Summary
Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.
Abstract
En varios modelos transgénicos de peces cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), se puede observar hepatomegalia durante las primeras etapas larvales. La cuantificación del tamaño del hígado larvario en los modelos de HCC de pez cebra proporciona un medio para evaluar rápidamente los efectos de los fármacos y otras manipulaciones en un fenotipo relacionado con oncogén. Aquí mostramos cómo reparar larvas de peces cebra, diseccionar los tejidos que rodean el hígado, fotografiar hígados usando microscopía de campo brillante, medir el área hepática y analizar los resultados. Este protocolo permite una cuantificación rápida y precisa del tamaño del hígado. Como este método implica medir el área hepática, puede subestimar las diferencias en el volumen hepático, y se requieren metodologías complementarias para diferenciar entre los cambios en el tamaño celular y los cambios en el número de células. La técnica de disección descrita en este documento es una excelente herramienta para visualizar el hígado, el intestino y el páncreas en sus posiciones naturales para innumerables aplicaciones aguas abajo, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la hibridación in situ. La estrategia descrita para cuantificar el tamaño del hígado larvario es aplicable a muchos aspectos del desarrollo y la regeneración del hígado.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (HCC) es la neoplasia maligna primaria más común del hígado1 y la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer2. Para comprender mejor los mecanismos de la hepatocarcinogénesis e identificar posibles terapias de HCC, nosotros y otros hemos desarrollado peces cebra transgénicos en los que la expresión específica de hepatocitos de oncogenes tales como la -catenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, o Yap18 conduce a HCC en animales adultos. En estos peces cebra, el agrandamiento del hígado se observa ya 6 días después de la fertilización (dpf), proporcionando una plataforma fácil para probar los efectos de los fármacos y alteraciones genéticas en el crecimiento excesivo del hígado impulsado por oncógeno. La medición precisa y precisa del tamaño del hígado larvaria es esencial para determinar los efectos de estas manipulaciones.
El tamaño y la forma del hígado pueden evaluarse semicuantitativamente en larvas fijas de peces cebra etiquetando CY3-SA9 o en larvas de peces cebra vivos utilizando reporteros fluorescentes específicos de hepatoparcitos y microscopía de disección de fluorescencia5,6. Este último método es relativamente rápido, y su falta de precisión se puede abordar fotografiando y midiendo el área de cada hígado utilizando el software de procesamiento de imágenes7,10. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil posicionar uniformemente todas las larvas vivas en un experimento tal que el área hepática bidimensional es una representación precisa del tamaño del hígado. Una técnica similar para cuantificar el tamaño del hígado implica el uso de microscopía de fluorescencia de láminas de luz para cuantificar el volumen del hígado larvario8, que puede ser más precisa para detectar diferencias de tamaño cuando el hígado se expande de forma no uniforme en diferentes dimensiones. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para contar el número de hepatocitos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células hepáticas en hígados larvarios8,11. En este método, los hígados larvales se agrupan y se disocian, por lo que se pierde información sobre el tamaño y la forma del hígado individual. En combinación con otro método de determinación del tamaño del hígado, FACS permite la diferenciación entre el aumento del número de células (hiperplasia) y el aumento del tamaño celular (hipertrofia). Todos estos métodos emplean costosa tecnología de fluorescencia (microscopio o clasificador celular) y, a excepción del etiquetado CY3-SA, requieren el etiquetado de hepatocitos con un reportero fluorescente.
Aquí describimos en detalle un método para cuantificar el área del hígado larvario de peces cebra utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes3,12,13,14. Este protocolo permite cuantificar con precisión el área de hígados individuales in situ sin el uso de microscopía de fluorescencia. Al analizar el tamaño del hígado, cegamos la identidad de la imagen para reducir el sesgo del investigador y mejorar el rigor científico15.
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Protocol
Los estudios en animales se llevan a cabo siguiendo procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah.
1. Fijación de larvas
- A los 3-7 días después de la fertilización (dpf), larvas de eutanasia con tricaína metanoesulfonato (0,03%) y recoger hasta 15 larvas en un tubo de 2 ml utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.
- Lave las larvas dos veces con 1 ml de frío (4 oC) 1 x solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo. Para cada lavado, retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y luego agregue 1 ml de PBS frío al tubo.
- Retire tanto PBS como sea posible utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y agregue 1 ml de frío (4 oC) 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
ADVERTENCIA: La PFA es un carcinógeno irritante y sospechoso. Los guantes deben usarse al manipular PFA, y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humo químico. - Incubar a 4oC al menos durante la noche (pero hasta varios meses) con un suave balanceo.
2. Diseción de los tejidos que rodean el hígado
- Retire las larvas de PFA enjuagando 3 veces con 1 ml de PBS frío (4 oC) y mecendo durante 5 minutos entre enjuagues.
NOTA: Está bien mantener las larvas enjuagadas en PBS durante uno o dos días a 4oC. - Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de un plato de vidrio de fondo redondo de 9 pozos.
- Retire la piel que rodea el hígado.
- Utilice fórceps finos para sostener la larva en su espalda (vientre hacia arriba), aferrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.
- Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pez y la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pez. Repita para el otro lado (lado derecho o izquierdo).
- Continúe agarrando colgajos de piel y tirando hacia abajo/hacia atrás hasta que se hayan extirpado toda la piel y los melanoforos que se encuentran sobre el hígado o cerca del hígado.
- Retire la yema, si está presente.
- Para larvas de 5-6 dpf, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para empujar la yema suavemente.
- Para larvas de 3-4 dpf, raspe la yema en pedazos. Sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema, comenzando desde el lado ventral.
- Coloque las larvas diseccionadas en PBS frío fresco utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.
3. Imágenes
- Para montar larvas, vierta unos pocos ml de 3% de celulosa metilenenente en la tapa de un plato Petri de plástico limpio.
- Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para agregar larvas a la celulosa metil, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.
- Bajo un microscopio de disección con bajo aumento, usa fórceps finos para orientar a los peces para que estén acostados en su lado derecho, mirando hacia la izquierda.
NOTA: Asegúrese de que los peces estén orientados perfectamente de su lado o que las mediciones hepáticas no sean precisas. - Tome una foto de cada pez.
- Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado, con un ojo directamente en la parte superior del otro ojo. Si es necesario, utilice fórceps finos para tocar ligeramente la cabeza o la cola de los peces para ajustar la orientación. Si la cola del pez está doblada, retira la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para eliminarla para que el pez quede plana.
- Acercar a un aumento alto y centrarse en el hígado, asegurándose de que el contorno del hígado es claramente visible.
- Toma una foto y guarda el archivo.
- Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.
- Tome una foto de un micrómetro utilizando el mismo aumento (consulte la Figura 2H).
4. Análisis de imagen
- Mida el área del hígado de cada pez utilizando un software de procesamiento de imágenes.
- Cegar todas las imágenes del hígado para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico15. Este paso puede ser realizado manualmente por otro miembro del laboratorio o utilizando un programa de computadora (Material Suplementario). Cambie el nombre de los archivos aleatoriamente y cree un "archivo de aleatorización" que contenga una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes.
- Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo 1.
- Elija la herramienta de selecciones a mano alzada y delinee cada hígado.
- Presione Ctrl-M para medir el área de cada hígado.
- Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión, inserte una medida de marcador de posición (muy pequeña o muy grande, para que pueda excluirse fácilmente más adelante).
- Guarde las medidas en un archivo de texto ("archivo de medidas").
- No ciego y analizar datos
- Abra "archivo de medidas" y "archivo de aleatorización" en un programa de hoja de cálculo.
- Inserte una nueva columna en el "archivo de medidas" y agregue los nombres de archivo originales para los archivos cegados, utilizando el "archivo de aleatorización". Guarde este archivo como "archivo de medidas sin ciegas".
- Ordene los datos por nombre de archivo original.
- Asegúrese de excluir las mediciones hepáticas para las que las imágenes fueron inadecuadas (ver Figura 2A–G).
- Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada (mm2, por ejemplo).
- Abra la barra de escala en el software de procesamiento de imágenes.
- Utilice la herramienta de línea recta para medir 1 mm en la barra de escala. El software de procesamiento de imágenes medirá en las mismas unidades que los hígados (píxeles), dando un factor de conversión.
- Utilice el factor de conversión para convertir las mediciones en el "archivo de medidas sin ciegas".
- Utilizando el programa de hoja de cálculo o pegando datos en un software científico de gráficos y estadísticas, determine la media y la desviación estándar y calcule los valores p.
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Representative Results
El pez cebra transgénico que expresa balasteo específico de hepatocitos activado (Tg(fabp10a:pt-a-cat) -cat) 3 y los hermanos de control no transgénicos fueron eutanasiados a 6 dpf y el área hepática se cuantificó utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado (0.0006 cm2) en comparación con sus hermanos no transgénicos (0.0004 cm2, p < 0.0001; Figura 1).
Figura 1: Análisis del tamaño del hígado de 6 dpf (días posteriores a la fertilización) pez cebra. (A-B) Imagen representativa de campo brillante de larva de pez cebra no transgénica de 6 dpf, que muestra la posición natural y la forma del hígado que cubre el intestino. El área del hígado se ha descrito en (B). Barras de escala a 0,1 mm. (C-D) Imagen representativa del campo brillante de 6 dpf larva de pez cebra transgénica que expresa la b-catenina activada específica de los hepatocitos (ABC), mostrando hígado agrandado. El área del hígado se ha descrito en (D). Barras de escala de 0,1 mm. (E) Gráfico que muestra las mediciones del tamaño del hígado (media de desviación estándar) de larvas de pez cebra no transgénicas de 6 dpf (No Tg) y larvas transgénicas de peces cebra que expresan b-catenina activada específica de hepatocitos (ABC). Las muestras se compararon utilizando una prueba t no emparejada. p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de imágenes y micrómetros inadecuados. (A-G) Imágenes representativas de hígados larvariales que deben excluirse del análisis. Barras de escamas de 0,1 mm. (A) Larva con piel que cubre el hígado. (B) Larva con yema que oscurece el hígado. (C) Larva con partes del hígado pellizcadas. (D) Larva con hígado dislocado y cayendo. (E) Larva con hígado faltante. (F) Larva con contorno hepático que es difícil de identificar porque la imagen está borrosa / desenfocada. (G) Larva con posicionamiento incorrecto. Los dos ojos no están alineados directamente uno encima del otro. (H) Imagen del micrómetro, utilizado para generar barras de escala y convertir mediciones de software de procesamiento de imágenes de píxeles a cm2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La cuantificación del tamaño del hígado es crucial en estudios dirigidos a comprender el desarrollo hepático, regeneración y oncogénesis. El protocolo descrito aquí es una técnica relativamente rápida, fácil y barata para la cuantificación del tamaño del hígado en peces cebra larvaria. Ejercer la precaución apropiada mientras se realizan ciertos aspectos del protocolo puede ayudar a aumentar la precisión de los resultados y disminuir la frustración.
La fijación adecuada de las larvas es crucial para obtener muestras biológicas bien conservadas y prevenir su desintegración. La dilución de la solución de PFA al 4% puede ocurrir cuando el PBS no se elimina por completo antes de la adición de PFA a las larvas enjuagadas. El uso de soluciones de PFA bien hechas y la canalización de la totalidad o la mayor parte de la solución de PBS antes de la adición de PFA es útil para abordar este problema.
Aunque rápida y fácil de realizar después de mucha práctica, la técnica de disección requiere una destreza manual sustancial. Mientras se disecte, es crucial eliminar la piel y la yema completamente fuera de por encima del hígado de tal manera que todo el hígado está expuesto. Si no lo hace, puede producirse imágenes en las que la vista del límite hepático está oscurecida(Figura 2A,B). Los movimientos no calificados y contundentes durante la disección pueden conducir a la pellizcar partes del hígado (Figura 2C) o aflojar los accesorios hepáticos, lo que resulta en el hígado desplazado (Figura 2D) o faltapor a su totalidad (Figura 2E). Los usuarios deben poner en un número adecuado de horas para perfeccionar sus habilidades de diseción en muestras de práctica antes de pasar a muestras experimentales.
Durante el montaje, se ha eliminado la piel por encima del hígado, aumentando la probabilidad de que el hígado se caiga durante los pasos posteriores. Para evitar esa posibilidad, se deben emplear movimientos suaves de pipeteo durante este proceso.
Durante la adquisición de imágenes con el microscopio de campo brillante, es crucial que se tomen imágenes de buena calidad. Imágenes borrosas y desenfocadas dificultarán la evaluación del verdadero límite del hígado(Figura 2F). Como este método implica medir la superficie del lóbulo izquierdo del hígado, es crucial que la larva esté bien orientada de su lado y no inclinada(Figura 2G). Asegúrese de que ambos ojos de la larva estén alineados (un ojo que cubre la vista del otro). Al medir el área de la superficie utilizando el software de procesamiento de imágenes, es importante dibujar el límite lo más cerca posible del contorno real del hígado para evitar discrepancias de medición. Excluir cualquier imagen en la que el hígado no pueda medirse con precisión(Figura 2A–G). Sin embargo, Tenga en cuenta que la exclusión de los hígados puede sesgar los datos, como hígados más grandes son más propensos a ser interrumpidos que los hígados más pequeños.
Una de las limitaciones de este protocolo es que se aplica sólo a las larvas fijas. Se pueden utilizar métodos alternativos como la microscopía de fluorescencia para medir el tamaño del hígado en larvas vivas que expresan reporteros fluorescentes específicos de hepatocitos5,7,10. Estos métodos alternativos permiten realizar mediciones secuenciales en el mismo animal, y también son más rápidos, ya que no requieren fijación o disección de los tejidos que sobrepasan el hígado. Las ventajas de este protocolo en comparación con la microscopía de fluorescencia en animales vivos son: 1) más flexibilidad con respecto a cuándo se miden los hígados, ya que el pez cebra se puede mantener en fijación durante semanas o meses antes de fotografiarlos; 2) ningún requisito para incorporar un reportero fluorescente, que puede ser engorroso cuando se trata de mutantes homocigotos; y 3) aplicabilidad de los pasos 1 y 2 para otros experimentos, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia o estudios de hibridación in situ. Utilizamos ambos métodos, dependiendo de la aplicación en particular. Por ejemplo, normalmente utilizamos imágenes en vivo y reporteros específicos de hepatocitos para la detección de alto rendimiento3, y realizamos un seguimiento de los compuestos de posibles aciertos utilizando el protocolo descrito aquí3.
Este protocolo sólo tiene en cuenta la superficie para la cuantificación del tamaño del hígado, por lo que no detecta cambios en el metabolismo celular o morfología, ni diferencia entre los aumentos en el número de células y los aumentos en el tamaño celular. Para hacer frente a esta limitación, se pueden realizar ensayos complementarios para evaluar la esteatosis16,histología6,número de celda8,11, tamaño de celda3,17, proliferación3,18y/o apoptosis19.
Otra limitación de este protocolo es que supone que aumenta o disminuye en la superficie del lóbulo hepático izquierdo reflejan los cambios en la superficie y el volumen del hígado en su conjunto. Esta suposición puede no aplicarse cuando el crecimiento hepático no es uniforme. Para examinar la forma del hígado y comprobar si hay aumentos no simétricos en el crecimiento hepático, realizamos rutinariamente una microscopía de fluorescencia de láminas ligeras8 o una microscopía confocal3 en nuestros modelos transgénicos. La microscopía de fluorescencia de láminas ligeras se puede utilizar para cuantificar directamente el volumen del hígado larvario8. En el pez cebra transgénico que expresa yap1 específico de hepatocitos, el área hepática y el volumen hepático se incrementaron de manera similar en comparación con los hermanos de control no transgénicos8.
La técnica de disección descrita aquí se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia, líneas de reporteros fluorescentes específicos de células y/u otras técnicas de etiquetado para estudiar otros aspectos del desarrollo hepático además del tamaño del hígado3,19,20. Como este protocolo de disección también expone el intestino y el páncreas, puede ser útil para los estudios de otros órganos viscerales, así.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer a Maurine Hobbs y el Centrald Zebrafish Animal Resource (CZAR) en la Universidad de Utah por proporcionar cría de peces cebra, espacio de laboratorio y equipo para llevar a cabo porciones de esta investigación. La expansión del CZAR es apoyada en parte por la subvención NIH n.o 1G20OD018369-01. También nos gustaría dar las gracias a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, y la instalación de pez cebra del Huntsman Cancer Institute (HCI) para el cuidado del pez cebra. Nos gustaría agradecer a Kenneth Kompass por su ayuda con la programación R. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Huntsman Cancer (en conjunto con la subvención P30 CA042014 otorgada al Huntsman Cancer Institute) (KJE) y NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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