현재 현대 임상 도구이며, 환자 샘플에 대한 약물 발견 및 약물 검사를 허용한다14. 전반적으로, 오르가노이드 배양은 1 차적인 세포의 자기 조직 수용량 및 형태 형성과 분화에 그들의 기여를 강조합니다.
여기서 제시된 것은 우유 생성 아시니로 분화될 수 있는 배양 뮤린 상피에 대한 프로토콜이다. 차동 트립시네화 기술은 2개의 별개의 MG 세포 구획을 구성하는 MyoECs 및 LECs를 격리하기 위하여 이용됩니다. 이 분리된 세포 분획은 그 때 유전자 기능을 과발현하거나 녹다운하기 위하여 유전으로 조작될 수 있습니다. 계보-내재성, 자기 조직은 유방 상피 세포의 타고난 속성이기 때문에15,,16,,17,이러한 세포 분획을 재조합하면 연구자들은 이중층, 모자이크 오르가노이드를 생성할 수 있다. 우리는 효소적으로 지방 조직을 소화하고 24 시간 동안 조직 배양 접시에 유방 조각을 배양하는 것으로 시작합니다(그림 1). 조직 단편은 생체 내 조직과 이중 층 조각으로 폴리스티렌 접시에 정착 : 내부 발광 층을 둘러싼 외부 근상피층 층. 이러한 세포 조직은 트립신-EDTA(0.05%)에 의한 외부 MyoECs의 격리를 허용합니다. 3-6분 동안 트립신-EDTA 2라운드(0.05%) 남은 내부 LES를 분리하는치료(그림 2). 따라서, 상이한 트립신 감도를 가진 이들 세포 유형은 단리되고 이후에 ECM에서 혼합 및 도금될 수있다(도 3). 세포는 내부 LEC를 둘러싼 MyoECs의 외부 층을 포함하는 이중 층구를 형성하기 위하여 자기 조직을 겪습니다. 루멘 형성은 세포가 성장 인자의 칵테일을 포함하는 배지에서 성장함에 따라 발생 (성장 매체에 대한 조리법 참조)13. 5일 후, 오르가노이드는 알베올로제네시스 배지(레시피 및 도 3F참조)로 전환하여 우유 생산 아시니로 분화하고 또 다른 5일 동안 배양할 수 있다. 대안적으로, 오르가노이드는 적어도 10일 동안 성장 배지에서 계속 확장및 분기될 것이다. 오르가노이드는 면역형광(도3D-F)을이용하여 분석하거나 회복용액을 사용하여 ECM으로부터 방출될 수 있다(물질표참조)하고 다른 방법들(예를 들어, 면역블롯, RT-qPCR)을 통해 분석될 수 있다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1일차: 유선 소화
- 성숙한 암컷 마우스로부터 10-14주령의 MGs를 수확할 준비를 한다.
- 무균 조건하에서 열린 벤치에서 수확을 수행하십시오.
- 수술 전 20분 동안 70%의 알코올을 오토클레이브하고 담금으로써 모든 수술 용품, 코르크 보드 및 핀을 살균하십시오.
- 0.5 mL 인슐린 주사기로 복강 내 주사를 통해 전달되는 펜토바르비탈 나트륨(2X 마취용량 0.06 mg/g 체중)으로 동물을 마취시다.
- 동물의 발가락을 꼬집어 반사 반응을 확인하고 동물이 완전히 마취 된 후에만 프로토콜을 시작하여 마취 수준을 모니터링하십시오.
- 동물을 등에 대고 부속물을 코르크보드에 고정하고 복부와 가슴을 에탄올로 닦아냅니다.
- #2, 3, 4, 및 5개의 MG를 하나의 마우스로부터 수확하기 위해(즉, 8개의 MGs, 도 1A)두 뒷다리 사이의 중간선을 식별하고 날카로운 가위로 복부 피부에 작은 절개(1cm)를 한 다음,목(18)까지컷을 확장한다.
- 면봉을 사용하여 피부가 방출 될 수 있도록 다리와 팔을 향해 작은 컷을 만들어 따릅니다. 피부를 멀리 당기고 한쪽에 고정하기 전에 단단히 스트레칭(그림 1B,1 단계 1)18. 그 아래에 절단하여 MGs를 제거하고, #4 땀샘에서 림프절을 제거(그림 1B,단계 2, 3)18. 신체의 반대편에서 절차를 반복합니다.
- MG 조직을 4°C Dulbecco의 변형 된 독수리 의 매체 (DMEM)/영양 혼합물 F12 (F12)에서 5 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1X 항생제 항균제(Anti-Anti)18로채취하십시오.
- 35mm 접시나 면도날 이나 티슈 다기를 사용하여 세라믹 접시에 땀샘을 잘라. 티슈 조각이 1 mL 마이크로 파이펫 팁을 쉽게 통과 할 수 될 때까지 5 개의 수동 갈비 또는 조직 헬기의 모든 라운드를 돌립니다 (~ 0.1 mm / 조각, 그림 1C).
- 소화 배지에서 MGs를 소화(표 1참조)에서 14시간 동안 37°C, 5%CO2에서6개의 잘 낮은 접착 접시에.
2. 일 2: 유방 상피 조직 단편의 격리
- 소화 14 시간 후, 1 mL 마이크로 파이펫을 사용하여 소화 된 조직을 10X로 부드럽게 섞어서 남아있는 기질 이나 지방 조직을 분해하여 거품이나 과도한 기계적 힘이 생성되지 않도록합니다.
참고 : 14 시간 후에 불완전한 소화가 있는 경우에, 이것은 전형DNA의 축적 때문일 수 있었습니다. 이 경우 소화 배지 2 mL당 1 mg/mL 데옥시리보누클리스 I(DNase I)의 1 μL을 추가합니다. 37 °C, 5%CO2에서또 다른 30 분 동안 배양하십시오. - 15 mL 튜브에서 조직을 수집하고 조직 배양 등급 1X 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)의 2-3 mL로 소화에 사용되는 잘 헹구고 Ca2 + 및 Mg2 +무료. 원심분리기는 600 x g에서 10분 간.
- 지질 층 및 배지를 포함하는 상급물질을 배출한 다음, DPBS의 5 mL에서 펠릿을 재중단하고 새로운 15 mL 튜브로 전환한다. 원심분리기는 600 x g에서 10분 간.
- 원심분리 동안 50 mL 튜브에 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 배치하고 37 °C DMEM / F12의 10 mL를 사용하여 스트레이너를 prewet.
- 프로토콜 단계 2.4에서 조직 단편을 5 mL의 DPBS를 사용하여 재중단하고 기질 세포 및 단일 세포를 제거하기 위해 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 전달합니다(도1D).
- 세포 스트레이너에 조직 단편을 수집합니다. 37°C DMEM/F12의 10 mL로 4X를 헹구는다(그림1D).
주의: 불완전한 헹구는 것은 비상피 세포로 오염된 배양물로 귀착될 것입니다. - 글로브핑기 탭을 장갑을 낀 손가락으로 잡고, 60 mm 조직 배양 접시 위에 스트레이너를 반전시키고 유지 보수 배지의 1 mL aliquots를 통과하여 조직 단편을 해제 (그림 1E)의 바닥을 통해 유지 보수 매체의 1 mL aliquots를 통과한다(도1E).
- 육안으로 볼 수 있는 조직 단편 잔재에 대한 여과기를 확인하고, 어떤 파편이 여전히 여과기에 준수되는 경우 유지 보수 매체의 1 mL로 스트레이너 1 배 더 헹구는다. 헹구는 조직 단편은 이제 기질 세포가 없어야합니다.
- 반전된 현미경(4X 또는 10X 목표, 도 1F)에서프로토콜 단계 2.9로부터 MG 단편을 함유하는 60 mm 접시를 신속하게 검사한다. 8개의 MG의 전형적인 제제는 ~ 500개의 조각을 산출한다. 단일 세포 또는 지방 물방울에 대 한 보고 하 고 오염 된 세포가 있는지 여부.
참고: 오염 된 세포가있는 경우, 5 mL 파이펫을 사용하여 60mm 접시에서 배지 및 파편을 수집하고 신선한 70 μm 스트레이너를 통해 조각을 다시 필터링하여 여과 단계를 반복하여 프로토콜 단계 2.6, 2.8-2.10을 반복합니다. - 37°C에서 24h, 5%CO2에서배양하고, 조직 단편이 이중층 단편을 부착하고 생성할 수 있도록한다(도 2A).
참고 : 조각이 24 시간까지 정착되지 않은 경우 부착 될 때까지 계속 배양하십시오. 파편이 잘 부착되지 않으면 셀 구획의 분리가 작동하지 않습니다. 연구원이 유착에 대해 우려하는 경우, 조직 배양 판은 단편 부착을 촉진하기 위해 치료될 수 있다(예를 들어, 폴리-L-리신).
3. 일 3: 근상피 및 발광 상피 세포의 차동 시도
- LES에서 MyoE를 분리하려면 접시에서 미디어를 비우고 DPBS 1 mL로 1 x를 헹구고 신선한 트립신 EDTA 1 mL (0.05 %)를 추가하고 반전 된 현미경 (10X 또는 20X 목표, 그림 2B,C,F)에서소화를 주의 깊게 모니터링하십시오. 외부 MyoEC 층의 분리는 트립신-EDTA (0.05%)에 따라 3-6 분이 필요합니다. 강도.
참고: 이 프로세스를 보여주는 대표 이미지는 그림 2를 참조하십시오. 밝은 필드 조명 에서 MyoECs는 둥글게 나타나고 중앙에 부착된 상태로 유지되고 더 어둡게 나타나는 LEC에 비해 더 밝은 모양을 갖습니다. - 2 mL 10% FBS/DPBS를 포함하는 15 mL 튜브에서 MyoEC 분획을 수집합니다. LES를 방해하지 않고 DPBS 2 mL로 60mm 접시를 부드럽게 헹구고 DPBS(그림 2H-I)를폐기하십시오.
참고: MyoECs의 일반적인 복구는 MG의 크기에 따라 범위(3.5 x 106-1.5 x 106)내에 있습니다. - LEC 분획을 제거하려면 트립신-EDTA 1mL(0.05%)를 추가합니다. 다시 접시에 7-15 분 배양, 과소화를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링. 트립신-EDTA (0.05%) 10 % FBS / DPBS의 2 mL로 접시에. 새로운 15 mL 튜브에서 LEC 분획을 수집합니다.
참고: LEC에 대한 일반적인 회복은 MGs의 크기에 따라 범위(2 x 10Figure 2E6-4.2 x 106)내에 있습니다.619 - 트립신-EDTA(0.05%)를 제거하기 위해 300 x g에서 5분 동안 각 분획을 원심분리기. 펠릿을 유지 보수 배지의 250 μL에서 다시 중단하고 혈세포 계측계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 각 세포 집단을 계산합니다. 셀을 계산하는 동안 얼음 위에 놓습니다.
참고 : 세포 분획의 유전 적 조작이 필요한 경우, 기본 세포는 낮은 접착 접시에 성장하고 렌티 바이러스(20)에감염 될 수있다.
4. 3일차: 세포외 기질에 세포 분획을 결합하고 포함
참고: MyoEC 및 LEC 분획을 수집하고 계산하면 결합할 수 있습니다. 일반적인 MyoEC/LEC 비율은 1:3(그림 3A)19입니다. 다른 연구가 수행 될 수있다. 예를 들어, 모자이크 연구를 수행하기 위해, 분획은 야생 형 (WT) 및 돌연변이 (돌연변이) 마우스에서 생성될 수 있고 결합 (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/음소거; 음소거/WT; 음소거/음소거)21,또는 분획은 MyoECs/LECs19의서로 다른 비율을 사용하여 결합될 수 있다.
- 셀 수에 따라 12,000개의 셀/웰(예: 3,000 MyoECs:9,000 LEC)에 대해 준비해야 하는 웰(8개의 웰 챔버, 재료 표참조)의 수를 계산합니다.
- 50% ECM(페놀 적색이 없는 50% ECM/50% DMEM/F12)의 90 μL을 추가하여 Table of Materials3D 배양에 대한 기본 층을 확립합니다. 거품이 없고 우물이 고르게 코팅되었는지 확인하십시오. 염기층을 고형화하기 위해 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 배양합니다.
참고 : ECM은이 단계까지 얼음 추위를 유지해야합니다, 그렇지 않으면 조기에 중합하고 고르지 않은 기본 코팅 및 중합으로 이어질 것입니다. 기본 ECM을 사용하면 단일 평면에서 오르가노이드 성장이 향상되어 이미지 캡처에 도움이 됩니다. 이것은 또한 더 빠른 오르가노이드 성장을 얻고 더 적은 ECM22를이용합니다. - 중합 하는 동안, 셀 믹스를 준비 합니다. 300 x g에서 5분 동안 MyoEC 및 LEC 분획을 펠렛하고 각 세포 분획을 10% ECM/90% 성장 배지에서 다시 일시 중단하여 각 웰이 100 μL을 가지도록 합니다(성장 배지를 만드는 방법에 대한 표 1 참조).
참고: 준비의 용이성을 위해 동일한 셀 믹스를 사용하여 우물을 복제하십시오. 이들은 하나의 튜브에서 결합및 제조될 수 있다(예를 들어, 동일한 세포 혼합물의 4개의 웰이 10% ECM/90% 성장 배지의 400 μL에서 제조될 수 있다). - 각 세포 혼합물의 100 μL을 각 우물에 10% ECM/90% 성장 배지에 넣고 오르가노이드가 37°C, 5%CO2에서20분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
- 세포가 정착되면, 각 우물의 챔버 벽을 부드럽게 피펫팅하여 성장 매체의 100 μL을 부드럽게 추가하십시오. 슬라이드를 37°C, 5%CO2에서 배양합니다(각 웰의 총 조성에 대한 도 3A 참조).
참고: 로키나제 억제제, R-spondin 및 Nrg1은 1차 뮤린 유방 세포 및 인간 유방암 세포 둘 다에서 성장한 오르가노이드의 장기 배양에 중요한 것으로 확인된 인자이다13,,14. 또한, 줄기세포 인자 B27 및 N2는 오르가노이드가 배양될 수 있는 시간을 연장한다. - 이미지 세포는 24시간마다 그들의 성장을 추적하고 100 μL/well을 사용하여 2-3일마다 성장 배지를 부드럽게 갱신한다(그림3B-E).
참고: 매체를 갱신할 때는 각별한 주의를 기울이세요. 챔버 슬라이드를 기울여 우물의 한 쪽 구석에 있는 매체를 수집합니다. 배지의 ≤100 μL을 제거하고 ECM 층을 방해받지 않도록 주의하여 보충하십시오. - 연구자들이 수유/알베올로제네시스 조사에 관심이 있다면, 5일째에 알베올로제네시스 배지(표 1참조)로 전환하고 10일(도3F)또는 그 이후에도 매 2-3일마다 배지를 계속 갱신한다(자료표 참조)13.Figure 3 Table of Materials
참고: 이 시점에서, 오르가노이드는 4°C 회수 용액의 400 μL에서 4°C에서 4°C로 배양함으로써 ECM으로부터 분리될 수 있다(프로토콜 및 시약 정보에 대한 재료 표 참조).
5. 5일 차 또는 10일: 고정 및 면역 염색 오르가노이드
- 매체를 부드럽게 파이펫팅하여 매체를 조심스럽게 제거하십시오 (전구 파이펫이 가장 잘 작동합니다). 1x 덜베코의 인산완충 식염수 200 μL을 사용하여 각 잘 헹구세요 (DPBS, 레시피 참조).
- 실온에서 10 분 동안 감기 (4 °C) 4 % (w / v) 파라 포름 알데히드 (PFA, 조리법 참조)를 사용하여 오르가노이드를 고정하십시오.
주의: PFA는 위험합니다. 개인 보호 장비(실험실 코트, 장갑 및 안전 안경)를 착용하십시오. 이 단계는 연기 후드 내부에서 수행해야합니다.
참고: ECM은 PFA 처리에 의해 용해됩니다. 불완전한 ECM 제거는 오르가노이드가 면역 형광에 의해 분석될 때 배경 염색으로 이끌어 낼 수 있습니다. - 4% PFA를 제거하고 글리신/DPBS 0.2%(v)의 200 μL을 Table 1각각 잘 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 또는 4°C로 밤새 인큐베이션하여 느린 설정으로 설정된 흔들 표면에서.
참고: 오르가노이드는 다음 단계 이전에 4°C에서 DPBS에서 1-3일 동안 보관할 수 있다. - DPBS + 0.25% 트리톤 X-100 (PBST, 표 1참조)을 사용하여 실온에서 10 분 동안 오르가노이드를 투과화.
- 흔들리는 표면에 1 시간 동안 DPBS에서 5 % 당나귀 혈청 (DS) (또는 이차 항체의 종과 일치하는 다른 혈청)을 사용하여 오르가노이드를 차단합니다.
참고: 이 단계는 흔들 표면에서 4°C에서 하룻밤 동안 수행될 수 있다. - 1% DS/DPBS에 1차 항체를 준비합니다. 각 우물에 125-200 μL을 사용하십시오. 흔들 표면에서 4°C에서 1차 항체에서 하룻밤 동안 오르가노이드를 배양하여 면역 염색을 수행합니다.
6. 11일: 완전한 면역형광
- 200 μL PBST로 2X를 5분 동안 세척하십시오. 1% DS/DPBS에 이차 항체를 각 웰당 125-200 μL을 사용하여 추가하십시오. 45 분 동안 흔들 표면에 실온에서 배양.
- 웰 당 200 μL PBST를 사용하여 각 우물 2X를 세척하십시오.
- DPBS에서 Hoechst DNA 염료를 사용하여 핵을 염색하십시오 (DPBS에서 1:2,000)를 실온에서 5 분 동안.
- 진공으로 부드럽게 흡입하여 우물에 남은 모든 액체를 제거합니다.
- 조심스럽게 챔버와 개스킷을 제거하고, 장착 매체 (재료 표참조)의 한 방울 (~30 μL)을 각 우물에 놓고 뚜껑슬립을 제거하고 거품을 제거하십시오. 슬라이드가 어두운 공간에서 1-2일 동안 건조되도록 합니다. 클리어 매니큐어로 밀봉합니다. 공초점 현미경상에서 오르가노이드를 이미지화하였다(그림3E-F).
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Representative Results
여기에 제시된 프로토콜은 모자이크 오르가노이드를 이용하여 유방 상피 세포의 특정 혈통 기여를 조사하는 방법을 설명합니다. 오르가노이드에 대한 1 차적인 뮤린 세포를 얻으려면 유방 선 상피가 먼저 주변 지방세포 풍부 기질로부터 분리되어야합니다(그림 1). 이 과정은 여기에 간략하게 설명되며 또한 이전에 발표된 연구18에기재되어 있다. 충분한 세포를 얻으려면 #2, 3, 4 및 5 MG를 제거하는 것이 좋습니다(그림 1A). 상피 세포의 순수한 집단을 분리하는 중요한 단계 열쇠는 준비를 오염시킬 면역 세포가 풍부한 #4 MGs에서 림프절의 제거입니다(그림 1A,B). MGs를 다진 후 크기 ~0.1 mm 크기의 조각을 생성하였다(도1B). 조직 단편은 그 때 효소적으로 소화되고, 콜라게나아제의 존재에서 일어나는 과정, 기질에서 에피테리아를 풀어 내고, 트립신의 부재에서, 세포 세포 접촉을 유지하는 카데린과 같은 단백질의 소화를 방지하기 위하여. 소화된 조직을 원심분리하여 지질을 제거하고 세포 스트레이너를 통해 여과하고세척하였다(도 1C). 스트레이너에 고수하는 상피 단편은 필터를 반전시키고 멤브레인을 세척하여 방출하였고, 이는 상피 단편을 폴리스티렌 접시상에 옮겼다(도1D). 이러한 조각은 작고 분지된 구조로나타났습니다(그림 1E).
정제된 상피 단편을 24시간 동안 배양하였다. 그들은 접시에 정착하고 부착, 내부 LEC를 둘러싸고 MyoECs의 외부 층과 평면, 팬케이크 같은 구조를 형성(그림 2A-B). 도 2C는 야생형 동물로부터 팬케이크와 같은 구조의 가장자리를 나타낸다. 트립신 치료는 먼저 분리된 MyoECs를 차별화하여 남은 입방체 LECs의 코어를 둘러싸는 밝고 둥근 세포로나타났습니다(그림 2C,F). MyoECs의 분리는 밝은 필드 현미경 검사법을 사용하여 주의 깊게 감시되고 3-6 분 안에 일어났습니다. MEC가 수집된 후, LEC는 7-15분의 두 번째, 더 긴 트립신 치료를 통해 분리되었다. 세포 분리에 필요한 시간은 트립신 농도와 신선도에 따라 다릅니다. 두 세포 구획의 전체 순도는 ~90%였으며, KRT14 양성 및 E-Cadherin(CDH1)-LEC 분획에서 KRT14-음성 및 E-카데린 양성이었던 세포에서 KRT14 양성 및 E-Cadherin 양성세포에서19로계산하였다.Figure 2D-E 우리는 MyoECs의 일부가 팬케이크 와 같은 구조의 상단뿐만 아니라 바깥 쪽 가장자리에서 제거된 것을 발견했습니다. 이는 유도성, 형광기저 마커(Cytokeratin 14(KRT14)-CreERT1로 표지된 마우스로부터 수집된 조직 단편을 이용하여 관찰하였다; R26RYFP/+) 및 75 mg/kg 타목시펜을 5일 전에 주입하였다. 그림 2F에서, G 팬케이크 구조의 가장자리 주위에서 MyoECs의 분리는 쉽게 명백하다. 이것은 트립신 치료의 처음 2 분 이내에 발생했습니다(그림 2F). 또한, YFP-KRT14 양성 세포를 구조 의 상부에서 관찰하였고, 여기서 그들은 트립신 처리 후 반올림하고 헹구기/수집단계(도 2G)에의해 제거되었다. YFP-KRT14 양성 세포를 거의 또는 전혀 함유하지 않은 LECs(그림2H)의표지되지 않은 코어는,(도 2I)이후 트립신 처리의 두 번째 라운드에서 분리되었다.
MyoEC 및 LEC 분획을 수집, 결합, 50% ECM 염기 위에 도금된 10% ECM에 내장하였다. 이것은 염기 층을 따라 주로 성장한 오르가노이드의 더 나은 광학 분해를 허용하였다(그림3A). 24시간 후, 세포는 주로 루멘이 부족한 응집된 구조로 조립하였다(도3B). 48시간 후, 중앙 루멘으로 형성된 초기 오르가노이드는 비어 있고 더 가벼운 내부 공간으로나타났다(도 3C). 10 일 후, 오르가노이드는 잘 발달 된 루멘을 가진 크고 분지 된 구조였습니다. ACTb-EGFP 마우스로부터 수확된 야생형 마우스 및 LECs로부터 수확된 MyoIc로부터 생성된 모자이크 오르가노이드는 기저 마커 알파-평활근 액틴(SMA)에 대한 항체로 면역염색하고, 핵을 나타내기 위해 Hoechst DNA 얼룩으로 염색하였다. 그림에서 상단 뷰와 단면 뷰는 Z 스택으로 수집되어 3D 뷰로 재구성된 다양한 이미지 세트를 보여준다(그림3D). 상단 뷰는 오르가노이드의 분기형태(그림 3E')를나타낸 형태를 드러낸다. 단면도는 이들 오르가노이드의 이중층 상피 구조 및 개방 루멘을나타낸다(도 3E'). 이들 오르가노이드는 또한 알베올로제네시스 배지를 사용하여 5일째에 분화될 수 있고 추가로 5일 동안 배양될 수있다(도 3F). 오르가노이드는 더 커졌고, 가지가 더 많았으며, 우유가 들어 있었다. 상기와 같이 분화된 오르가노이드를 생성하고 우유 마커, 유청산성 단백질에 대해 지시된 항체로 면역염색하였다(WAP, 도 3F). WAP는 우유에 분비되는 수용성 단백질입니다. 이 액체의 대부분은 세포가 고정되고 그(것)들에서 면역얼룩될 때 분실되었습니다. 따라서, 상부 및 단면도에서, WAP 염색은 세포 분비 세포에서 세포 내 및 세포 외로 고착 동안 세포 표면에 갇혀 있는 우유에서 세포 내적으로 볼 수있다(그림 3F),단면도에서 작은 오르가노이드가 액체 우유를 함유하는 것으로 보이지만(그림3F'boxed overlay).Figure 3
그림 1: 유방 조각 격리. (A)마우스의 5개의 MGs의 라벨이 부착되어 있으며, 라벨이 부착되지 않은, 반대로 페어링된 MGs.(B)마우스 MG의 이미지와 #4 MG 박스와 확대하여 제거를 위한 림프절을 식별하는 방법을 보여준다. (C)6개의 잘 낮은 접착판에 잘 박하된 MGs의 이미지와 눈금자를 통해 티슈 조각의 크기를 나타내는 (~0.1 mm 각). (D-E) 프로토콜 을 설명하는 회로도 2.7-2.9. (D)MG 단편을 70 μm 스트레이너를 통해 여과하고 4배 헹구었다. (e)스트레이너를 60 mm 폴리스티렌 조직 배양 접시위에 반전시키고 파편을 접시에 풀어 놓았다. (F)기질이 없는 60 mm 접시에 수집된 여과된 조직 단편을 보여주는 이미지. 화살표는 70 μm 스트레이너에 수집되는 가장 작은 조각을 가리킵니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 차동 시도. (A)폴리스티렌 접시에 부착 된 조직 조각을 보여주는 브라이트 필드 이미지, 팬케이크 와 같은 구조를 형성. (B-C) 제1 차동 트립시네화 단계는 MyoECs를D위한 Cytokeratin 14 (KRT14) 세포 마커를 사용하여 MyoECs (아래) 및 LECs(상단)의 3분 후 밝고 둥근 세포로 선명하게 보이는 MyoECs를 분리하고, LeCs용 E-Cadherin(CDH1) 세포 마커를 사용하였다. (e)KRT14 및 CDH1의 발현은 차분화된 트립시네화된 세포 분획의 수율 및 순도를 정량화하는 데 사용되었다. (F-I)를 입력합니다. 대표적인 상-콘트라틴 14(KRT14)-CreERT1로부터의 조직 단편의 대표적인 상 대비 및 형광(YFP) 이미지; R26RYFP/+ Mg. 마우스는 수확 5일 전에 75 mg/kg 타목시펜을 주입하였다. (F)초기 트립신-EDTA(0.05%) 동안 MyoECs(화살표) 분리 배양 후 2 분. (G)라벨이 없는 LEC의 팬케이크 위에 KRT14-YFP-MyoECs(화살표)를 뿌립니다. (H)초기 트립시네이드 및 MyoEC 분리 후 LEC의 브라이트필드 이미지. (I)MyoEC 분리 후, KRT14-YFP-MyoEc은 YFP 발현이 없는 것과 같이 더 이상 보이지 않는다. 스케일 바 = 30 μm (A, 브라이트 필드) 100 μm (F, 브라이트 필드), 50 μm (G, 형광), 100 μm (H,I). 이 그림의 패널 A-E는 Macias 등에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 3차원 오르가노이드 배양. (a)10% ECM/90% 성장 배지에 내장된 단일 세포의 개략적 표현은 50% ECM/50% DMEM 염층에서 성장하였다(프로토콜 단계 4.5). (B-C) 24시간(B)및 48시간(C)에서 MyoECs 및 LECs를 차별화하고 재결합하여 생성된 유방 유기노이드의 신속한 자기 조직화 용량을 보여주는 일러스트레이션 및 위상 대비 이미지.C 디지털 광시야현미경(D)을사용하여 수집된 이미지는 면역 염색된 오르가노이드를 나타내기 위해 E-F에 사용되는 상단(왼쪽) 또는 섹션(오른쪽) 뷰를 예시하는 회로도 표현이다. (e)성장 배지에서 5-10일 동안 성장한 유방 오가노이드를 함유하는 8개의 웰 챔버 슬라이드의 단일 웰의 개략적 표현. (E'-E") 상단보기(E') 및 단면뷰(E")성장의 10 일째에 면역 염색 된 오르가노이드. MyoECs는 가성 색 마젠타에 부드러운 액틴 근육 (SMA)로 표시됩니다. LEC는 ACTb-EGFP 마우스로부터 이며 가짜 색 녹색으로 표시됩니다. 핵은 Hoechst 염료로 염색되었습니다. (F)성장 배지에서 5일 및 알베올로제네시스 배지에서 5일 동안 성장한 유방 유기체를 함유하는 8개의 웰 챔버 슬라이드의 단일 웰의 개략적 표현. (F'-F"). 상단보기(F') 및 단면뷰(F)의면역 염색 된 오르가노이드의 성장 10 일째. MyoECs에는 표시되지 않습니다. ACTb-EGFP 마우스로부터의 LEC는 가성색 녹색으로 나타내고 있다. 우유 단백질, 유청 산성 단백질 (WAP)은 LECs에서 가짜 색상 노란색으로 표시되고 오르가노이드의 루멘 내부를 코팅합니다. 핵은 Hoechst 염료로 염색되었습니다. 방적 디스크 공초점 현미경을 사용하여 수집된 이미지 및Imaris(E', E')또는 하단 섹션 ~30슬라이스(F',F")를사용하여 3D로 재구성하였다. 배율 막대 = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 10 mL | 소화 매체 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 9.45 mL | DMEM/F12 | |
| 100 μL | 항생제 항균제 (100X) | |
| 0.04 g | 클래스 3 콜라게나아제 | |
| 0.04 g | 클래스 2 디스파스 | |
| 50 μL | 겐타미신 | 최종 농도: 500 μg |
| 2.5 mL | 태아 소 세럼 | 최종 농도: 5% (v/v) |
| 0.22μm 필터 통과 | ||
| 50 mL | 유지 보수 매체 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 49.47 mL | DMEM/F12 | |
| 0.5 mL | 항생제 항균제 (100X) | |
| 2.5 mL | 태아 소 세럼 | 최종 농도: 5% (v/v) |
| 25 μL | 인슐린 | 최종 농도: 250 μg |
| 5 μL | Egf | 최종 농도: 500 ng |
| 10 mL | 성장 매체 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, 페놀 레드 없음 | |
| 100 μL | N-2 보충제 (100x) | |
| 200 μL | 비타민 A가 없는 B27 보충제 (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 | 재고 : 100μg / mL |
| 42.5 μL | R-스폰딘 | 재고: 10 μg/mL |
| 1 μL | 로 억제제 Y-27632 | 재고: 10 μM |
| 1 μL | Egf | 재고: 0.1 μg/μL |
| 10 mL | 알베올로제네시스 미디엄 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, 페놀 레드 없음 | |
| 100 μL | N-2 보충제 (100x) | |
| 200 μL | 비타민 A가 없는 B27 보충제 (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 | 재고 : 100μg / mL |
| 42.5 μL | R-스폰딘 | 재고: 10 μg/mL |
| 1 μL | 로 억제제 Y-27632 | 재고: 10 μM |
| 5 μL | 오빈 뇌하수체 프롤락틴 | 최종 농도: 1 μg/mL |
| 1 μL | 덱사메타손 | 최종 농도: 5 μg/mL |
| 5 μL | 인슐린 | 최종 농도: 5 μg/mL |
| 1L | 10X DPBS | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 80g | Nacl | |
| 2 g | KCl | |
| 14.4 g | NaH2PO4 | |
| 2.4 g | KH2PO4 | |
| 1L | 디 H2O | |
| 마른 시약을 추가하기 전에 800 mL로 채우고 용해하십시오. 채우기 볼륨을 1L. pH를 7.4로 조정합니다. 소독할 오토클레이브. | ||
| 1L | 1X DPBS | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 900 mL | 디 H2O | |
| 1L | PBST | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 2.5 mL | 트리톤 X-100 | |
| 250 mL | 4% 파라포름알데히드 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 10g | 파라포름알데히드 | |
| 200 mL | 디 H20 | 물은 60 °C에 있어야합니다 |
| 25 mL | 10X DPBS | |
| 50 μL | 10 N 수산화나트륨 | |
| 0.45 μm 필터를 통과하여 멸균하고 pH가 7.4임을 보장합니다. | ||
| 10 mL | 1 % 당나귀 세럼 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 100 μL | 멸균 여과 된 당나귀 세럼 | |
| 9.9 mL | 1X DPBS | |
| 10 mL | 0.2% 글리신 | |
| 금액 | 시약 | 노트 |
| 0.02 g | 글리신 | |
| 10 mL | 1X DPBS | |
표 1: 솔루션 레시피.
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Discussion
여기에서, 연구원은 1 차적인 MG 세포를 사용하여 3D organoid 문화를 생성할 수 있는 방법을 상세히 제시됩니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 차이점은 두 개의 별개의 MG 세포 구획인 외부 기저 MyoECs 및 내부 LEC를 분리하는 방법을 자세히 설명한다는 것입니다. 우리의 방법은 2 단계 트립신 EDTA (0.05 %)를 채택 우리가 차등 트립시니화 라고 하는 치료19. 이 절차는 연구원이 정교한 유동 세포 측정을 사용하지 않고 MyoECs 및 LEC를 분리할 수 있게 해주며, 따라서 FACS에 필요한 잘 특성화된 바이오마커가 없을 수 있는 다양한 포유류 종에서 수확된 MGs를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 두 세포 하위 집단을 분리하는 능력은 연구원이 유전으로 분리된 세포를 독립적으로 수정하거나 유전 돌연변이 또는 라벨을 품고 있는 동물에게서 세포를 재결합하고, 따라서 3D 문화에서 모자이크 오르가노이드를 생성하는 것을 가능하게 합니다. 현재 프로토콜의 한계는 기질 구획이 배양 조건에 포함되지 않는다는 것입니다. 그러나, 새로운 방법은 생체 ECM23,,,24,,25,26,및 이들 방법에서 더 잘 재봉화하기 위해 1차 세포 또는 세포주로부터 생성된 오르가노이드와 의기질 성분을 동배하기 위해 개발되고 있으며, 이들 방법은 이 프로토콜에 적용될 수 있다. 또한, 이 프로토콜은 MyoEC 및 LEC 분획(~90% 정제)의 큰 농축을 달성하지만, 분수는 순수한 세포 계보를 나타내지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
이 프로토콜의 성공은 여러 가지 주요 단계에 의존합니다. 첫째, MG 조직을 부드럽게 소화하는 것이 중요합니다. 조직의 과다 소화는 세포 사멸과 상피 세포의 낮은 회복으로 이어질 것입니다. 불완전한 소화는 기질 및 지방 세포 오염을 초래할 것이고, 이는 나중에 분석 (예를 들면, 면역 형광, 단백질 분석 및 mRNA 측정)를 방해할 것입니다. 둘째, 프로토콜 2.8단계에서 오염세포를 제거하기 위해 MG 조직을 철저히 헹구는 것이 중요하다. 프로토콜 단계 2.9에서, MG 조직 단편은 60 mm 접시로 방출된다. 연구원은 접시에 부착하기 전에 즉시 방출 된 조각을 모니터링해야합니다. 지방 방울 또는 단일 세포가 관찰되는 경우 프로토콜 단계 2.6 및 2.8-2.11을 반복해야합니다. 이를 위해, 배지 및 조직 단편을 접시에서 수집하고, 새로운 70 μm 스트레이너에 넣고, 37 °C DMEM/F12로 4X를 세척한 다음 새로운 60 mm 접시로 방출한다. 셋째, 첫 트립신-EDTA(0.05%)를 보는 것이 필수적입니다. MyoECs는 처음 3 분 이내에 분리 할 수 있기 때문에 밀접하게 배양하지만 최대 6 분 동안 부착 할 수 있습니다. 트립신-EDTA (0.05%)가 있는 경우가 있었습니다. 최적이 아니었고, MyoECs의 성공적인 정제로 10 분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 그러나,>10 트립시네이션의 분 MyoECs와 LEC의 동시 수집 결과. 또한 첫 번째 배양 중에 접시가 방해받지 않는 상태로 유지하는 것도 중요합니다. 그렇지 않으면 LEC를 가진 MyoEC 분획의 오염이 발생할 수 있습니다. 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. MyoECs가 접시에서 완전히 분리되지 않으면 LEC 분획을 오염시것입니다. 연구원이 MyoECs 또는 LECs를 독점적으로 표지하는 리포터 마우스를 사용하는 경우 형광 현미경으로 분리를 시각화하는 것이 더 쉽습니다(그림2F-I). 마지막으로, 연구원이 면역 형광 분석을 위한 오르가노이드 를 고정할 계획이라면, 4% PFA의 pH(7.4) 및 온도(4°C)는 ECM의 성공적인 해리를 위해 중요하다. 오르가노이드가 다른 분석(예: 단백질 및 mRNA 측정)을 위해 수집되는 경우, 회복 용액이 4°C에 있어야 합니다. ECM이 용해되지 않는 경우, 회수 용액을 가진 배양은 10 분 연장 될 수있다 (즉, 30 분 총 배양). 그러나, 더 긴 잠복기는 3D 구조물 및 세포 죽음의 손실로 이끌어 낼 것입니다. 복구 프로토콜(재료 표에나열됨)은 넓은 보어 팁의 사용을 지정합니다. 이것은 세포의 무결성뿐만 아니라 오르가노이드의 3D 구조를 유지하는 데 중요합니다.
이러한 네 가지 주요 단계 외에도 프로토콜의 성공에 영향을 주는 두 가지 요소가 있습니다. 첫째, 오르가노이드 성장은 세포 증식을 감소시키고 따라서 ECM에 있는 organoid 성장을 감소시키는 유전 돌연변이에 의해 제한될 수 있습니다. 소수의 오르가노이드만 얻을 경우, 후속 고정 단계는 종종 손실을 초래합니다. 이 문제를 해결하려면 MyoECs:LECs(프로토콜 단계 4.1-4.2)의 비율을 유지하면서 ECM 내에 내장된 셀 수를 늘려야 합니다. 둘째, 일단 세포가 ECM으로 옮겨지면 매일 그들의 성장을 지켜보고 미디어 갱신에 대해 경계하는 것이 중요합니다 (매 2-3 일). 이 프로토콜은 더 나은 시각화를 위해 페놀 적색 자유 시약을 지정하지만 페놀 적색 양성 시약을 사용하여 동일한 성공과 성장을 달성합니다. 고정(프로토콜 단계 4.6)에 앞서 배지 갱신이 발생하는 날은 세포 손실을 줄이기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야 합니다. 10% ECM 상단 층은 섬세합니다. 따라서 기계적 장애를 최소화하기 위해 챔버 벽 아래로 유체를 파이펫팅하여 세안또는 중간 재생을 수행해야합니다.
유기체를 우유 생산 아시니로 분화하려면 하이드로 코르티손 또는 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴과 같은 분화 보충제로 치료가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 덱사메타손을 권장합니다. 또한, 프롤락틴은 시판되는 동안, 이 프로토콜에 사용된 프롤락틴은 국립 호르몬 및 펩티드 프로그램에서 얻어졌다. 다시 말하지만, Alveologenesis 배지를 변경할 때 오르가노이드를 방해받지 않고 두는 것이 매우 중요합니다. 차별화에는 최소 5일이 필요합니다. 이것은 또 다른 3-5 일을 연장 할 수 있지만, ECM의 염기 층은 10-12 일 후에 저하된다. 차별화된 오르가노이드는 우유로 채워지고 루멘은 더 어둡게 보입니다.
이것은 유방 상피 형태 형성 및 분화에 구획 특정, 계보 기여를 해결하기 위하여 이용될 수 있는 능률적인 기술입니다. 이 기술을 통해 연구원은 다른 유전 돌연변이를 품고 있는 마우스에게서 얻어진 MyoECs 및 LECs21,또는 MyoECs 및 LECs를 분분하게 조작한 포함하는 모자이크 오르가노이드를 생성할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 계보 특이적 세포 구획이 장기 형태 형성과 우유 생산과 같은 특수 기능의 획득에 대한 기여를 더 잘 이해할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 캘리포니아 대학에서 기술 지원 및 핵심 지원을 벤 아브람스 감사합니다, 산타 크루즈 (UCSC) 줄기 세포의 생물학 연구소 (IBSC). 우리는 그들의 솔라미어 회전 디스크 공초점 현미경의 사용에 대한 수잔 스트롬과 빌 색스턴 감사합니다. 이 작품은 고등 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 UCSC에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (S.R.), NIH에서 (NIH GM058903) 학생 개발을 극대화하기위한 이니셔티브에 대한 (H.M.) 대학원 연구 펠로우십 (O.C. DGE 1339067)과 UC-암 연구 조정위원회 (LH)의 보조금 (A18-0370)에 의해 국립 과학 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
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