Summary
La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.
Abstract
Gli organiidi offrono strutture tissutali tridimensionali auto-organizzanti che riassumono i processi fisiologici nella comodità di un piatto. La ghiandola mammaria murina è composta da due distinti compartimenti cellulari epiteliali, che servono diverse funzioni: l'esterno, il compartimento mioeile contrattile e il compartimento luminoso interno e secretorico. Qui, descriviamo un metodo con cui le cellule che compongono questi compartimenti vengono isolate e poi combinate per studiare i loro contributi individuali di lignaggio alla morfogenesi e differenziazione della ghiandola mammaria. Il metodo è semplice ed efficiente e non richiede sofisticate tecnologie di separazione come lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza. Invece, raccogliamo e digeriamo enzimaticamente il tessuto, seminamo l'epitelio su piatti di coltura tissutale aderenti, e poi usiamo la provadifferenziata per separare il mioepitheal dalle cellule luminali con purezza del 90%. Le cellule vengono poi placcate in una matrice extracellulare dove si organizzano in organoidi bistrato tridimensionali (3D) che possono essere differenziati per produrre latte dopo 10 giorni di coltura. Per testare gli effetti delle mutazioni genetiche, le cellule possono essere raccolte da modelli murini di tipo selvatico o geneticamente modificati, oppure possono essere geneticamente manipolate prima della coltura 3D. Questa tecnica può essere utilizzata per generare organoidi a mosaico che consentono di sapieggiare la funzione genica specificamente nel compartimento luminooso o mioepitele.
Introduction
La ghiandola mammaria (MG) è una struttura epiteliale tubolare simile ad un albero incorporata all'interno di uno stroma ricco di adipociti. L'epitelio duttale bistrato comprende uno strato basale esterno e basale di contratture, cellule mioepiteliali (MyoEC) e uno strato interno di cellule epiteliali luminali e secretorie (LEC), che circondano un lumaro centrale1. Durante l'allattamento, quando i myoEC esterni si contraggono per spremere il latte dai LEC dell'alveolar interno, la MG subisce numerosi cambiamenti che sono sotto il controllo dei fattori di crescita (ad esempio, EGF e FGF) e degli ormoni (ad esempio progne, insulina e prolattina). Questi cambiamenti causano la differenziazione delle strutture specializzate, gli alveoli, che sintetizzano e secernono il latte durante l'allattamento1. L'epitelio mammario può essere manipolato sperimentalmente utilizzando tecniche in cui sia frammenti di tessuto epiteliale, cellule, o anche una singola cellula basale vengono trapiantati in cuscinetti di grasso mammari ospiti, precleared di parenchyma mammario endogeno, e lasciato crescere per ricostituire un intero albero epileliale funzionale2,3,4,5. Il trapianto è una tecnica potente, ma richiede tempo e impossibile se una mutazione si traduce in una prima letalità embrionale (prima dell'E14) che impedisce il salvataggio dell'anlage mammario trapiantabile. Inoltre, i ricercatori desiderano spesso ricercare i ruoli dei due diversi comparti, che derivano da cellule progenitrici soggette a restrizioni di lignaggio. Mentre la tecnologia Cre-lox consente la manipolazione genetica differenziata di myoEC e LEC, questa è anche un'impresa lunga e costosa. Così, fin dagli anni '50, gli investigatori hanno usato organoidi mammari in vitro come un modo relativamente semplice ed efficiente per affrontare le questioni riguardanti la struttura e la funzione del tessuto mammario6,7.
Nei primi protocolli che descrivono l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali mammarie primarie, i ricercatori hanno scoperto che una matrice di membrana seminterrato (BME), composta da un coagulo di plasma ed estratto di embrione di pollo, era necessaria per frammenti di MG coltivati su un piatto6. Nei decenni successivi, le matrici extracellulari (ECU, collagene e matrice proteica gelatina secreta dalle cellule del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm) sono state sviluppate per facilitare la coltura 3D e imitare meglio l'ambiente in vivo7,8,9,10. Cellule cullanti in matrici 3D hanno rivelato da molteplici criteri (morfologia, espressione genica e reattività ormonale) che un tale microambiente migliori modelli in vivo fisiologici processi fisiologici9,10,11,12. La ricerca sulle cellule murine primarie ha identificato i fattori di crescita chiave e i morfogeni necessari per la manutenzione prolungata e la differenziazione degli organoidi13. Questi studi hanno posto le basi per il protocollo qui presentato, e per la coltura delle cellule mammarie umane come organoidi 3D, che è ora uno strumento clinico moderno, consentendo la scoperta di farmaci e test farmacologici su campioni di pazienti14. Nel complesso, la coltura organoide mette in evidenza le capacità di auto-organizzazione delle cellule primarie e il loro contributo alla morfogenesi e alla differenziazione.
Presentato qui è un protocollo alla cultura murine epitelia che può essere differenziato in acini di produzione di latte. Una tecnica di prova differenziale viene utilizzata per isolare i MyoEC e i LEC che compongono i due distinti compartimenti delle cellule MG. Queste frazioni cellulari separate possono quindi essere geneticamente manipolate per sovraesprimere o abbattere la funzione genica. Poiché lignaggio-intrinseco, l'auto-organizzazione è una proprietà innata delle cellule epiteliali mammarie15,16,17, ricombinando queste frazioni cellulari permette ai ricercatori di generare organoidi bistrato. Iniziamo digerindo enzimaticamente il tessuto adiposo, e poi incubando i frammenti mammari su un piatto di coltura dei tessuti per 24 h (Figura 1). I frammenti di tessuto si depositano su piatti di polistirolo come frammenti bistrato con la loro organizzazione in vivo: strato mioeelistiale esterno che circonda strati luminali interni. Questa organizzazione cellulare consente l'isolamento dei MyoEC esterni da trypsin-EDTA (0,05%) trattamento per 3-6 min seguito da un secondo giro di trippsina-EDTA (0,05%) trattamento che stacca i restanti LEC interni (Figura 2). Pertanto, questi tipi di cellule con diversa sensibilità alla trypsina sono isolati e possono essere successivamente miscelati e placcati in ECM (Figura 3). Le cellule si sottopono all'auto-organizzazione per formare sfere a scansione, che comprendono uno strato esterno di MyoEC che circondano i LEC interni. La formazione del lume si verifica quando le cellule crescono in un mezzo contenente un cocktail di fattori di crescita (vedi ricette per Mezzo di crescita)13. Dopo 5 giorni, gli organoidi possono essere differenziati in acini che producono latte passando all'Alveologenesi Medium (vedi ricette e Figura 3F)e incubati per altri 5 giorni. In alternativa, gli organoidi continueranno ad espandersi e a ramificarsi in Growth Medium per almeno 10 giorni. Gli organiidi possono essere analizzati utilizzando l'immunofluorescenza (Figura 3D-F) o rilasciati dall'ECM utilizzando una soluzione di recupero (cfr. tabella dei materiali)e analizzati tramite altri metodi (ad esempio, immunoblot, RT-qPCR).
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, Santa Cruz.
1. Giorno 1: Digestione della ghiandola mammaria
- Prepararsi a raccogliere le MG da topi femmine maturi 10-14 settimane di età.
- Eseguire la raccolta su un banco aperto in condizioni asettiche.
- Sterilizzare tutte le forniture chirurgiche, tavole di sughero, e perni da autoclaving e ammollo in 70% alcol per 20 min prima dell'intervento chirurgico.
- Anestetizza gli animali con pentobarbital di sodio (2X dose anestetica di 0,06 mg/g di peso corporeo) somministrati tramite iniezione intraperitoneale con una siringa insulinica da 0,5 ml.
- Monitorare il livello di anestesia pizzicando le dita dei dei pipi' dell'animale per verificare la presenza di una risposta riflessiva e iniziare il protocollo solo dopo che l'animale è completamente anestesizzato.
- Posizionare l'animale sulla schiena, pinare le sue appendici alla tavola di sughero, e pulire il suo addome e petto con etanolo.
- Per raccogliere i #2, 3, 4 e 5 MG da un topo (cioè 8 MG, Figura 1A), identificare la linea mediana tra le due zampe posteriori e fare una piccola incisione (1 cm) sulla pelle addominale con forbici affilate, quindi estendere il taglio fino al collo18.
- Seguire facendo piccoli tagli lateralmente verso le gambe e le braccia per consentire il rilascio della pelle utilizzando un tampone di cotone. Tirare la pelle e allungarla stretta prima di apporrla su un lato (Figura 1B,passaggio 1)18. Rimuovere gli MG tagliando sotto di essi e rimuovere i linfonodi dalle ghiandole #4(Figura 1B, passaggi 2, 3)18. Ripetere la procedura sull'altro lato del corpo.
- Raccogliere il tessuto MG in 50 mL di 4 .C's Modified Eagle's Media (DMEM)/Miscela Nutriente F12 (F12) integrato con il 5% di siero bovino fetale (FBS) e 1X Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)18.
- Tritare le ghiandole in un piatto da 35 mm o su un piatto di ceramica utilizzando una lama di rasoio o un elicottero di tessuto. Ruotare la piastra ogni cinque braciole manuali o ogni giro sull'elicottero di tessuto fino a quando i pezzi di tessuto possono essere montati attraverso una punta di micropipette da 1 mL con facilità (0,1 mm/frammento, Figura 1C).
- Digerire gli MG in Digestione Media (cfr. tabella 1)per 14 h in un piatto di adesione ben basso a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.
2. Giorno 2: Isolamento dei frammenti di tessuto epiteliale mammario
- Dopo 14 h di digestione, mescolare delicatamente pipeting il tessuto digerito 10X utilizzando una micropipetta da 1 mL per abbattere qualsiasi stroma o tessuto adiposo rimanente, assicurando che non vengano generate bolle né forza meccanica in eccesso.
NOTA: Se c'è una digestione incompleta dopo 14 h, ciò potrebbe essere dovuto all'accumulo di DNA tranè. In questo caso, aggiungere 1 L di 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) per 2 mL di Digestione Media. Incubare per altri 30 min a 37 , 5% CO2. - Raccogliere il tessuto in un tubo da 15 mL e risciacquare il pozzo utilizzato per la digestione con 2-3 mL di coltura tissutale grado 1X Dulbecco fosfato buffered Saline (DPBS) libero da Ca2 e Mg2. Centrifuga a 600 x g per 10 min.
- Evacuare il soldante contenente lo strato lipidico e il mezzo, quindi risospendere il pellet in 5 mL di DPBS e passare a un nuovo tubo da 15 mL. Centrifuga a 600 x g per 10 min.
- Durante la centrifugazione posizionare un colino a celle di nylon di 70 m in un tubo da 50 ml e il colino preliminare utilizzando 10 mL di 37 m DMEM/F12.
- Risospendere i frammenti di tessuto dal passaggio 2.4 del protocollo utilizzando 5 mL di DPBS e passare la sospensione attraverso un colino a celle di nylon da 70 m per rimuovere le cellule stromali e le singole cellule (Figura 1D).
- Raccogliere i frammenti di tessuto sul colino cellulare. Risciacquare 4X con 10 mL di 37 gradi centigradi/F12 (Figura 1D).
AVVISO: il risciacquo incompleto si tradurrà in colture contaminate da cellule non epiteliali. - Rilasciare i frammenti di tessuto tenendo la linguetta del colino con le dita guantate, invertendo il colino su un piatto di coltura dei tessuti di 60 mm e passando 1 mL di Livelli di Manutenzione (vedi Tabella 1) attraverso il fondo del colino 4X (Figura 1E).
- Controllare il colino per i resti dei frammenti di tessuto, che saranno visibili ad occhio nudo, e risciacquare il colino 1X in più con 1 mL di manutenzione media se eventuali frammenti sono ancora aderendo al colino. I frammenti di tessuto sciacquato dovrebbero ora essere privi di cellule stromali.
- Esaminare rapidamente il piatto da 60 mm contenente i frammenti di MG del protocollo step 2.9 al microscopio invertito (obiettivo 4X o 10X, Figura 1F). Una tipica preparazione di otto MG produce 500 frammenti. Cercare singole cellule o goccioline di grasso e se ci sono cellule contaminanti.
NOTA: Se ci sono cellule contaminanti, ripetere la fase di filtrazione raccogliendo il mezzo e frammenti dal piatto da 60 mm utilizzando una pipetta da 5 mL e filtrando nuovamente il frammento attraverso un nuovo colino da 70 m, ripetendo i passi del protocollo 2.6, 2.8-2.10. - Incubare 24 h a 37 , 5% CO2, permettendo al frammento di tessuto di aderire e generare frammenti bistrato (Figura 2A).
NOTA:Se i frammenti non si sono stabilizzati di 24 h, continuare a incubare fino a quando non sono stati aderitati. Se i frammenti non aderiscono bene, la separazione dei compartimenti delle celle non funzionerà. Se i ricercatori sono preoccupati per l'adesione, le piastre di coltura dei tessuti possono essere trattate per promuovere l'attaccamento del frammento (ad esempio, poli-L-lisina).
3. Giorno 3: prova differenziale delle cellule epiteliali mioee e luminali
- Per separare i MyOEC dai LEC, svuotare i supporti dal piatto, risciacquare 1x con 1 mL di DPBS e aggiungere 1 mL di trifoglio-EDTA fresco (0,05%) e monitorare attentamente la digestione sotto un microscopio invertito (10X o 20X obiettivo, Figura 2B,C,F). Il distacco dello strato MyoEC esterno richiederà 3-6 min, a seconda della trypsin-EDTA (0,05%) Forza.
NOTA: Vedere la figura 2 per le immagini rappresentative che mostrano questo processo. Sotto l'illuminazione di campo luminoso, i myoEC appaiono arrotondati e hanno un aspetto più luminoso rispetto ai LEC, che rimangono aderente al centro e appaiono più scuri. - Raccogliere la frazione MyoEC in un tubo da 15 mL contenente 2 mL 10% FBS/DPBS. Senza disturbare i LEC, sciacquare delicatamente il piatto da 60 mm con 2 mL di DPBS e quindi smaltire il DPBS (Figura 2H-I).
NOTA: il ripristino abituale per i MyoEC è compreso in un intervallo compreso tra (3,5 x 106-1,5 x 106)a seconda delle dimensioni degli MG. - Per rimuovere la frazione LEC, aggiungere 1 mL di trypsin-EDTA (0,05%) al piatto di nuovo e incubare 7-15 min, monitorando attentamente per evitare sovradigestione. Spegnire la trypsin-EDTA (0,05%) sul piatto con 2 mL di 10% FBS/DPBS. Raccogliere la frazione LEC in un nuovo tubo da 15 mL.
NOTA: il recupero abituale per i LEC è all'interno di un intervallo (2 x 106-4,2 x 106) a seconda delle dimensioni degli MG di routine, la purezza di entrambe le frazioni come analizzato dall'immunosintochimica è del 90%19 (Figura 2E). - Centrifugare ogni frazione per 5 min a 300 x g per rimuovere la trypsin-EDTA (0,05%). Risospendere il pellet in 250 gradi di Maintenance Medium e contare ogni popolazione cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato. Posizionare le cellule sul ghiaccio durante il conteggio.
NOTA: Se si desidera la manipolazione genetica delle frazioni cellulari, le cellule primarie possono essere coltivate su piatti a bassa adesione e infettate da lentivirus20.
4. Giorno 3: Combinazione e incorporamento di frazioni di cellule in una matrice extracellulare
NOTA: Una volta che le frazioni MyoEC e LEC sono state raccolte e conteggiate, possono essere combinate. Il tipico rapporto MyoEC/LEC è 1:3 (Figura 3A)19. Possono essere eseguiti diversi studi. Ad esempio, per eseguire studi sul mosaico, le frazioni possono essere generate da topi di tipo selvaggio (WT) e mutanti (Mut) e combinati (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, o frazioni possono essere combinate utilizzando diversi rapporti di MyoEC/ LEC19.
- In base al numero di cellule, calcolare il numero di pozzi (8 pozzi camera, vedere Tabella dei materiali) che devono essere preparati per 12.000 cellule/pozzetto (ad esempio 3.000 MyoEC:9.000 LEC).
- Stabilire lo strato di base per la coltura 3D aggiungendo a ciascuno della Tabella dei Materiali 90 % L del 50% (50% ECM/50% DMEM/F12, senza rosso fenoglio - vedere la Tabella dei Materiali) ad ogni pozzo. Assicurarsi che non ci siano bolle e che i pozze siano rivestiti in modo uniforme. Per solidificare lo strato di base, incubare i vetrini a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per 30 min.
NOTA: L'ECM deve rimanere ghiacciato fino a questo passaggio, altrimenti polimerizza prematuramente e porterà a rivestimento di base irregolare e polimerizzazione. L'utilizzo di un ECM di base migliora la crescita organoide in un singolo piano, che facilita l'acquisizione di immagini. Questo ottiene anche una crescita organoide più veloce e utilizza meno ECM22. - Durante la polimerizzazione, preparare le miscele cellulari. Pellet le frazioni MyoEC e LEC a 300 x g per 5 min e respendere ogni frazione di cella in 10% ECM/90% Mezzo di crescita in modo che ogni pozzo ha 100 l (vedi tabella 1 per come rendere Media crescita).
NOTA: Per facilitare la preparazione, replicare i pozze utilizzando le stesse miscele di cellule. Questi possono essere combinati e preparati in un tubo (ad esempio, quattro pozze dello stesso mix di cellule possono essere preparati in 400 :L del 10% ECM/90% Mezzo di crescita). - Aggiungete 100 l di ogni miscela cellulare nel 10% ECM/90% Growth Medium in ogni pozzo e lasciate che gli organoidi si stabilizzino per 20 min a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Una volta che le cellule si sono depositate, aggiungere delicatamente 100 l'L di Growth Medium con il pipettaggio dolcemente lungo la parete della camera di ogni pozzo. Incubare i vetrini a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2 (vedi Figura 3A per la composizione totale di ogni pozzo).
NOTA: L'inibitore di Rho Kinase, R-spondin, e Nrg1 sono fattori che sono stati identificati come importanti per la coltura a lungo termine di organoidi cresciuti sia da cellule mammarie primarie e cellule di cancro al seno umano13,14. Inoltre, i fattori delle cellule staminali B27 e N2 estendono il tempo di coltura degli organoidi. - Celle di immagine ogni 24 h per monitorare la loro crescita e rinnovare delicatamente il mezzo di crescita ogni 2-3 giorni utilizzando 100 l/well (Figura 3B-E).
NOTA: quando si rinnova il supporto, prestare estrema attenzione. Inclinare i vetrini della camera per raccogliere il mezzo in un angolo dei pozzi. Togliere 100 l del mezzo e ricostituire con cura di lasciare lo strato ECM indisturbato. - Se i ricercatori sono interessati a studiare l'allattamento/alveologenesi, passare a Alveologenesi Medium (vedi tabella 1) il giorno 5 e continuare a rinnovare il mezzo ogni 2-3 giorni fino al giorno 10 (Figura 3F) o oltre passando utilizzando la soluzione di recupero (vedi la tabella dei materiali)13.
NOTA: A questo punto, gli organoidi possono essere isolati dall'ECM incubando a 4 gradi centigradi in 400 gradi di soluzione di recupero a 4 gradi centigradi (vedere Tabella dei materiali per le informazioni sul protocollo e sul reagente).
5. Giorno 5 o 10: organidi fissaggio e immunostaining
- Rimuovere il mezzo con attenzione pipettando delicatamente dal supporto (una pipetta a bulbo funziona meglio). Risciacquare ogni pozzo utilizzando 200 l of 1x Dulbecco's Foshate Buffered Saline (DPBS, vedi ricette).
- Fissare gli organoidi utilizzando la paraformaldeide fredda (4 gradi centigradi) 4% (w/v) (PFA, vedi ricette) per 10 min a temperatura ambiente.
AVVISO: il PFA è pericoloso. Indossare dispositivi di protezione personale (cappotto da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza). Questo passaggio deve essere eseguito all'interno di un cappuccio fumatore.
NOTA: l'ECM viene sciolto dal trattamento PFA. La rimozione incompleta dell'ECM può portare alla colorazione dello sfondo quando gli organoidi vengono analizzati dall'immunofluorescenza. - Rimuovere il 4% PFA e aggiungere 200 L di 0,2% (w/v) glicine/DPBS (vedi tabella 1) a ogni pozzo. Incubare gli scivoli a temperatura ambiente per 30 min o 4 gradi durante la notte su una superficie a dondolo impostata su un'impostazione lenta.
NOTA: Gli organoidi possono essere conservati per 1-3 giorni in DPBS a 4 gradi centigradi prima del passaggio successivo. - Permeabilizzare gli organoidi utilizzando DPBS - 0.25% Triton X-100 (PBST, vedi Tabella 1) per 10 min a temperatura ambiente.
- Bloccare gli organoidi utilizzando il siero d'asino (DS) del 5% (o di altro siero corrispondente alla specie dell'anticorpo secondario) in DPBS per 1 h su una superficie a dondolo.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito durante la notte a 4 gradi centigradi su una superficie a dondolo. - Preparare gli anticorpi primari nell'1% DS/DPBS. Utilizzare 125-200 l per ogni pozzo. Eseguire l'immunostaining incubando gli organoidi negli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi su una superficie a dondolo.
6. Giorno 11: completa immunofluorescenza
- Lavare ogni pozzo 2X con 200 PBST per 5 min. Aggiungere l'anticorpo secondario in 1% DS/DPBS utilizzando 125-200 -L per ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente su una superficie a dondolo per 45 min.
- Lavare ogni pozzo 2X utilizzando 200 PBST per pozzo.
- Macchia redigere i nuclei utilizzando il colorante del DNA di Hoechst in DPBS (1:2,000 in DPBS) per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere tutto il liquido lasciato sul pozzo aspirando delicatamente con un vuoto.
- Rimuovere con attenzione le camere e la guarnizione, posizionare una goccia (30 dollari l) dei supporti di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su ogni pozzo e coverslip, facendo attenzione a rimuovere le bolle. Lasciare asciugare lo scivolo in uno spazio buio per 1-2 giorni. Sigillare con smalto trasparente. Immagini degli organoidi su un microscopio confocale (Figura 3E-F).
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Representative Results
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per studiare specifici contributi di lignaggio delle cellule epiteliali mammarie facendo uso di organoidi mosaici. Per ottenere cellule murine primarie per gli organoidi, l'epitelio della ghiandola mammaria deve prima essere isolato dallo stroma ricco di adipociti circostante (Figura 1). Questo processo è descritto brevemente qui ed è descritto anche in uno studio pubblicato in precedenza18. Per ottenere un numero sufficiente di celle, si consiglia di rimuovere #2, 3, 4 e 5 MG (Figura 1A). Un importante passo chiave per isolare una popolazione pura di cellule epiteliali è la rimozione dei linfonodi dalle #4 MG, che sono ricchi di cellule immunitarie che contaminano la preparazione (Figura 1A,B). Gli MG sono stati macinati per generare frammenti di dimensioni 0,1 mm(Figura 1B). I frammenti di tessuto sono stati poi enzimaticamente digeriti, un processo che si verifica in presenza di collagenasi, per rilasciare epitelia da stroma e in assenza di trypsin, per prevenire la digestione di proteine come le cadherine che mantengono i contatti delle cellule. Il tessuto digerito è stato poi centrifugato per rimuovere i lipidi e filtrato attraverso un colino cellulare e lavato (Figura 1C). Frammenti epiteliali, aderito al colino, sono stati rilasciati invertendo il filtro e lavando la membrana, che ha trasferito i frammenti epiteliali su un piatto di polistirolo (Figura 1D). Questi frammenti sono apparsi come piccole strutture ramificate (Figura 1E).
I frammenti epiteliali purificati sono stati incubati per 24 ore. Si stabilirono sul piatto e aderirono, formando strutture piatte simili a frittelle con uno strato esterno di MyoEC che circondavano i LEC interni (Figura 2A-B). Figura 2C mostra il bordo di tale struttura frittella-come da un animale di tipo selvatico. Il trattamento Trypsin ha staccato in modo differenziale i mioeC, che si sono staccati per primi e sono apparsi come celle luminose e arrotondate che circondavano il nucleo dei restanti LEC cuboidili (Figura 2C,F). Il distacco dei mioeC è stato attentamente monitorato mediante microscopia a campo luminoso e si è verificato entro 3-6 min. Una volta raccolti i MEC, i LEC sono stati successivamente staccati attraverso un secondo trattamento trypsin più lungo di 7-15 min. Il tempo necessario per il distacco cellulare dipende dalla concentrazione e freschezza della trypsin. La purezza complessiva dei compartimenti a due celle è stata del 90%, come sottolineato dal conteggio delle cellule che erano KRT14-positive e E-Cadherin (CDH1) -negativo nella frazione MyoEC e nelle celle che erano KRT14-negative ed E-Cadherin-positive nella frazione LEC (Figura 2D-E)19. Abbiamo scoperto che alcuni myoEC sono stati rimossi dalla parte superiore della struttura simile a un pancake e dai bordi esterni. Questo è stato osservato utilizzando frammenti di tessuto raccolti da topi etichettati con un marcatore basale inducibile e fluorescente (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP / z) e iniettato con 75 mg/kg di tamoxifene 5 giorni prima della raccolta. Nella Figura 2F,G il distacco di myoEC da circa i bordi della struttura pancake è immediatamente evidente. Ciò si è verificato all'interno dei primi 2 min di trattamento con la trypsin (Figura 2F). Inoltre, le cellule YFP-KRT14-positive sono state osservate sopra la struttura, dove si sono arrotondate dopo il trattamento della trypsin e sono state rimosse dal passaggio di risciacquo/raccolta (Figura 2G). Il nucleo non etichettato dei LEC (Figura 2H), che conteneva poche o nessuna cella YFP-KRT14-positiva, (Figura 2I) successivamente staccato nel secondo ciclo di trattamento con trippsina.
Le frazioni MyoEC e LEC sono state raccolte, combinate e inserite in 10% ECM placcate su una base ECM del 50%. Questo ha permesso una migliore risoluzione ottica degli organoidi che crescevano principalmente lungo lo strato di base (Figura 3A). Dopo 24 h, le cellule assemblate in strutture aggregate che in gran parte mancavano di un lume (Figura 3B). Dopo 48 h, organoidi nascenti formati come il lume centrale scavato e apparso come uno spazio interno più leggero (Figura 3C). Dopo 10 giorni, gli organoidi erano grandi strutture ramificate con lumen ben sviluppati. Gli organoidi mosaici generati dai mioeC raccolti da topi di tipo selvatico e LEC raccolti da topi ACTb-EGFP sono stati fissati in situ, immunostainse con un anticorpo contro l'atto muscolare alfa-liscio marcatore basale (SMA), e macchiati con la macchia del DNA di Hoechst per mostrare i nuclei. Nelle figure, le viste superiore e di sezione mostrano diversi set di immagini raccolte come stack a z e ricostruite in una vista3D(Figura 3D ). La vista superiore rivela la morfologia ramificata degli organoidi (Figura 3E'). La vista di sezione mostra la struttura epiteliale bidomica e il lume aperto di questi organoidi (Figura 3E''). Questi organoidi possono anche essere differenziati al giorno 5 utilizzando Alveologenesi Medium e incubati per altri 5 giorni (Figura 3F). Gli organoidi si ingrandivano, avevano più rami e contenevano latte. Gli organoidi differenziati sono stati generati come descritto sopra e immunostainse con un anticorpo diretto contro il marcatore del latte, proteina acida del siero del latte (WAP, Figura 3F). WAP è una proteina solubile secreta nel latte. Gran parte di questo liquido è stato perso quando le cellule sono state fissate e immunostainse in situ. Pertanto, nelle viste superiore e di sezione, la colorazione WAP è visibile intracellulare nelle cellule di secernono e extracellulare nel latte che è rimasto intrappolato sulla superficie cellulare durante la fissazione (Figura 3F), anche se nella vista in sezione un piccolo organoide sembra contenere latte liquido(Figura 3F'' sovrapposta al box).
Figura 1: Isolamento dei frammenti mammari. (A) Schema etichettato dei 5 MG di un topo con MG accoppiati senza etichetta (B) Immagini di MG del mouse con il #4 MG in scatola e ingranditi per mostrare come identificare il linfonodo per la rimozione. (C) Immagine di MG tritati in una piastra adedile ben bassa con un righello che mostra le dimensioni dei pezzi di tessuto (0,1 mm ciascuno). (D-E) Schematico che illustra i passaggi del protocollo 2.7-2.9. (D) I frammenti di MG sono stati filtrati attraverso un colino di 70 m e sciacquati 4X. (E) Il colino è stato poi invertito su un piatto di coltura del tessuto di polistirolo da 60 mm e frammenti sono stati rilasciati nel piatto. (F) Immagine che mostra i frammenti di tessuto filtrato raccolti su un piatto da 60 mm privi di stroma. Le frecce indicano i frammenti più piccoli che vengono raccolti sul colino da 70 m. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: propsinizzazione differenziale. (A) Immagine di Brightfield che mostra un frammento di tessuto aderito su un piatto di polistirolo, formando una struttura simile a un pancake. (B-C) La prima fase differenziale di propsinizzazione ha staccato mymioC che sono chiaramente visibili come celle luminose e arrotondate dopo 3 min. (D) Immagini immunofluorescenti di MyoEC (in basso) e LEC (in alto) utilizzando il marcatore di cella Cytokeratin 14 (KRT14) per MyoEC e marcatore di cella E-Cadherin (CDH1) per i LEC. (E) L'espressione di KRT14 e CDH1 è stata utilizzata per quantificare la resa e la purezza delle frazioni cellulari in differenzialmente tripsinized. (F-I). Immagini rappresentative di contrasto di fase e fluorescenza (YFP) di frammenti di tessuto di Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; I topi R26RYFP/o MGs sono stati iniettati con 75 mg/kg di tamoxifene 5 giorni prima della raccolta. (F) Distacco dei MyoEC (frecce) durante la prova-EDTA iniziale (0,05%) 2 min dopo l'incubazione. (G) Una spolverata di KRT14-YFP-MyoECs (frecce) sopra un pancake di LEC senza etichetta. (H) Immagine luminosa dei LEC dopo la prova iniziale e il distacco myoEC. (I) Dopo il distacco di MyoEC, KRT14-YFP-MyoECs non sono più visibili come dimostra l'assenza di espressione YFP. Barre di scala : 30 m (A, campo luminoso) 100 m (F, campo luminoso), 50 m (G, fluorescenza), 100 m (H,I). I pannelli A-E di questa figura sono modificati da Macias etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: coltura organoide tridimensionale. (A) Rappresentazione schematica di singole celle incorporate nel 10% ECM/90% Growth Medium e cresciuta su un livello di base DMEM ECM/50% 50% (passaggio del protocollo 4.5). (B-C) Illustrazioni e immagini a contrasto di fase che mostrano le capacità rapide di auto-organizzazione degli organoidi mammari generati da MyoEC e LEC in modo differenziale a 24 h (B) e 48 h (C). Immagini raccolte utilizzando un microscopio digitale widefield(D)rappresentazione schematica che illustra le viste superiore (sinistra) o di sezione (a destra) utilizzate in E-F per mostrare organoidi immunostained. (E) Rappresentazione schematica di un singolo pozzo di uno scivolo a 8 camere contenente organoidi mammari coltivati per 5-10 giorni in Growth Medium. (E'-E") Vista dall'alto (E') e vista di sezione (E") degli organoidi immunosofed al giorno 10 di crescita. I myoEC sono contrassegnati con muscolo actin liscio (SMA) in pseudocolore magenta. I LEC provengono da topi ACTb-EGFP e sono mostrati in verde pseudocolore. I nuclei erano macchiati di colorazione Hoechst. (F) Rappresentazione schematica di un singolo pozzo di uno scivolo a 8 camere contenente organoidi mammari coltivati per 5 giorni in Growth Medium e 5 giorni in Alveologenesi Medium. (F'-F"). Vista dall'alto (F') e vista di sezione (F") degli organoidi immunosofed al giorno 10 di crescita. I MyoEC non sono contrassegnati. I LEC dei topi ACTb-EGFP sono mostrati in verde pseudocolore. La proteina del latte, proteina acida del siero del latte (WAP), è mostrata in giallo pseudocolore nei LEC e riveste l'interno dei lumen degli organoidi. I nuclei erano macchiati di colorazione Hoechst. Immagini raccolte utilizzando un microscopio confocale a disco rotante e ricostruite in 3D utilizzando Imaris (E', E')o la sezione inferiore 30 fette (F', F"). Barre di scala: 100 m (C), 20 m (E), 40 m (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 10 mL | Digestione Media | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 9,45 mL | DMEM/F12 | |
| 100 ll | Antibiotico-antimicotico (100X) | |
| 0,04 g | Classe 3 Collagenae | |
| 0,04 g | Classe 2 Dispase | |
| 50 ll | Gentamicina | Concentrazione finale: 500 g |
| 2,5 mL | Siero Bovino Fetale | Concentrazione finale: 5% (v/v) |
| Passare attraverso il filtro da 0,22 m | ||
| 50 mL | Mezzo di manutenzione | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 49,47 mL | DMEM/F12 | |
| 0,5 mL | Antibiotico-antimicotico (100X) | |
| 2,5 mL | Siero Bovino Fetale | Concentrazione finale: 5% (v/v) |
| 25 ll | Insulina | Concentrazione finale: 250 g |
| 5 ll | Feg | Concentrazione finale: 500 ng |
| 10 mL | Mezzo di crescita | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, senza fenolo rosso | |
| 100 ll | Supplemento N-2 (100x) | |
| 200 l | Integratore B27 senza vitamina A (50x) | |
| 10 ll | Nrg1 | Magazzino: 100 g/mL |
| 42,5 ll | R-spondina | Magazzino: 10 g/mL |
| 1 ll | Inibitore di Rho Y-27632 | Magazzino: 10 M |
| 1 ll | Feg | Magazzino: 0,1 g/L |
| 10 mL | Alveologenesi Media | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, senza fenolo rosso | |
| 100 ll | Supplemento N-2 (100x) | |
| 200 l | Integratore B27 senza vitamina A (50x) | |
| 10 ll | Nrg1 | Magazzino: 100 g/mL |
| 42,5 ll | R-spondina | Magazzino: 10 g/mL |
| 1 ll | Inibitore di Rho Y-27632 | Magazzino: 10 M |
| 5 ll | Prolatta pituitaria di Ovine | Concentrazione finale: 1 g/mL |
| 1 ll | Desametasone | Concentrazione finale: 5 g/mL |
| 5 ll | Insulina | Concentrazione finale: 5 g/mL |
| 1 L | 10X DPBS | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | Kcl | |
| 14,4 g | NaH2PO4 | |
| 2,4 g | KH2PO4 | |
| 1 L | di H2O | |
| Riempire a 800 mL prima di aggiungere reagenti asciutti e sciogliere. Volume di riempimento a 1 L. Regolare il pH a 7,4. Autoclave per sterilizzare. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 900 mL | di H2O | |
| 1 L | Pbst | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 2,5 mL | Triton X-100 | |
| 250 mL | 4% paraformaldeide | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 10 g | Paraformaldeide | |
| 200 mL | di H20 | l'acqua deve essere a 60 gradi centigradi |
| 25 mL | 10X DPBS | |
| 50 ll | 10 N Idrossido di sodio | |
| Passare attraverso un filtro da 0,45 m per sterilizzare e assicurare che il pH sia 7,4 | ||
| 10 mL | 1 % Siero d'asino | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 100 ll | Siero dell'asino filtrato sterile | |
| 9,9 mL | 1X DPBS | |
| 10 mL | 0,2% Glicina | |
| Quantità | Reagente | Note |
| 0,02 g | Glicina | |
| 10 mL | 1X DPBS | |
Tabella 1: Ricette di soluzione.
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Discussion
Qui viene presentato un metodo che descrive in dettaglio come i ricercatori possono generare colture organoidi 3D utilizzando cellule MG primarie. La differenza tra questo e altri protocolli è che dettagliamo un metodo per separare i due compartimenti cellulari MG distinti: i MyoEC basali esterni e i LEC interni. Il nostro metodo impiega una trypsin-EDTA in due fasi (0,05%) trattamento che chiamiamo metapsinizzazione differenziale19. Questa procedura consente ai ricercatori di isolare myinfo e LEC senza utilizzare una citometria di flusso sofisticata e quindi può essere utilizzata per studiare le MG raccolte da un'ampia varietà di specie di mammiferi che potrebbero non avere i biomarcatori ben caratterizzati necessari per FACS. La capacità di separare le due sottopopolazioni cellulari consente ai ricercatori di modificare geneticamente le cellule isolate in modo indipendente o di ricombinare le cellule di animali che ospitano mutazioni genetiche o etichette, generando così organoidi mosaici nella coltura 3D. Una limitazione del protocollo attuale è che il compartimento stroforme non è incluso nelle condizioni di coltura. Tuttavia, sono in fase di sviluppo nuovi metodi per cocoltura componenti stromali con organoidi generati da cellule primarie o linee cellulari per riassumere meglio in vivo ECM23,24,25,26, e questi metodi possono essere adattati a questo protocollo.26 Inoltre, è importante notare che, sebbene questo protocollo raggiunga un grande arricchimento delle frazioni MyoEC e LEC (purificazione del 90%), le frazioni non rappresentano lignaggi di cellule pure.
Il successo di questo protocollo si basa su una serie di passaggi chiave. In primo luogo, è importante digerire delicatamente ma a fondo il tessuto MG. L'eccessiva digestione del tessuto porterà alla morte delle cellule e al minor recupero delle cellule epiteliali. La digestione incompleta comporterà la contaminazione delle cellule stromali e adipose, che interferirà con analisi successive (ad esempio, immunofluorescenza, analisi delle proteine e misurazioni dell'mRNA). In secondo luogo, è importante sciacquare accuratamente il tessuto MG per rimuovere le cellule contaminanti nel protocollo step 2.8. Nel protocollo step 2.9, i frammenti di tessuto MG vengono rilasciati in un piatto di 60 mm. I ricercatori dovrebbero monitorare immediatamente i frammenti rilasciati, prima che aderiscano al piatto. Se si osservano goccioline di grasso o singole cellule, devono essere ripetuti i passi di protocollo 2.6 e 2.8-2.11. Per fare questo, i frammenti di mezzo e di tessuto vengono raccolti dal piatto, collocati in un nuovo colino da 70 m, lavati 4X con 37 C DMEM/F12 e poi rilasciati in un nuovo piatto da 60 mm. In terzo luogo, è essenziale osservare la prima trypsin-EDTA (0,05%) incubazione da vicino perché i mioeC possono staccarsi entro i primi 3 min, ma possono anche aderire fino a 6 min. Ci sono stati casi in cui la trypsin-EDTA (0,05%) era non ottimale, e l'incubazione procedeva per 10 min con la purificazione di successo dei MyoEC. Tuttavia, >10 min di provepinizzazione ha portato alla raccolta simultanea di MyoEC e LEC. È anche importante che il piatto rimanga indisturbato durante la prima incubazione. In caso contrario, può verificarsi la contaminazione della frazione MyoEC con LEC. È vero anche il contrario; se i MyoEC non sono completamente staccati dal piatto, contaminano la frazione LEC. Se i ricercatori utilizzano topi reporter che etichettano esclusivamente MyoEC o LEC, è più facile visualizzare la separazione al microscopio a fluorescenza (Figura 2F-I). Infine, se i ricercatori prevedono di fissare gli organoidi per le analisi dell'immunofluorescenza, il pH (7,4) e la temperatura (4 gradi centigradi) del 4% di PFA sono importanti per il successo della dissociazione dell'ECM. Se gli organoidi vengono raccolti per altre analisi (ad esempio, misurazioni di proteine e mRNA), è importante che la soluzione di recupero sia a 4 gradi centigradi. Se l'ECM non si scioglie, l'incubazione con la soluzione di recupero può essere estesa di 10 min (cioè incubazione totale di 30 min). Tuttavia, periodi di incubazione più lunghi porteranno alla perdita della struttura 3D e alla morte cellulare. Il protocollo di ripristino (elencato nella tabella dei materiali) specifica l'utilizzo di punte wide-bore. Questo è importante per mantenere la struttura 3D degli organoidi e l'integrità delle cellule.
Oltre a questi quattro passaggi chiave, ci sono due fattori che influenzano il successo del protocollo. In primo luogo, la crescita degli organiidi può essere limitata da mutazioni genetiche che riducono la proliferazione cellulare e quindi riducono la crescita degli organiidi nell'ECM. Se si ottengono solo pochi organoidi, la successiva fase di fissazione spesso comporta la loro perdita. Per risolvere questo problema, il numero di celle incorporate all'interno dell'ECM deve essere aumentato mantenendo il rapporto di MyoEC:LEC (passaggi di protocollo 4.1-4.2). In secondo luogo, una volta che le cellule vengono trasferite in un ECM è importante guardare la loro crescita ogni giorno e essere vigili sul rinnovamento dei media (ogni 2-3 giorni). Questo protocollo specifica i reagenti liberi rossi fenoli per una migliore visualizzazione, ma lo stesso successo e crescita si ottiene utilizzando reagenti positivi rossi fenoli. I giorni in cui si verifica il rinnovamento medio prima della fissazione (passaggio protocollo 4.6) devono essere eseguiti con estrema attenzione per ridurre la perdita di cellule. Lo strato superiore ECM 10% è delicato; pertanto i fumi o i mezzi rinnovi devono essere eseguiti con il tubo del fluido lungo le pareti della camera per ridurre al minimo i disturbi meccanici.
La differenziazione degli organoidi in acini che producono latte richiede un trattamento con integratori di differenziazione: idrocortisone o dexamethasone, insulina e prolattina. In questo protocollo, dexamethasone è raccomandato. Inoltre, mentre la prolattina è disponibile in commercio, la prolattina utilizzata in questo protocollo è stata ottenuta dal National Hormone and Peptide Program. Ancora una volta, è molto importante lasciare gli organoidi indisturbati quando si cambia il mezzo alveologenesi. La differenziazione richiede un minimo di 5 giorni. Questo può essere esteso altri 3-5 giorni, ma lo strato di base di ECM si degrada dopo 10-12 giorni. Gli organoidi differenziati sono riempiti di latte e i loro lumen appaiono più scuri.
Si tratta di una tecnica efficiente che può essere utilizzata per indirizzare i contributi di lignaggio specifici del compartimento alla morfogenesi e differenziazione dell'epiteliale mammaria. Con questa tecnica, i ricercatori possono generare organoidi mosaici che comprendono MyoEC e LEC geneticamente manipolati in modo differenziale21,o MyoEC e LEC ottenuti da topi che presentano diverse mutazioni genetiche. Ciò consente ai ricercatori di comprendere meglio i contributi dei compartimenti cellulari specifici del lignaggio alla morfogenesi degli organi e l'acquisizione di funzioni specializzate come la produzione di latte.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Ben Abrams per l'assistenza tecnica e il supporto di base dell'Istituto per la biologia delle cellule staminali (IBSC) dell'Università della California (UCSC). Ringraziamo Susan Strome e Bill Saxton per l'uso del loro Microscopio Solamere Spinning Disk Confocal. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni all'UCSC dall'Howard Hughes Medical Institute attraverso il programma James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), dal NIH (NIH GM058903) per l'iniziativa di massimizzare lo sviluppo degli studenti (H.M.) e da la National Science Foundation for a graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) e con una sovvenzione (A18-0370) del Comitato di coordinamento della ricerca UC-Cancro (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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