Summary
Her viser vi en metode for å kvantifisere leverstørrelse i larval sebrafisk, noe som gir en måte å vurdere effekten av genetiske og farmakologiske manipulasjoner på levervekst og utvikling.
Abstract
I flere transgene sebrafiskmodeller av hepatocellulært karsinom (HCC) kan hepamegali observeres under tidlige larvestadier. Kvantifiserende larval leverstørrelse i sebrafisk HCC modeller gir et middel til raskt å vurdere effekten av narkotika og andre manipulasjoner på en onkogen-relatert fenotype. Her viser vi hvordan du fikser sebrafisk larver, dissekerer vevet rundt leveren, fotograferer lever ved hjelp av lyse feltmikroskopi, måler leverområdet og analyserer resultater. Denne protokollen muliggjør rask, presis kvantifisering av leverstørrelse. Siden denne metoden innebærer å måle leverområdet, kan det undervurdere forskjeller i levervolum, og komplementære metoder er nødvendig for å skille mellom endringer i cellestørrelse og endringer i cellenummer. Disseksjonsteknikken som er beskrevet her, er et utmerket verktøy for å visualisere leveren, tarmen og bukspyttkjertelen i naturlige posisjoner for utallige nedstrøms applikasjoner, inkludert immunfluorescensfarging og in situ hybridisering. Den beskrevne strategien for å kvantifisere larval leverstørrelse gjelder for mange aspekter av leverutvikling og regenerering.
Introduction
Hepatocellulært karsinom (HCC) er den vanligste primære maligniteten i leveren1 og den tredje ledende årsaken til kreftrelatert dødelighet2. For bedre å forstå mekanismer for hepatokarsinogenese og identifisere potensielle HCC-terapeutiske midler, har vi og andre utviklet transgene sebrafisk der hepatoktino-spesifikt uttrykk for onkogenes som β-catenin3,4, Kras(V12)5,6,Myc7eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse sebrafiskene er leverforstørrelse notert så tidlig som 6 dager etter befruktning (dpf), noe som gir en facile plattform for å teste effekten av narkotika og genetiske endringer på onkogendrevet leverovervekst. Nøyaktig og presis måling av larval leverstørrelse er avgjørende for å bestemme effekten av disse manipulasjonene.
Leverstørrelse og form kan vurderes semikvantitativt i faste sebrafisk larver ved CY3-SA merking9 eller i levende sebrafisk larver ved hjelp av hepatocytterspesifikke fluorescerende reportere og fluorescensdissekermikroskopi5,6. Sistnevnte metode er relativt rask, og mangelen på presisjon kan løses ved å fotografere og måle området av hver lever ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare7,10. Det kan imidlertid være teknisk utfordrende å jevnt plassere alle levende larver i et eksperiment slik at todimensjonalt leverområde er en nøyaktig representasjon av leverstørrelse. En lignende teknikk for å kvantifisere leverstørrelse innebærer å bruke lysark fluorescens mikroskopi for å kvantifisere larval levervolum8, som kan være mer nøyaktig for å oppdage størrelsesforskjeller når leveren utvides ikke-jevnt i forskjellige dimensjoner. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan brukes til å telle antall fluorescerende merkede hepatocytter og andre levercelletyper i larvallever8,11. I denne metoden er larvallever samlet og dissosiert, så informasjon om individuell leverstørrelse og form går tapt. I kombinasjon med en annen metode for bestemmelse av leverstørrelse muliggjør FACS differensiering mellom økt cellenummer (hyperplasi) og økt cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metodene bruker dyr fluorescensteknologi (mikroskop eller cellesortering) og, med unntak av CY3-SA-merking, krever merking av hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detalj en metode for å kvantifisere sebrafisk larveleverområde ved hjelp av lyse felt mikroskopi og bildebehandling programvare3,12,13,14. Denne protokollen muliggjør nøyaktig kvantifisering av arealet av individuelle lever in situ uten bruk av fluorescens mikroskopi. Mens du analyserer leverstørrelsen, blinder vi bildeidentiteten for å redusere etterforskerbias og forbedre vitenskapelig rigor15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier utføres etter prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Utah.
1. Feste larver
- Ved 3–7 dager etter befruktning (dpf) eutaniserer eutanasi larver med trikainmetansulfonat (0,03 %) og samle opptil 15 larver i et 2 ml rør ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe.
- Vask larver to ganger med 1 ml kaldt (4 °C) 1x fosfatbufret saltvann (PBS) på is. For hver vask, fjern så mye væske som mulig fra røret med en glasspipette og pipettepumpe, og tilsett deretter 1 ml kald PBS til røret.
- Fjern så mye PBS som mulig ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe, og tilsett 1 ml kald (4 °C) 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS.
FORSIKTIG: PFA er et irriterende og mistenkt kreftfremkallende. Hansker bør brukes ved håndtering av PFA, og konsentrerte løsninger skal håndteres i en kjemisk røykhette. - Inkuber ved 4 °C minst over natten (men opptil flere måneder) med mild gynge.
2. Dissekere vev rundt leveren
- Fjern larver fra PFA ved å skylle 3x med 1 ml kald (4 °C) PBS og gynge i 5 min mellom skyllene.
MERK: Det er greit å holde de skyllede larver i PBS i en dag eller to ved 4 °C. - Pipette flere larver i PBS i en brønn av en 9-brønn rund bunn glassrett.
- Fjern huden rundt leveren.
- Bruk fine tang til å holde larven på ryggen (magen opp), gripende på hver side av hodet så forsiktig som mulig. Deretter bruker du veldig fine pinsett i den andre hånden for å ta tak i huden bare overliggende hjertet.
- Trekk huden ned diagonalt mot halen av fisken og bunnen av parabolen på venstre eller høyre side av fisken. Gjenta for den andre siden (høyre eller venstre side).
- Fortsett å gripe hudklaffer og trekk ned/tilbake til hele huden og melanopforene som ligger over eller i nærheten av leveren, er fjernet.
- Fjern eggeplomme, hvis det finnes.
- For 5-6 dpf larver, løft eggeplomme av i ett stykke ved å holde fisken med fine tang på ryggen og bruke de svært fine pinsett ene til å prod eggeplomme forsiktig.
- For 3-4 dpf larver, skrap eggeplommen av i stykker. Hold fisken med fine tang på ryggen og bruk de svært fine tang til å stryke eggeplommen, fra ventralsiden.
- Plasser dissekert larver i frisk kald PBS ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe.
3. Bildebehandling
- For å montere larver, hell noen ml 3% metylcellulose på lokket på en ren plast Petri-tallerken.
- Bruk en glasspipette og pipettepumpe for å legge larver til metylcellulose, og tilsett så lite PBS med larver som mulig.
- Under et dissekeringsmikroskop ved lav forstørrelse, bruk fine tang for å orientere fisken slik at de ligger på høyre side, vendt mot venstre.
MERK: Pass på at fisken er perfekt orientert på sin side eller levermålingene kan ikke være nøyaktige. - Ta et bilde av hver fisk.
- Bekreft at fisken som skal fotograferes er riktig justert, med det ene øyet direkte på toppen av det andre øyet. Bruk om nødvendig fine tang til å trykke lett på hode eller hale av fisk for å justere retningen. Hvis fiskens hale er bøyd, fjern halen ved å klemme den kraftig med tang for å fjerne den slik at fisken legger seg flatt.
- Zoom inn til høy forstørrelse og fokuser på leveren, og sørg for at leverens disposisjon er tydelig synlig.
- Ta et bilde på et bilde og lagre filen.
- Gjenta for all fisk, sørg for at forstørrelsen er den samme for hvert bilde.
- Ta et bilde av et mikrometer ved hjelp av samme forstørrelse (se figur 2H).
4. Bildeanalyse
- Mål området av hver fisklever ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
- Blind alle leverbilder for å unngå potensielle etterforsker bias og fremme vitenskapelig rigor15. Dette trinnet kan gjøres manuelt av et annet laboratoriemedlem eller ved hjelp av et dataprogram (Tilleggsmateriale). Gi nytt navn til filer tilfeldig og opprett en "randomiseringsfil" som inneholder en liste over de opprinnelige filnavnene og tilsvarende blindede filnavn.
- Åpne randomiserte filer i rekkefølge, fra og med fil 1.
- Velg frihåndsvalgverktøyet og skisser hver lever.
- Trykk Ctrl-M for å måle området for hver lever.
- For lever som ikke kan måles nøyaktig, setter du inn en plassholdermåling (svært liten eller veldig stor, slik at den enkelt kan utelukkes senere).
- Lagre målene i en tekstfil ("målfil").
- Un-blind og analysere data
- Åpne "målfil" og "randomiseringsfil" i et regnearkprogram.
- Sett inn en ny kolonne i "målfilen" og legg til de opprinnelige filnavnene for de blindede filene ved hjelp av "randomiseringsfilen". Lagre denne filen som "ublindet målfil".
- Sorter data etter opprinnelig filnavn.
- Sørg for å utelukke eventuelle levermålinger som bildene var utilstrekkelige (se figur 2A–G).
- Om nødvendig, konverter måleverdier til ønsket skala (mm2, for eksempel).
- Åpne skaleringslinjen i bildebehandlingsprogramvaren.
- Bruk det rette linjeverktøyet til å måle 1 mm på skaleringslinjen. Bildebehandlingsprogramvaren vil måle i de samme enhetene som leverene (piksler), noe som gir en konverteringsfaktor.
- Bruk konverteringsfaktoren til å konvertere målinger i "ublindet mål-filen".
- Bruk regnearkprogrammet eller liminn data i en vitenskapelig grafer- og statistikkprogramvare, bestem gjennomsnitts- og standardavvik og beregn p-verdi(er).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgen sebrafisk som uttrykker hepatocyttspesifikk aktivert β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-cat) sebrafisk)3 og ikke-transgene kontrollsøsken ble euthanized ved 6 dpf og leverområdet ble kvantifisert ved hjelp av brightfield mikroskopi og bildebehandlingsprogramvare. Transgene sebrafisk har betydelig økt leverstørrelse (0,0006 cm2)sammenlignet med deres ikke-transgene søsken (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figur 1).
Figur 1: Leverstørrelsesanalyse av 6 dpf (dager etter befruktning) sebrafisk. - Jeg har ikkenoe å si. Representativ brightfield bilde av 6 dpf ikke-transgene sebrafisk larven, som viser naturlig posisjon og form av leveroverliggende tarmen. Leverområdet er skissert i (B). Skala barer = 0,1 mm. (C-D) Representativ brightfield bilde av 6 dpf transgene sebrafisk larve uttrykke hepatocytter-spesifikk aktivert b-catenin (ABC), viser forstørret lever. Leverområdet er skissert i (D). Skalastenger = 0,1 mm. (E) Graf som viser målinger av leverstørrelse (gjennomsnittlig ± standardavvik) av 6 dpf ikke-transgene sebrafisklarver (Ikke-Tg) og transgene sebrafisklarver som uttrykker hepatocyttspesifikk aktivert b-catenin (ABC). Prøvene ble sammenlignet med ikke-parkoblet t-test. p < 0.0001. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempler på utilstrekkelige bilder og mikrometer. - Jeg har ikkenoe å si. Representative bilder av larvallever som bør utelukkes fra analyse. Skala barer = 0,1 mm. (A) Larve med hud som dekker leveren. (B) Larve med eggeplomme skjule leveren. (C) Larve med deler av leveren klemt av. (D) Larve med lever forstuet og faller av. -Larve med manglende lever. (F) Larve med leveromriss som er vanskelig å identifisere fordi bildet er uskarpt / ute av fokus. (G) Larva med feil posisjonering. De to øynene er ikke justert direkte oppå hverandre. (H) Bilde av mikrometeret, brukes til å generere skalalinjer og konvertere bildebehandlingsprogramvaremålinger fra piksler til cm2. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifisering av leverstørrelse er avgjørende i studier som tar sikte på å forstå leverutvikling, regenerering og onkogenese. Protokollen som er beskrevet her er en relativt rask, enkel og billig teknikk for leverstørrelse kvantifisering i larval sebrafisk. Utøvelse av passende forsiktighet mens du utfører visse aspekter av protokollen kan hjelpe til med økt nøyaktighet av resultater og redusert frustrasjon.
Riktig fiksering av larver er avgjørende for å få godt bevarte biologiske prøver og forhindre oppløsning. Fortynning av 4% PFA-oppløsningen kan oppstå når PBS ikke fjernes helt før tilsetning av PFA til de skyllede larver. Bruk av vellagde PFA-løsninger og pipettering av hele eller det meste av PBS-løsningen før PFA-tillegget er nyttig for å løse dette problemet.
Selv om det er raskt og enkelt å utføre etter mye trening, krever disseksjonsteknikken betydelig fingerferdighet. Mens dissekering, Det er avgjørende å fjerne huden og eggeplomme helt av fra over leveren slik at hele leveren er utsatt. Unnlatelse av å gjøre dette kan resultere i bilder der visningen av levergrensen er skjult (Figur 2A,B). Ufaglærte og kraftfulle bevegelser mens dissekering kan føre til klemming av deler av leveren (Figur 2C) eller løsning av levervedlegg, noe som resulterer i at leveren blir forskjøvet (Figur 2D) eller mangler helt (Figur 2E). Brukere bør sette i tilstrekkelig antall timer mot honing sine dissekere ferdigheter på praksis prøver før du går videre til eksperimentelle prøver.
Under montering har huden over leveren blitt fjernet, noe som øker sannsynligheten for at leveren faller ut under påfølgende trinn. For å unngå denne muligheten bør milde pipetteringsbevegelser brukes i løpet av denne prosessen.
Under bildeinnkjøp ved hjelp av brightfield-mikroskopet er det avgjørende at bilder av god kvalitet tas. Uklare, ute av fokus bilder vil gjøre det vanskelig å vurdere den sanne grensen av leveren (Figur 2F). Da denne metoden innebærer å måle overflatearealet på venstre flike i leveren, er det avgjørende at larven er godt orientert på siden og ikke vippet (Figur 2G). Pass på at begge øynene på larven er justert (det ene øyet som dekker synet på den andre). Mens måle overflateareal ved hjelp av bildebehandling programvare, er det viktig å trekke grensen så nært som mulig til den virkelige omrisset av leveren for å unngå måling avvik. Utelukke eventuelle bilder der leveren ikke kan måles nøyaktig (figur 2A–G). Men, Husk at unntatt lever kan skjev data, som større lever er mer sannsynlig å bli forstyrret enn mindre lever.
En av begrensningene i denne protokollen er at den bare gjelder faste larver. Alternative metoder som fluorescens mikroskopi kan brukes til å måle leverstørrelse i levende larver som uttrykker hepatocyttspesifikke fluorescerende reportere5,7,10. Disse alternative metodene gjør det mulig å gjøre sekvensielle målinger på samme dyr, og de er også raskere, siden de ikke krever fiksering eller disseksjon av vevet som overligger leveren. Fordelene med denne protokollen sammenlignet med fluorescensmikroskopi hos levende dyr er: 1) mer fleksibilitet med hensyn til når lever måles, da sebrafisk kan holdes i fikserende i uker eller måneder før de fotograferes; 2) ingen krav til å innlemme en fluorescerende reporter, som kan være tungvint når du arbeider med homozygot mutanter; og 3) anvendelseav trinn 1 og 2 for andre eksperimenter, inkludert immunofluorescens farging eller i situ hybridisering serutasjonsstudier. Vi bruker begge metodene, avhengig av den aktuelle applikasjonen. For eksempel bruker vi vanligvis levende bildebehandling og hepatocyttspesifikke reportere for screening 3 med høy gjennomstrømning3, og følger opp potensielle treffforbindelser ved hjelp av protokollen som er beskrevet her3.
Denne protokollen tar bare overflatearealet i betraktning for kvantifisering av leverstørrelse, så det oppdager ikke endringer i cellemetabolisme eller morfologi, og det skiller heller ikke mellom økninger i cellenummer og økninger i cellestørrelse. For å løse denne begrensningen, komplementære analyser for å vurdere steatose16, histologi6, celle nummer8,11, celle størrelse3,17, spredning3,18, og / eller apoptose19 kan utføres.
En annen begrensning av denne protokollen er at den forutsetter at øker eller reduseres i overflatearealet av venstre leverflike reflekterer endringene i overflateareal og volum av lever som helhet. Denne antagelsen kan ikke gjelde når levervekst er ikke-ensartet. For å undersøke leverform og se etter ikke-symmetriske økninger i levervekst, gjør vi rutinemessig lysarkfluorescensmikroskopi8 eller konfokal mikroskopi3 på våre transgene modeller. Lysark fluorescens mikroskopi kan brukes til å kvantifisere larval leveren volum8. Ved transgene sebrafisk som uttrykte hepatocyttspesifikk Yap1, ble leverareal og levervolum på samme måte økt sammenlignet med ikke-transgene kontrollsøsken8.
Disseksjonsteknikken som er beskrevet her, kan kombineres med immunfluorescensfarging, cellespesifikke fluorescerende reporterlinjer og/eller andre merkingsteknikker for å studere andre aspekter ved leverutvikling i tillegg til leverstørrelse3,19,20. Siden denne disseksjonsprotokollen også avslører tarmen og bukspyttkjertelen, kan det være nyttig for studier av andre viscerale organer også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne Maurine Hobbs og centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for å gi sebrafisk husdyrhold, laboratorieplass og utstyr for å utføre deler av denne forskningen. Utvidelse av CZAR støttes delvis av NIH stipend # 1G20OD018369-01. Vi vil også takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for sebrafiskomsorg. Vi vil gjerne takke Kenneth Kompass for hjelp med R-programmering. Dette arbeidet ble delvis finansiert av tilskudd fra Huntsman Cancer Foundation (i forbindelse med stipend P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
