Summary
Мэммарийская железа представляет собой двухслойную структуру, состоящую из внешних миоэпителиальных и внутренних светящихся эпителиальных клеток. Представлен протокол для подготовки органоидов с использованием дифференциальной трипсинизации. Этот эффективный метод позволяет исследователям отдельно манипулировать этими двумя типами клеток, чтобы исследовать вопросы, касающиеся их роли в форме и функции молочной железы.
Abstract
Органоиды предлагают самоорганизующиеся, трехмерные структуры тканей, которые повторяют физиологические процессы в удобстве блюда. Мюринная молочная железа состоит из двух различных эпителиальных клеточных отсеков, обслуживающих различные функции: внешний, сократительный миоэпителиальный отсек и внутренний, секреторный светящийся отсек. Здесь мы описываем метод, с помощью которого клетки, составляющие эти отсеки, изолированы, а затем объединены для исследования их индивидуального вклада в родословную для морфогенеза молочной железы и дифференциации. Метод прост и эффективен и не требует сложных технологий разделения, таких как флуоресценция активированной сортировки клеток. Вместо этого, мы урожай и ферментативно переварить ткани, семена эпителия на приверженных тканях культуры блюда, а затем использовать дифференциальной трипсинизации отделить миоэпителия от светящихся клеток с й90% чистоты. Клетки затем покрываются ввнеклеточной матрицы, где они организуются в двухслойные, трехмерные (3D) органоиды, которые могут быть дифференцированы для производства молока после 10 дней в культуре. Чтобы проверить влияние генетических мутаций, клетки могут быть собраны из диких типов или генетически модифицированных моделей мыши, или они могут быть генетически манипулировать до 3D культуры. Этот метод может быть использован для генерации мозаичных органоидов, которые позволяют исследования функции генов именно в светящейся или миоэпителиальной отсеке.
Introduction
Мэммарийская железа (MG) представляет собой дерево-как, трубчатая эпителиальная структура встроенных в адипоцит богатых стромы. Двухслойный протоковый эпителий включает в себя внешний, базальный слой сократительных, миоэпителиальных клеток (MyoECs) и внутренний слой светящихся, секреторных эпителиальных клеток (LECs), опоясывая центральный просвет1. Во время лактации, когда внешние MyoECs контракт выжать молоко из внутренних альвеолярных LECs, MG претерпевает многочисленные изменения, которые находятся под контролем факторов роста (например, EGF и FGF) и гормоны (например, прогестерон, инсулин и пролактин). Эти изменения вызывают дифференциацию специализированных структур, альвеолы, которые синтезируют и выделяют молоко во время лактации1. Мэммарий эпителия может быть экспериментально манипулировать с помощью методов, в которых либо эпителиальной ткани фрагменты, клетки, или даже одной базальной клетки пересаживаются в принимающей молочной жировых прокладок, предочищенные эндогенной молочной паренхии, и позволили вырасти, чтобы восстановить весь, функциональный эпителиевдерево дерево2,3,,5.5 Трансплантация является мощным методом, но это отнимает много времени и невозможно, если мутация приводит к ранней эмбриональной летальности (до E14), что предотвращает спасение трансплантации молочной анлечы. Кроме того, исследователи часто хотят исследовать роль двух различных отсеков, которые являются производными от линии ограниченных клеток-прародителей. В то время как технология Cre-lox позволяет дифференциальные генетические манипуляции MyoECs и LECs, это также трудоемкое и дорогостоящее предприятие. Таким образом, с 1950-х годов, исследователи использовали в пробирке молочных органоидов в качестве относительно простого и эффективного способа решения вопросов, касающихся структуры ткани молочной железы и функции6,7.
В ранних протоколах, описывающих изоляцию и культуру первичных эпителиальных клеток молочной железы, исследователи обнаружили, что мембранная матрица подвала (BME), состоящая из плазменного сгустка и экстракта куриного эмбриона, была необходима для фрагментов MG, выращенных на блюде6. В последующие десятилетия, внеклеточные матрицы (ECMs, коллаген, и желеобразная белковая матрица, выделяемая клетками саркомы Engelbreth-Holm-Swarm) были разработаны для облегчения 3D-культуры и лучше имитировать среду vivo7,8,9,10. Культивирование клеток в 3D-матрицах выявлено по нескольким критериям (морфология, экспрессия генов и гормональной реакции), что такая микросреда лучше моделиирует в виво физиологических процессов9,10,11,12. Исследования с использованием первичных муринных клеток определили ключевые факторы роста и морфогены, необходимые для длительного обслуживания и дифференциации органоидов13. Эти исследования задали основу для протокола, представленного здесь, и для культуры клеток молочной железы человека, как 3D органоидов, который в настоящее время современный клинический инструмент, позволяющий для обнаружения наркотиков и тестирования на наркотики на пациента образцов14. В целом, органоидный культивирование подчеркивает возможности самоорганизации первичных клеток и их вклад в морфогенез и дифференциацию.
Представлено здесь протокол к культуре мурин эпителии, которые могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини. Дифференциальная методика трипсинизации используется для изоляции MyoECs и LECs, которые состоят из двух различных отсеков ячейки MG. Эти разделенные фракции клетки можно провести генетические манипуляции, чтобы переэкспрессировать или нокдаун генной функции. Потому что родословная-внутренняя, самоорганизация является врожденным свойством молочных эпителиальных клеток15,,16,,17, рекомбинация этих клеточных фракций позволяет исследователям генерировать двуслойные, мозаичные органоиды. Начинаем с ферментативного переваривания жировой ткани, а затем инкубации фрагментов молочной ткани на блюдо культуры тканей на 24 ч(рисунок 1). Фрагменты ткани оседают на полистироловых посудах в виде двухслойных фрагментов с их организацией in vivo: внешний миоэпителиальный слой, окружающий внутренние светящиеся слои. Эта клеточная организация позволяет изоляции внешних MyoECs трипсин-EDTA (0.05%) лечение 3-6 мин с последующим вторым раундом трипсина-ЭДТА (0.05%) лечение, которое отсоединяет оставшиеся внутренние LECs(Рисунок 2). Таким образом, эти типы клеток с различной чувствительностью трипсина изолированы и впоследствии могут быть смешаны и покрыты eCM(рисунок 3). Клетки подвергаются самоорганизации для формирования двухслойных сфер, включающих внешний слой MyoECs, окружающих внутренние LECs. Образование люмен происходит, как клетки растут в среде, содержащей коктейль факторов роста (см. рецепты для роста Medium)13. После 5 дней, органоиды могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини, переключившись на Alveologenesis Medium (см. рецепты и рисунок 3F) и инкубируется еще на 5 дней. Кроме того, органоиды будут продолжать расширяться и ветвиться в рост средних, по крайней мере 10 дней. Органоиды могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции(рисунок 3D-F) или освобождены от ECM с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)и проанализированы с помощью других методов (например, иммуноблот, RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Санта-Крус.
1. День 1: Пищеварение молочной железы
- Приготовьтесь собирать MGs от зрелых самок мышей 10-14 недель возраста.
- Выполните уборку на открытой скамейке в асептических условиях.
- Стерилизовать все хирургические принадлежности, пробковые доски и булавки путем автоклавирования и замачивания в 70% алкоголя в течение 20 минут до операции.
- Анестезия животных с пентобарбиталом натрия (2X анестезирующей дозы 0,06 мг/г массы тела) доставлены через интраперитонеальной инъекции с 0,5 мл инсулина шприца.
- Мониторинг уровня анестезии, щипать пятки животного, чтобы проверить на рефлекторный ответ и начать протокол только после того, как животное полностью анестезируется.
- Поместите животное на спину, прикрепите его придатки к пробковой доске, и протрите его живот и грудь с этанолом.
- Чтобы собрать #2, 3, 4 и 5 MGs от одной мыши (т.е., 8 MGs, Рисунок 1A), определить средней линии между двумя задними ногами и сделать небольшой разрез (1 см) на брюшной коже с острыми ножницами, а затем продлить разрез до шеи18.
- Последующие путем принятия небольших сокращений боковой к ногам и рукам, чтобы обеспечить освобождение кожи с помощью ватного тампона. Вытяните кожу прочь и растянуть его плотно, прежде чем прикрепить его вниз на одной стороне (Рисунок 1B, шаг 1)18. Удалите MGs, разрезая под ними, и удалить лимфатические узлы из #4 желез(Рисунок 1B, шаги 2, 3)18. Повторите процедуру на другой стороне тела.
- Соберите ткани MG в 50 мл 4 КС Dulbecco в модифицированных Eagle's Media (DMEM) / Питательные смеси F12 (F12) дополнены 5% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1X антибиотик-антимикотических (Анти-Анти)18.
- Нарезать железы в 35 мм блюдо или на керамической пластине с помощью лезвия бритвы или ткани измельчитель. Поверните пластину каждые пять ручных отбивных или каждый раунд на измельчитель ткани, пока ткани части могут поместиться через 1 мл микропайпет апогея с легкостью (0,1 мм / фрагмент, Рисунок 1C).
- Digest MGs в пищеварение medium (см. Таблица 1) для 14 ч в 6 хорошо низкой адгезии блюдо на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
2. День 2: Изоляция фрагментов эпителиальной ткани молочной железы
- После 14 ч пищеварения, аккуратно перемешать путем pipetting переваренной ткани 10X с помощью 1 мл микропайпетта, чтобы сломать все оставшиеся стромы или жировой ткани, гарантируя, что ни пузырьки, ни избыток механической силы генерируются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть неполное пищеварение после 14 ч, это может быть связано с накоплением сколы ДНК. В этом случае добавьте 1 кл/ 1 мг/мл дезоксирибонулеI I (DNase I) на 2 мл пищеварения Medium. Инкубировать еще 30 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. - Соберите ткани в трубке 15 мл и промыть хорошо используется для пищеварения с 2-3 мл ткани культуры класса 1X Dulbecco в фосфат буферный солин (DPBS) без Ca2 "и Mg2 ". Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
- Эвакуируйте супернатант, содержащий липидный слой и средний, а затем приостановите гранулы в 5 мл DPBS и переключитесь на новую трубку 15 мл. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
- Во время центрифугации поместите 70 мкм нейлоновой сетки в трубку 50 мл и prewet ситечко с помощью 10 мл 37 КС DMEM/F12.
- Resuspend фрагменты ткани из протокола шаг 2.4 с помощью 5 мл DPBS и пройти подвески через prewet 70 мкм нейлоновой клетки ситечко для удаления стромальных клеток и одиночных клеток (Рисунок 1D).
- Соберите фрагменты ткани на клеточном ситечко. Промыть 4X с 10 мл 37 КК DMEM/F12(рисунок 1D).
ВНИМАНИЕ: Неполное промывка приведет к культуре, загрязненной неэпителиальными клетками. - Отпустите фрагменты ткани, удерживая ситечко с перчатками пальцами, инвертируя ситечко над 60 мм ткани культуры блюдо и прохождения 1 мл aliquots обслуживания среднего (см. Таблица 1) через дно ситечко 4X (Рисунок 1E).
- Проверьте ситечко на наличие остатков фрагмента ткани, которые будут видны невооруженным глазом, и промойте ситечко 1X больше с 1 мл обслуживания среднего, если какие-либо фрагменты все еще придерживаются ситечко. Фрагменты промытых тканей теперь должны быть свободны от стромальных клеток.
- Быстро изучить 60 мм блюдо, содержащее фрагменты MG из протокола шаг 2.9 под перевернутым микроскопом (4X или 10X цель, Рисунок 1F). Типичная подготовка восьми MGs дает 500 фрагментов. Ищите одиночные клетки или капли жира и есть ли загрязняющие клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть загрязняющие клетки, повторите этап фильтрации, собрав среду и фрагменты из 60-мм тарелки с помощью пипетки 5 мл и фильтруя фрагмент снова через свежий 70 мкм ситечко, повторяя протокол шаги 2.6, 2.8-2.10. - Инкубировать 24 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,что позволяет фрагменту ткани придерживаться и генерировать двуслойные фрагменты(рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фрагменты не поселились на 24 ч, продолжайте инкубировать до тех пор, пока не будут соблюдены. Если фрагменты не прилипают хорошо, разделение клеточных отсеков не будет работать. Если исследователи обеспокоены слипа, пластины культуры тканей можно лечить для содействия фрагмента крепления (например, поли-L-лизин).
3. День 3: Дифференциальная трипсизационизация миоэпителиальных и светящихся эпителиальных клеток
- Чтобы отделить MyoECs от LECs, опорожнить средства массовой информации от блюда, промыть 1x с 1 мл DPBS и добавить 1 мл свежего трипсина-EDTA (0,05%), и тщательно контролировать пищеварение под перевернутым микроскопом (10X или 20X цель, Рисунок 2B, C , F). Отслоение внешнего слоя MyoEC потребует 3-6 мин, в зависимости от трипсина-EDTA (0.05%) Силы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите рисунок 2 для репрезентативных изображений, показывающих этот процесс. Под яркой подсветкой поля, MyoECs появляются округлые и имеют более яркий вид по сравнению с LECs, которые остаются придерживаться в центре и появляются темнее. - Соберите фракцию MyoEC в трубке 15 мл, содержащей 2 мл 10% FBS/DPBS. Не нарушая LECs, аккуратно промыть 60 мм блюдо с 2 мл DPBS, а затем распоряжаться DPBS(Рисунок 2H-I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычное восстановление для MyoECs находится в пределах (3,5 х 106-1,5 х 106)в зависимости от размера MGs. - Чтобы удалить фракцию LEC, добавьте 1 мл трипсина-EDTA (0.05%) к блюду снова и инкубировать 7-15 мин, тщательно контролируя, чтобы предотвратить переварение желудка. Утолить трипсин-EDTA (0.05%) на блюдо с 2 мл 10% FBS/DPBS. Соберите фракцию LEC в новой трубке 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычное восстановление для LECs находится в пределах (2 х 10-4,2х 106) в зависимости от размера MGs. Обычно, чистота обеих фракций, как анализ иммуногистохимии составляет 90%19 (Рисунок 2E). - Центрифуга каждой фракции в течение 5 мин при 300 х г, чтобы удалить трипсин-EDTA (0,05%). Приостановите действие гранул ы в 250 л среднего обслуживания и подсчитайте каждую популяцию клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Поместите клетки на лед во время подсчета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если генетическая манипуляция клеточных фракций желательно, первичные клетки могут быть выращены на низких стыковых блюд и инфицированы лентивирусом20.
4. День 3: Объединение и встраивание клеточных фракций во внеклеточной матрице
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как фракции MyoEC и LEC были собраны и подсчитаны, они могут быть объединены. Типичное соотношение MyoEC/LEC составляет 1:3(Рисунок 3А)19. Различные исследования могут быть выполнены. Например, для проведения мозаичных исследований фракции могут образовываться из диких мышей типа (WT) и мутантов (Mut) и комбинированных (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, или фракции могут быть объединены с помощью различных соотношений MyoECs / LECs19.
- На основе количества клеток, рассчитать количество скважин (8 хорошо камеры, см. Таблица материалов), которые должны быть подготовлены для 12000 ячеек / хорошо (например, 3000 MyoECs:9,000 LECs).
- Установите базовый слой для 3D-культуры, добавив 90 кЛ 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, без фенола красного - см. Таблицу Материалов) к каждому колодцу. Убедитесь, что нет пузырьков и скважины покрыты равномерно. Чтобы укрепить базовый слой, инкубировать слайды при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECM должен оставаться ледяной до этого шага, в противном случае он будет полимеризации преждевременно и привести к неравномерному базовому покрытию и полимеризации. Использование базы ECM повышает рост органоидов в одной плоскости, которая помогает захвату изображения. Это также получает более быстрый рост органоидов и использует меньше ECM22. - Во время полимеризации подготовьте клеточные смеси. Пеллет MyoEC и LEC фракций на 300 х г в течение 5 минут и повторной каждой фракции ячейки в 10% ECM/90% Рост Средний так что каждая скважина имеет 100 КЛ (см. Таблица 1 о том, как сделать рост средний).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства приготовления, реплицировать скважины с помощью тех же клеточных смесей. Они могут быть объединены и подготовлены в одной трубке (например, четыре скважины одной и той же клеточной смеси могут быть подготовлены в 400 л 10% ECM/90% Рост Средний). - Добавьте 100 qL каждой смеси клетки в 10% ECM/90% Средний рост к каждому наилучшим образом и позволяют органоиды установить для 20 min на 37 C, 5% CO2.
- После того, как клетки поселились, аккуратно добавьте 100 злителк Среднего роста, аккуратно понижая на камерную стенку каждого колодца. Инкубировать слайды при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 (см. рисунок 3А для общего состава каждой скважины).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор Rho Kinase, R-спондин, и Nrg1 являются факторами, которые были определены как важные для долгосрочной культуры органоидов, выращенных из первичных клеток мюрина молочных и клеток рака молочной железы человека13,14. Кроме того, факторы стволовых клеток B27 и N2 продлевают время культивации органоидов. - Ячейки изображения каждые 24 ч, чтобы отслеживать их рост и осторожно обновлять средний рост каждые 2-3 дня, используя 100 Л/хорошо(рисунок 3B-E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте крайнюю осторожность при обновлении среды. Наклоните камеры слайды для сбора среды в одном углу скважин. Удалите 100 евро средней и пополнить с осторожностью, чтобы оставить слой ECM спокойно. - Если исследователи заинтересованы в исследовании лактации / альвеологезеза, переключиться на Alveologenesis Medium (см. Таблица 1) на 5 день и продолжать обновлять среду каждые 2-3 дней до дня 10 (Рисунок 3F) или за его путем прохождения с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)13.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент органоиды могут быть изолированы от ECM путем инкубации при 4 градусах Цельсия в 400 кв. м 4-c решения для восстановления (см. Таблица материалов для протокола и информации о реагентах).
5. День 5 или 10: Фиксация и иммуно-пятновающих органоидов
- Удалите среду тщательно, аккуратно pipetting от средств массовой информации (лампочка пипетка работает лучше всего). Промыть каждый хорошо с помощью 200 Л 1x Dulbecco в фосфатбуферных солине (DPBS, см. рецепты).
- Исправьте органоиды с помощью холодных (4 кв.кв.) 4% (w/v) параформальдегида (PFA, см. рецепты) в течение 10 минут при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: PFA является опасным. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторное пальто, перчатки и защитные очки). Этот шаг должен быть выполнен внутри дыма капот.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECM растворяется в лечении PFA. Неполное удаление ECM может привести к фоновому окрашиванию, когда органоиды анализируются с помощью иммунофлуоресценции. - Удалите 4% PFA и добавьте 200 qL 0,2% (w/v) глицин /DPBS (см. таблицу 1) к каждому хорошо. Инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 30 минут или 4 градусов по Цельсию на ночь на скалодроме, установленном в медленной обстановке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут храниться в течение 1-3 дней в DPBS при 4 градусах Цельсия до следующего шага. - Пермяки органоидов с помощью DPBS 0,25% Тритон X-100 (PBST, см. Таблица 1) в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Блок органоидов с помощью 5% осла сыворотки (DS) (или других сыворотки, соответствующие видов вторичного антитела) в DPBS в течение 1 ч на качалке поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в одночасье при 4 градусах По Цельсия на поверхности качания. - Подготовка первичных антител в 1% DS / DPBS. Используйте 125-200 л для каждой скважины. Выполните иммуностогирование путем инкубации органоидов в первичных антител ночь на 4 градусов по Цельсию на качалке поверхности.
6. День 11: Полная иммунофлуоресценция
- Вымойте каждый колодец 2X с 200 Л PBST в течение 5 мин. Добавить вторичные антитела в 1% DS /DPBS с использованием 125-200 Л для каждой скважины. Инкубировать при комнатной температуре на раскачивной поверхности в течение 45 минут.
- Вымойте каждый колодец 2X, используя 200 Л L PBST на скважину.
- Пятно ядра с помощью Hoechst ДНК красителя в DPBS (1:2,000 в DPBS) в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Удалите всю жидкость, оставить на колодце, аккуратно всасывая вакуумом.
- Тщательно удалите камеры и прокладку, поместите одну каплю (30 евро) монтажных носителей (см. Таблицу Материалов)на каждую скважину и крышку, заботясь, чтобы удалить пузыри. Дайте слайду высохнуть в темном пространстве в течение 1-2 дней. Печать с прозрачным лаком для ногтей. Изображение органоидов на конфокальный микроскоп(Рисунок 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол описывает метод исследования конкретных родов молочной эпителиальных клеток с использованием мозаичных органоидов. Для получения первичных клеток морин для органоидов, эпителий молочной железы должны быть сначала изолированы от окружающих адипоцитов богатый стромы (Рисунок 1). Этот процесс кратко описан здесь, а также описан в ранее опубликованном исследовании18. Чтобы получить достаточное количество клеток, рекомендуется удалить #2, 3, 4 и 5 MGs(рисунок 1A). Важным шагом для изоляции чистой популяции эпителиальных клеток является удаление лимфатических узлов из #4 MGs, которые богаты иммунными клетками, которые будут загрязнять препарат (Рисунок 1A,B). MGs были фарш для генерации фрагментов 0,1 мм в размерах(рисунок 1B). Фрагменты ткани затем ферментативно усваивается, процесс, происходящий в присутствии коллагеназы, чтобы освободить эпителии от стромы, и в отсутствие трипсина, чтобы предотвратить переваривание белков, таких как cadherins, которые поддерживают контакты клеток. Переваренная ткань затем была центрифугирована для удаления липидов и фильтруется через клеточный ситечко и промывается(рисунок 1C). Эпителиальные фрагменты, придерживающиеся ситечко, были выпущены путем инвертирования фильтра и мытья мембраны, которая перенесла эпителиальные фрагменты на полистирол блюдо(рисунок 1D). Эти фрагменты появились как небольшие, разветвленные структуры(рисунок 1E).
Очищенные эпителиальные фрагменты были инкубированы в течение 24 ч. Они поселились на блюдо и придерживались, образуя плоские, блиноподобные структуры с внешним слоем MyoECs, окружающих внутренние LECs(рисунок 2A-B). На рисунке 2C показан край такой блиноподобной структуры от дикого животного типа. Лечение трипсина дифференимно отделило MyoECs, которые отделились первыми и появились как яркие, округлые клетки, которые окружали ядро оставшихся кубоидальных LECs(Рисунок 2C,F). Отряд МиоЭК тщательно контролировался с помощью яркой микроскопии и происходил в течение 3-6 мин. После того, как MECs были собраны, LECs были впоследствии отделены через второй, более длительный трипсин лечения 7-15 мин. Время, необходимое для отслоения клеток, зависит от концентрации трипсина и свежести. Общая чистота двух клеточных отсеков составила 90%, как и было сказано подсчетом клеток, которые были KRT14-положительными и E-Cadherin (CDH1)-отрицательными в фракции MyoEC и клетках, которые были KRT14-отрицательными и E-Cadherin-положительными в LEC(Рисунок 2D-E)19. Мы обнаружили, что некоторые из MyoECs были удалены из верхней части блин, как структура, а также от внешних краев. Это наблюдалось с помощью фрагментов тканей, собранных у мышей, помеченных индуцированным, флуоресцентным базальным маркером (Цитокератин 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP /) и вводят с 75 мг/кг тамоксифена за 5 дней до сбора урожая. На рисунке 2F, G отряд MyoECs от по краям блин структуры легко очевидно. Это произошло в течение первых 2 минут лечения трипсина(рисунок 2F). Кроме того, YFP-KRT14-положительные клетки наблюдались на верхней части структуры, где они округлены после лечения трипсина и были удалены промыть / этап сбора (Рисунок 2G). Немаркированное ядро LECs(Рисунок 2H),который содержал мало или нет YFP-KRT14-положительных клеток, (Рисунок 2I) впоследствии отделился во втором раунде лечения трипсина.
Фракции MyoEC и LEC были собраны, объединены и встроены в 10% ECM, покрытые 50% eCM базы. Это позволило улучшить оптическое разрешение органоидов, которые росли в основном вдоль базового слоя(рисунок 3А). После 24 ч, клетки собраны в агрегированные структуры, которые в значительной степени не хватало просвета(Рисунок 3B). После 48 ч, зарождающиеся органоиды образуются как центральные люмены выдолбленные и появились как легче внутреннего пространства(Рисунок 3C). Через 10 дней органоиды были большими, разветвленными структурами с хорошо развитыми люменами. Мозаичные органоиды, генерируемые из МиоЭК, собранных у мышей дикого типа, и LECs, собранные у мышей ACTb-EGFP, были зафиксированы на месте, immunostained с антителом против базального маркера альфа-гладкий мышечный актин (SMA), и окрашенные с hoechst ДНК пятно, чтобы показать ядра. На рисунках представления верхней и секции показывают различные наборы изображений, собранных в виде стека и реконструированных в 3D-представление(рисунок 3D). Вид сверху показывает разветвленную морфологию органоидов(рисунок 3E'). Вид раздела показывает двухслойную эпителиальную структуру и открытый просвет этих органоидов(рисунок 3E''). Эти органоиды также могут быть дифференцированы в день 5 с использованием Alveologenesis Medium и инкубируется в течение дополнительных 5 дней(рисунок 3F). Органоиды стали больше, имели больше ветвей и содержали молоко. Дифференцированные органоиды были созданы, как описано выше, и иммуноокрашенные с антителом, направленным против молочного маркера, сывороточного кислотного белка (WAP, Рисунок 3F). WAP - растворимый белок, выделяемый в молоко. Большая часть этой жидкости была потеряна, когда клетки были зафиксированы и immunostained in situ. Таким образом, в верхней и секции мнения, WAP окрашивание видно внутриклеточного в выделении клеток и внеклеточно в молоке, который был пойман в ловушку на поверхности клетки во время фиксации(Рисунок 3F), хотя в обзоре раздела небольшой органоид, как представляется, содержат жидкое молоко (Рисунок 3F'коробочной накладки).
Рисунок 1: Изоляция фрагмента молочной железы. (A) Приклеенные этикетку схема мыши 5 MGs с немаркированными, контралатеральные паре MGs. (B) Изображения мыши MGs с #4 MG коробку и увеличен, чтобы показать, как определить лимфатический узлы для удаления. (C) Изображение нарезанных MGs в 6 хорошо низкой плиты стыковки с линейкой, показывающие размер частей ткани (0,1 мм каждый). (D-E) Схематический иллюстрирующие протокольные шаги 2.7-2.9. (D) ФРАГМЕНТы MG были отфильтрованы через 70 мкм ситечко и промыть 4X. (E) ситечко затем перевернутый более 60 мм полистирола ткани культуры блюдо и фрагменты были выпущены в блюдо. (F) Изображение, показывающее отфильтрованные фрагменты тканей, собранные на 60-мм блюде, которое не имеет стромы. Стрелки указывают на мельчайшие фрагменты, которые собраны на 70 мкм ситечко. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Дифференциальная пробивная. (A)Брайтфилд изображение, показывающее фрагмент ткани придерживается на полистирол блюдо, образуя блин, как структура. (B-C) Первый шаг дифференциальной трипсинизации отделил MyoECs, которые хорошо видны как яркие, округлые клетки после 3 мин. (D) Иммунофлуоресцентные изображения MyoECs (внизу) и LECs (вверху) с помощью цитокератина 14 (KRT14) маркер ательдля для MyoECs, и E-Cadherin (CDH1) маркер ячейки для LECs. (E) Выражение KRT14 и CDH1 было использовано для количественной оценки урожайности и чистоты дифференциально трипсинизированных клеточных фракций. (F-I). Репрезентативное фазово-контрастное и флуоресценция (YFP) изображения фрагментов тканей цитокератина 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP / Я МГ. Мыши были введены с 75 мг/кг тамоксифен 5 дней до сбора урожая. (F) Отсоединение MyoECs (стрелки) во время первоначального трипсина-EDTA (0.05%) 2 мин после инкубации. (G) Опрыскивание KRT14-YFP-MyoECs (стрелки) на вершине блин немаркированных LECs. (H) Брайтфилд изображение LECs после первоначальной трипсиизации и MyoEC отряда. (Я) После отряда MyoEC, KRT14-YFP-MyoECs больше не видны, как показано на отсутствие выражения YFP. Шкала баров 30 мкм (A, яркое поле) 100 мкм (F, яркое поле), 50 мкм (G, флуоресценция), 100 мкм (H,I). Панели A-E этой фигуры изменены от Macias et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Трехмерная органоидная культура. (A) Схематическое представление одиночных ячеек, встроенных в 10% ECM/90% Рост Средний и вырос на 50% ECM/50% DMEM базовый слой (протокол шаг 4.5). (B-C) Иллюстрации и фазово-контрастные изображения, показывающие быструю самоорганизующуюся способность органов молочной железы, генерируемых из дифференциально трипсинизированных и рекомбинированных МиоЭК ов и LECs на 24 ч (B) и 48 ч(C). Изображения, собранные с помощью цифрового широкоугольного микроскопа(D) Схематическое представление, иллюстрирующее верхний (слева) или раздел (справа) мнения, используемые в E-F для отображания иммуноокрашенных органоидов. (E) Схематическое представление одного колодца 8 хорошо камерный слайд, содержащий молочные органоиды, выращенные в течение 5-10 дней в рост средних. (E'-E ") Вид сверху(E') и вид раздела (E)иммуноокрашенных органоидов в день 10 роста. МиоЭК отмечены гладкой мышцы актина (SMA) в псевдоцвет пурпурный. LECs от ACTb-EGFP мышей и показаны в псевдоцвет зеленый цвет. Ядра были окрашены красителями Hoechst. (F) Схематическое представление одного колодца 8 хорошо камерный слайд, содержащий молочные органоиды, выращенные в течение 5 дней в рост средних и 5 дней в Alveologenesis Medium. (F'-F "). Вид сверху(F')и вид раздела (F)иммуноокрашенных органоидов в день 10 роста. MyoECs без опознавательных знаков. LECs от ACTb-EGFP мышей показаны в псевдоцвет зеленый цвет. Молочный белок, сывороточный белок (WAP), показан в псевдоцвете желтого цвета в LECs и покрытие внутри люменов органоидов. Ядра были окрашены красителями Hoechst. Изображения, собранные с помощью вращающегося диска конфокальный микроскоп и реконструированы в 3D с помощью Imaris(E', E') или нижней секции 30 ломтиков(F', F "). Шкала баров - 100 мкм (C), 20 мкм (Е), 40 мкм (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| 10 мл | Пищеварение Средний | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 9,45 мл л. | DMEM/F12 | |
| 100 л | Антибиотик-антимикотик (100X) | |
| 0,04 г | Коллагенеза класса 3 | |
| 0,04 г | Класс 2 Dispase | |
| 50 зл | Гентамицин | Окончательная концентрация: 500 мкг |
| 2,5 мл л. | Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Окончательная концентрация: 5% (v/v) |
| Пройдите через фильтр 0.22 м | ||
| 50 мл | Среднее техническое обслуживание | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 49,47 мл л. | DMEM/F12 | |
| 0,5 мл л. | Антибиотик-антимикотик (100X) | |
| 2,5 мл л. | Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Окончательная концентрация: 5% (v/v) |
| 25 зл. | Инсулина | Окончательная концентрация: 250 мкг |
| 5 зл | EGF | Окончательная концентрация: 500 нг |
| 10 мл | Средний рост | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 9,6455 мл л. | DMEM/F12, без фенола красный | |
| 100 л | N-2 Дополнение (100x) | |
| 200 зл. | Добавка B27 без витамина А (50x) | |
| 10 зл | Nrg1 | Запас: 100 г/мл |
| 42,5 л л | R-спондин | Запас: 10 мкг/мл |
| 1 зл | Роингиор Y-27632 | Запас: 10 мкм |
| 1 зл | EGF | Запас: 0,1 мкг/л |
| 10 мл | Альвеологез Средний | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 9,6355 мл л. | DMEM/F12, без фенола красный | |
| 100 л | N-2 Дополнение (100x) | |
| 200 зл. | Добавка B27 без витамина А (50x) | |
| 10 зл | Nrg1 | Запас: 100 г/мл |
| 42,5 л л | R-спондин | Запас: 10 мкг/мл |
| 1 зл | Роингиор Y-27632 | Запас: 10 мкм |
| 5 зл | Овин Гипуза Пролактин | Окончательная концентрация: 1 мкг/мл |
| 1 зл | Дексаметазон | Окончательная концентрация: 5 мкг/мл |
| 5 зл | Инсулина | Окончательная концентрация: 5 мкг/мл |
| 1 л | 10X DPBS | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 80 г | Nacl | |
| 2 г | Kcl | |
| 14,4 г | NaH2PO4 | |
| 2,4 г | KH2PO4 | |
| 1 л | ди H2O | |
| Заполните до 800 мл, прежде чем добавить сухие реагенты и растворить. Заполните объем до 1 л. Отрегулируйте рН до 7,4. Автоклав для стерилизации. | ||
| 1 л | 1X DPBS | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 100 мл | 10X PBS | |
| 900 мл | ди H2O | |
| 1 л | PBST | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 100 мл | 10X PBS | |
| 2,5 мл л. | Тритон X-100 | |
| 250 мл | 4% Параформальдегид | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 10 г | Параформальдегид | |
| 200 мл | ди H20 | вода должна быть при 60 градусах Цельсия |
| 25 мл | 10X DPBS | |
| 50 зл | 10 N Гидроксид натрия | |
| Пройдите через фильтр 0,45 мкм для стерилизации и обеспечения рН составляет 7,4 | ||
| 10 мл | 1 % Сыворотка осла | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 100 л | Стерильная фильтрованная сыворотка осла | |
| 9,9 мл | 1X DPBS | |
| 10 мл | 0,2% Глицин | |
| Сумма | Реагента | Заметки |
| 0,02 г | Глицин | |
| 10 мл | 1X DPBS | |
Таблица 1: Рецепты решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен метод, в которых подробно описывается, как исследователи могут генерировать 3D органоидные культуры с помощью первичных клеток МГ. Разница между этим и другими протоколами заключается в том, что мы подробно метод, чтобы отделить два, различные отсеки ячейки MG: внешние базальные MyoECs и внутренние LECs. Наш метод использует двухступенчатый трипсин-EDTA (0.05%) лечение, которое мы называем дифференциальной трипсинизации19. Эта процедура позволяет исследователям изолировать MyoECs и LECs без использования изощренной цитометрии потока и таким образом может быть использован для изучения MGs заготовленных от широкого разнообразия mammalian видов которые не могут иметь well-characterized biomarkers необходимые для FACS. Способность сегрегировать две клетки субпопуляции позволяет исследователям генетически модифицировать изолированные клетки самостоятельно или рекомбинировать клетки от животных, укрывающих генетические мутации или этикетки, и таким образом генерировать мозаичные органоиды в 3D-культуре. Ограничением текущего протокола является то, что стромальный отсек не включен в условия культивирования. Тем не менее, новые методы разрабатываются для сокультуры стромальных компонентов с органоидами, генерируемых из первичных клеток или клеточных линий, чтобы лучше резюмировать in vivo ECM23,24,,25,26, и эти методы могут быть адаптированы к этому протоколу. Кроме того, важно отметить, что, хотя этот протокол достигает большого обогащения фракций MyoEC и LEC (90% очистки), фракции не представляют собой чистые клеточные линии.
Успех этого протокола зависит от ряда ключевых шагов. Во-первых, важно мягко, но тщательно переварить ткани MG. Переварение тканей приведет к гибели клеток и снижению восстановления эпителиальных клеток. Неполное пищеварение приведет к загрязнению стромальным и жировой клеткой, что будет мешать более поздним анализам (например, иммунофлуоресценции, анализу белка и измерениям мРНК). Во-вторых, важно тщательно промыть ткань MG, чтобы удалить загрязняющие клетки в протоколе шаг 2.8. В протокольном шаге 2.9 фрагменты ткани MG высвобождаются в тарелку калибра 60 мм. Исследователи должны следить за освобожденными фрагментами немедленно, прежде чем они прилипают к блюду. При наблюдении жировых капель или одиночных клеток необходимо повторить протокольные шаги 2.6 и 2.8-2.11. Для этого из тарелки собираются фрагменты средней и ткани, помещают в новый ситечко размером 70 мкм, промывают 4X с 37 кв. м DMEM/F12, а затем выпускают в новую 60-мм тарелку. В-третьих, важно следить за первой трипсин-ЭДТА (0.05%) инкубации тесно, потому что MyoECs может отделить в течение первых 3 минут, но они также могут придерживаться до 6 мин. Были случаи, когда трипсин-EDTA (0.05%) был неоптимальным, и инкубация продолжалась в течение 10 минут с успешной очисткой МиоЭК. Тем не менее, 10 минут трипсиизации привели к одновременной коллекции MyoECs и LECs. Важно также, чтобы блюдо оставалось нетронутым во время первой инкубации. В противном случае может произойти загрязнение фракции MyoEC с помощью LECs. Обратное также верно; если MyoECs не полностью отделены от блюда, они будут загрязнять фракцию LEC. Если исследователи используют репортер мышей, которые этикетки MyoECs или LECs исключительно, легче визуализировать разделение под флуоресценции микроскопом (Рисунок 2F-I). Наконец, если исследователи планируют фиксации органоидов для иммунофлуоресценции анализов, рН (7,4) и температура (4 кС) 4% ПФА имеет важное значение для успешной диссоциации ECM. Если органоиды собираются для других анализов (например, измерений белка и мРНК), важно, чтобы решение восстановления было при температуре 4 градусов По Цельсию. Если ECM не растворяется, инкубация с помощью решения восстановления может быть продлена на 10 мин (т.е. 30 мин общей инкубации). Однако более длительные инкубационные периоды приведут к потере 3D-структуры и гибели клеток. Протокол восстановления (указанный в таблице материалов)определяет использование широкоствольных советов. Это важно для поддержания 3D-структуры органоидов, а также целостности клеток.
В дополнение к этим четырем ключевым шагам, есть два фактора, которые влияют на успех протокола. Во-первых, рост органоидов может быть ограничен генетическими мутациями, которые уменьшают пролиферацию клеток и, следовательно, снижают рост органоидов в ECM. Если получено всего несколько органоидов, последующий шаг фиксации часто приводит к их потере. Для решения этой проблемы количество ячеек, встроенных в ECM, должно быть увеличено при сохранении соотношения MyoECs:LECs (протокольные шаги 4.1-4.2). Во-вторых, после того, как клетки передаются в ECM, важно ежедневно следить за их ростом и быть бдительными в отношении обновления мультимедиа (каждые 2-3 дня). Этот протокол определяет фенол красные свободные реагенты для лучшей визуализации, но тот же успех и рост достигается с помощью фенола красные положительные реагенты. Дни, когда среднее обновление происходит до фиксации (протокол шаг 4.6) должны быть выполнены с крайней осторожностью, чтобы уменьшить потерю клеток. 10% ECM верхний слой является деликатным; поэтому мойки или среднее обновление должно быть выполнено трубачей жидкости вниз стенки камеры, чтобы свести к минимуму механические нарушения.
Дифференциация органоидов на молочные ацини требует лечения дифференциационными добавками: гидрокортизоном или дексаметазоном, инсулином и пролактином. В этом протоколе рекомендуется дексаметазон. Кроме того, в то время как пролактина является коммерчески доступным, пролактин, используемый в этом протоколе был получен из Национальной программы гормонов и пептида. Опять же, очень важно оставить органоиды нетронутыми при изменении Alveologenesis Medium. Дифференциация требует не менее 5 дней. Это может быть продлено еще на 3-5 дней, но базовый слой ECM деградирует через 10-12 дней. Дифференцированные органоиды заполнены молоком, и их люмены кажутся темнее.
Это эффективный метод, который может быть использован для решения отсека конкретных, родообразующих вкладов в молочной эпителиального морфогенеза и дифференциации. С помощью этого метода, исследователи могут генерировать мозаичные органоиды, состоящие из дифференциально генетически манипулируемых MyoECs и LECs21, или MyoECs и LECs, полученных от мышей укрывательство различных генетических мутаций. Это позволяет исследователям лучше понять вклад линейных клеточных отсеков в морфогенез органов и приобретение специализированных функций, таких как производство молока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Бена Абрамса за техническую помощь и основную поддержку со стороны Калифорнийского университета, Института биологии стволовых клеток (UCSC). Мы благодарим Сьюзан Стром и Билл Сакстон за использование их Solamere спиннинг дискconfocal микроскоп. Эта работа была частично поддержана грантами UCSC от Медицинского института Говарда Хьюза через программу стипендий Джеймса Х. Гиллиама для расширенного обучения (S.R.), от NIH (NIH GM058903) за инициативу по максимизации развития студентов (H.M.) и от Национальный научный фонд для аспирантуры стипендий (O.C. DGE 1339067) и грант (A18-0370) от UC-Cancer Research Координационный комитет (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L.
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
