Summary
乳腺是一种双层结构，包括外层皮和内光上皮细胞。提出是一种使用微分锥形制备器官的协议。这种有效的方法允许研究人员分别操作这两种细胞类型，以探索有关它们在乳腺形式和功能中的作用的问题。
Abstract
有机体提供自组织、三维组织结构，在菜肴的便利性下重述生理过程。母鼠乳腺由两个不同的上皮细胞隔间组成，具有不同的功能：外层、收缩性近垂体质隔间和内层分泌的发光室。在这里，我们描述了一种方法，其中组成这些隔间的细胞被分离，然后结合，以调查其个体系对乳腺形态和分化的贡献。该方法简单高效，不需要复杂的分离技术，如荧光活性细胞分拣。相反，我们收获和酶消化组织，在粘附组织培养皿上播种上皮，然后用微分试湿法将肌皮与纯度为90%的发光细胞分离。细胞然后镀在细胞外基质中，它们组织成双层三维（3D）器官，在培养10天后可以分化以生产牛奶。为了测试基因突变的影响，可以从野生类型或基因工程小鼠模型中采集细胞，也可以在3D培养之前对其进行基因操纵。该技术可用于生成马赛克器官，允许特别在亮度或骨髓间研究基因功能。
Introduction
乳腺（MG）是一种树状的管状上皮结构，嵌入于一个多头细胞丰富的血管。双层导管上皮包括外层、基底层收缩层、体外皮细胞（MyoECs）和一层发光、分泌上皮细胞（LECs），环绕着中央流明1。在哺乳期间，当外部MyoECs收缩从内性醇的牛奶，MG经历许多变化，在生长因子（如，EGF和FGF）和激素（如孕酮，胰岛素和蛋白酶）的控制下。这些变化导致特殊结构，alveoli的分化，在哺乳期合成和分泌牛奶1。乳房上皮可以实验性地操纵使用技术，其中上皮组织片段，细胞，甚至单个基底细胞移植到宿主乳腺脂肪垫，预清除内源性乳腺皮瘤，并允许生长出来，以重建一个完整的，功能上皮树2,2，3，4，5。3,4,5移植是一种强大的技术，但如果突变导致早期胚胎杀伤力（在E14之前）阻止拯救可移植的乳腺，则耗时且不可能。此外，研究人员经常希望研究两个不同隔间的作用，它们来自受血统限制的后代细胞。虽然Cre-lox技术允许对MyoEC和LECs进行微分基因操作，但这也是一项耗时且昂贵的工作。因此，自20世纪50年代以来，研究者一直使用体外乳腺器官作为一种相对容易和有效的方法来解决有关乳腺组织和功能66，77的问题。
在描述原发性乳腺上皮细胞的分离和培养的早期协议中，研究人员发现，在6号菜上生长的MG片段需要一个基底膜基质（BME），由血浆血栓和鸡胚胎提取物组成。在接下来的几十年里，开发了恩格尔布雷斯-霍尔姆-斯温-斯温鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质（ECMs、胶原蛋白和果冻状蛋白基质），以促进3D培养，更好地模拟体内环境77、8、9、10。8,9,10培养细胞在3D矩阵中揭示的多种标准（形态、基因表达和激素反应能力），这种微环境更好的模型在体内生理过程99，10，11，12。10,11,12使用原鼠细胞的研究确定了器官的扩展维持和分化所需的关键生长因子和形态原13。这些研究为这里介绍的协议以及人类乳腺细胞作为3D器官的培养设定了舞台，这是现代的临床工具，允许在患者样本上发现药物和进行药物检测。总体而言，器官培养突出了原细胞的自我组织能力及其对形态生成和分化的贡献。
这里介绍的是培养鼠上皮的规程，可以分化成产奶的阿基尼。差分试导技术用于分离构成两个不同的MG细胞舱的MyoE和LE。然后，这些分离的细胞分数可以遗传操纵，以过度表达或击倒基因功能。由于系系内在，自组织是乳腺上皮细胞15、16、17,17的先15,天属性，重新组合这些细胞分数使研究人员能够生成双层的马赛克器官。我们首先酶消化脂肪组织，然后在组织培养皿上孵育乳腺碎片24小时（图1）。组织碎片在聚苯乙烯盘上沉降成双层碎片，其体内组织：内层周围外层皮层。此细胞组织允许通过胰蛋白酶-EDTA （0.05%） 隔离外部 MyoECs治疗3-6分钟，然后进行第二轮胰蛋白酶-EDTA（0.05%）分离其余内部 LEC 的处理（图 2）。因此，这些具有不同胰蛋白酶灵敏度的细胞类型被分离，并随后在ECM中混合和镀层（图3）。细胞通过自我组织形成双层球体，包括围绕内部LECs的MyoECs的外层。流门的形成发生在细胞生长在含有生长因子的混合物的媒介中（见生长中型的食谱）13。5天后，通过切换到Alveolo成因介质（见食谱和图3F），再孵育5天，可以分化成产奶的阿基尼。或者，器官将继续扩展，并在生长媒介中分支至少10天。可以使用免疫荧光（图3D-F）分析有机体，或使用恢复溶液（参见材料表）从ECM中释放，并通过其他方法（例如，免疫布洛、RT-qPCR）进行分析。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得加州大学圣克鲁斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 第1天：乳腺消化
- 准备从成熟雌性小鼠10-14周的年龄中收获MG。
- 在无菌条件下在开放式长凳上进行收获。
- 在手术前20分钟内，通过高压灭菌和浸泡70%酒精，对所有手术用品、软木板和针脚进行消毒。
- 用五巴比妥钠（2X麻醉剂量为0.06mg/g体重）对动物进行麻醉，通过腹内注射，使用0.5 mL胰岛素注射器。
- 通过捏住动物的脚趾来监测麻醉水平，以检查反射反应，并在动物完全麻醉后启动治疗方案。
- 将动物放在背上，将附属物固定在软木板上，并用乙醇擦拭其腹部和胸部。
- 为了从一只老鼠身上收获#2、3、4和5个MG（即8个MG，图1A），确定两条后腿之间的中线，用锋利的剪刀在腹部皮肤上做一个小切口（1厘米），然后将切口延伸到颈部18。
- 接下来，横向向腿部和手臂进行小切口，以便使用棉签释放皮肤。把皮肤拉开，紧紧拉伸，然后把它固定在一侧（图1B，步骤1）18。18通过切割去除MG，然后从#4腺体上取下淋巴结（图1B，步骤2，步骤2，步骤3）18。在身体的另一侧重复该过程。
- 收集MG组织在50 mL的4°CDulbecco的改良鹰的介质（DMEM）/营养混合物F12（F12）补充5%胎儿牛血清（FBS）和1X抗生素抗霉素（抗抗）18。
- 使用剃刀刀片或组织切碎器将腺体切碎 35 mm 的盘子或陶瓷板上。每五根手动切碎或组织切碎器上每轮旋转一次板，直到组织片子可以轻松通过 1 mL 微移液笔尖（±0.1 毫米/片段，图 1C）。
- 在37°C，5%CO2的6口低粘附盘中消化消化介质中的MG（见表1），14小时。
2. 第2天：乳腺上皮组织片段的分离
- 消化14小时后，使用1 mL微移液器移液消化的组织10倍，轻轻混合，分解任何剩余的支马或脂肪组织，确保不产生气泡或多余的机械力。
注：如果14小时后消化不完整，这可能是由于皮肤DNA的积累。在这种情况下，每2 mL消化介质中加入1μL1mg/mL脱氧核糖核酸I（DNase I）。在37°C，5%CO2孵育30分钟。2 - 在15 mL管中收集组织，用2-3 mL的组织培养等级1X Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）免费卡2+和Mg2+冲洗用于消化的井。在 600 x g下离心 10 分钟。
- 排空含有脂质层和介质的上清液，然后在5mLDPBS中重新悬浮颗粒，并切换到新的15 mL管。在 600 x g下离心 10 分钟。
- 在离心期间，将一个70μm尼龙细胞滤网放在50 mL管中，并使用10 mL的37°C DMEM/F12预湿滤网。
- 使用 5 mL DPBS 重新悬挂协议步骤 2.4 中的组织片段，并通过预湿 70 μm 尼龙细胞滤网通过悬浮液，去除基质细胞和单个细胞（图 1D）。
- 收集细胞滤网上的组织碎片。用 10 mL 的 37 °C DMEM/F12（图 1D）冲洗 4X。
注意：不完全的皮毛会导致被非上皮细胞污染的培养物。 - 通过用戴手套的手指握住滤网标签，将滤网倒置在 60 mm 的组织培养盘中，并通过滤网底部的 1 mL 等号（见表 1），通过滤网底部 4X（图 1Figure 1E），释放组织碎片。
- 检查滤网是否有组织碎片残留物（肉眼可见），如果任何碎片仍附着在滤网上，则使用 1 mL 的维护介质冲洗滤网 1 倍。冲洗的组织片段现在应该没有基质细胞。
- 在倒置显微镜（4X 或 10X 目标，图 1F）下快速检查包含协议步骤 2.9 中的 MG 片段的 60 mm 盘。8个MG的典型制备会产生+500个片段。寻找单个细胞或脂肪滴，以及是否存在污染细胞。
注：如果存在污染细胞，请重复过滤步骤，使用 5 mL 移液器从 60 mm 盘中收集介质和片段，然后通过新鲜的 70 μm 滤网再次过滤片段，重复协议步骤 2.6、2.8-2.10。 - 在37°C下孵育24小时，CO25%，使组织片段粘附并生成双层片段（图2A）。
注：如果碎片在24小时前尚未沉降，继续孵育，直到粘附。如果碎片粘附良好，细胞室的分离将不起作用。如果研究人员担心粘附，组织培养板可以治疗以促进片段附着（例如，聚L-莱辛）。
3. 第3天：肌皮和光上皮细胞的微分尝试
- 要将 MyoEC 与 LEC 分离，请从盘中清空介质，用 1 mL DPBS 冲洗 1x，并加入 1 mL 的新鲜胰蛋白酶-EDTA （0.05%），并在倒置显微镜下仔细监测消化（10 倍或 20 倍目标，图 2B、C、F）。外MyoEC层的分离将需要3-6分钟，具体取决于胰蛋白酶-EDTA （0.05%）强度。
注： 有关显示此过程的代表性图像，请参阅图 2。在明亮场照明下，MyoEC 看起来圆润，与保持在中心且看起来更暗的 LEC 相比，其外观更明亮。 - 在含有 2 mL 10% FBS/DPBS 的 15 mL 管中收集 MyoEC 分数。在不干扰LEC的情况下，用2 mL DPBS轻轻冲洗60毫米的盘子，然后处理DPBS（图2H-I）。
注： MyoEC 的通常恢复范围 （3.5 x 106-1.5 x 106）， 具体取决于 MG 的大小。 - 要删除 LEC 分数，请添加 1 mL 的胰蛋白酶 EDTA （0.05%）再次到菜和孵育7-15分钟，仔细监测，以防止消化过度。绞线-EDTA （0.05%）在 2 mL 的 10% FBS/DPBS 的菜上。在新的 15 mL 管中收集 LEC 分数。
注：LEC的通常恢复是在一个范围内（2 x 106-4.2 x 106），具体取决于MG的大小。 通常，免疫组织化学所测定的两个分数的纯度是±90%19（19图2E）。 - 在 300 x g下将每个分数离心 5 分钟，以去除胰蛋白酶-EDTA （0.05%）。在250μL的维持介质中重新悬浮颗粒，并使用造血仪或自动细胞计数器计算每个细胞群。计数时将单元格放在冰上。
注：如果需要对细胞分数进行基因操作，原细胞可以在低粘附性培养皿上生长，并感染扁病毒20。
4. 第3天：在细胞外基质中结合和嵌入细胞分数
注：一旦收集并计数 MyoEC 和 LEC 分数，就可以组合它们。典型的MyoEC/LEC比率为1：3（图3A）19。19可以进行不同的研究。例如，为了进行马赛克研究，可以从野生类型 （WT） 和突变 （Mut） 小鼠生成分数并组合（MyoEC/LEC：WT/WT;WT/Mut;羊肉/WT;穆特/穆特）21，或分数可以组合使用不同的比例的MyoECs/LECs19。
- 根据细胞计数，计算需要为 12，000 个细胞/孔（例如 3，000 个 MyoECs：9，000 LECs）准备的孔数（8 个井室，参见材料表）。
- 通过在每个油井中添加 90 μL 50% ECM（50% ECM/50% DMEM/F12，不含苯酚红色 - 参见材料表），建立 3D 培养基层。确保没有气泡，井的涂层均匀。要固化基层，在 37 °C、5% CO2孵育 30 分钟。
注：ECM 需要保持冰冷，直到此步骤，否则它会过早聚合，并导致不均匀的基础涂层和聚合。使用基础 ECM 可增强单个平面中的器官生长，从而有助于图像捕获。这也获得更快的器官生长和使用较少的ECM22。 - 在聚合过程中，准备细胞混合物。在 300 x g下将 MyoEC 和 LEC 分数在 5 分钟内重悬浮每个细胞分数，并在 10% ECM/90% 生长介质中重新悬浮每个细胞分数，因此每个孔具有 100 μL（有关如何制造生长介质，请参阅表 1）。
注：为了便于制备，使用相同的细胞混合体复制井。这些可以组合和制备在一个管中（例如，相同的细胞混合物的四口井可以在400μL的10%ECM/90%生长介质中制备）。 - 在每个孔中加入100 μL的每个细胞混合物，在10%ECM/90%生长介质中加入，让器官在37°C、5%CO2下沉淀202分钟。
- 细胞液位后，通过轻轻移液到每个井的腔壁上，轻轻加入100μL的生长介质。在 37 °C、5% CO2孵育幻灯片（有关每个井的总组成，参见图 3A）。
注：Rho Kinase抑制剂、R-spondin和Nrg1是被确定为对从原发性母细胞和人类乳腺癌细胞13、14,14生长的器官的长期培养中的重要因素。此外，干细胞因子B27和N2延长了组织器官培养的时间。 - 图像细胞每24小时跟踪其生长，并使用100 μL/well每2-3天轻轻更新生长介质（图3B-E）。
注：更新介质时，要格外小心。倾斜造型室滑轨以收集井的一角的介质。去除介质 ±100 μL，并小心补充，使 ECM 层不受干扰。 - 如果研究人员有兴趣研究哺乳/性发育，请在第5天切换到阿尔韦洛形成中（见表1），并每2-3天继续更新介质，直到第10天（图3F）或以后使用恢复溶液（见材料表）13。
注：此时，在4°C恢复溶液的400μL下孵育4°C，可以分离出器官与ECM（有关协议和试剂信息的材料表）。
5. 第5天或第10天：修复和免疫染色器官
- 通过轻轻移液介质（灯泡移液器效果最佳），小心地去除介质。使用 200 μL 的 1x Dulbecco 的磷酸缓冲盐水冲洗每个井（DPBS，见食谱）。
- 在室温下，使用冷（4°C）4%（w/v）甲醛（PFA，见食谱）固定10分钟。
注意：PFA 是危险的。佩戴个人防护装备（实验室外套、手套和安全眼镜）。此步骤应在烟雾罩内执行。
注：ECM 通过 PFA 处理溶解。通过免疫荧光分析器官时，不完全的 ECM 去除可能导致背景染色。 - 取出 4% 的 PFA，在每个井中加入 200 μL 0.2%（v）甘氨酸/DPBS（见表 1）。在室温下孵育幻灯片 30 分钟或 4 °C，在设置为慢速的岩石表面过夜。
注：在下一步之前，在4°C下，风琴可以在DPBS中储存1-3天。 - 在室温下，使用 DPBS 对器官进行渗透 = 0.25% Triton X-100（PBST，参见表 1），10分钟。
- 在DPBS中使用5%的驴血清（DS）（或其他与次生抗体的物种匹配）的血清在摇摆表面上块1小时。
注：此步骤可在 4°C 下在摇摆表面上过夜。 - 在 1% DS/DPBS 中制备主要抗体。每口井均使用125-200μL。通过在摇摆表面上在4°C下通宵孵育原抗体，进行免疫染色。
6. 第11天：完全免疫荧光
- 用200μL PBST清洗每口井2X5分钟。每口井使用125-200μL在1%DS/DPBS中加入二次抗体。在岩石表面的室温下孵育45分钟。
- 每口井使用200μL PBST清洗每口井2倍。
- 在室温下，使用DPBS中的Hoechst DNA染料（DPBS中的1：2，000）染色核5分钟。
- 用真空轻轻吸气，去除井上遗留的所有液体。
- 小心地拆下腔室和垫片，在每个井上放置一滴（±30 μL）的安装介质（参见材料表）和盖玻片，注意去除气泡。让幻灯片在黑暗的空间干燥 1-2 天。用透明指甲油密封。在共聚焦显微镜上成像器官（图3E-F）。
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Representative Results
此处介绍的协议描述了一种利用马赛克器官研究乳腺上皮细胞特定系系贡献的方法。为了获得器官的原鼠细胞，必须首先从周围多球菌丰富的半胱分离（图1）。这个过程在这里被简要地描述，并在先前发表的研究18中也进行了描述。要获得足够的单元格，建议删除#2、3、4 和 5 个 MG（图 1A）。分离上皮细胞的纯种群的一个重要步骤关键是从#4MG中去除淋巴结，后者富含会污染制剂的免疫细胞（图1A，B）。对 MM 进行切碎以生成 ±0.1 mm 大小的碎片（图 1B）。然后，组织片段被酶消化，这个过程发生在胶原蛋白酶的存在，释放上皮脂从频闪，并在没有胰蛋白酶，以防止消化蛋白质，如基那林，维持细胞接触。然后，消化的组织被离心，以去除脂质，并通过细胞过滤器过滤和洗涤（图1C）。附着在滤网上的上皮碎片通过反转过滤器和清洗膜被释放，将上皮碎片转移到聚苯乙烯盘中（图1D）。这些碎片以小而分枝的结构形式出现（图1E）。
纯化的上皮碎片孵育了24小时。他们安顿在盘子上，粘附着，形成扁平的煎饼状结构，外层有MyoECs环绕着内部LEC（图2A-B）。图 2C显示了来自野生动物的这种类似煎饼的结构的边缘。胰蛋白酶治疗差异分离MyoECs，它首先分离，并出现作为明亮，圆润细胞包围剩余的多方细胞核核心（图2C，F）。MyoECs的分离使用明场显微镜进行了仔细监测，并在3-6分钟内发生。收集MEC后，LEC随后通过7-15分钟的第二次、更长的胰蛋白酶治疗分离。细胞分离所需的时间取决于胰蛋白酶的浓度和新鲜度。两个细胞室的整体纯度为+90%，如计算在MyoEC分数中KRT14阳性和E-Cadherin（CDH1）阴性的细胞和在LEC分数中KRT14阴性和E-Cadherin阳性的细胞（图2D-E）19。19我们发现，一些MyoECs是从煎饼状结构的顶部以及外边缘移除的。这是通过使用从标记出的可诱导荧基底标记（细胞角蛋白14（KRT14）-CreERT1）标记的小鼠身上收集的组织片段来观察到的;R26RYFP/+），在收获前5天注射75毫克/千克他莫西芬。在图2F中，G从煎饼结构边缘分离的MyoEC很容易显现出来。这发生在胰蛋白酶治疗的前2分钟内（图2F）。此外，在结构顶部观察到YFP-KRT14阳性细胞，在胰蛋白酶治疗后四舍五入，并通过冲洗/收集步骤去除（图2G）。LEC的无标签核心（图2H），其中含有很少或没有YFP-KRT14阳性细胞，（图2I）随后在第二轮胰蛋白酶治疗中分离。
MyoEC 和 LEC 分数被收集、组合并嵌入到镀到 50% ECM 底座上的 10% ECM 中。这允许主要沿着基层生长的器官的光学分辨率更高（图3A）。24小时后，细胞组装成聚合结构，基本上缺乏流明（图3B）。48小时后，新生的器官形成为中央流明空心，并出现作为一个较轻的内部空间（图3C）。10天后，器官是大型的、分枝的结构，具有发达的流明。从野生型小鼠和从ACTb-EGFP小鼠身上采集的LECs产生的马赛克风琴被固定在原位，免疫上沾有抗体，对抗基底标记α-平滑肌肉作用素（SMA），并沾染了Hoechst DNA染色物，以显示核。在图中，顶部视图和剖面视图显示作为 Z 堆栈收集并重建为 3D 视图的不同图像集（图 3D）。顶部视图揭示了器官的分支形态（图 3E'）。截面视图显示这些器官的双层上皮结构和开放流明（图 3E'）。这些器官也可以在第5天使用阿尔韦洛菌形成中分化，并孵育额外的5天（图3F）。有机体变大，枝条多，含牛奶。如上所述，分化的有机体产生，免疫染色的抗体针对牛奶标记物，乳清酸性蛋白（WAP，图3F）。WAP是一种溶性蛋白质，分泌到牛奶中。当细胞被固定并原位免疫染色时，大部分液体丢失。因此，在顶部和截面视图中，WAP 染色在分泌细胞中可见，在固定过程中被困在细胞表面的牛奶中细胞外可见（图 3F），尽管在剖面视图中，一个小有机体似乎含有液态奶（图3F'盒装叠加）。
图1：乳腺碎片隔离。（A） 标有鼠标 5 MG 的标签原理图，带有未标记的、反向配对的 MG.（B） 鼠标 MG 图像，#4 MG 盒装和放大，以显示如何识别淋巴节点进行移除。B（C） 在 6 孔低粘附板上切碎的 MG 图像，带有一把标尺，显示组织碎片的大小（每个尺寸±0.1 毫米）。（D-E）示意图说明协议步骤 2.7-2.9。（D） MG 片段通过 70 μm 滤网过滤并冲洗 4X。（E） 过滤器然后倒置在 60 毫米聚苯乙烯组织培养盘上，碎片被释放到盘中。（F） 图像显示在 60 毫米盘上收集的过滤组织碎片，这些盘没有斯特龙。箭头指向在 70 μm 滤网上收集的最小片段。比例尺 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图2：差分尝试。（A） 明亮场图像显示一个组织碎片粘在聚苯乙烯盘上，形成类似煎饼的结构。（B-C）第一个差分试导步骤分离MyoECs，在3分钟（D）免疫荧光图像后，使用细胞角蛋白14（KRT14）细胞标记为MyoECs，E-Cadherin （CDH1）细胞标记为LECs，可以清楚地看到。（E） KRT14 和 CDH1 的表达用于量化微分试胰蛋白酶细胞分数的屈服和纯度。（F-I）。细胞角蛋白14（KRT14）-克雷特1组织片段的代表性相对比和荧光（YFP）图像;R26RYFP/+ MG.小鼠在收获前5天注射了75毫克/千克他莫西芬。（F） 在初始胰蛋白酶-EDTA （0.05%） 期间分离肌酶（箭头）孵育后2分钟。（G） KRT14-YFP-MyoEC（箭头）在未标记的LEC煎饼上洒下。（H） LED 初始尝试化后 LED 的布莱特菲尔德图像和 MyoEC 分遣队。（I） 在 MyoEC 分离之后，KRT14-YFP-MyoEC 不再可见，如缺少 YFP 表达式所示。刻度柱 = 30 μm （A， 明亮场） 100 μm （F， 亮场）， 50 μm （G， 荧光）， 100 μm （H，I）。这个数字的A-E面板是从马西亚斯等人修改的19。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：三维器官培养。（A） 嵌入在 10% ECM/90% 生长介质中的单个细胞的原理图表示，并在 50% ECM/50% DMEM 基层上生长（协议步骤 4.5）。（B-C）插图和相位对比图像显示，在24小时（B）和48小时（C）下，由不同尝试和重组的MyoEC和LEC产生的乳腺器官的快速自组织能力。使用数字宽场显微镜（D） 图解表示收集的图像，用于显示 E-F 中使用的顶部（左）或部分（右）视图，以显示免疫染色的器官。（E） 8井腔幻灯片的单口图解表示，该滑井含有生长5-10天的乳腺器官。（E'-E））在生长的第10天，免疫染色器官的顶部视图 （E'） 和部分视图 （E"） .肌瘤在伪色品红色中标有平滑作用肌 （SMA）。LEC 来自 ACTb-EGFP 小鼠，以伪颜色绿色显示。核被霍奇斯特染料弄脏了。（F） 8井腔滑道的单口图解表示，该滑井含有生长中生长5天、在阿尔韦洛根中生长5天的乳腺器官。（F'-F）。在生长的第10天，免疫染色器官的顶部视图 （F'） 和部分视图 （F）.MyoECs 未标记。来自 ACTb-EGFP 小鼠的 LEC 以伪颜色绿色显示。牛奶蛋白，乳清酸性蛋白（WAP），在LEC中以伪颜色黄色显示，并在器官的流明内涂上涂层。核被霍奇斯特染料弄脏了。使用旋转的圆盘共聚焦显微镜收集的图像，并使用 Imaris（E'， E'）或底部部分 #30 切片（F'， F"） 在 3D 中重建。刻度杆 = 100 μm （C）、20 μm （E）、40 μm （F）。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 10 mL | 消化介质 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 9.45 mL | DMEM/F12 | |
| 100 μL | 抗生素抗病 （100X） | |
| 0.04 克 | 3类胶原酶 | |
| 0.04 克 | 第 2 类 迪斯帕塞 | |
| 50 μL | 庆大霉素 | 最终浓度：500 μg |
| 2.5 mL | 胎儿牛血清 | 最终浓度：5%（v/v） |
| 通过 0.22μm 过滤器 | ||
| 50 mL | 维护介质 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 49.47 mL | DMEM/F12 | |
| 0.5 mL | 抗生素抗病 （100X） | |
| 2.5 mL | 胎儿牛血清 | 最终浓度：5%（v/v） |
| 25 μL | 胰岛素 | 最终浓度：250 μg |
| 5 μL | Egf | 最终浓度： 500 ng |
| 10 mL | 增长媒介 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 9.6455 mL | DMEM/F12，无苯酚红色 | |
| 100 μL | N-2 补充 （100x） | |
| 200 μL | 不含维生素A的B27补充剂（50倍） | |
| 10 μL | Nrg1 | 库存： 100μg/mL |
| 42.5 μL | R-斯庞丁 | 库存： 10 μg/mL |
| 1 μL | Rho抑制剂 Y-27632 | 库存： 10 μM |
| 1 μL | Egf | 库存： 0.1 μg/μL |
| 10 mL | 阿尔韦洛形成中等 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 9.6355 mL | DMEM/F12，无苯酚红色 | |
| 100 μL | N-2 补充 （100x） | |
| 200 μL | 不含维生素A的B27补充剂（50倍） | |
| 10 μL | Nrg1 | 库存： 100μg/mL |
| 42.5 μL | R-斯庞丁 | 库存： 10 μg/mL |
| 1 μL | Rho抑制剂 Y-27632 | 库存： 10 μM |
| 5 μL | 奥文皮图利乳素 | 最终浓度：1微克/mL |
| 1 μL | 地 塞 米松 | 最终浓度：5微克/mL |
| 5 μL | 胰岛素 | 最终浓度：5微克/mL |
| 1 升 | 10X DPBS | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 80 克 | Nacl | |
| 2 克 | 氯化钾 | |
| 14.4 克 | NaH2PO4 | |
| 2.4 克 | KH2PO4 | |
| 1 升 | 迪 H2O | |
| 在添加干试剂并溶解之前，将填充至 800 mL。将 pH 调整到 7.4，将体积填充到 1 L。高压灭菌器。 | ||
| 1 升 | 1X DPBS | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 900 mL | 迪 H2O | |
| 1 升 | PBST | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 2.5 mL | 特里顿 X-100 | |
| 250 mL | 4%甲醛 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 10 克 | 甲醛 | |
| 200 mL | 迪 H20 | 水必须在 60°C |
| 25 mL | 10X DPBS | |
| 50 μL | 10 N 氢氧化钠 | |
| 通过 0.45 μm 过滤器进行消毒，并确保 pH 值为 7.4 | ||
| 10 mL | 1 % 驴血清 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 100 μL | 无菌过滤驴血清 | |
| 9.9 mL | 1X DPBS | |
| 10 mL | 0.2% 甘氨酸 | |
| 量 | 试剂 | 笔记 |
| 0.02 克 | 甘 氨 酸 | |
| 10 mL | 1X DPBS | |
表1：解决方案配方。
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Discussion
在这里，介绍了一个详细说明研究人员如何使用原质MG细胞生成3D器官培养物的方法。此协议与其他协议之间的区别是，我们详细介绍了分离两个不同的 MG 细胞舱的方法：外基底 MyoEC 和内部 LEC。我们的方法采用两步胰蛋白酶-EDTA （0.05%）治疗，我们称之为差分尝试19。此过程允许研究人员分离 MyoE 和 LEC，而无需使用复杂的流细胞学，因此可用于研究从各种哺乳动物物种中采集的 MG，这些物种可能没有 FACS 所需的良好特征的生物标志物。分离两个细胞亚群的能力使研究人员能够独立地对分离的细胞进行基因改造，或将细胞与含有遗传突变或标签的动物重新组合，从而在3D培养中产生马赛克器官。当前协议的一个限制是，在培养条件下不包括基质舱。然而，正在开发新方法，以共同培养基质分量与从原细胞或细胞系生成的器官，以更好地在体内重述ECM23，24，25，26，,25,26这些方法可以适应这个协议。23,此外，需要注意的是，虽然该协议实现了 MyoEC 和 LEC 分数的极大浓缩（+90% 纯化），但分数并不代表纯细胞谱系。
该协议的成功依赖于许多关键步骤。首先，轻轻彻底消化MG组织是很重要的。组织过度消化会导致细胞死亡和上皮细胞恢复率降低。不完全消化会导致基质细胞和脂肪细胞污染，从而干扰以后的分析（例如免疫荧光、蛋白质分析和mRNA测量）。其次，在协议步骤2.8中彻底冲洗MG组织以去除污染细胞是很重要的。在协议步骤2.9中，MG组织片段被释放到60毫米的盘中。研究人员应该立即监测释放的碎片，然后它们粘在盘子上。如果观察到脂肪液滴或单个细胞，则必须重复协议步骤 2.6 和 2.8-2.11。为此，从盘中收集介质和组织碎片，放入新的 70 μm 滤网中，用 37 °C DMEM/F12 洗涤 4X，然后释放到新的 60 mm 盘中。第三，必须观看第一次胰蛋白酶-EDTA （0.05%）孵育密切，因为MyoECs可以在前3分钟内分离，但也可以坚持长达6分钟。曾发生过胰蛋白酶-EDTA （0.05%）次优，孵化进行10分钟，并成功地纯化了MyoECs。但是，>10 分钟的胰蛋白酶化导致 MyoE 和 LEC 同时收集。同样重要的是，在第一次孵化期间，菜肴保持不受干扰。否则，可能会对 LEC 的 MyoEC 分数进行污染。反之亦然;如果 MyoEC 没有完全脱离盘子，它们就会污染 LEC 分数。如果研究人员使用专门标记MyoECs或LECs的记者小鼠，则更容易在荧光显微镜下可视化分离（图2F-I）。最后，如果研究人员计划修复用于免疫荧光分析的器官，4%PFA的pH值（7.4）和温度（4°C）对于ECM的成功分离非常重要。如果收集器官进行其他分析（例如，蛋白质和mRNA测量），恢复溶液在4°C时很重要。如果 ECM 未溶解，则使用恢复溶液进行孵育可延长 10 分钟（即总孵育 30 分钟）。然而，更长的潜伏期将导致3D结构的损失和细胞死亡。恢复协议（在材料表中列出）指定宽孔提示的使用。这对保持器官的 3D 结构以及细胞的完整性非常重要。
除了这四个关键步骤之外，还有两个因素会影响协议的成功。首先，器官生长可以受到基因突变的限制，这些突变可减少细胞增殖，从而减少ECM中的器官生长。如果只得到几个器官，后续的固定步骤经常导致其丢失。为了解决这个问题，应增加嵌入 ECM 中的单元数，同时保持 MyoECs：LECs 的比例（协议步骤 4.1-4.2）。其次，一旦细胞被转移到ECM，重要的是要每天观察其生长，并警惕媒体更新（每2-3天）。该协议指定酚红色无试剂，以更好地可视化，但同样的成功和增长是使用苯酚红阳性试剂实现的。在固定之前进行中等更新的天数（协议步骤 4.6）应格外小心，以减少细胞损失。10% ECM 顶层很细腻;因此，应通过移液将液移化到造型室壁上进行湿注或介质更新，以尽量减少机械干扰。
将有机体分化成产牛奶的阿基尼需要用分化补充剂进行治疗：氢皮质酮或地塞米松、胰岛素和蛋白酶。在此协议中，建议使用地塞米松。此外，虽然催乳素是商业性的，但本协议中使用的催乳素是从国家激素和肽计划获得的。同样，在改变阿尔维洛形成性中等时，保持器官不受干扰是非常重要的。差别化至少需要5天。这可以再延长 3-5 天，但 ECM 的基础层在 10-12 天后会降低。分化的风琴体充满了牛奶，其流明看起来更暗。
这是一种有效的技术，可用于解决隔间特有的、系系对乳腺上皮形态发生和分化的贡献。利用这项技术，研究人员可以产生马赛克器官，包括不同基因操纵的MyoECs和LECs21，或从携带不同基因突变的小鼠获得的MyoE和LEC。这使得研究人员能够更好地了解特定血统的细胞舱对器官形成和获得牛奶生产等特殊功能的贡献。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢本·艾布拉姆斯提供加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）干细胞生物学研究所（IBSC）的技术援助和核心支持。我们感谢苏珊·斯特罗姆和比尔·萨克斯顿使用他们的索拉米尔旋转磁盘共聚焦显微镜。这项工作部分得到了霍华德·休斯医学院通过詹姆斯·吉利亚姆高级研究奖学金计划（S.R.）、NIH（NIH GM058903）和来自国家科学基金会研究生研究奖学金（O.C.DGE 1339067）和加州大学癌症研究协调委员会（LH）的赠款（A18-0370）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
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