Summary
Mælkekirtlen er en tolaget struktur, bestående af ydre myoepithelial og indre luminale epitelceller. Præsenteret er en protokol til at forberede organoids ved hjælp af differentiale trypsinization. Denne effektive metode gør det muligt for forskere at separat manipulere disse to celletyper til at udforske spørgsmål vedrørende deres roller i mælkekirtlen form og funktion.
Abstract
Organoids tilbyder selvorganiserende, tre-dimensionelle vævstrukturer, der opsummerer fysiologiske processer i bekvemmeligheden af en skål. Murine mælkekirtlen består af to forskellige epitelcellerum, der tjener forskellige funktioner: det ydre, kontraktile myoepitelrum og det indre, sekretoriske luminale rum. Her beskriver vi en metode, hvorved de celler, der omfatter disse rum, isoleres og derefter kombineres for at undersøge deres individuelle afstamningsbidrag til brystkirtel morfogenese og differentiering. Metoden er enkel og effektiv og kræver ikke avancerede separationsteknologier såsom fluorescensaktiveret cellesortering. I stedet høster og enzymatisk fordøje vævet, frø epitel på klæbende væv kultur retter, og derefter bruge differentiale trypsinization at adskille myoepithelial fra luminale celler med ~ 90% renhed. Cellerne er derefter belagt i en ekstracellulær matrix, hvor de organiserer sig i tolagede, tre-dimensionelle (3D) organoids, der kan differentieres til at producere mælk efter 10 dage i kultur. For at teste virkningerne af genetiske mutationer, celler kan høstes fra vilde type eller genetisk manipuleret musemodeller, eller de kan være genetisk manipuleret før 3D-kultur. Denne teknik kan bruges til at generere mosaik organoids, der tillader undersøgelse af genfunktionen specifikt i luminal eller myoepitelrummet.
Introduction
Mælkekirtlen (MG) er en træ-lignende, rørformede epitelstruktur indlejret i en adipocyte rig stroma. Det tolagede ductal epitel består af et ydre, basalt lag af kontraktile, myoepitheliale celler (MyoECs) og et indre lag af luminale, sekretoriske epitelceller (LECs), der omkranser en central lumen1. Under amning, når de ydre MyoECs kontrakt at presse mælk fra den indre alveolær LECs, MG gennemgår talrige ændringer, der er under kontrol af vækstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse ændringer forårsager differentiering af specialiserede strukturer, alveoler, som syntetisere og udskiller mælk under amning1. Den mamma epithelia kan eksperimentelt manipuleres ved hjælp af teknikker, hvor enten epitelvæv fragmenter, celler, eller endda en enkelt basal celle transplanteres i værten mælkefedt puder, præryddet af endogene mammary parenkym, og lov til at vokse ud for at rekonstituere en hel, funktionel epiteltræ2,3,4,5. Transplantation er en kraftfuld teknik, men det er tidskrævende og umuligt, hvis en mutation resulterer i tidlig embryonal dødelighed (før E14), der forhindrer redning af transplanterbar mamma anlage. Desuden ønsker efterforskere ofte at undersøge rollerne for de to forskellige rum, som er afledt af afstamningsbegrænsede sogenitorceller. Mens Cre-lox-teknologien muliggør differentieret genetisk manipulation af MyoECs og LECs, er dette også en tidskrævende og dyr virksomhed. Således har efterforskere siden 1950'erne brugt in vitro mamma organoids som en forholdsvis nem og effektiv måde at behandle spørgsmål vedrørende brystvævstruktur og funktion6,7.
I tidlige protokoller, der beskriver isolering og kultur af primære mælkeepitelceller, fandt efterforskerne, at en kældermembranmatrix (BME), der bestod af en plasmablodprop og kyllingeembryoekstrakt, var påkrævet for MG-fragmenter dyrket på en skål6. I de følgende årtier, ekstracellulære matricer (Ecm'er, kollagen, og jellylike protein matrix udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom celler) blev udviklet for at lette 3D-kultur og bedre efterligne in vivo miljø7,8,9,10. Dyrkning af celler i 3D-matricer afsløret af flere kriterier (morfologi, genekspression, og hormon reaktionsevne), at et sådant mikromiljø bedre modeller in vivo fysiologiske processer9,10,11,12. Forskning ved hjælp af primære murineceller identificerede de vigtigste vækstfaktorer og morfogener, der er nødvendige for den udvidede vedligeholdelse og differentiering af organoider13. Disse undersøgelser har sat scenen for protokollen præsenteres her, og for kulturen af menneskelige brystceller som 3D organoider, som nu er et moderne klinisk værktøj, der giver mulighed for lægemiddelopdagelse og lægemiddeltest på patientprøver14. Samlet set, organoid dyrkning fremhæver selv-organisation kapacitet af primære celler og deres bidrag til morfogenese og differentiering.
Præsenteret her er en protokol til kultur murine epithelia, der kan differentieres i mælkeproducerende acini. En differentialtrypsiniseringsteknik bruges til at isolere MyoECs og LECs, der omfatter de to forskellige MG-cellerum. Disse adskilte cellefraktioner kan derefter genetisk manipuleres til overexpress eller knockdown genfunktion. Fordi afstamning-iboende, selv-organisation er en medfødt egenskab af mælkeepitelceller15,16,17, rekombinere disse cellefraktioner giver forskerne mulighed for at generere tolagede, mosaik organoider. Vi begynder med enzymatisk fordøje fedtvæv, og derefter inkubere mælkefragmenter på en vævskultur parabol for 24 h (Figur 1). Vævsfragmenterne sætter sig på polystyrenretter som tolagede fragmenter med deres in vivo organisation: ydre myoepithelial lag omkring indre luminale lag. Denne cellulære organisation giver mulighed for isolering af de ydre MyoECs ved trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min efterfulgt af en anden runde af trypsin-EDTA (0,05%) behandling, der løsner de resterende indre LECs (Figur 2). Således er disse celletyper med forskellig trypsin følsomhed isoleret og kan efterfølgende blandes og belagt i ECM (Figur 3). Cellerne gennemgår selvorganisering til at danne tolagede kugler, der omfatter et ydre lag af MyoECs omkring indre LECs. Lumen dannelse opstår som cellerne vokser i et medium, der indeholder en cocktail af vækstfaktorer (se opskrifter på Vækst Medium)13. Efter 5 dage kan organoider differentieres til mælkeproducerende acini ved at skifte til Alveologenesis Medium (se opskrifter og figur 3F)og inkuberes i yderligere 5 dage. Alternativt vil organoider fortsætte med at udvide og filial i Vækst Medium i mindst 10 dage. Organoider kan analyseres ved hjælp af immunfluorescens (figur 3D-F) eller frigives fra ECM ved hjælp af en genvindingsopløsning (se Materialetabel)og analyseres ved hjælp af andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Mælkekirtlen fordøjelse
- Forbered dig på at høste MGs fra modne hunmus 10-14 uger.
- Udfør høsten på en åben bænk under aseptiske forhold.
- Steriliser alle kirurgiske forsyninger, kork brædder, og stifter ved autoklavering og iblødsætning i 70% alkohol i 20 min før operationen.
- Bedøve dyr med natriumpentobarbital (2X anæstesidosis på 0,06 mg/g kropsvægt) leveret via intraperitoneal injektion med en 0,5 ml insulinsprøjte.
- Overvåg anæstesiniveauet ved at klemme dyrets tæer for at kontrollere for en refleksrespons og påbegynde protokollen, når dyret er fuldt bestøvet.
- Placer dyret på ryggen, pin dens vedhæng til opslagstavlen, og tør ned sin mave og bryst med ethanol.
- At høste #2, 3, 4 og 5 MGs fra den ene mus (dvs. 8 MGs, Figur 1A), identificere midterlinjen mellem de to bagben og lave et lille snit (1 cm) på mavehuden med skarp saks, derefter udvide snittet op til halsen18.
- Følg ved at lave små snit sideværts mod ben og arme for at give mulighed for frigivelse af huden ved hjælp af en vatpind. Træk huden væk og stræk den stramt, før du fastgør den ned på den ene side(Figur 1B, trin 1)18. Fjern mg'erne ved at skære under dem, og fjern lymfeknuderne fra #4 kirtler (Figur 1B, trin 2, 3)18. Gentag proceduren på den anden side af kroppen.
- MG-vævet opsamles i 50 ml 4 °C Dulbeccos Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) suppleret med 5% føtal kvægserum (FBS) og 1X Antimycotic (Antimycotic (Anti-Anti)18.
- Hak kirtlerne i en 35 mm skål eller på en keramisk plade ved hjælp af et barberblad eller vævchopper. Drej pladen hver femte manuelle koteletter eller hver runde på vævshakkeren, indtil vævsstykkerne let kan være gennem en 1 ml mikropipettespids (~0,1 mm/fragment, figur 1C).
- Der fordøjes mg'erne i fordøjelsesmediet (se tabel 1)i 14 timer i en 6 brøndlav vedhæftningsskål ved 37 °C, 5% CO2.
2. Dag 2: Isolering af mælkeepitelvævsfragmenter
- Efter 14 timers fordøjelse blandes forsigtigt ved at pipettere det fordøjede væv 10X ved hjælp af en 1 ml mikropipette til at nedbryde eventuelle resterende stroma- eller fedtvæv, hvilket sikrer, at der hverken genereres bobler eller overskydende mekanisk kraft.
BEMÆRK: Hvis der er ufuldstændig fordøjelse efter 14 timer, kan dette skyldes ophobning af skær DNA. I dette tilfælde tilsættes 1 μL 1 mg/ml deoxyribonuclease I (DNase I) pr. 2 ml fordøjelsesmedium. Inkuber i yderligere 30 minutter ved 37 °C, 5% CO2. - Væv samles i et 15 ml rør, og brønden skylles med 2-3 ml vævskulturkvalitet 1X Dulbeccos Fosfatbuffered Salin (DPBS) uden Ca2+ og Mg2+. Centrifugeres ved 600 x g i 10 min.
- Evakuer supernatanten, der indeholder lipidlaget og mediet, og resuspender derefter pelleten i 5 ml DPBS og skift til et nyt 15 ml rør. Centrifugeres ved 600 x g i 10 min.
- Under centrifugering anbringes en 70 μm nyloncellesi i et 50 ml rør og fordamps sien med 10 ml 37 °C DMEM/F12.
- Resuspender vævsfragmenter fra protokoltrin 2.4 ved hjælp af 5 ml DPBS og passere suspensionen gennem en forskud 70 μm nyloncellesi til at fjerne stromale celler og enkelte celler (Figur 1D).
- Saml vævsfragmenterne på cellesien. 4X skylles med 10 ml 37 °C DMEM/F12 (Figur 1D).
FORSIGTIG: Ufuldstændig skylning vil resultere i kulturer, der er forurenet med ikke-epitelceller. - Vævsfragmenterne frigøres ved at holde sifanen med behandskede fingre, vende sien over en 60 mm vævskulturskål og passere 1 ml prøver af vedligeholdelsesmediet (se tabel 1) gennem bunden af sien 4X (Figur 1E).
- Kontroller sien for vævsfragmentrester, som vil være synlige med det blotte øje, og skyl sien 1X mere med 1 ml vedligeholdelsesmedium, hvis der stadig er fragmenter, der holder sig til sien. De skyllede vævsfragmenter bør nu være fri for stromale celler.
- Undersøg hurtigt 60 mm skålen, der indeholder MG-fragmenterne fra protokoltrin 2.9 under et omvendt mikroskop (4X- eller 10X-mål, figur 1F). En typisk forberedelse af otte MGs udbytter ~ 500 fragmenter. Kig efter enkelte celler eller fedtdråber, og om der er forurenende celler.
BEMÆRK: Hvis der er forurenende celler, gentages filtreringstrinnet ved at samle mediet og fragmenterne fra 60 mm skålen ved hjælp af en 5 ml pipette og filtrere fragmentet igen gennem en frisk 70 μm si, gentage protokoltrin 2.6, 2.8-2.10. - Inkuber 24 timer ved 37 °C, 5% CO2, så vævsfragmentet kan klæbe og generere tolagede fragmenter (figur 2A).
BEMÆRK: Hvis fragmenterne ikke har lagt sig ved 24 timer, skal du fortsætte med at inkubere, indtil de er klæbet. Hvis fragmenterne ikke klæber godt, vil adskillelsen af cellerummene ikke fungere. Hvis forskere er bekymrede over vedhæftning, kan vævskulturpladerne behandles for at fremme fragmentfastgørelse (f.eks. poly-L-lysin).
3. Dag 3: Differentialtrypsinisering af myoepitel- og luminale epitelceller
- For at adskille MyoECs fra LECs, tømme mediet fra skålen, skylle 1x med 1 ml DPBS og tilføje 1 ml frisk trypsin-EDTA (0,05%), og omhyggeligt overvåge fordøjelsen under en omvendt mikroskop (10X eller 20X mål, Figur 2B, C, F). Løsrivelsen af det ydre MyoEC-lag vil kræve 3-6 min, afhængigt af trypsin-EDTA (0,05%) Styrke.
BEMÆRK: Se figur 2 for repræsentative billeder, der viser denne proces. Under brightfield belysning, myoecs synes afrundet og har et lysere udseende i forhold til LECs, som forbliver overholdes i midten og synes mørkere. - MyoEC-fraktionen opsamles i et 15 ml rør med 2 ml 10% FBS/DPBS. Uden at forstyrre LEC'erne skylles 60 mm skålen forsigtigt med 2 ml DPBS, og derefter bortskaffes DPBS(Figur 2H-I).
BEMÆRK: Den sædvanlige opsving for MyoECs er inden for et interval på (3,5 x 106-1,5 x 106),afhængigt af størrelsen af mgb' erne. - Hvis du vil fjerne LEC-brøken, tilsættes 1 ml trypsin-EDTA (0,05 %) skålen igen og inkubere 7-15 min, overvågning omhyggeligt for at forhindre overfordøjelsesbesvær. Slukning af trypsin-EDTA (0,05%) på skålen med 2 ml 10% FBS/DPBS. LEC-fraktionen opsamles i et nyt 15 ml rør.
BEMÆRK: Den sædvanlige genopretning for LECs er inden for et interval (2 x 106-4,2 x 106)afhængigt af størrelsen af MGs. Rutinemæssigt, renheden af begge fraktioner som angivet ved immunhistokemi er ~ 90%19 (Figur 2E). - Der centrifugeres hver fraktion i 5 min ved 300 x g for at fjerne trypsin-EDTA (0,05%). Resuspender pellet i 250 μL vedligeholdelsesmedium og tæl hver cellepopulation ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Placer cellerne på is, mens tælle.
BEMÆRK: Hvis der ønskes genetisk manipulation af cellefraktionerne, kan primære celler dyrkes på lavvedhæftningsretter og inficeres med lentivirus20.
4. Dag 3: Kombinere og integrere cellefraktioner i en ekstracellulær matrix
BEMÆRK: Når MyoEC- og LEC-fraktionerne er indsamlet og talt, kan de kombineres. Det typiske MyoEC/LEC-forhold er 1:3 (Figur 3A)19. Forskellige undersøgelser kan udføres. For eksempel, at udføre mosaik undersøgelser, fraktioner kan genereres fra vilde type (WT) og mutant (Mut) mus og kombineret (MyoEC / LEC: WT / WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, eller brøker kan kombineres ved hjælp af forskellige forhold mellem MyoECs/LECs19.
- Baseret på celletal, beregne antallet af brønde (8 godt kammer, se Tabel over materialer),der skal forberedes til 12.000 celler / godt (f.eks 3.000 MyoECs: 9.000 LECs).
- Fastgør basislaget for 3D-kultur ved at tilføje 90 μL på 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, uden fenolrød - se materialetabellen)til hver brønd. Sørg for, at der ikke er bobler, og brøndene er belagt jævnt. For at størkne basislaget skal objektglassene inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 min.
BEMÆRK: ECM nødt til at forblive iskold indtil dette trin, ellers vil polymerisere for tidligt og føre til ujævn base belægning og polymerisering. Ved hjælp af en base ECM øger organoid vækst i et enkelt plan, som hjælper billedoptagelse. Dette opnår også hurtigere organoid vækst og bruger mindre ECM22. - Under polymerisering forberedes celleblandingerne. Pellet MyoEC og LEC fraktioner på 300 x g i 5 min og resuspender hver celle fraktion i 10% ECM/90% Vækst Medium, så hver brønd har 100 μL (se tabel 1 for hvordan man laver vækstmedium).
BEMÆRK: For at lette tilberedningen skal du replikere brønde ved hjælp af de samme celleblandinger. Disse kan kombineres og fremstilles i ét rør (f.eks. kan fire brønde af samme celleblanding fremstilles i 400 μL på 10% ECM/90% Growth Medium). - Der tilsættes 100 μL af hver celleblanding i 10% ECM/90% Vækstmedium til hver brønd, og organoiderne kan nøjes med 20 min ved 37 °C, 5% CO2.
- Når cellerne har lagt sig, tilsættes forsigtigt 100 μL vækstmedium ved forsigtigt at pipettere kammervæggen i hver brønd. Objektglassene inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 (se figur 3A for den samlede sammensætning af hver brønd).
BEMÆRK: Rho Kinase-hæmmeren, R-spondin og Nrg1 er faktorer, der er blevet identificeret som vigtige for den langsigtede kultur af organoider dyrket fra både primære murine mælkeceller og humane brystkræftceller13,14. Desuden forlænger stamcellefaktorerne B27 og N2 den tid, som organoider kan dyrkes. - Billedceller hver 24 timer for at spore deres vækst og forsigtigt forny vækstmediet hver 2-3 dage ved hjælp af 100 μL/brønd (Figur 3B-E).
BEMÆRK: Vær yderst forsigtig, når du fornyer mediet. Vip kammerrutsjebanerne for at samle mediet i det ene hjørne af brøndene. ≤100 μL af mediet fjernes, og der fyldes op med forsigtighed for at efterlade ECM-laget uforstyrret. - Hvis forskere er interesseret i at undersøge amning/alveologenesis, skal du skifte til Alveologenesis Medium (se tabel 1) på dag 5 og fortsætte med at forny mediet hver 2-3 dage indtil dag 10 (Figur 3F) eller videre ved at passere ved hjælp af genvindingsopløsning (se materialetabellen)13.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan organoider isoleres fra ECM ved at inkubere ved 4 °C i 400 μL 4 °C genvindingsopløsning (se Materialetabel for protokol og reagensinformation).
5. Dag 5 eller 10: Fastgørelse og immunfarvning af organoider
- Fjern mediet forsigtigt ved forsigtigt at pipettere mediet (en pærepipette fungerer bedst). Skyl hver brønd ved hjælp af 200 μL af 1x Dulbecco's Fosfat Buffered Saltvand (DPBS, se opskrifter).
- Organoiderne anfindes med kulde (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA, se opskrifter) i 10 min ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: PFA er farligt. Bær personlige værnemidler (laboratoriekittel, handsker og sikkerhedsbriller). Dette trin skal udføres inde i en røg hætte.
BEMÆRK: ECM opløses ved PFA-behandlingen. Ufuldstændig Fjernelse af ECM kan føre til baggrundsfarvning, når organoiderne analyseres ved immunfluorescens. - Pfa på 4 % fjernes, og der tilsættes 200 μL 0,2 % (w/v) glycin/DPBS (se tabel 1)til hver brønd. Kiglede ved stuetemperatur i 30 min eller 4 °C natten over på en gyngeoverflade indstillet til en langsom indstilling.
BEMÆRK: Organoiderne kan opbevares i 1-3 dage i DPBS ved 4 °C før næste trin. - Permeabiliser eorganoiderne med DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, se tabel 1)i 10 min ved stuetemperatur.
- Organoiderne blokeres ved hjælp af 5% æselserum (DS) (eller andet serum, der matcher arten af det sekundære antistof) i DPBS i 1 time på en gyngende overflade.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres natten over ved 4 °C på en gyngeoverflade. - Der fremstilles primære antistoffer i 1% DS/DPBS. Brug 125-200 μL for hver brønd. Udfør immunfarvning ved inkubering af organoiderne i det primære antistof natten over ved 4 °C på en gyngeoverflade.
6. Dag 11: Komplet immunfluorescens
- Hver brønd 2X med 200 μL PBST i 5 min. Der tilsættes sekundært antistof i 1% DS/DPBS ved hjælp af 125-200 μL for hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur på en gyngeoverflade i 45 min.
- Vask hver brønd 2X ved hjælp af 200 μL PBST pr. brønd.
- Plette kernerne ved hjælp af Hoechst DNA-farvestof i DPBS (1:2.000 i DPBS) i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern al væske tilbage på brønden ved forsigtigt at suge med et vakuum.
- Fjern forsigtigt kamrene og pakningen, placer en dråbe (~30 μL) monteringsmedier (se Materialetabel)på hver brønd og dæksel, og sørg for at fjerne bobler. Lad slæden tørre i et mørkt rum i 1-2 dage. Seal med klar neglelak. Billede organoiderne på et konfokalmikroskop (Figur 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres her beskriver en metode til at undersøge specifikke afstamning bidrag af mælkeepitelceller ved at gøre brug af mosaik organoider. For at opnå primære murinceller til organoider skal mælkekirtlens epitel først isoleres fra den omgivende adipocyte rige stroma (Figur 1). Denne proces beskrives kort her og beskrives også i en tidligere offentliggjort undersøgelse18. For at opnå nok celler anbefales det, at #2, 3, 4 og 5 MG fjernes (figur 1A). Et vigtigt skridt nøglen til at isolere en ren population af epitelceller er fjernelse af lymfeknuder fra #4 MGs, som er rige på immunceller, der vil forurene præparatet (Figur 1A,B). MGs blev hakket til at generere fragmenter ~ 0,1 mm i størrelse (Figur 1B). Vævsfragmenterne blev derefter enzymatisk fordøjet, en proces, der forekommer i nærvær af kollagen, at frigive epithelia fra stroma, og i mangel af trypsin, for at forhindre fordøjelsen af proteiner såsom cadherins, der opretholder celle-celle kontakter. Det fordøjede væv blev derefter centrifugeret for at fjerne lipider og filtreret gennem en cellesi og vasket (Figur 1C). Epitelfragmenter, der var tilsat sien, blev frigivet ved at vende filteret og vaske membranen, som overførte epitelfragmenterne til en polystyrenskål (Figur 1D). Disse fragmenter fremstod som små, forgrenede strukturer (figur 1E).
De rensede epitelfragmenter blev inkuberet i 24 timer. De slog sig ned på fadet og klæbede, danner flade, pandekage-lignende strukturer med et ydre lag af MyoECs omkranser indre LECs (Figur 2A-B). Figur 2C viser kanten af en sådan pandekagelignende struktur fra et vildt dyr af typen. Trypsin behandling differentieret løsrevet MyoECs, som løsrives først og optrådte som lyse, afrundede celler, der omkransede kernen i de resterende kubiske LECs (Figur 2C,F). Udstationeringen af MyoECs blev nøje overvåget ved hjælp af brightfield mikroskopi og fandt sted inden for 3-6 min. Når MECs blev indsamlet, LECs blev efterfølgende løsrevet gennem en anden, længere trypsin behandling af 7-15 min. Den tid, der kræves til celleløsrivelse, afhænger af trypsinkoncentrationen og friskheden. Den samlede renhed af de to cellerum var ~ 90%, som angivet ved at tælle celler, der var KRT14-positive og E-Cadherin (CDH1)-negative i MyoEC fraktion og celler, der var KRT14-negative og E-Cadherin-positive i LEC fraktion (Figur 2D-E)19. Vi opdagede, at nogle af MyoECs blev fjernet fra toppen af pandekage-lignende struktur samt fra de ydre kanter. Dette blev observeret ved hjælp af vævsfragmenter indsamlet fra mus mærket med en inducible, fluorescerende basalmarkør (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) og injiceres med 75 mg/kg tamoxifen 5 dage før høst. I figur 2F,G er det let at få afmonteringen af MyoECs rundt om kanten af pandekagestrukturen. Dette skete inden for de første 2 minutters behandling af trypsin (figur 2F). Desuden blev YFP-KRT14-positive celler observeret oven på strukturen, hvor de rundede op efter behandling med trypsin og blev fjernet ved skylle-/indsamlingstrinnet (figur 2G). Den umærkede kerne af LECs (Figur 2H), som indeholdt få eller ingen YFP-KRT14-positive celler (Figur 2I) efterfølgende løsrevet i anden runde af trypsin behandling.
MyoEC og LEC fraktioner blev indsamlet, kombineret, og indlejret i 10% ECM belagt på en 50% ECM base. Dette gav mulighed for bedre optisk opløsning af organoiderne, der primært voksede langs basislaget (Figur 3A). Efter 24 timer, cellerne samlet i aggregerede strukturer, der stort set manglede en lumen (Figur 3B). Efter 48 timer, spirende organoider dannet som den centrale lumen udhulet og optrådte som en lysere indre rum (Figur 3C). Efter 10 dage var organoiderne store, forgrenede strukturer med veludviklede lumen. Mosaik organoider genereret fra MyoECs høstet fra vilde type mus og LECs høstet fra ACTb-EGFP mus blev fastsat in situ, immunplettet med et antistof mod basal markør alpha-glat muskel actin (SMA), og farves med Hoechst DNA pletten for at vise kernerne. I figurerne viser top- og sektionsvisningerne forskellige sæt billeder, der er indsamlet som en Z-stak og rekonstrueret til en 3D-visning (Figur 3D). Den øverste visning afslører organoidernes forgrenede morfologi (figur 3E'). Sektionsvisningen viser den tolagede epitelstruktur og åbne lumen af disse organoider (figur 3E'). Disse organoider kan også differentieres på dag 5 ved hjælp af Alveologenesis Medium og inkuberes i yderligere 5 dage (Figur 3F). De organoider voksede sig større, havde flere grene, og indeholdt mælk. Der blev genereret differentierede organoider som beskrevet ovenfor og immunplettet med et antistof rettet mod mælkemarkør, vallesyreprotein (WAP, figur 3F). WAP er et opløseligt protein udskilles i mælk. Meget af denne væske gik tabt, da cellerne blev fikseret og immunplettet in situ. Derfor, i toppen og afsnit synspunkter, WAP farvning er synlig intracellulært i udskilleceller og ekstracellulære i mælk, der blev fanget på celleoverfladen under fiksering (Figur 3F), selv om der i afsnit se en lille organoid synes at indeholde flydende mælk ( Figur3F'' boxed overlay).
Figur 1: Mammary fragment isolation. (A) Mærket skematisk af en mus 5 MG'er med umærkede, kontralaterale parrede MG'er. (B) Billeder af mus-mgs med #4 MG boxed og forstørret for at vise, hvordan lymfeknuden til fjernelse. (C) Billede af hakkede MGs i en 6 godt lav vedhæftning plade med en lineal, der viser størrelsen af væv stykker (~ 0,1 mm hver). (D-E) Skematisk illustration af protokoltrin 2.7-2.9. (D) MG-fragmenter blev filtreret gennem en 70 μm si og skyllet 4X. (E) Sien blev derefter omvendt over en 60 mm polystyren vævkultur fad og fragmenter blev frigivet i fadet. (F) Billede, der viser de filtrerede vævsfragmenter, der er indsamlet på en 60 mm skål, der er fri for stroma. Pilene peger på de mindste fragmenter, der er indsamlet på 70 μm si. Skalabar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Differentialtrypsinisering. (A) Brightfield billede viser et væv fragment klæbet på en polystyren fad, danner en pandekage-lignende struktur. (B-C) Den første differentiale trypsinization trin løsrevet MyoECs, der er klart synlige som lyse, afrundede celler efter 3 min. (D) Immunofluorescerende billeder af MyoECs (nederst) og LECs (top) ved hjælp af Cytokeratin 14 (KRT14) celle markør for MyoECs, og E-Cadherin (CDH1) celle markør for LECs. (E) Udtrykket af KRT14 og CDH1 blev anvendt til at kvantificere udbyttet og renheden af de differentierede trypsiniserede cellefraktioner. (F-I). Repræsentative fasekontrast- og fluorescensbilleder af vævsfragmenter fra Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1 R26RYFP/+ MGGs. Mus blev injiceret med 75 mg/kg tamoxifen 5 dage før høst. (F) Afmontering af MyoECs (pile) under den indledende trypsin-EDTA (0,05%) 2 min efter inkubation. (G)Et drys af KRT14-YFP-MyoECs (pile) oven på en pandekage af umærkede LECs. (H) Brightfield billede af LECs efter første trypsinisering og MyoEC udstationering. (I) Efter MyoEC-løsrivelse er KRT14-YFP-MyoECs ikke længere synlige, som det fremgår af fraværet af YFP-udtryk. Skalastænger = 30 μm (A, brightfield) 100 μm (F, brightfield), 50 μm (G, fluorescens), 100 μm (H,I). Paneler A-E af denne figur er ændret fra Macias et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tredimensionel organoidkultur. (A) Skematisk repræsentation af enkelte celler indlejret i 10% ECM/90% Vækst Medium og dyrket på en 50% ECM/50% DMEM basislag (protokol trin 4.5). (B-C) Illustrationer og fase-kontrast billeder, der viser den hurtige selvorganiserende kapacitet af mamma organoider genereret fra differentieret trypsinized og rekombineret MyoECs og LECs på 24 h (B) og 48 h (C). Billeder indsamlet ved hjælp af et digitalt widefield mikroskop (D) Schematic repræsentation illustrerer den øverste (venstre) eller sektion (højre) synspunkter, der anvendes i E-F til at vise immunbesfarvede organoider. (E) Skematisk repræsentation af en enkelt brønd af en 8 brønd kammer dias indeholder mamma organoids dyrket i 5-10 dage i Vækst Medium. (E'-E") Topvisning ( E' ) ogsektionsvisning(E") af immunopnåede organoider på dag 10 i vækst. MyoECs er markeret med glat actin muskel (SMA) i pseudocolor magenta. LECs er fra ACTb-EGFP mus og er vist i pseudocolor grøn. Kerner blev plettet med Hoechst farvestof. (F) Skematisk repræsentation af en enkelt brønd af en 8 brønd kammer dias indeholder bryst organoider dyrket i 5 dage i Vækst Medium og 5 dage i Alveologenesis Medium. (F'-F"). Topvisning (F') og sektionsvisning (F") af immunopnåede organoider på dag 10 i vækst. MyoECs er umærkede. LECs fra ACTb-EGFP mus er vist i pseudocolor grøn. Mælkeproteinet, vallesyreproteinet (WAP), er vist i pseudofarvegult i LEC'erne og belægning på indersiden af organoidernes lumen. Kerner blev plettet med Hoechst farvestof. Billeder indsamlet ved hjælp af et roterende diskkonfokalmikroskop og rekonstrueret i 3D ved hjælp af Imaris (E', E') eller nederste sektion ~30 skiver (F', F"). Skalastænger = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
| 10 ml | Fordøjelsesmedium | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 9,45 ml | DMEM/F12 | |
| 100 μL | Antimyskotisk antimyskotisk (100X) | |
| 0,04 g | Klasse 3 Collagenase | |
| 0,04 g | Klasse 2 Dispase | |
| 50 μL | Gentamicin | Endelig koncentration: 500 μg |
| 2,5 ml | Føtal kvæg serum | Endelig koncentration: 5% (v/v) |
| Passere gennem 0,22 μm filter | ||
| 50 ml | Vedligeholdelsesmedie | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 49,47 ml | DMEM/F12 | |
| 0,5 ml | Antimyskotisk antimyskotisk (100X) | |
| 2,5 ml | Føtal kvæg serum | Endelig koncentration: 5% (v/v) |
| 25 μL | Insulin | Endelig koncentration: 250 μg |
| 5 μL | Globaliseringsfonden | Endelig koncentration: 500 ng |
| 10 ml | Vækst mellem | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 9,6455 ml | DMEM/F12, ingen phenol rød | |
| 100 μL | N-2 Tillæg (100x) | |
| 200 μL | B27 tilskud uden vitamin A (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 (Nrg1) | Materiel: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin (R-spondin) | Materiel: 10 μg/ml |
| 1 μL | Rho-hæmmer Y-27632 | Materiel: 10 μM |
| 1 μL | Globaliseringsfonden | Materiel: 0,1 μg/μL |
| 10 ml | Alveologenesis Mellem | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 9,6355 ml | DMEM/F12, ingen phenol rød | |
| 100 μL | N-2 Tillæg (100x) | |
| 200 μL | B27 tilskud uden vitamin A (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 (Nrg1) | Materiel: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin (R-spondin) | Materiel: 10 μg/ml |
| 1 μL | Rho-hæmmer Y-27632 | Materiel: 10 μM |
| 5 μL | Får hypofyse Prolactin | Endelig koncentration: 1 μg/ml |
| 1 μL | Dexamethason | Endelig koncentration: 5 μg/ml |
| 5 μL | Insulin | Endelig koncentration: 5 μg/ml |
| 1 L | 10X DPBS | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | KCl (KCl) | |
| 14,4 g | NaH2PO4 (NaH2PO4) | |
| 2,4 g | KH2PO4 delte et u2.4. | |
| 1 L | di H2O | |
| Fyld til 800 ml, før der tilsættes tørre reagenser og opløses. Fyld volumen til 1 L. Juster pH til 7,4. Autoklave at sterilisere. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 100 ml | 10X PBS | |
| 900 ml | di H2O | |
| 1 L | PBST (PBST) | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 100 ml | 10X PBS | |
| 2,5 ml | Triton X-100 | |
| 250 ml | 4% Paraformaldehyd | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 10 g | Paraformaldehyd | |
| 200 ml | di H20 | vand skal være ved 60 °C |
| 25 ml | 10X DPBS | |
| 50 μL | 10 N Natriumhydroxid | |
| Passere gennem et 0,45 μm filter for at sterilisere og sikre pH er 7,4 | ||
| 10 ml | 1 % Æsel serum | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 100 μL | Sterilt filtreret æselserum | |
| 9,9 ml | 1X DPBS | |
| 10 ml | 0.2% glycin | |
| Beløb | Reagens | Noter |
| 0,02 g | Glycin | |
| 10 ml | 1X DPBS | |
Tabel 1: Løsningsopskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres en metode med detaljer om, hvordan forskere kan generere 3D organoidkulturer ved hjælp af primære MG-celler. Forskellen mellem dette og andre protokoller er, at vi detaljer en metode til at adskille de to, forskellige MG cellerum: den ydre basal MyoECs og indre LECs. Vores metode anvender en to-trins trypsin-EDTA (0,05%) behandling, som vi kalder differentialtrypsinisering19. Denne procedure gør det muligt for forskere at isolere MyoECs og LECs uden at bruge sofistikeret flow cytometri og dermed kan bruges til at studere MGs høstet fra en bred vifte af pattedyr arter, der måske ikke har de velkarakteriserede biomarkører kræves for FACS. Evnen til at adskille de to cellesubpopulationer gør det muligt for forskere at genetisk modificere de isolerede celler uafhængigt eller rekombinere celler fra dyr, der huser genetiske mutationer eller etiketter, og dermed generere mosaik organoider i 3D-kultur. En begrænsning af den nuværende protokol er, at det stromale rum ikke er inkluderet i dyrkningsbetingelserne. Der udvikles imidlertid nye metoder til samkulturaf stromale komponenter med organoider, der er genereret fra enten primærceller eller cellelinjer for bedre at opsummere in vivo ECM23,24,25,26, og disse metoder kan tilpasses denne protokol. Desuden er det vigtigt at bemærke, at mens denne protokol opnår en stor berigelse af MyoEC og LEC fraktioner (~ 90% rensning), fraktionerne ikke repræsenterer rene celle slægter.
Denne protokols succes afhænger af en række vigtige skridt. For det første er det vigtigt at forsigtigt, men grundigt fordøje MG væv. Overfordøjelse af vævet vil føre til celledød og lavere genopretning af epitelceller. Ufuldstændig fordøjelse vil resultere i stromale og fedtcellemæssige kontaminering, som vil forstyrre senere analyser (f.eks. immunfluorescens, proteinanalyse og mRNA-målinger). For det andet er det vigtigt grundigt at skylle MG-vævet for at fjerne forurenende celler i protokoltrin 2.8. I protokoltrin 2.9 frigives MG-vævsfragmenterne i en 60 mm skål. Forskere bør overvåge de frigivne fragmenter straks, før de klæber til fadet. Hvis der observeres fedtdråber eller enkelte celler, skal protokoltrin 2.6 og 2.8-2.11 gentages. For at gøre dette opsamles medium- og vævsfragmenterne fra skålen, anbringes i en ny 70 μm si, vaskes 4X med 37 °C DMEM/F12 og frigives derefter i en ny skål på 60 mm. For det tredje er det vigtigt at se den første trypsin-EDTA (0,05%) inkubation tæt, fordi MyoECs kan frigøre inden for de første 3 min, men de kan også overholde i op til 6 min. Der har været tilfælde, hvor trypsin-EDTA (0,05%) var suboptimal, og inkubationen fortsatte i 10 minutter med vellykket rensning af MyoECs. > 10 min trypsinisering resulterede imidlertid i den samtidige samling af MyoECs og LECs. Det er også vigtigt, at skålen forbliver uforstyrret under den første inkubation. Ellers kan der forekomme kontaminering af MyoEC-fraktionen med LECs. Det modsatte er også tilfældet; Hvis MyoECs ikke er helt løsrevet fra skålen, vil de forurene LEC fraktion. Hvis forskere bruger reporter mus, der mærker MyoECs eller LECs udelukkende, er det lettere at visualisere adskillelsen under en fluorescens mikroskop (Figur 2F-I). Endelig, hvis forskerne planlægger fastsættelse organoider til immunfluorescens analyser, pH (7.4) og temperatur (4 °C) af 4% PFA er vigtigt for en vellykket dissociation af ECM. Hvis organoiderne indsamles til andre analyser (f.eks. protein- og mRNA-målinger), er det vigtigt, at genvindingsopløsningen er ved 4 °C. Hvis ECM'en ikke opløses, kan inkubationen med genvindingsopløsningen forlænges med 10 min( dvs. 30 min total inkubation). Længere inkubationsperioder vil dog føre til tab af 3D-struktur og celledød. Genoprettelsesprotokollen (der er angivet i materialetabellen) angiver brugen af bredboringer. Dette er vigtigt for at opretholde 3D-strukturen af organoids samt integriteten af cellerne.
Ud over disse fire vigtige trin er der to faktorer, der påvirker protokollens succes. For det første kan organoid vækst begrænses af genetiske mutationer, der reducerer celleproliferation og derfor reducerer organoid vækst i ECM. Hvis der kun opnås nogle få organoider, resulterer det efterfølgende fikseringstrin ofte i tab. For at løse dette, bør antallet af celler indlejret i ECM øges samtidig bevare forholdet mellem MyoECs:LECs (protokol trin 4.1-4.2). For det andet, når cellerne er overført til en ECM er det vigtigt at se deres vækst dagligt og være på vagt over for medier fornyelse (hver 2-3 dage). Denne protokol specificerer fenol røde gratis reagenser for bedre visualisering, men den samme succes og vækst opnås ved hjælp af fenol rød positive reagenser. De dage, hvor medium fornyelse sker før fiksering (protokoltrin 4.6) skal udføres med stor forsigtighed for at reducere celletab. Den 10% ECM øverste lag er delikat; derfor vasker eller medium fornyelse bør udføres ved pipettering væske ned kammeretvægge for at minimere mekaniske forstyrrelser.
Differentiering af organoider i mælkeproducerende acini kræver behandling med differentiering kosttilskud: hydrocortison eller dexamethason, insulin, og prolaktin. I denne protokol anbefales dexamethason. Desuden, mens prolaktin er kommercielt tilgængelige, prolaktin anvendes i denne protokol blev opnået fra det nationale hormon og peptid Program. Igen er det meget vigtigt at forlade organoids uforstyrret, når du ændrer Alveologenesis Medium. Differentiering kræver mindst 5 dage. Dette kan forlænges yderligere 3-5 dage, men basislaget af ECM nedbrydes efter 10-12 dage. Differentierede organoider er fyldt med mælk og deres lumen synes mørkere.
Dette er en effektiv teknik, der kan bruges til at løse rum-specifikke, afstamning bidrag til mamma epitelmorfse setilese og differentiering. Med denne teknik, forskere kan generere mosaik organoider bestående af differentieret genetisk manipuleret MyoECs og LECs21, eller MyoECs og LECs fremstillet af mus huser forskellige genetiske mutationer. Dette gør det muligt for forskere bedre at forstå bidragene fra afstamning-specifikke cellesegmenter til orgel morfogenese og erhvervelse af specialiserede funktioner såsom mælkeproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ben Abrams for teknisk bistand og kernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologi stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for brugen af deres Solamere Spinning Disk Konfokale mikroskop. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gennem James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (SR), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet til at maksimere de studerendes udvikling (GM) og fra National Science Foundation for et akademisk forskningsstipendium (O.C. DGE 1339067) og ved et tilskud (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
