Fluorescerende merkede antibiotika er kraftige verktøy som kan brukes til å studere flere aspekter av antimikrobiell resistens. Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av fluorescerende merket antibiotika og deres anvendelse for å studere antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan brukes til å studere mekanismer for bakteriell resistens (f.eks. efflux) ved spektrofotometri, flytcytometri og mikroskopi.
Fluorescerende antibiotika er flerbruksforskningsverktøy som lett brukes til studiet av antimikrobiell resistens, på grunn av deres betydelige fordel over andre metoder. For å forberede disse sondene syntetiseres azidederivater av antibiotika, deretter kombinert med alkyne-fluoropforer ved hjelp av azide-alkyne dipolar cycloaddition ved klikkkjemi. Etter rensing testes antibiotikaaktiviteten til fluorescerende antibiotika ved minimum hemmende konsentrasjonsvurdering. For å studere bakteriell akkumulering kan enten spektrofototri eller flytcytometri brukes, noe som gjør det mulig for mye enklere analyse enn metoder som er avhengige av radioaktive antibiotikaderivater. Videre kan konfokal mikroskopi brukes til å undersøke lokalisering i bakteriene, og gir verdifull informasjon om handlingsmåte og endringer som oppstår hos resistente arter. Bruk av fluorescerende antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens er en kraftig metode med mye potensial for fremtidig ekspansjon.
Antimikrobiell resistens (AMR) er en stigende krise som utgjør en stor trussel mot menneskers helse rundt om i verden. Resistens mot de fleste antibiotika er rapportert, og infeksjoner forårsaket av bakterier som er resistente mot alle klinisk tilgjengelige legemidler, oppstår. For å bekjempe fremveksten av AMR, må vi øke vår forståelse av dette mangefasetterte fenomenet og de underliggende mekanismene og interaksjonene mellom antibiotika og bakterier. Et aspekt som historisk er dårlig forstått, er permeasjonen av antibiotika til bakterier, sammen med fenomenene akkumulering og efflux. Denne kunnskapen er avgjørende for å designe nye stoffer og forstå motstandsmekanismer. Derfor spiller dette en kritisk rolle i AMR-forskning.
Det er to hovedtilnærminger som kan tas for å måle antibiotikakonsentrasjon: måle stoffet direkte eller tagge med et moiety designet for å lette kvantifisering. Selv om merking av antibiotika forbedrer deteksjon, dette kan perturb den biologiske aktiviteten til stoffet, som antimikrobiell aktivitet og permeabilitet. Dette er ikke et problem for ikke-kodede metoder; Deteksjon kan imidlertid være utfordrende. I de siste årene har teknologiske fremskritt ført til en boom i forskning utnytte massespektrometri (MS) å direkte måle antibiotikakonsentrasjonen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Disse studiene har vist at det er mulig å studere intracellulær akkumulering hos en rekke bakterier, med gramnegative bakterier som er mest studert. Kvantifisering av molekylpermeabilitet har da vært knyttet til aktivitet og brukes til å informere legemiddelutvikling2,3,4, men forsiktighet må tas når direkte konflatering og målaktivitet5. Før MS utvikling, de eneste antibiotika hvis konsentrasjon kunne måles direkte var de som har iboende fluorescens, som tetracyklin og quinolones8,9,10,11. Selv om det åpenbart var begrenset i omfang, ble akkumulering og efflux undersøkt og kvantifisert, noe som illustrerer nytten av fluorescensbasert kvantifisering.
Tagged antibiotika har blitt brukt i mange tiår for å studere distribusjoner, virkningsformer og resistens, med radioaktive og fluorescerende koder er vanlig. Radiomerkede sonder har fordelen av å være nesten identisk med den overordnede forbindelsen, derfor er den biologiske aktiviteten usannsynlig å være betydelig annerledes. Isotoper som 3H, 14C og 15N har blitt ofte brukt på grunn av fremtredende av disse elementene i antibiotika, og en rekke antibiotika stillas har blitt undersøkt1,10,12,13. Selv om påvisning av radiosonder er enkel, er det en rekke logistiske bekymringer (f.eks. sikkerhet, isotop halveringstid) som har begrenset bruken av denne tilnærmingen. En annen strategi er fluorescerende-merket antibiotika. Disse sondene kan brukes til å undersøke distribusjon og virkningsformer og motstand av moderstoffet, ved hjelp av enklere teknologi enn MS og uten logistiske problemer med stråling8. Den største ulempen med denne tilnærmingen er at antibiotika er generelt relativt små molekyler, derav innføringen av en fluorescerende moiety utgjør en betydelig kjemisk endring. Denne endringen kan påvirke fysiokjemiske egenskaper og antibakteriell aktivitet. Det må derfor utvises forsiktighet for å vurdere disse faktorene for å generere resultatrepresentant for foreldreantibiotika.
I dette arbeidet er en metode beskrevet for å syntetisere, vurdere og bruke fluorescerende antibiotika, som i våre tidligere publikasjoner14,15,16. Gjennom tidligere arbeid har en rekke fluorescerende antibiotika blitt utarbeidet og brukt til en rekke formål (se Stone et al.8). For å minimere sannsynligheten for å påvirke biologisk aktivitet, brukes svært små fluoropforer i dette arbeidet: nitrobenzoksadiazol (NBD, grønn) og 7-(dimetylamino)-2-oksokso-2H-chromen-4-yl (DMACA, blå). Videre er vurderingen av antibakteriell aktivitet ved hjelp av mikrobroth fortynning minimum hemming konsentrasjon (MIC) analyse beskrevet, slik at effekten av modifikasjoner på aktivitet kan måles. Disse fluorescerende merkede sondene kan brukes i spektrofotometriske analyser, flytcytometri og mikroskopi. Utvalget av mulige anvendelser er hvor fordelen med fluorescerende antibiotika ligger. Cellulær akkumulering kan kvantifiseres, kategoriseres og visualiseres, noe som ikke er mulig å bruke MS alene. Det er håpet at kunnskapen som oppnås gjennom bruk av fluorescerende antibiotika vil hjelpe til med vår forståelse av resistens, og kampen mot AMR.
Opprettelsen av en vellykket fluorescerende antibiotikasonde må begynne med nøye planlegging og vurdering av SAR av moderstoffet. Hvis SAR ikke er kjent eller fullstendig utforsket, kan det hende at flere alternativer må testes for å finne et nettsted som kan endres selektivt uten å avskaffe biologisk aktivitet. Når et nettsted/s er identifisert, er installasjon av en linker moiety ofte viktig for å gi steric avstand mellom det biologiske handlingsstedet og inaktiv fluoropfor. Forsiktighet må tas at reaksjonen som brukes til å feste linker til antibiotika forlater en bio-stabil funksjonell gruppe, unngå for eksempel estere som er utsatt for spalting av esterases in vivo. Avhengig av den farmakodynamiske og farmakokinetiske profilen til antibiotika, kan en enkel alkyllinker brukes, ellers bør et mindre lipofilt alternativ som en polyetylenglykol (PEG) linker vurderes. Med linker festet, bør den antibakterielle aktiviteten vurderes for å sikre at MICs mot relevante bakterier ligner på den overordnede forbindelsen.
I dette arbeidet anbefaler vi bruk av Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (klikk kjemi, se figur 1)for å ligate fluorophore til antibiotika, av flere grunner. Klikkreaksjoner er svært selektive, noe som betyr at beskyttelse av reaktive grupper på antibiotika ikke er nødvendig, og videre etterlater reaksjonen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidekomponenten introduseres til antibiotikadelen i våre prosedyrer, da dette generelt lettere oppnås med en rekke strukturelle typer enn innføring av en alkyne. Syntesene til to alkyne-avledede fluoropforer er beskrevet her, selv om andre kan utforskes hvis ønskelig. NBD og DMACA ble valgt på grunn av sin lille størrelse, noe som minimerer muligheten for å forstyrre cellepenetrasjon og målinteraksjon. Klikkreaksjonen i seg selv utføres ved hjelp av kobberkatalys, der enten Cu2+ (CuSO4, med et askorbinsyrereduksjonsmiddel) eller Cu+ (CuI) kan brukes som startreagens. Etter rensing (figur 2)skal MICene testes som med aziden. Selv med nøye vurdering av fluoropforvalg og vedleggssted, er det mulig at dårlig antibiotikaaktivitet vil bli observert. Dette betyr imidlertid ikke at en inaktiv sonde er uten bruk. Som vist med TMP-sondene, kan forbindelser med dårlig antibakteriell aktivitet fortsatt binde seg til samme mål som det overordnede stoffet. Dette kan muliggjøre studier på handlingsmåte og undersøkelse av fenomener som fører til motstand, for eksempel efflux.
Som beskrevet i protokolldelen, er det mulig å analysere bakteriell merking ved fluorescerende antibiotika ved hjelp av enten en enkel spektrofotometrianalyse (figur 3) eller flytcytometri (figur 4). Begge metodene er i stand til å kvantifisere cellulær akkumulering, og ved å lysing celler og undersøke fluorescens lokalisering i lysate, er det mulig å vurdere intracellulær akkumulering. I denne protokollen beskrives bruk av lysozym for cellelysis, da dette er en rask, universell teknikk. Andre lysisforhold, som behandling over natten med glycine-HCl7,har også blitt brukt. Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å studere virkningen av efflux på antibiotikacellulær akkumulering, som er en viktig mekanisme for resistens. Hvis efflux faktisk er tilstede i bakteriene, vil mangel på intracellulær akkumulering observeres, selv om dette kan reddes ved hjelp av en efflux-hemmer som CCCP.
Mikroskopi kan også utføres for å visuelt inspisere probelokalisering i forskjellige bakterier, få informasjon om handlingsmåte, og potensielt også motstand (se figur 5 for representative eksempler). For å se lokalisering i bakterier, er det nødvendig med et høyoppløselig konfokalmikroskop, utstyrt med evner som SIM (strukturert belysningmikroskopi), SR-SIM (superresolution-SIM), Airyscan eller STED (stimulert utslippsuttømming). Videre bør høyytelses coverslips brukes, og etter bildebehandling analyse utført på en passende programvare (f.eks FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder sammenlignes med fargestoffer som flekker spesifikke arkitekturer, som Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), Syto-9 (grønn, nukleinsyre) og FM4-64FX (rød, membran). Valget av fargestoffer bør gjøres for å matche fluorescerende antibiotika, slik at hver farge som brukes har minimal spektral overlapping. For å få best mulig bilder, kan optimalisering være nødvendig. For eksempel, hvis bakterier er for overfylt på lysbildet, ta bare en del av suspendert pellet, deretter fortynne med mer monteringsmedium. I motsetning, hvis bakterier er for sparsomme på lysbildet, starter du bare med flere bakterier. I denne protokollen anbefales bruk av en termoreversibel gel som er kompatibel med levende celler (f.eks. Cygel) for levende celleavbildning, da den immobiliserer bakterier (inkludert motilbakterier), men andre monteringsmedier eller agarose har også blitt brukt.
Samlet sett, til tross for utfordringer som kan møtes i utarbeidelsen av en biologisk aktiv fluorescerende antibiotikaderivater, gjør enkelheten i bruken og deres allsidighet disse sondene attraktive verktøy for forskning i AMR. Fremtidig arbeid ved hjelp av fluorescerende antibiotika har potensial til å gi innsikt i mekanismer for antibiotikaresistens, forbedre vår forståelse av hvordan dagens antibiotika opererer, og hjelpe utviklingen av bedre legemidler.
The authors have nothing to disclose.
MRLS støttes av en Australsk Postgraduate Award (APA) og et Institutt for molekylær biovitenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang ble støttet av UQ International Scholarship (UQI) og IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC er en NHMRC prinsippstipendiat (APP1059354) og har også en brøkdel professoriell stipendiat avtale ved University of Queensland, med sin gjenværende tid som administrerende direktør i Inflazome Ltd, et selskap som utvikler legemidler for å løse kliniske udekkede behov i inflammatorisk sykdom. MATB støttes delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z og NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi ble utført ved Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som ble etablert med støtte fra ACRF.
3-(dimethylamino)phenol | Alfa-Aesar | B23067 | |
4-chloro-7-nitro-benzofuran | Sigma-Aldrich | 163260-5G | |
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane | Merck | UFC501096 | |
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10×250 mm) | Waters | 186008205 | |
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) | Waters | 186003734 | |
Bruker Avance 600 MHz spectrometer | Bruker | ||
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge | Buchi | BUC145152103 | |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
Celite 545 | Sigma-Aldrich | 22140-5KG-F | |
Cygel | ABCAM | Ab109204 | |
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope | Zeiss | ||
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain | Life Technologies Australia Pt | F34653 | |
Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise | CHRIST | ||
Gilson HPLC 2020 | Gilson | ||
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 | Hettich | ||
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) | Schott/Zeiss | 474030-9000-000 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – Fluo | Life Technologies Australia Pt | H21492 | |
LB | AMRESCO | J106 | |
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation | Leica | ||
Lysozyme from chicken egg white lyophilized powder |
Sigma-Aldrich | L6876 | |
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted | Becton Dickinson | 212322 | |
Propargylamine | Sigma-Aldrich | P50900-5G | |
Reveleris GRACE MPLC | Buchi | ||
Shimadzu LCMS-2020 | Shimadzu | ||
Sigma 1-15 Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | ||
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) | Merck | 1093859025 | |
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Life Technologies Australia Pt | S34854 | |
TECAN Infinite M1000 PRO | TECAN |