Summary
La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.
Abstract
Los organoides ofrecen estructuras de tejido tridimensionales autoorganizadas que recapitulan los procesos fisiológicos en la comodidad de un plato. La glándula mamaria murina se compone de dos compartimentos celulares epiteliales distintos, que cumplen diferentes funciones: el compartimento mioepitelial externo y contractilo y el compartimento luminal interior y secretor. Aquí, describimos un método por el cual las células que componen estos compartimentos se aíslan y luego se combinan para investigar sus contribuciones individuales de linaje a la morfogénesis y diferenciación de la glándula mamaria. El método es simple y eficiente y no requiere tecnologías de separación sofisticadas como la clasificación celular activada por fluorescencia. En su lugar, cosechamos y digerimos enzimáticamente el tejido, sembramos el epitelio en platos de cultivo de tejidoadherente, y luego usamos trippsinización diferencial para separar el mioepitelial de las células luminales con una pureza del 90 %. Las células se platean en una matriz extracelular donde se organizan en organoides bicapados tridimensionales (3D) que se pueden diferenciar para producir leche después de 10 días en cultivo. Para probar los efectos de las mutaciones genéticas, las células se pueden cosechar a partir de modelos de ratón de tipo salvaje o genéticamente diseñados, o pueden ser manipuladas genéticamente antes del cultivo 3D. Esta técnica se puede utilizar para generar organoides de mosaico que permiten la investigación de la función génica específicamente en el compartimento luminal o mioepitelial.
Introduction
La glándula mamaria (MG) es una estructura epitelial tubular similar a un árbol incrustada dentro de un estroma rico en adipocitos. El epitelio ductal bicapado comprende una capa externa basal de células contráctil, mioepiteliales (MyoEC) y una capa interna de células epiteliales luminarias y secretoras (LEC), que rodea un lumen central1. Durante la lactancia cuando los MyoECexternos externos se contraen para exprimir la leche de los LEC alveolares internos, la MG sufre numerosos cambios que están bajo el control de factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y FGF) y hormonas (por ejemplo, progesterona, insulina y prolactina). Estos cambios causan la diferenciación de las estructuras especializadas, alvéolos, que sintetizan y secretan la leche durante la lactancia1. La epitelía mamaria puede ser manipulada experimentalmente utilizando técnicas en las que los fragmentos de tejido epitelial, las células o incluso una sola célula basal se trasplantan en almohadillas de grasa mamaria del huésped, precleares del parénquima mamario endógeno, y se les permite crecer para reconstituir un árbol epitelial completo y funcional2,,3,4,5. El trasplante es una técnica poderosa, pero es lenta e imposible si una mutación resulta en una letalidad embrionaria temprana (antes de E14) que evita el rescate del anlage mamario trasplanible. Además, los investigadores con frecuencia desean investigar las funciones de los dos compartimentos diferentes, que se derivan de células progenitoras restringidas al linaje. Si bien la tecnología Cre-lox permite la manipulación genética diferencial de myoECs y LECs, también es una tarea costosa y que consume mucho tiempo. Así, desde la década de 1950, los investigadores han utilizado organoides mamarios in vitro como una manera relativamente fácil y eficiente de abordar cuestiones relativas a la estructura y función del tejido mamario6,7.
En los primeros protocolos que describen el aislamiento y el cultivo de células epiteliales mamarias primarias, los investigadores encontraron que se requería una matriz de membrana de sótano (BME), compuesta por un coágulo plasmático y extracto de embrión de pollo, para los fragmentos de MG cultivados en un plato6. En las décadas siguientes, se desarrollaron matrices extracelulares (ECM, colágeno y matriz proteica gelatinosa secretada por células de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm) para facilitar el cultivo 3D e imitar mejor el entorno in vivo7,,8,9,10. Células de cultivo en matrices 3D reveladas por múltiples criterios (morfología, expresión génica y capacidad de respuesta hormonal) que tal microambiente modela mejor los procesos fisiológicos vivos9,10,11,12. La investigación utilizando células murinas primarias identificó factores clave de crecimiento y morógenos necesarios para el mantenimiento extendido y la diferenciación de organoides13. Estos estudios han establecido el escenario para el protocolo presentado aquí, y para el cultivo de células mamarias humanas como organoides 3D, que ahora es una herramienta clínica moderna, lo que permite el descubrimiento de fármacos y pruebas de drogas en muestras de pacientes14. En general, el cultivo organoide retocomodo pone de relieve las capacidades de autoorganización de las células primarias y sus contribuciones a la morfogénesis y diferenciación.
Presentado aquí es un protocolo para el cultivo de la epitelia murina que se puede diferenciar en acini productor de leche. Se utiliza una técnica de tripinización diferencial para aislar los MyoECs y LEC que componen los dos compartimentos celulares MG distintos. Estas fracciones celulares separadas pueden ser manipuladas genéticamente para sobreexpresar o derribar la función genética. Debido a que el linaje-intrínseco, la autoorganización es una propiedad innata de las células epiteliales mamarias15,16,17, la recombinación de estas fracciones celulares permite a los investigadores generar bicapas, organoides de mosaico. Comenzamos digiriendo enzimáticamente el tejido adiposo, y luego incubando los fragmentos mamarios en un plato de cultivo de tejido durante 24 h(Figura 1). Los fragmentos de tejido se asientan sobre platos de poliestireno como fragmentos bicapados con su organización in vivo: capa mioepitelial exterior que rodea las capas luminales internas. Esta organización celular permite el aislamiento de los MyoECexternos externos por trippsina-EDTA (0,05%) tratamiento durante 3-6 min seguido de una segunda ronda de trypsin-EDTA (0,05%) tratamiento que separa los LEC internos restantes(Figura 2). Por lo tanto, estos tipos de células con diferente sensibilidad a la trippsina se aíslan y posteriormente se pueden mezclar y chapar en ECM(Figura 3). Las células se someten a una autoorganización para formar esferas bicapas, que comprenden una capa externa de Micmy que rodean los LEC internos. La formación de lúmenes se produce a medida que las células crecen en un medio que contiene un cóctel de factores de crecimiento (ver recetas para el medio de crecimiento)13. Después de 5 días, los organoides se pueden diferenciar en acini productores de leche cambiando a Medio de Alveologénesis (ver recetas y Figura 3F)e incubados durante otros 5 días. Alternativamente, los organoides continuarán expandiéndose y ramificándose en el Medio de Crecimiento durante al menos 10 días. Los organoides pueden analizarse utilizando inmunofluorescencia(Figura 3D-F)o liberarse del ECM utilizando una solución de recuperación (ver Tabla de Materiales)y analizarse a través de otros métodos (por ejemplo, inmunoblot, RT-qPCR).
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Santa Cruz.
1. Día 1: Digestión de la glándula mamaria
- Prepárese para cosechar los GM de ratones hembra maduras de 10-14 semanas de edad.
- Realizar la cosecha en un banco abierto en condiciones asépticas.
- Esterilice todos los suministros quirúrgicos, tablas de corcho y alfileres autoclavendo y empapándose en 70% de alcohol durante 20 minutos antes de la cirugía.
- Anestetizar animales con pentobarbital sódico (2X dosis anestésica de 0,06 mg/g de peso corporal) administrada mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de insulina de 0,5 ml.
- Controle el nivel de anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos del animal para comprobar si hay una respuesta reflejo y comenzar el protocolo sólo después de que el animal esté completamente anestesiado.
- Coloque al animal en su espalda, pin sus apéndices en el corcho, y limpie su abdomen y pecho con etanol.
- Para cosechar los #2, 3, 4 y 5 MM de un ratón (es decir, 8 MGs, Figura 1A),identificar la línea media entre las dos patas traseras y hacer una pequeña incisión (1 cm) en la piel abdominal con tijeras afiladas, luego extender el corte hasta el cuello18.
- Siga haciendo pequeños cortes lateralmente hacia las piernas y los brazos para permitir la liberación de la piel usando un hisopo de algodón. Tire de la piel y estírela firmemente antes de fijarla hacia abajo en un lado(Figura 1B, paso 1)18. Retire los GM cortando debajo de ellos, y retire los ganglios linfáticos de las glándulas #4(Figura 1B, pasos 2, 3)18. Repita el procedimiento en el otro lado del cuerpo.
- Recoger el tejido MG en 50 mL de 4 oC Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) complementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti)18.
- Picar las glándulas en un plato de 35 mm o en una placa de cerámica usando una cuchilla de afeitar o un helicóptero de tejido. Gire la placa cada cinco chuletas manuales o cada ronda en el helicóptero de tejido hasta que las piezas de tejido puedan caber a través de una punta de micropipeta de 1 ml con facilidad (0,1 mm/fragmento, Figura 1C).
- Digerir los GM en medio de digestión (ver Tabla 1) durante 14 h en un plato de 6 pozos de baja adherencia a 37oC, 5% CO2.
2. Día 2: Aislamiento de fragmentos de tejido epitelial mamario
- Después de 14 h de digestión, mezcle suavemente pipeteando el tejido digerido 10X usando una micropipeta de 1 ml para descomponer cualquier estroma restante o tejido adiposo, asegurando que no se generen burbujas ni exceso de fuerza mecánica.
NOTA: Si hay digestión incompleta después de 14 h, esto podría deberse a la acumulación de ADN cizallado. En este caso, añadir 1 l de 1 mg/ml de desoxirribonucleasa I (DNase I) por 2 ml de medio de digestión. Incubar otros 30 min a 37oC, 5%CO2. - Recoger tejido en un tubo de 15 ml y enjuagar el pozo utilizado para la digestión con 2-3 mL de cultivo tisular grado 1X dulbecco fosfato tamposo salino (DPBS) libre de Ca2+ y Mg2+. Centrífuga a 600 x g durante 10 min.
- Evacuar el sobrenadante que contiene la capa de lípidos y el medio, y luego resuspender el pellet en 5 ml de DPBS y cambiar a un nuevo tubo de 15 ml. Centrífuga a 600 x g durante 10 min.
- Durante la centrifugación coloque un colador de células de nylon de 70 m en un tubo de 50 ml y humedezca previamente el colador con 10 ml de 37 oC DMEM/F12.
- Resuspender fragmentos de tejido del paso de protocolo 2.4 utilizando 5 ml de DPBS y pasar la suspensión a través de un colador de células de nylon prehúmedo de 70 m para eliminar las células estromales y células individuales(Figura 1D).
- Recoger los fragmentos de tejido en el colador celular. Enjuagar 4X con 10 mL de 37oC DMEM/F12(Figura 1D).
ADVERTENCIA: El enrredado incompleto dará lugar a cultivos contaminados con células no epiteliales. - Suelte los fragmentos de tejido sosteniendo la pestaña del colador con los dedos enguantados, invirtiendo el colador sobre un plato de cultivo de tejido de 60 mm y pasando 1 ml de alícuotas del medio de mantenimiento (ver Tabla 1) a través de la parte inferior del colador 4X (Figura 1E).
- Compruebe el colador en busca de restos de fragmentos de tejido, que serán visibles a simple vista, y enjuague el colador 1X más con 1 ml de medio de mantenimiento si algún fragmento todavía se adhiere al colador. Los fragmentos de tejido enjuagado ahora deben estar libres de células estromales.
- Examine rápidamente la placa de 60 mm que contiene los fragmentos MG del paso de protocolo 2.9 bajo un microscopio invertido (objetivo 4X o 10X, Figura 1F). Una preparación típica de ocho GM produce 500 fragmentos de euros. Busque células individuales o gotas de grasa y si hay células contaminantes.
NOTA: Si hay células contaminantes, repita el paso de filtración recogiendo el medio y los fragmentos de la placa de 60 mm utilizando una pipeta de 5 ml y filtrando el fragmento de nuevo a través de un nuevo colador de 70 m, repitiendo los pasos del protocolo 2.6, 2.8-2.10. - Incubar 24 h a 37oC, 5%CO2,permitiendo que el fragmento de tejido se adhiera y genere fragmentos bicapados(Figura 2A).
NOTA:Si los fragmentos no se han liquidado antes de 24 h, continúe incubando hasta que se adhieran. Si los fragmentos no se adhieren bien, la separación de los compartimentos de la celda no funcionará. Si los investigadores están preocupados por la adhesión, las placas de cultivo de tejido se pueden tratar para promover la unión de fragmentos (por ejemplo, poli-L-lisina).
3. Día 3: Trippsinización diferencial de células mioepiteliales y epiteliales luministras
- Para separar los MyoEC de los LECs, vacíe el medio del plato, enjuague 1x con 1 ml de DPBS y agregue 1 ml de trippsina fresca-EDTA (0,05%), y monitoree cuidadosamente la digestión bajo un microscopio invertido (objetivo 10X o 20X, Figura 2B,C,F). El desprendimiento de la capa externa de MyoEC requerirá 3-6 min, dependiendo de la trippsina-EDTA (0,05%) Fuerza.
NOTA: Consulte la Figura 2 para ver las imágenes representativas que muestran este proceso. Bajo iluminación de campo brillante, los MyoECs aparecen redondeados y tienen un aspecto más brillante en comparación con los LEC, que permanecen adheridos en el centro y aparecen más oscuros. - Recoger la fracción MyoEC en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml 10% FBS/DPBS. Sin molestar a los LEC, enjuague suavemente el plato de 60 mm con 2 ml de DPBS y luego deseche el DPBS(Figura 2H-I).
NOTA: La recuperación habitual para los MyoECs está dentro de un rango de (3,5 x 106-1,5 x 106) dependiendo del tamaño de los GM. - Para eliminar la fracción LEC, agregue 1 ml de trippsina-EDTA (0,05%) al plato de nuevo e incubar 7-15 min, monitoreando cuidadosamente para prevenir la sobredigestión. Aquench la trippsina-EDTA (0,05%) en el plato con 2 mL de 10% FBS/DPBS. Recoja la fracción LEC en un nuevo tubo de 15 ml.
NOTA: La recuperación habitual de los LEC está dentro de un rango (2 x 106-4.2 x 106) dependiendo del tamaño de los GM. Rutinariamente, la pureza de ambas fracciones como se ensaya por la inmunohistoquímica es de 90%19 (Figura 2E). - Centrifugar cada fracción durante 5 min a 300 x g para eliminar la trippsina-EDTA (0,05%). Resuspenda el pellet en 250 ml de medio de mantenimiento y cuente cada población celular usando un hemocitómetro o contador de células automatizado. Coloque las células en hielo mientras cuenta.
NOTA: Si se desea la manipulación genética de las fracciones celulares, las células primarias pueden cultivarse en platos de baja adhesión e infectarse con lentivirus20.
4. Día 3: Combinación e incrustación de fracciones celulares en una matriz extracelular
NOTA: Una vez que las fracciones MyoEC y LEC se han recopilado y contado, se pueden combinar. La relación típica de MyoEC/LEC es 1:3(Figura 3A)19. Se pueden realizar diferentes estudios. Por ejemplo, para realizar estudios de mosaico, se pueden generar fracciones a partir de ratones de tipo salvaje (WT) y mutantes (Mut) y combinarse (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, o fracciones se pueden combinar utilizando diferentes proporciones de MyoECs/LECs19.
- En función del recuento de celdas, calcule el número de pozos (8 cámaras de pozos, véase Tabla de materiales)que deben prepararse para 12.000 celdas/pozos (por ejemplo, 3.000 MIC:9.000 LEC).
- Establezca la capa base para el cultivo 3D añadiendo 90 ml de 50% de ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sin rojo fenol - ver la Tabla de Materiales)a cada poca. Asegúrese de que no haya burbujas y que los pozos estén recubiertos uniformemente. Para solidificar la capa base, incubar las diapositivas a 37oC, 5%CO2 durante 30 min.
NOTA: El ECM debe mantenerse helado hasta este paso, de lo contrario se polimerizará prematuramente y conducirá a un recubrimiento base y polimerización desiguales. El uso de un ECM base mejora el crecimiento organoide en un solo plano, lo que ayuda a la captura de imágenes. Esto también obtiene un crecimiento organoide más rápido y utiliza menos ECM22. - Durante la polimerización, prepare las mezclas celulares. Pellet las fracciones MyoEC y LEC a 300 x g durante 5 min y resuspende cada fracción de célula en 10% ECM/90% Medio de Crecimiento para que cada pozo tenga 100 l (ver Tabla 1 para saber cómo hacer Medio de Crecimiento).
NOTA: Para facilitar la preparación, replique los pozos utilizando las mismas mezclas celulares. Estos se pueden combinar y preparar en un tubo (por ejemplo, cuatro pozos de la misma mezcla celular se pueden preparar en 400 l de 10% ECM/90% medio de crecimiento). - Añadir 100 l de cada mezcla celular en 10% ECM/90% Medio de crecimiento a cada poca y permitir que los organoides se asienten durante 20 min a 37 oC, 5% CO2.
- Una vez que las células se hayan asentado, agregue suavemente 100 s de medio de crecimiento pipeteando suavemente la pared de la cámara de cada poca. Incubar las diapositivas a 37oC, 5% CO2 (ver Figura 3A para la composición total de cada pociembre).
NOTA: El inhibidor de Rho Kinase, R-spondin y Nrg1 son factores que han sido identificados como importantes para el cultivo a largo plazo de organoides cultivados a partir de células mamarias murinas primarias y células de cáncer de mama humano13,14. Además, los factores de células madre B27 y N2 extienden el tiempo que se pueden cultivar organoides. - Las celdas de la imagen cada 24 h para realizar un seguimiento de su crecimiento y renovar suavemente el Medio de Crecimiento cada 2-3 días usando 100 l/bien(Figura 3B-E).
NOTA: Tenga mucho cuidado al renovar el medio. Incline las diapositivas de la cámara para recoger el medio en una esquina de los pozos. Retire los 100 s del medio y reponga con cuidado para dejar la capa de ECM intacta. - Si los investigadores están interesados en investigar la lactancia/alveologénesis, cambie al medio de alveologénesis (véase el cuadro 1) el día 5 y continúe renovando el medio cada 2-3 días hasta el día 10(Figura 3F)o más allá mediante el paso mediante la solución de recuperación (véase la Tabla de Materiales)13.
NOTA: En este punto, los organoides se pueden aislar del ECM incubando a 4 oC en 400 oC de solución de recuperación de 4 oC (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el protocolo y el reactivo).
5. Día 5 o 10: Fijación e inmunostainción de organoides
- Retire el medio cuidadosamente pipeteando suavemente el medio (una pipeta de bombilla funciona mejor). Enjuague cada pocal con 200 ml de 1 salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS, ver recetas).
- Fijar los organoides usando frío (4 oC) 4% (p/v) paraformaldehído (PFA, ver recetas) durante 10 min a temperatura ambiente.
ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa. Use equipo de protección personal (abrigo de laboratorio, guantes y gafas de seguridad). Este paso debe realizarse dentro de una campana de humos.
NOTA: El ECM se disuelve mediante el tratamiento con PFA. La eliminación incompleta de ECM puede conducir a la tinción de fondo cuando los organoides son analizados por inmunofluorescencia. - Retire el 4% de PFA y añada 200 ml de glicina/DPBS al 4% (véase la Tabla 1)a cada pocal. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos o 4 oC durante la noche en una superficie de balanceo en un ajuste lento.
NOTA: Los organoides se pueden almacenar durante 1-3 días en DPBS a 4 oC antes del siguiente paso. - Permeabilizar los organoides utilizando DPBS + 0.25% Triton X-100 (PBST, ver Tabla 1) durante 10 min a temperatura ambiente.
- Bloquear los organoides usando un 5% de suero de burro (DS) (u otro suero que coincida con las especies del anticuerpo secundario) en DPBS durante 1 h en una superficie de balanceo.
NOTA: Este paso se puede realizar durante la noche a 4 oC sobre una superficie de balanceo. - Preparar anticuerpos primarios en 1% DS/DPBS. Utilice 125-200 l para cada pocto. Realizar inmunomanchas incubando los organoides en anticuerpos primarios durante la noche a 4oC sobre una superficie mecedora.
6. Día 11: Inmunofluorescencia completa
- Lavar cada poca tope 2 veces con 200 s de PBST durante 5 min. Añadir anticuerpo secundario en 1% DS/DPBS usando 125-200 l para cada poc. Incubar a temperatura ambiente sobre una superficie de balanceo durante 45 min.
- Lave cada poca 2 veces con 200 PBST por poca.
- Mancha los núcleos utilizando el tinte de ADN Hoechst en DPBS (1:2,000 en DPBS) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire todo el líquido que queda en el pozo succionar suavemente con un vacío.
- Retire cuidadosamente las cámaras y la junta, coloque una gota (30 l) de los medios de montaje (ver Tabla de materiales)en cada pocal y cubra, teniendo cuidado de eliminar las burbujas. Deje que la diapositiva se seque en un espacio oscuro durante 1-2 días. Selle con esmalte de uñas transparente. Imagen de los organoides en un microscopio confocal(Figura 3E-F).
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Representative Results
El protocolo presentado aquí describe un método para investigar las contribuciones específicas del linaje de las células epiteliales mamarias mediante el uso de organoides de mosaico. Para obtener células murinas primarias para organoides, el epitelio de la glándula mamaria primero debe aislarse del estroma rico en adipocitos circundantes(Figura 1). Este proceso se describe brevemente aquí y también se describe en un estudio publicado anteriormente18. Para obtener suficientes celdas, se recomienda que se eliminen #2, 3, 4 y 5 GM(Figura 1A). Un paso importante para aislar una población pura de células epiteliales es la eliminación de los ganglios linfáticos de los #4 los grupos de seguridad, que son ricos en células inmunitarias que contaminarán la preparación(Figura 1A,B). Los GM se incluyeron para generar fragmentos de 0,1 mm de tamaño(Figura 1B). Los fragmentos de tejido fueron entonces digeridos enzimáticamente, un proceso que ocurre en presencia de colagenasa, para liberar la epitelia del estroma, y en ausencia de trippsina, para prevenir la digestión de proteínas como las cadherrinas que mantienen los contactos celulares. El tejido digerido se centrifugaba para eliminar los lípidos y se filtraba a través de un colador celular y se lavaba(Figura 1C). Los fragmentos epiteliales, adhiriéndose al colador, se liberaron invirtiendo el filtro y lavando la membrana, que transfirió los fragmentos epiteliales a un plato de poliestireno(Figura 1D). Estos fragmentos aparecieron como pequeñas estructuras ramificadas(Figura 1E).
Los fragmentos epiteliales purificados fueron incubados durante 24 h. Se asentaron en el plato y se adhirieron, formando estructuras planas, similares a panqueques con una capa externa de MyoEC que rodean los LECs internos(Figura 2A-B). La Figura 2C muestra el borde de una estructura similar a un panqueque de un animal de tipo salvaje. El tratamiento con trippsina separó diferencialmente de los MyoECs, que se separaron primero y aparecieron como células brillantes y redondeadas que rodeaban el núcleo de los LEC cuboidales restantes(Figura 2C,F). El desprendimiento de los MyoECs fue cuidadosamente monitoreado usando microscopía de campo brillante y ocurrió dentro de 3-6 min. Una vez recogidos los MEC, los LEC se separaron posteriormente a través de un segundo tratamiento de trippsina más largo de 7-15 min. El tiempo necesario para el desprendimiento celular depende de la concentración de tripsina y la frescura. La pureza general de los dos compartimentos celulares fue del 90%, como se ha logrado contando las células que fueron KRT14-positivas y E-Cadherin (CDH1)-negativo en la fracción MyoEC y las células que fueron KRT14-negativas y E-Cadherin-positivas en la fracción LEC (Figura 2D-E)19. Descubrimos que algunos de los MyoECs fueron retirados de la parte superior de la estructura similar a panqueques, así como de los bordes exteriores. Esto se observó mediante el uso de fragmentos de tejido recogidos de ratones etiquetados con un marcador basal fluorescente inducible (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) e inyectado con 75 mg/kg de tamoxifeno 5 días antes de la cosecha. En la Figura 2F,G el desprendimiento de MyoECs alrededor de los bordes de la estructura del panqueque es fácilmente evidente. Esto ocurrió dentro de los primeros 2 minutos de tratamiento con trippsina(Figura 2F). Además, se observaron células positivas YFP-KRT14 en la parte superior de la estructura, donde se redondearon después del tratamiento con trippsina y se retiraron mediante el paso de enjuague/recogida(Figura 2G). El núcleo no etiquetado de leC(Figura 2H), que contenía pocas o ninguna células yfp-KRT14 positivas,(figura 2I)se desprendía posteriormente en la segunda ronda de tratamiento con trippsina.
Las fracciones MyoEC y LEC fueron recolectadas, combinadas e incrustadas en un 10% de ECM chapado en una base de ECM del 50%. Esto permitió una mejor resolución óptica de los organoides que crecían principalmente a lo largo de la capa base(Figura 3A). Después de las 24 h, las células se ensamblaban en estructuras agregadas que en gran medida carecía de un lumen(Figura 3B). Después de 48 h, organoides nacientes se formaron como los lúmenes centrales huecos y aparecieron como un espacio interno más ligero(Figura 3C). Después de 10 días, los organoides eran grandes estructuras ramificadas con lúmenes bien desarrollados. Los organoides de mosaico generados a partir de MyoEC cosechados a partir de ratones de tipo salvaje y LECs cosechados de ratones ACTb-EGFP se fijaron in situ, se inmunomancharon con un anticuerpo contra el marcador basal de actina muscular alfa-suave (SMA), y se mancharon con la mancha de ADN Hoechst para mostrar los núcleos. En las figuras, las vistas superior y en sección muestran diferentes conjuntos de imágenes recopiladas como una pila Z y reconstruidas en una vista 3D(Figura 3D). La vista superior revela la morfología ramificada de los organoides(Figura 3E'). La vista en sección muestra la estructura epitelial bicapa y el lumen abierto de estos organoides(Figura 3E''). Estos organoides también se pueden diferenciar en el día 5 utilizando el medio de alveologénesis y se pueden incubar durante 5 días adicionales(Figura 3F). Los organoides se hicieron más grandes, tenían más ramas y contenían leche. Los organoides diferenciados se generaron como se describió anteriormente e inmunomanchados con un anticuerpo dirigido contra el marcador de leche, proteína ácida de suero de leche (WAP, Figura 3F). WAP es una proteína soluble secretada en la leche. Gran parte de este líquido se perdió cuando las células se fijaron e inmunomancharon in situ. Por lo tanto, en las vistas superior y en sección, la tinción WAP es visible intracelularmente en las células secretas y extracelularmente en la leche que quedó atrapada en la superficie celular durante la fijación(Figura 3F), aunque en vista de sección un pequeño organoide parece contener leche líquida(Figura 3F'' superpuesta en caja).
Figura 1: Aislamiento del fragmento de mamío. (A) Esquema etiquetado de los 5 MM de un ratón con MG emparejados contralaterales sin etiquetar. (B) Imágenes de LOS MG de ratón con el #4 MG en caja y magnificados para mostrar cómo identificar el nodo linfático para la extracción. (C) Imagen de los GM picados en una placa de adhesión de 6 pocillos bien con una regla que muestra el tamaño de las piezas de tejido (0,1 mm cada una). (D-E) Pasos del protocolo de ilustración esquemática 2.7-2.9. (D) Los fragmentos de MG se filtraron a través de un colador de 70 m y se enjuagaron 4Veces. (E) El colador se invirtió sobre un plato de cultivo de tejido de poliestireno de 60 mm y se liberaron fragmentos en el plato. (F) Imagen que muestra los fragmentos de tejido filtrado recogidos en un plato de 60 mm que están libres de estroma. Las flechas apuntan a los fragmentos más pequeños que se recogen en el colador de 70 m. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Trippsinización diferencial. (A) Imagen de Brightfield que muestra un fragmento de tejido adherido en un plato de poliestireno, formando una estructura similar a un panqueque. (B-C) El primer paso de trippsinización diferencial desprendió MyoEC que son claramente visibles como células brillantes y redondeadas después de 3 min. (D) Imágenes inmunofluorescentes de MyoEC (abajo) y LEC (arriba) utilizando el marcador celular Cytokeratin 14 (KRT14) para MyoEC, y marcador celular E-Cadherin (CDH1) para LECs. (E) La expresión de KRT14 y CDH1 se utilizó para cuantificar el rendimiento y la pureza de las fracciones celulares diferenciadas. (F-I). Imágenes representativas de contraste de fase y fluorescencia (YFP) de fragmentos de tejido de Cytoqueratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. Se inyectaron ratones con 75 mg/kg de tamoxifeno 5 días antes de la cosecha. (F) Separación de MyoECs (flechas) durante la trypsin-EDTA inicial (0,05%) 2 min después de la incubación. (G) Un aspersión de KRT14-YFP-MyoECs (flechas) en la parte superior de un panqueque de LECs sin etiquetar. (H) Imagen de Brightfield de LECs después de la trippsinización inicial y el desprendimiento de MyoEC. (I) Después del desprendimiento de MyoEC, los KRT14-YFP-MyoEC ya no son visibles como se muestra por la ausencia de expresión YFP. Barras de escala a 30 m (A, campo brillante) 100 m (F, campo brillante), 50 m (G, fluorescencia), 100 m (H,I). Los paneles A-E de esta figura se modifican de Macias et al.19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo organoide tridimensional. (A) Representación esquemática de células individuales incrustadas en un 10% de ECM/90% de medio de crecimiento y cultivadas en una capa base de 50% ECM/50% DMEM (paso de protocolo 4.5). (B-C) Ilustraciones e imágenes de contraste de fase que muestran las capacidades rápidas de autoorganización de los organoides mamarios generadas a partir de MioCE y LECs retrotratados y recombinados diferencialmente a 24 h (B) y 48 h (C). Imágenes recopiladas con un microscopio digital de campo ancho (D) Representación esquemática que ilustra las vistas superior (izquierda) o sección (derecha) utilizadas en E-F para mostrar organoides inmunoconservados. (E) Representación esquemática de un solo pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos que contiene organoides mamarios cultivados durante 5-10 días en medio de crecimiento. (E'-E") Vista superior (E') y vista en sección (E") de organoides inmunomanchados en el día 10 de crecimiento. Los mioCE están marcados con músculo actina suave (SMA) en pseudocolor magenta. Los LEC son de ratones ACTb-EGFP y se muestran en verde pseudocolor. Los núcleos se tiñieron con tinte Hoechst. (F) Representación esquemática de un solo pozo de un tobogán de cámara de 8 pozos que contiene organoides mamarios cultivados durante 5 días en Medio de Crecimiento y 5 días en Medio de Alveologénesis. (F'-F"). Vista superior (F') y vista en sección (F") de organoides inmunomanchados en el día 10 de crecimiento. Los MyoECs no están marcados. Los LEC de los ratones ACTb-EGFP se muestran en verde pseudocolor. La proteína láctea, la proteína ácida de suero de leche (WAP), se muestra en pseudocolor amarillo en los LEC y cubriendo el interior de los lúmenes de los organoides. Los núcleos se tiñieron con tinte Hoechst. Imágenes recogidas con un microscopio confocal de disco giratorio y reconstruidas en 3D utilizando Imaris (E', E') o la sección inferior 30 rebanadas (F', F"). Barras de escala a 100 m (C), 20 m (E), 40 m (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 10 mL | Medio de digestión | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 9,45 ml | DMEM/F12 | |
| 100 l | Antibiótico-Antimicótico (100X) | |
| 0,04 g | Clase 3 Colagenasa | |
| 0,04 g | Dispensación de clase 2 | |
| 50 l | Gentamicina | Concentración final: 500 g |
| 2,5 ml | Suero Bovino Fetal | Concentración final: 5% (v/v) |
| Pasar a través del filtro de 0,22 m | ||
| 50 mL | Medio de mantenimiento | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 49,47 ml | DMEM/F12 | |
| 0,5 ml | Antibiótico-Antimicótico (100X) | |
| 2,5 ml | Suero Bovino Fetal | Concentración final: 5% (v/v) |
| 25 l | Insulina | Concentración final: 250 g |
| 5 l | Egf | Concentración final: 500 ng |
| 10 mL | Medio de crecimiento | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, sin rojo fenol | |
| 100 l | Suplemento N-2 (100x) | |
| 200 l | Suplemento B27 sin vitamina A (50x) | |
| 10 l | Nrg1 | Stock: 100 g/ml |
| 42,5 l | R-spondin | Stock: 10 g/ml |
| 1 L | Inhibidor Rho Y-27632 | Stock: 10 m |
| 1 L | Egf | Stock: 0,1 g/L |
| 10 mL | Medio de alveologénesis | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, sin rojo fenol | |
| 100 l | Suplemento N-2 (100x) | |
| 200 l | Suplemento B27 sin vitamina A (50x) | |
| 10 l | Nrg1 | Stock: 100 g/ml |
| 42,5 l | R-spondin | Stock: 10 g/ml |
| 1 L | Inhibidor Rho Y-27632 | Stock: 10 m |
| 5 l | Prolactina pituitaria ovino | Concentración final: 1 g/ml |
| 1 L | Dexametasona | Concentración final: 5 g/ml |
| 5 l | Insulina | Concentración final: 5 g/ml |
| 1 L | 10X DPBS | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | Kcl | |
| 14,4 g | NaH2PO4 | |
| 2,4 g | KH2PO4 | |
| 1 L | di H2O | |
| Llene a 800 ml antes de añadir reactivos secos y disolver. Volumen de llenado a 1 L. Ajuste el pH a 7.4. Autoclave para esterilizar. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 100 ml | 10x PBS | |
| 900 ml | di H2O | |
| 1 L | PBST | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 100 ml | 10x PBS | |
| 2,5 ml | Tritón X-100 | |
| 250 ml | 4% Paraformaldehyde | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 10 g | Paraformaldehido | |
| 200 ml | di H20 | el agua debe estar a 60 oC |
| 25 mL | 10X DPBS | |
| 50 l | 10 N Hidróxido de sodio | |
| Pasar a través de un filtro de 0,45 m para esterilizar y asegurar que el pH es 7,4 | ||
| 10 mL | 1 % Suero de burro | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 100 l | Suero de burro filtrado estéril | |
| 9,9 ml | 1X DPBS | |
| 10 mL | 0.2% Glicina | |
| Cantidad | Reactivo | Notas |
| 0.02 g | Glicina | |
| 10 mL | 1X DPBS | |
Tabla 1: Recetas de solución.
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Discussion
Aquí, se presenta un método que detalla cómo los investigadores pueden generar cultivos organoides 3D utilizando células MG primarias. La diferencia entre este y otros protocolos es que detallamos un método para separar los dos compartimentos celulares MG distintos: los Miciscos basales externos y los LEC internos. Nuestro método emplea una trippsina-EDTA de dos pasos (0,05%) tratamiento que llamamos trippsinización diferencial19. Este procedimiento permite a los investigadores aislar MyoEC y LECs sin utilizar sofisticadacitometría de flujo y por lo tanto se puede utilizar para el estudio de los GM cosechados de una amplia variedad de especies de mamíferos que pueden no tener los biomarcadores bien caracterizados requeridos para FACS. La capacidad de segregar las subpoblaciones de dos células permite a los investigadores modificar genéticamente las células aisladas de forma independiente o recombinar células de animales que albergan mutaciones genéticas o etiquetas, y así generar organoides de mosaico en el cultivo 3D. Una limitación del protocolo actual es que el compartimiento estrobar no está incluido en las condiciones de cultivo. Sin embargo, se están desarrollando nuevos métodos para cocultivar componentes estromales con organoides generados a partir de células primarias o líneas celulares para recapitular mejor in vivo ECM23,,24,,25,,26, y estos métodos pueden adaptarse a este protocolo. Además, es importante señalar que si bien este protocolo logra un gran enriquecimiento de las fracciones MyoEC y LEC (purificación del 90%), las fracciones no representan linajes celulares puros.
El éxito de este protocolo se basa en una serie de pasos clave. En primer lugar, es importante digerir suavemente pero a fondo el tejido MG. La sobredigestión del tejido conducirá a la muerte celular y a una menor recuperación de las células epiteliales. La digestión incompleta dará lugar a contaminación de células estromales y adiposas, que interferirá con análisis posteriores (por ejemplo, inmunofluorescencia, análisis de proteínas y mediciones de ARNm). En segundo lugar, es importante enjuagar a fondo el tejido MG para eliminar las células contaminantes en el paso de protocolo 2.8. En el paso de protocolo 2.9, los fragmentos de tejido MG se liberan en un plato de 60 mm. Los investigadores deben monitorear los fragmentos liberados inmediatamente, antes de que se adhieran al plato. Si se observan gotas de grasa o células individuales, se deben repetir los pasos de protocolo 2.6 y 2.8-2.11. Para ello, los fragmentos medios y tisulares se recogen del plato, se colocan en un nuevo colador de 70 m, se lavan 4X con 37 oC DMEM/F12 y luego se liberan en un nuevo plato de 60 mm. En tercer lugar, es esencial observar la primera trippsina-EDTA (0,05%) incubación de cerca porque los MyoECs pueden desprenderse dentro de los primeros 3 min, pero también pueden adherirse hasta 6 min. Ha habido casos en los que la trippsina-EDTA (0,05%) fue subóptimo, y la incubación procedió durante 10 minutos con la purificación exitosa de myoECs. Sin embargo, >10 min de trippsinización dio lugar a la recopilación simultánea de MyoECs y LEC. También es importante que el plato permanezca inalterado durante la primera incubación. De lo contrario, puede producirse contaminación de la fracción MyoEC con LECs. Lo contrario también es cierto; si los MyoECs no están completamente separados del plato, contaminarán la fracción LEC. Si los investigadores utilizan ratones reportero que etiquetan exclusivamente a los Mic o LEC, es más fácil visualizar la separación bajo un microscopio de fluorescencia(Figura 2F-I). Por último, si los investigadores planean fijar los organoides para los análisis de inmunofluorescencia, el pH (7,4) y la temperatura (4 oC) del 4% de PFA son importantes para la disociación exitosa del ECM. Si los organoides se recogen para otros análisis (por ejemplo, mediciones de proteínas y ARNm), es importante que la solución de recuperación esté a 4 oC. Si el ECM no se está disolviendo, la incubación con la solución de recuperación se puede extender por 10 min (es decir, 30 min de incubación total). Sin embargo, períodos de incubación más largos conducirán a la pérdida de la estructura 3D y la muerte celular. El protocolo de recuperación (incluido en la Tabla de materiales)especifica el uso de puntas de diámetro ancho. Esto es importante para mantener la estructura 3D de los organoides, así como la integridad de las células.
Además de estos cuatro pasos clave, hay dos factores que influyen en el éxito del protocolo. En primer lugar, el crecimiento organoide puede estar limitado por mutaciones genéticas que reducen la proliferación celular y, por lo tanto, reducen el crecimiento organoide en ECM. Si sólo se obtienen unos pocos organoides, el paso de fijación posterior con frecuencia resulta en su pérdida. Para abordar esto, el número de células incrustadas dentro del ECM debe aumentarse conservando la relación de MyoECs:LECs (pasos de protocolo 4.1-4.2). En segundo lugar, una vez que las células se transfieren a un ECM es importante vigilar su crecimiento diariamente y estar atentos a la renovación de los medios de comunicación (cada 2-3 días). Este protocolo especifica reactivos libres de fenol rojo para una mejor visualización, pero el mismo éxito y crecimiento se logra utilizando reactivos positivos rojo fenol. Los días en que se produce una renovación media antes de la fijación (paso 4.6 del protocolo) deben realizarse con extremo cuidado para reducir la pérdida celular. La capa superior 10% ECM es delicada; por lo tanto, los lavados o la renovación media deben realizarse pipeteando el líquido por las paredes de la cámara para minimizar las perturbaciones mecánicas.
Diferenciación de los organoides en acini productor de leche requiere tratamiento con suplementos de diferenciación: hidrocortisona o dexametasona, insulina, y prolactina. En este protocolo, se recomienda la dexametasona. Además, mientras que la prolactina está disponible comercialmente, la prolactina utilizada en este protocolo se obtuvo del Programa Nacional de Hormonas y Péptidos. Una vez más, es muy importante dejar los organoides intactos al cambiar el medio de alveologénesis. La diferenciación requiere un mínimo de 5 días. Esto se puede extender otros 3-5 días, pero la capa base de ECM se degrada después de 10-12 días. Los organoides diferenciados están llenos de leche y sus lúmenes parecen más oscuros.
Esta es una técnica eficiente que se puede utilizar para abordar contribuciones de linaje específicas del compartimiento a la morfogénesis epitelial mamaria y la diferenciación. Con esta técnica, los investigadores pueden generar organoides de mosaico que comprenden MyoECs y LECs manipulados genéticamente diferencialmente21,o MicyE CICOS y LECs obtenidos a partir de ratones que albergan diferentes mutaciones genéticas. Esto permite a los investigadores comprender mejor las contribuciones de los compartimentos celulares específicos del linaje a la morfogénesis de órganos y la adquisición de funciones especializadas como la producción de leche.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Ben Abrams por la asistencia técnica y el apoyo básico del Instituto de La Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) para la Biología de las Células Madre (IBSC). Agradecemos a Susan Strome y Bill Saxton por el uso de su solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones a la UCSC del Instituto Médico Howard Hughes a través del programa James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), del NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y desde la Fundación Nacional de Ciencias para una beca de investigación de posgrado (O.C. DGE 1339067) y por una beca (A18-0370) del Comité coordinador de investigación del cáncer de UC (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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