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Immunology and Infection

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

doi: 10.3791/60743 Published: March 2, 2020

Summary

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

형광 성 항생제는 다른 방법에 비해 중요한 이점 때문에 항균 내성의 연구에 쉽게 사용되는 다목적 연구 도구입니다. 이러한 프로브를 준비하기 위해, 항생제의 아지드 유도체는 합성되고, 클릭 화학에 의해 아지드 알키네 디폴라 사이클로추가를 사용하여 알키네-플루오로포어와 결합된다. 정제 후, 형광 항생제의 항생제 활성은 최소 억제 농도 평가에 의해 시험된다. 박테리아 축적을 연구하기 위해 분광광도법 또는 유세포 분석법을 사용할 수 있으므로 방사성 항생제 유도체에 의존하는 방법보다 훨씬 간단한 분석을 할 수 있습니다. 또한, 공초점 현미경 검사법은 저항하는 종에서 일어나는 작용의 모드 및 변경에 관하여 귀중한 정보를 제공하는 박테리아 내의 현지화를 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 항균 저항의 연구 결과에 있는 형광 항생제 탐사기의 사용은 미래 확장을 위한 많은 잠재력을 가진 강력한 방법입니다.

Introduction

항균 저항 (AMR)는 전 세계 인간의 건강에 큰 위협을 제기 상승 위기입니다. 대부분의 항생제에 대한 내성이 보고되고 있으며, 임상적으로 이용 가능한 모든 약물에 내성이 있는 박테리아에 의한 감염이 나타나고 있다. AMR의 상승에 대처하기 위하여는, 우리는 이 다각적인 현상및 항생제와 박테리아 사이 근본적인 기계장치 그리고 상호 작용의 우리의 이해를 증가할 필요가 있습니다. 역사적으로 제대로 이해 된 한 가지 측면은 축적과 유출현상과 함께 박테리아로항생제의 투과입니다. 이 지식은 새로운 약을 설계하고 저항의 기계장치를 이해하는 에서 결정적이다. 따라서, 이것은 AMR 연구에 있는 중요한 역할을 합니다.

항생제 농도를 측정하기 위해 취할 수있는 두 가지 주요 접근법이 있습니다 : 약물을 직접 측정하거나 정량화를 용이하게하기 위해 고안된 변조로 태깅. 항생제를 태그하면 검출이 향상되지만 항균 활성 및 투과성과 같은 약물의 생물학적 활성을 교란시킬 수 있습니다. 태그가 지정되지 않은 메서드에는 문제가 되지 않습니다. 그러나 탐지는 어려울 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 기술 발전은 박테리아1,2,3,4,5,6,7의항생제 농도를 직접 측정하기 위해 질량 분석법 (MS)을 활용한 연구의 붐을 주도했습니다. 이러한 연구는 다양 한 박테리아에 세포 내 축적을 공부 하는 것이 가능 하다는 것을 보여주었다, 그람 음성 박테리아와 함께 가장 널리 공부. 분자 투과성의 정량화는 그 때 활성에 연결되고 약물 개발2,3,4를알리기 위하여 이용되고, 비록 직접 축적 및 표적 활성을 수렴할 때 주의해야 한다5. MS 발달 이전에는 테트라사이클린과 퀴놀론8,9,10,11과같은 본질적인 형광을 가진 항생제만이 농도를 직접 측정할 수 있었습니다. 범위가 분명히 제한되어 있지만 축적 및 유출을 검사하고 정량화하여 형광 기반 정량화의 유용성을 설명했습니다.

태그가 달린 항생제는 방사성 및 형광 태그가 일반적인 분포, 작용의 모드 및 저항을 공부하기 위하여 수십 년 동안 이용되었습니다. 무선 태그가 있는 프로브는 모 화합물과 거의 동일하다는 장점이 있으므로 생물학적 활성이 현저히 다를 수 없습니다. 3H, 14C15N과같은 동위원소는 항생제에서 이들 원소의 돌출로 인해 빈번하게 사용되어 왔으며, 다양한 항생제 스캐폴드가1,10,12,13으로조사되었다. 무선 프로브의 검출은 간단하지만, 이러한 접근법의 사용을 제한하는 많은 물류 문제(예: 안전, 동위원소 반감기)가 있습니다. 또 다른 전략은 형광 태그 항생제입니다. 이러한 프로브는 MS보다 간단한 기술을 사용하고 방사선8의물류 문제없이 부모 약물의 분포 및 작용 및 저항모드를 검사하는데 사용될 수 있다. 이 접근에 주요 한 점은 항생제는 일반적으로 상대적으로 작은 분자, 따라서 형광 moiety의 도입은 중요 한 화학 적 변화를 포즈. 이 변경 은 생리 화학 적 특성 및 항균 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 부모 항생제의 대표적인 결과를 생성하기 위하여 이 요인을 평가하기 위하여 주의를 기울여야 합니다.

이 작품에서, 방법은 우리의 이전 간행물14,15,16에서와같이 형광 항생제를 종합, 평가 및 사용하는 방법에 대해 설명한다. 이전 작업을 통해 다양한 목적으로 많은 형광 항생제가 준비되고 사용되었습니다 (Stone et al.8참조). 생물학적 활동에 영향을 미칠 가능성을 최소화하기 위해 이 작업에 는 니트로벤조사디아졸(NBD, 녹색) 및 7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl(DMACA, 블루)이 매우 작은 형광증이 사용됩니다. 또한, 마이크로브로스 희석 최소 억제 농도(MIC) 분석법을 이용한 항균 활성의 평가는, 활성에 대한 변형의 효과를 측정할 수 있도록 설명된다. 이러한 형광 태그프로브는 분광광도 측정, 유세포분석및현미경검사법에 사용될 수 있습니다. 가능한 응용 프로그램의 범위는 형광 항생제의 장점이있는 곳입니다. 세포 축적은 MS 만으로는 불가능한 정량화, 분류 및 시각화될 수 있습니다. 형광 항생제의 사용을 통해 얻은 지식이 저항에 대한 우리의 이해와 AMR과의 싸움에 도움이 되기를 바랍니다.

Protocol

1. 알키네 형광단합성

  1. NBD-알킨합성 (7-니트로-N-(prop-2-yn-1-yl)벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-아민)
    1. 테트라하이드로푸란(THF)의 60 mL에 4-클로로-7-니트로-벤조푸란(5.181 mmol)의 1,031 mg을 용해시. 추가 1,857 CsCO의 mg3 (5.696 mmol), 다음 프로 파 질 라 민의 0.39 mL (6.1 mmol). 반응을 갈색에서 녹색으로 변한 다음 실온(RT)으로 냉각하는 2시간 동안 50°C로 가열합니다.
    2. 여과 보조제(재료 참조)를 사용하여 반응을 필터링하고 에틸 아세테이트(EA)로 세척합니다. 감압하에 여과액을 농축한 다음, EA 150 mL에서 잔류물을 용해시키고 500 mL 분리 깔때기로 이동합니다.
    3. EA 용액을 물과 염수로 각각 100 mL로 씻으소서. 그런 다음 수성 단계를 결합하고 EA의 100 mL로 2x를 세척하십시오.
    4. 무수 마그네슘 황산마그네슘 위에 결합된 유기상을 건조한 다음, 저압하에서 필터와 농축을 하십시오.
    5. 실리카 겔(석유 에테르의 20-30% EA)에 플래시 크로마토그래피에 의한 조료 를 정화하고, 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LCMS, [M+H]+ = 219.1) 및/또는 핵 자기 공명(NMR) 분광법, 화학적 변화에 의한 순도를 확인한다.
      1개 H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.7 Hz, J = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 2.5 Hz, 1H); 13세 C NMR(CD3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      참고: 실리카 겔 크로마토그래피에 의한 정제를 수행할 때, 열거된 용매의 극성 이하를 사용하여 컬럼을 준비한다. 조화합물은 용해도가 허용되지 않는 경우 농축용액으로서 적재되거나 실리카 상에 흡착될 수 있다. 화합물이 실리카의 상부에 첨가된 후, 실리카 습윤에 사용되는 동일한 용매의 1-2 컬럼 부피를 통해 실행한다. 그런 다음 나열된 용매 비율로 시작하여 각 용매의 적어도 1 개의 컬럼 부피를 통해 실행하고 용매 조성에서 큰 점프를하지 않도록하십시오. 분획을 수집하고 LCMS 또는 TLC (얇은 층 크로마토그래피)에 의해 순도 / 신원을 확인합니다. 순수한 분획을 결합하고 회전 증발에 의해 감소 된 압력하에서 농축.
  2. DMACA 알키네의 합성 (2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)아세타미드).
    1. 에탄올 30 mL에 3-(디메틸아미노) 페놀(36.6 mmol)의 5.02 g을 용해한 다음, 6.7 mL의 디에틸 1,3-아세톤디카르박실레이트(36 mmol)를 첨가합니다. ZnCl2 (77.2 mmol)의 10.5 g을 추가한 다음 42 시간 동안 빨간색 용액을 환류한 다음 ZnCl2 (67.6 mmol)의 9.20 g을 추가한 다음 8 시간 동안 역류합니다.
    2. 반응을 식히고 감소된 압력하에서 농축하십시오. 결과적 적색 고체를 EA 200 mL에서 분산시킨 다음 필터를 500 mL 분리 깔때기로 옮김을 전달합니다.
    3. EA를 각각 200 mL의 물과 염수로 씻은 다음 무수 마그네슘 황산염으로 건조시면 됩니다. 건조 된 유기 상을 필터링 하 고 감소 된 압력에서 농축.
    4. 실리카 겔(PE에서 0-100% EA)에 플래시 크로마토그래피에 의해적색 고체(에틸 2-(7--7--2-oxo-2-크롬-4-yl)아세테이트를 정화하고, LCMS([M+H]+++275.1) 및/또는 NMR에 의한 순도 를 검사한다.
      1개 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.9 Hz, J = 2.6 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.87 (m, 1H), 2.96 (m, 8H), 2.25 (d, J = 1.2 Hz, 3H).
    5. THF 10 mL에 에틸 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl)아세테이트(1.18 mmol)를 용해한 다음, 157 mg의 LiOH· H2O (3.74 mmol) 물 15 mL. RT에서 반응을 3 시간 동안 저어시킨 다음 분리 된 깔때기로 이동하여 추가로 50 mL의 물로 희석하십시오.
    6. 반응 혼합물을 50 mL의 디에틸 에테르(Et2O)로 2x 세척한 다음, 25 mL의 물로 결합된 유기상 2x를 세척한다. 유기 층으로 노란색 침전을 가져 가라. 회전 식 증발기로 감소 된 압력하에서 유기 상을 농축하십시오.
    7. 수성상을 pH=2로 농축된 HCl로 산성화하고, 밤새 4°C로 냉각한다. 산성화된 수성 상을 걸류하고 농축된 유기상에 황색 고체를 첨가한다.
      참고 : 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)아세트산은 추가 정제없이 사용할 수 있지만 LCMS ([M +H]+ = 247.1) 및 / 또는 NMR, 다음과 같이 화학 적 변화에 의해 확인할 수 있습니다:
      1개 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 9.2 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 2.35 (d, J = 0.9 Hz, 2H); 13세 C NMR (CDCl3,150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
    8. 466 mg의 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl)아세트산(1.89 mmol)을 7 mL의 드라이 N,N-디메틸포마미드(DMF)에용해시키고 질소의 대기하에 놓습니다.
    9. 질소 하에서 건조 DMF의 7 mL에 프로 파 질 라 민 (5.1 mmol)의 0.33 mL를 용해. 1.30 mL의 디이소프로플레텔레틸 아민 (DIPEA, 7.50 mmol)을 염료 용액에 넣고 535mg의 O -(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-yl)-1,1,1,3,3,3테트라메틸루로늄 헥사플루오로포스페이트(HTUmol, 29mmol)를 첨가한다. RT에서 활성화된 염료 용액을 15분 간 저은 다음 아민 용액을 한 방울 떨어뜨리고 밤새 저어줍니다.
    10. 다음 날, 35 mL의 물로 반응을 희석 한 다음 감소 된 압력하에 농축하십시오.
    11. 생성된 주황색 고체를 EA와 염수(각각 100mL)를 250mL 분리 깔때기에서 분할합니다. 레이어를 분리하고(두 레이어를 다른 플라스크로 실행) EA 의 100 mL로 수성 단계를 세척합니다.
    12. 결합된 유기상을 저압하에 농축한 다음, 오렌지 고체를 1:1 아세토니트릴(ACN)/물(v/v)의 3mL로 다시 용해시고. C18 카트리지 컬럼(용매 A: 물, 용매 B: ACN)이 장착된 역상 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템에 주입하여 원유 제품을 정화합니다.
    13. LCMS에 의한 순도 검사([M+H]+ = 284.1, 아래 주어진 NMR 화학 적 변화), 다음 결합 및 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)아세타미드, NMR 화학 적 시프트다음과 같이 적절한 분획을 주고 적절한 분획을 결합하고 동호우성 화
      1개 H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ 8.65 (t, J = 5.4Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H, 0H, 0H) 13세 C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 28.

2. 형광 항생제의 합성

  1. 앞서14,15,16에기재된 바와 같이 항생제의 아지드 유도체를 준비한다.
    참고: 절차는 각 항생제에 특정하고 기능화된 항생제가 부모에 필적하는 활성을 유지하는지 확인하기 위하여 부모 분자의 구조 활성 관계 (SAR)의 주의 깊은 검토가 요구됩니다. (예를 들어, 시프로플렉스사신16,라인졸리드14,및 트리메쇼프림15). 도 1은 발표된 형광 항생제 및 일반 합성 계획의 예에 대한 예.
  2. 반응 프로시저 A를 클릭합니다.
    참고 : 항생제의 대부분을 들어, 구리 촉매 Huisgen [2 + 3] 아지드 (단계 2.1) 및 형광 알키네 (1 단계에서 제조)의 사이클로 추가에 대해 여기에 상세한 절차를 따르십시오.
    1. 둥근 바닥 플라스크에 아지드 항생제를 넣고 테르트-butanol(tBuOH) 및 물 (1 : 1 v / v, 25 ml 각 mmol azide 당)을 추가합니다.
    2. 1.1단계(3 eq.)에서 제조된 형광알키네를 첨가하고 반응을 50°C로 가열한다. 그런 다음 반응에 구리 황산염 (물 100 mM, 0.6 eq.)을 넣고 아스코르브 산 (물 500 mM, 2.4 eq.)을 추가합니다.
    3. 50°C에서 1시간 동안 또는 반응 완료(시작 아지드의 완전한 소비)의 표시시 LCMS에 의해 분석될 때까지 반응을 교반한다.
    4. 항생제 스캐폴드에 적합한 반응을 냉각시키고 2.3 단계 또는 2.4단계로 정화를 진행한다.
      참고 : 스캐폴드의 극성과 안정성에 따라 여러 가지 정제 방법이 가능합니다.
  3. 반응 절차 B를 클릭합니다.
    참고 : 펩티드 기반 항생제에 대한이 절차를 따라 더 강한 반응 조건을 제공합니다 (출판되지 않은 작업, Phetsang, 2019).
    1. 펩타이드 아지드 항생제를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 충분한 DMF (750 mL / mmol azide)를 첨가하여 용해시도록 하십시오.
    2. 1단계(5 eq.)에서 제조된 형광-알퀴네를 첨가하고 반응을 1시간 동안 50°C로 가열한다.
    3. 구리 (I) 요오드화물 (20 eq.), DIPEA (120 eq.), 다음 아세트산 (240 eq.)을 추가합니다.
    4. 1 시간 동안 50 °C에서 반응을 교반하거나 LCMS에 의한 분석이 반응 완료를 나타냅니다 (즉, 시작 아지드의 완전한 소비). 반응을 냉각시키고 방법 1에 의한 정제를 진행한다(단계 2.3 참조).
  4. 정화 방법 1 (시프로플렉스사신, 트리메토프림 및 라인졸리드에 사용)
    1. 냉각된 클릭 반응을 MPLC C18 카트리지 컬럼에 직접 삽입합니다.
    2. 실행 시작 시 긴 세척 단계(약 100분)를 통합한 다음 최대 100% 용매 B까지 그라데이션을 실행한 다음 용매 A로 복귀합니다.
      참고: 용매 A는 용해도, 안정성 및 피크의 최상의 분해능에 따라 물, 물에 0.05-0.1% 포름산(FA), 물에 있는 0.05-0.1% 트리플루오아세트산(TFA)에서 선택할 수 있습니다. 용매 B는 아세토니트릴(ACN), ACN에서 0.05-0.1% FA, ACN에서 0.05-0.1% TFA로부터 선택되어 용매 A와 일치시킬 수 있다. 용출이 어렵다는 것이 입증되면, 메탄올은 ACN 대신에 사용될 수 있다.
    3. LCMS 및 색상(올바른 질량, 단수 피크)에 의해 표시된 바와 같이 적절한 분획을 수집하고 결합한 다음, (반)순수 형광 항생제를 주기 위해 동우성 화한다.
    4. 필요한 경우 제품을 추가로 정화하십시오. 스캐폴드에 적합한 컬럼 및 방법을 사용하여 NMR 및/또는 LCMS 및 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 순도를 평가합니다.
  5. 정화 방법 2
    참고 : 용해도가 허용하는 경우, 사전 정화는 수성 작업 (매크로 라이드, 게시되지 않은 작품, 돌 2019에 사용)에 의해 수행 될 수있다.
    1. 냉각된 클릭 반응을 물과 Et2O(초기 반응 량에서 약 10배 희석) 적절한 크기의 분리 깔때기로 옮기십시오.
    2. 층을 분리하고 Et2O로 수성 상을 두 번 세척하십시오.
    3. 결합 된 유기 상을 물 (유기 상과 동일한 부피)으로 2 배 씻은 다음 Na2SO4에서건조하십시오.
    4. 건조 된 유기 상을 필터링 하 고 감소 된 압력에서 농축.
    5. 2.4.4단계에서 설명한 대로 MPLC 및/또는 HPLC에 의해 원유 제품을 정제합니다.
      참고: 불완전하고 완전하며 정제된 클릭 반응 LCMS 추적의 예는 그림 2를 참조하십시오. 항생제 형광소 클릭 반응에 대한 전형적인 정제 수율은 30-80 %의 범위입니다.
      주의: 이러한 합성에 사용되는 대부분의 화학 물질은 특정 안전 위험을 가지고 있습니다. 개인 보호 장비 사용을 포함하여 항상 주의를 기울여야 합니다. Et2O, tBuOH, FA, 아세트산, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, 프로파가민, 및 HCTU는 모두 가연성; 열이나 스파크 소스와의 접촉을 피하십시오. THF, 프로파가민, DIPEA, t부오, FA, DMF, 및 PE는 모두 독성; 노출을 방지할 수 있습니다. 프로파가민, CsCO3,ZnCl2,LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, 아세트산 및 HCl은 모두 부식성; 접촉을 피하고 표면 접촉을 인식하십시오. ZnCl2,CuSO4,CuI 및 PE는 환경 적 위험을 제시합니다. 폐기 조건을 염두에 두어야 합니다. THF는 폭발성 과산화물을 형성할 수 있습니다. 보관 조건에 주의를 기울여야 합니다. 유기 아지드는 폭발성; 특히 대규모 생산에 주의를 기울여야 합니다.

3. 항균 활성 평가

참고: 박테리아와 관련된 모든 작업은 분석또는 실험실의 오염을 피하기 위해 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다. 모든 매체는 사용하기 전에 오토클레이브를 해야 하며, 플라스틱 제품 및 파이펫과 같은 장비는 멸균 상태로 보관해야 합니다. 생체 봉쇄 후드 (유형 2)에서 작업을 수행하는 것이 좋습니다.

  1. 리소제니 육수 한천(LB, 제조사의 지시에 따라 제조됨)에 항생제 스캐폴드에 적합한 세균성 균주의 줄무늬 글리세롤 스톡은 37°C에서 하룻밤 사이에 자랍니다.
    참고 : 항균 활성을 테스트하는 박테리아의 선택은 사용되는 항생제 스캐폴드에 따라 이루어져야합니다. 5-10 박테리아의 대표적인 범위는 실험실의 물류 능력에 주어진 고려와 함께, 항생제에 취약 한 것으로 알려진 종에서 선택 되어야 한다. 가능 하면, 저항 하는 박테리아도 테스트 해야 합니다. 아래에 주어진 프로토콜은 대부분의 박테리아에서 작동하지만 특수 조건이 필요한지 확인 (예 : CO2, 특수 매체)을 확인하고 필요에 따라 변경하십시오. 이러한 조건을 사용하여 성공적으로 분석된 박테리아는 황색포도상구균, 연쇄상 구균, 바실리, 대장균, 클렙시엘라 폐렴, 슈도모나스 녹농균,엔테로코커스 패시움을 포함한다.
  2. 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 5 mL의 양이온에서 밤새 배양하여 37°C에서 뮬러-힌튼 브로스(CAMHB, 제조사의 지시에 따라 제조)를 조정하였다.
  3. CAMHB에서 야간 배양액 ~40배를 희석하고 600 nm(OD600)= 0.4-0.8, 부피 5 mL에서 중간 로그 상, 광학 밀도로 성장한다.
  4. 멸균수에서 1.28 mg/mL에서 각 형광 항생제의 재고 용액을 준비하고, 96 웰 플레이트의 첫 번째 컬럼에 항생제의 피펫 10 μL을 준비합니다.
  5. 첫 번째 컬럼에 CAMHB 90 μL을 추가하고 다른 모든 웰에 50 μL을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 가로 질러 직렬 2 배 희석을 수행합니다.
  6. 철저히 혼합한 다음 중간 로그 상 배양액을 ~10 6°C(CFU)/mL로 희석하고 모든 웰에 50 μL을 추가하여 ~5 x 105 CFU/mL의 최종 농도를 제공합니다.

    배양량(mL) = (mL의 미디어 볼륨)/(OD600 x 1,000)

    예를 들어, OD600 = 12 mL의 원하는 미디어 볼륨에서 0.5 배양에 대해, (12/(0.5 x 1,000) = 배양물 0.024 mL을 12 mL의 배지에 추가하십시오.
  7. 뚜껑으로 접시를 덮고 흔들리지 않고 18-24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
  8. MIC가 눈에 띄는 성장 없이 가장 낮은 농도로 플레이트를 시각적으로 검사합니다.
    참고: 활성 및 비활성 형광 항생제의 몇 가지 예는 표 1을 참조하십시오.

4. 분광광도정 및 유동 세포측정법에 의한 프로브 축적 분석

참고 : 이러한 원심 분리 시간은 대장균에최적화되어 있으므로 다른 종에 약간의 변경이 필요할 수 있습니다. 프로브 축적을 위한 대표적인 데이터는 NBD 표지된 시프로플렉스사신 프로브에 대해 보고된다.

  1. 세균성 균주의 줄무늬 글리세롤 스톡을 LB 한천에 시키고 37°C에서 하룻밤 동안 자랍니다.
  2. 37°C에서 LB에서 하룻밤 동안 플레이트 및 배양으로부터 단일 콜로니를 선택한다.
  3. 하룻밤 배양액 ~50배 배지를 희석하고 중간 로그 상으로 성장한다(OD600 = 0.4-0.8).
  4. 25 분 동안 1,470 x g에서 문화를 원심 분리하고 미디어를 decant.
  5. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 1 mL에서 박테리아를 다시 중단한 다음 15 분 동안 1,470 x g에서 원심 분리기를 하십시오.
  6. 미디어를 데낸트하고 최종 OD600 = 2로 PBS에서 세척된 펠릿을 재중단시켰다.
  7. 원하는 경우, 카보닐 시안화물 3-클로로페닐히드라존 10.1 μL(CCCP, PBS에서 10 mM)을 박테리아 1mL(최종 농도 100 μM)에 넣고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: CCCP는 유출 펌프 억제제입니다. CCCP를 추가하면 유출의 영향을 검사 할 수 있습니다.
  8. 배양물 18,000 x g에서 20°C에서 4분 동안 배양하고 매체를 데언트한다.
  9. 펠릿에 형광 항생제 용액 1 mL (PBS에서 10-100 μM)을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
  10. 배양물 18,000 x g에서 4°C에서 7분 동안 배지를 데언트한다.
  11. 1 mL의 차가운 PBS에서 박테리아를 다시 중단하고 4.9 단계를 반복합니다.
  12. 단계 4.10을 총 4x반복합니다.
  13. 원하는 경우, 용해 완충액 180 μL(20 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 2 mM 나트륨 EDTA)을 첨가하여 박테리아를 70 μL의 리소자임(H2O에서 72 mg/mL)을 첨가하였다.
  14. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 3x(-78°C에서 5분, 15분 동안 34°C)를 동결해 넣습니다.
  15. 샘플을 20분 동안 초음파 처리한 다음 65°C로 30분 동안 가열합니다.
  16. 용해 된 샘플 (18,000 x g,8 분)을 원심 분리한 다음 10 kDa 필터 멤브레인을 통해 필터링하십시오.
  17. 100 μL의 물로 필터를 4x 세척하십시오.
  18. 용해액을 평평한 바닥 검정 96 웰 플레이트로 옮기고 불소에 적합한 여기 및 방출 파장을 가진 플레이트 리더상에서 형광 강도를 측정합니다(즉, DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
    참고: 형광 NBD 표지 된 시프로플록사신 항생제를 사용하여 박테리아의 분광광도 분석의 예는 그림 3을 참조하십시오.
  19. 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 동일한 성장 및 염색 조건(단계 4.1-4.17)을 최종 준비에서만 변경과 함께 사용할 수 있다.
    1. 총 볼륨을 PBS의 1mL로 가져옵니다.
    2. 데이터 수집을 위한 로거스믹 증폭을 사용하여 약 60 μL/min의 유량속도로 유량 세포계의 샘플을 판독합니다(F1 여기 = 488 nm; 방출 = 525/20 nm).
    3. 총 10,000개의 이벤트를 기록한 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
    4. F1의 형광 강도를 이벤트 수에 대해 플롯하여 박테리아가 염색된 후 히스토그램 피크의 중간 형광 강도를 추정합니다.
      참고: NBD 표지된 시프로플렉스사신 항생제를 사용하여 박테리아의 유동 세포분석 분석의 예는 그림 4를 참조하십시오.

5. 현미경 분석을 위한 준비

  1. MIC 평가의 경우 하위 배양을 OD600 = 0.4로 성장한 다음 3-5분 동안 1mL aliquots 및 원심분리기로 18,000 x g으로 나눕니다.
  2. 데캔트 및 폐기 하 고 HBSS의 500 μL에서 세균 펠 릿을 다시 중단.
  3. 원심분리기는 3분 동안 18,000 x g으로, 미디어를 폐기합니다.
  4. 1-100 μM의 농도로 HBSS에서 항생제 프로브의 솔루션을 준비합니다.
  5. 세척된 박테리아를 프로브 용액의 500 μL에서 재중단하고, 37°C에서 30분 동안 배양한다.
  6. 5.3단계를 반복합니다. 다중 표지 실험을 위해, 직교 색핵산 염료의 500 μL에 펠릿을 다시 중단. 녹색의 경우 Syto9(HBSS에서 5 μM)를 사용합니다. 파란색의 경우 Hoechst 33342(HBSS에서 20 μg/mL)를 사용합니다. RT에서 15-30 분 동안 인큐베이션하십시오.
  7. 5.3단계를 반복한 다음 FM4-64FX(HBSS에서 5 μg/mL)의 500 μL로 다시 중단하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
  8. 5.3단계를 반복한 다음 HBSS 500 μL에서 다시 일시 중단하고 5.3단계를 다시 반복합니다.
  9. 5.8단계를 반복한 다음, 마침내 세척된 염색된 박테리아를 장착 매체의 15 μL로 중단시켰다(재료 참조).
  10. 현미경 슬라이드에 피펫 장착 매체와 고성능 커버 슬립 상단, 다음 명확한 매니큐어로 가장자리를 밀봉.
    참고: NBD 표지된 시프로플렉스와 트리메토프림 항생제로 촬영한 공초점 현미경 이미지의 예와 DMACA 표지된 옥사졸리딘(라인졸리드) 항생제에 대한 그림 6을 참조하십시오.

Representative Results

그림 1 형광항생제의 제조를 위한 핵심 클릭 화학반응(A)을예시하고,(B)시프로플록사신(cipro), 트리메쇼프림(TMP) 및 라인졸리드에 기초한 당사의 출판된 형광 항생제의 구조의 예를 예시한다. 이들 프로브는 모두 아지드 중간을 통해 상응하는 항생제로부터 합성되었다. 그 후 NBD 및 DMACA 형광단에 결합하여 각각 알케인으로 기능화시켰다.

도 2는 시프로플록사신-N 3 및 NBD-알키네 클릭 반응에서 LCMS 트레이스를 예로 들수 있는데, 여기서 아지드는 3.2분에서 용출되고 생성물은 3.8분에서 용출되었다. 스펙트럼 3은 MS 및 UV 트레이스에서 잘못된 피크가 사라지면서 정화의 영향을 보여줍니다. 제품 피크와 불순물 피크의 통합을 통해 순도와 반응 진행률을 정량화할 수 있습니다.

도 3은 유출의 존재 와 부재에서 형광 분광법에 의한 세포내 축적의 평가에서 전형적인 결과를 보여줍니다. 본 실험에서, 대장균은 양성자 동기력(PMF)을 붕괴시키는 CCCP의 첨가 유무에 관계없이 TMP-NBD로 처리하였다. 박테리아의 세포내 형광은 CCCP로 전처리될 때 상당히 높았으며, 이는 유출이 이 박테리아의 축적을 감소시임을 나타낸다. 이 실험은 tolC에결핍된 박테리아를 사용하여 반복되었고, 개별 적인 유출 펌프 성분의 영향을 조사하기 위해 이 분석법의 용량을 표시하였다. 이 경우, 야생형 세균에 비해 세포내 형광이 증가했지만 CCCP 축적은 여전히 증가하였다. 이러한 연구 결과는 tolC가 TMP 유출에 참여하지만 유일한 PMF 구동 펌프가 아니라는 것을 나타냅니다.

도 4는 도 2와동일한 실험의 결과를 나타내지만 분광법 대신 유세포분석으로 측정된 축적을 나타낸다. 동일한 데이터 동향이 관찰되었다, 어느 기술이 유출 매개 세포 내 축적의 현상을 연구하는 데 사용될 수 있음을 입증.

도 5는 TMP-NBD(1) 및 cipro-NBD(2+3) 형광 프로브로 표지된 그람양성(S.orureus)그람 음성박테리아(E. coli)의대표적인 공초점 현미경 이미지를 각각 나타낸다. 두 경우 모두, 적색 막 염료 FM4-64FX를 공동 국소화를 비교하기 위해 첨가하였다. TMP-NBD의 경우, 청색 핵산 염료 Hoechst-33342도 사용되었다. 이러한 이미지를 오버레이함으로써 박테리아에서 항생제의 국소화를 시각화하였다. 패널 2와 3을 비교하면 유출의 영향이 어떻게 조사되었는지, 2에사용된 유출 억제제 CCCP를 통해 세포내 축적을 초래하는 방법을 보여줍니다. 패널 3에서는CCCP가 추가되지 않았습니다. 따라서, 유출은 활성 및 프로브 축적을 볼 수 없었다.

도 6은 DMACA 표지된 옥사졸리디논의 프로브 Lz-NBD로 표지된 그람양성(S. aureus)박테리아의 대표적인 공초점 현미경 영상을 나타낸다. 적색 막 염료 FM4-64FX를 공동 국소화를 비교하기 위해 첨가하였고, 녹색 핵산 염료 Hoechst-33342도 사용되었다. 이러한 이미지를 오버레이함으로써, 박테리아에 있는 항생제의 국소화는 막과 핵산에서 구별되는 내부 국소화를 보여주는 가시화되었습니다.

표 1은 3개의 형광 항생제, 시프로플록사신, 트리메토프림(TMP) 및 리졸리드(Lz)에 대한 MIC 값을 나타내며, 각각의 모 항생제, NBD 및 DMACA 유도체에 대해 제시된 데이터를 나타낸다. 각 항생제에 대한 대표적인 종은 그람 양성 및 그람 음성 을 모두 포함하여 선택되었다. 시프로플록사신 시리즈의 경우, 두 형광 프로브는 모약물에 비해 항생제 활성을 잃었지만 모든 종에 대한 일부 활성을 유지했다. 유사하게, linezolid 프로브는 몇몇 활동을 분실했습니다, 그러나 약한 항생제에 온건한 남아 있었습니다. TMP 프로브는 야생형 박테리아에 대한 거의 모든 활성을 잃었지만, 유출성 결핍 대장균에대해 활성이 있었으며, 이는 항균 활성의 손실이 축적의 부족 때문임을 나타낸다.

Figure 1
그림 1: 항생제 유래 프로브의 합성 및 구조. (a)아지드 항생제 및 알키네 형광단으로부터형광항생제 프로브의 합성을 위한 일반적인 반응 방식. (B)시프로플렉스사신, 트리메토프림 및 라인졸리드를 기반으로 한 당사의 간행된 프로브의 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: LCMS에 의한 항생제 유래 프로브 순도 측정. 분석 LCMS는 (1) 불완전, (2) 완료 및 (3) HPLC 정제 시프로펠록사신-N3 + NBD-알키네 클릭 반응으로부터의 추적으로 반응 완료 시 시작 물질의 실종을 입증하고, 정제에 대한 기타 피크를 시음한다. A = UV-Vis 트레이스(250nm의 흡광도), B = MS 트레이스(양수 및 음수 모드). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 항생제 유래 프로브 축적의 플레이트 리더 측정. 야생 형 (1, ATCC 25922) 및 Δ톨C (2, ATCC 25922) 대장균 배양(A)(B)에서TMP-NBD (50 μM)의 세포 축적의 형광 분광 측정CCCP (100 μM)를 첨가하지 않고. 통계적 유의성(**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001)은 CCCP의 부재 또는 존재 와 야생형과 Δ톨C대장균사이에 도시된다. 보고된 데이터는 3개의 실험에 대한 평균 ±SD이다. 이 수치는 이전 간행물15에서적응하고, 세포 내 축적에 유출의 역할을 설명하기 위해 분광학의 사용을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 항생제 유래 프로브 축적의 유세포 분석 측정. 야생 유형 (1, ATCC 25922) 및 ΔtolC (2, ATCC 25922) 대장균에서 TMP-NBD를 사용하여 세포 축적의 유세포 분석 측정은 CCCP (100 μM)의 첨가및 첨가없이 배양. 중앙값 형광 활성은 10,000개의 세균 사건으로부터 도시되며, 통계적 유의성(***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001) CCCP의 부재 와 존재 사이 및 야생 형및 ΔtolC대장균사이에 도시된다. 보고된 데이터는 3개의 실험에 대한 평균 ±SD이다. 이 수치는 우리의 이전 간행물15에서적응하고, 세포 내 축적에 유출의 역할을 설명하기 위해 유세포 분석의 사용을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: NBD 프로브 현지화의 공초점 현미경 시각화. 1) Hoechst-33342 (청색, 핵산), TMP-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 막) 및 중첩으로 표지된 S. 아우레우스를 살아있는 S. 아우레우스; 2) cipro-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 막) 및 중첩된 CCCP(유출 억제제)로 처리된 살아있는 대장균; 3) 살아있는 대장균을 cipro-NBD (녹색), FM4-64FX (적색, 멤브레인)로 표시하고 중첩한다. 이 수치는 이전 간행물15,16에서적응하고, 유출의 충격을 포함하여 프로브 국소화를 검사하기 위하여 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: DMACA 프로브 현지화의 공초점 현미경 시각화. 옥사졸리디논의 프로브 Lz-DMACA (파란색), 수축녹색 (녹색, 핵산) 및 FM4-64FX (적색, 막)로 표지된 살아있는 S. 아우레우스의 공초점 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MIC(μg/mL)
스트레인 시프로 (주) 시프로-NBD 시프로 드마카 Tmp TMP-NBD TMP-DMACA 라인졸리드 (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
황색포도상구균 ATCC 25923 0.125 - 0.5 32 - ≥64 16 1 16 >64
ATCC 43300 1 16 >64
연쇄상 구균 폐렴 ATCC 700677 1 4 64
엔테로코커스 파에시움 ATCC 35667 1 - 8 32 32 - ≥64
ATCC 51559 2 16 32
클렙시엘라 폐렴 ATCC 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
슈도모나스 녹농균사 ATCC 27853 0.25 - 1 32 - ≥64 32 - ≥64
대장균 ATCC 25922 ≤0.004 8 2 0.5 >64 >64
돌연변이 Δ톨C 0.125 0.25 2

표 1. 국물 미세 희석 MIC 분석에 의해 측정된 바와 같이, 적절한 임상적으로 관련된 세균성 균주에 대하여 시프로플록사신, trimethoprim 및 linezolid에 근거를 둔 형광 항생제 프로브의 항생제 활동. 대부분의 경우, 프로브는 부모 약물에 비해 일부 활성을 잃었지만, 일부 측정 가능한 항생제 효능을 유지 (추가 연구에서 유용하기에 충분).

Discussion

성공적인 형광 항생제 프로브의 생성은 부모 약물의 SAR을 신중하게 계획하고 고려하는 것으로 시작해야합니다. SAR이 알려지지 않았거나 완전히 탐구되지 않은 경우 생물학적 활성을 폐지하지 않고 선택적으로 수정될 수 있는 부위를 찾기 위해 몇 가지 옵션을 테스트해야 할 수도 있습니다. 일단 사이트/s가 확인되면, 링커 moiety의 설치는 종종 행동의 생물학적 사이트와 비활성 형광단 사이의 입체 간격을 제공하기 위해 필수적이다. 항생제에 링커를 부착하는 데 사용되는 반응이 생체 내 에스테르에 의해 절단에 취약한 예를 들어, 예를 들어, 에스테르를 피하는 생체 안정 기능 그룹을 떠난다는 것을 주의해야 한다. 항생제의 약동적 및 약동학적 프로파일에 따라, 간단한 알킬 링커가 사용될 수 있고, 그렇지 않으면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커와 같은 덜 친유성 옵션을 고려해야 한다. 링커를 부착하면 관련 박테리아에 대한 NIC가 모 화합물과 유사하도록 항균 활성을 평가해야합니다.

이 작품에서는 여러 가지 이유로, 우리는 Huigsen azide-alkyne [3+2] 다극성 사이클로더 (클릭 화학, 그림 1참조)를 항생제에 불소 불소를 리게이트하는 것을 권장합니다. 클릭 반응은 매우 선택적이며, 이는 항생제에 대한 반응성 기의 보호가 필요하지 않다는 것을 의미하며, 또한 반응은 안정적이고 생체 적합성 트리아졸 을 떠난다. 아지드 성분은 일반적으로 알키네의 도입보다 다양한 구조적 유형으로 더 쉽게 달성되기 때문에 우리의 절차에서 항생제 부분에 도입된다. 2개의 알키네 파생된 형광단의 합성은, 그 외가 원하는 경우에 탐구될 수 있더라도, 여기에서 기술됩니다. NBD와 DMACA는 작은 크기로 인해 선택되어 세포 침투 및 표적 상호 작용을 방해할 가능성을 최소화했습니다. 클릭 반응 자체는 구리 촉매를 사용하여 수행되며, 여기서 Cu2+(CuSO 4,아스코르브산 환원제) 또는 Cu+(CuI)가 시약으로 사용될 수 있다. 다음 정제(그림 2),MICs는 다음 azide와 같이 테스트되어야한다. 형광포핍증 선택과 부착 부위를 신중하게 고려하더라도 열악한 항생제 활동이 관찰 될 수 있습니다. 그러나 비활성 프로브를 사용하지 않는다는 의미는 아닙니다. TMP 프로브와 같이, 항균 활성이 좋지 않은 화합물은 여전히 모약물과 동일한 표적에 결합할 수 있다. 이것은 운동 의 모드에 대한 연구를 가능하게하고 유출과 같은 저항으로 이어지는 현상의 검사.

프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 간단한 분광광도 분석법(도3)또는 유세포분석법(도4)을사용하여 형광 항생제에 의한 세균 라벨링을 분석할 수 있다. 두 방법 모두 세포 축적을 정량화할 수 있으며, 세포를 포량화하고 포세이트에서 형광 국소화를 검사함으로써 세포내 축적을 평가할 수 있다. 이 프로토콜에서, 세포 용해를 위한 리소자임의 사용은, 이것은 급속한, 보편적인 기술이기 때문에 기술됩니다. 글리신-HCl7을사용한 하룻밤 치료와 같은 다른 용해 조건도 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술을 사용하여, 저항의 중요한 기계장치인 항생제 세포 축적에 유출의 충격을 공부하는 것이 가능합니다. 유출이 실제로 박테리아에 존재하는 경우, 세포 내 축적의 부족이 관찰 될 것이다, 이 CCCP 같은 유출 억제제등을 사용하여 구출 될 수 있지만.

현미경 검사는 또한 다른 박테리아에 있는 프로브 현지화를 시각적으로 검사하기 위하여 실행될 수 있고, 행동의 모드에 대한 정보를 얻고, 잠재적으로 또한 저항 (대표적인 예에 대한 그림 5 참조). 박테리아 내국화를 보기 위해서는 SIM(구조화 조명 현미경), SR-SIM(초해상도-SIM), Airyscan 또는 STED(자극방출 고갈)와 같은 기능을 갖춘 고해상도 공초점 현미경이 필요합니다. 또한 고성능 커버 슬립을 사용해야 하며 적절한 소프트웨어(예: FIJI, Zen 또는 Imaris)에서 이미징 후 분석을 수행해야 합니다. 프로브의 국소화는 Hoechst-33342 (청색, 핵산), Syto-9 (녹색, 핵산) 및 FM4-64FX (적색, 막)와 같은 특정 아키텍처를 얼룩지게하는 염료와 비교됩니다. 염료의 선택은 형광 항생제와 일치하도록 해야하며, 사용되는 각 색상은 최소한의 스펙트럼 중복을 가져야합니다. 최상의 이미지를 얻으려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아가 슬라이드에 너무 붐비는 경우 부유 펠릿의 일부만 가져 온 다음 더 많은 장착 매체로 희석하십시오. 대조적으로, 박테리아가 슬라이드에 너무 희소한 경우, 단순히 더 많은 박테리아로 시작합니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 세포(예: Cygel)와 호환되는 열 가역 겔의 사용이 박테리아(운동성 박테리아 포함)를 고정하기 때문에 살아있는 세포 이미징에 권장되지만 다른 마운팅 매체 또는 아가로즈도 성공적으로 사용되었습니다.

전반적으로, 생물학적활성 형광 항생제 유도체의 제조에 직면할 수 있는 도전에도 불구하고, 그들의 사용의 단순성과 그들의 다양성은 AMR에 있는 연구를 위한 이 탐사기 매력적인 공구를 만듭니다. 형광 성 항생제를 사용하여 미래의 작업은 항생 저항의 기계장치에 대한 통찰력을 제공하고, 현재 항생제가 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 이해를 향상시키고, 더 나은 약물의 개발을 도울 가능성이 있습니다.

Disclosures

저자는 선언할 것이 없습니다.

Acknowledgments

MRLS는 호주 대학원 상 (APA)과 분자 생물 과학 연구 발전 상을위한 연구소에 의해 지원됩니다. 와니다 페상은 UQ 국제 장학금 (UQI)과 IMB 대학원 상 (IMBPA)에 의해 지원되었다. MAC는 NHMRC 원리 연구원 (APP1059354)이며 퀸즐랜드 대학에서 분수 교수 연구원 임명을 보유하고 있으며 염증 성 질환의 임상 충족되지 않은 요구를 해결하기 위해 약물을 개발하는 회사인 Inflazome Ltd.의 CEO로 남은 시간을 보유하고 있습니다. MATB는 웰컴 트러스트 전략 그랜트 WT1104797/Z/14/Z 및 NHMRC 개발 보조금 APP1113719에 의해 부분적으로 지원됩니다. 현미경 검사는 ACRF의 지원으로 설립된 분자 생물 과학 암 생물학 화상 진찰 시설에 대한 호주 암 연구 재단 (ACRF) /연구소에서 수행되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder
Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

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형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화
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Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

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