इस रिपोर्ट में विजुअल जीपीसीआर, रोडोप्सिन और मिनी-जीओके साथ इसके कॉम्प्लेक्स को तैयार करने के लिए विभिन्न डिटर्जेंट की स्क्रीनिंग का वर्णन किया गया है । शुद्धिकरण के दौरान विभिन्न चरणों में परिसर की गुणवत्ता की विशेषता वाले जैव रासायनिक तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को उनके भविष्य के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन परिसरों में सामान्यीकृत किया जा सकता है।
झिल्ली प्रोटीन परिसरों की क्रिस्टल संरचनाओं का निर्धारण करने की कुंजी क्रिस्टलीकरण से पहले नमूने की गुणवत्ता है। विशेष रूप से, डिटर्जेंट का चुनाव महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह परिसर की स्थिरता और मोनोफैलाव दोनों को प्रभावित करता है। हमने हाल ही में 3.1 Å संकल्प पर एक इंजीनियर जी प्रोटीन, मिनी-जीओके साथ-साथ गोजातीय रोडोप्सिन की सक्रिय स्थिति की क्रिस्टल संरचना निर्धारित की। यहां, हम रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी को अनुकूलित करने की प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। डार्क-स्टेट रोडोप्सिन को शास्त्रीय और नेलोप्टाइल ग्लाइकोल (एनपीजी) डिटर्जेंट में तैयार किया गया था, जिसके बाद प्रकाश एक्सपोजर के तहत मिनी-जीओ के साथ जटिल गठन किया गया था। रोडोप्सिन की स्थिरता का आकलन पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा किया गया था, जो प्रकाश-संवेदनशील लिगामेंट, 9-सीआईएस रेटिना के रोडोप्सिन में पुनर्गठन की निगरानी करता है। स्वचालित आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की मोनोडिस्टिसिटी को चित्रित करने के लिए किया गया था। एसडीएस-पॉलीएक्रिलैमाइड इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) ने कूमासी नीले रंग के साथ जेल को धुंधला करने के बाद रोडोप्सिन और मिनी-जीओ के बीच 1:1 मोलर अनुपात की पहचान करके परिसर के गठन की पुष्टि की। इस सभी विश्लेषणात्मक डेटा को क्रॉस-मान्य करने के बाद, हमने अनुपयुक्त डिटर्जेंट को समाप्त कर दिया और बड़े पैमाने पर तैयारी और क्रिस्टलीकरण के लिए सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार डिटर्जेंट के साथ जारी रखा। एन-ग्लाइकोसिलेशन की विषमता से एक अतिरिक्त समस्या उत्पन्न हुई। विषमरूप से व्यक्त रोडोप्सिन को एसडीएस-पेज पर दो अलग-अलग एन-ग्लाइकोसिलेटेड आबादी के लिए मनाया गया था, जो शायद क्रिस्टलोजेनेसिस में रुकावट डालता था। इसलिए, विभिन्न डिग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों का परीक्षण किया गया, और एन-ग्लाइकोसिलेशन की एक प्रजाति के साथ रोडोप्सिन का उत्पादन किया गया। प्रोटीन की गुणवत्ता की विशेषता के लिए इस रणनीतिक पाइपलाइन के साथ, क्रिस्टल संरचना देने के लिए रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी को अनुकूलित किया गया था। यह केवल जीपीसीआर-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की तीसरी क्रिस्टल संरचना थी। नमूना तैयारी और संरचना निर्धारण की सुविधा के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों के लिए भी इस दृष्टिकोण को सामान्यीकृत किया जा सकता है।
झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों की क्रिस्टल संरचनाओं का निर्धारण हमेशा अच्छी तरह से विवर्तित क्रिस्टल प्राप्त करने में कठिनाइयों के कारण चुनौतीपूर्ण रहा है। घुलनशील प्रोटीन के विपरीत, अभिन्न झिल्ली प्रोटीन में एक हाइड्रोफोबिक कोर शामिल है जो कोशिका झिल्ली तक फैला है। कोशिका झिल्ली से झिल्ली प्रोटीन को जलीय बफर में हटाने के लिए, डिटर्जेंट का उपयोग डिटर्जेंट-प्रोटीन मिसेल बनाने के लिए किया जाना चाहिए, इस प्रकार झिल्ली प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक कोर के आसपास लिपिड की जगह। झिल्ली प्रोटीन की स्थिरता, गतिविधि और अखंडता सीधे डिटर्जेंट1के रासायनिक और संरचनात्मक गुणों पर निर्भर करती है, और डिटर्जेंट के गुण भी मिसेल के आकार को निर्धारित करते हैं। एक बड़ा डिटर्जेंट मिसेल एक छोटी झिल्ली प्रोटीन की हाइड्रोफिलिक सतहों को रोक सकता है, इस प्रकार वाष्प प्रसार विधि का उपयोग करते समय क्रिस्टल संपर्कों की कमी के कारण क्रिस्टलीकरण को रोक सकता है। एक छोटा डिटर्जेंट मिसेल क्रिस्टलोग्राफी के लिए फायदेमंद होता है, लेकिन शॉर्ट चेन डिटर्जेंट आमतौर पर कठोर होते हैं और इसलिए झिल्ली प्रोटीन के अस्थिरता और एकत्रीकरण का कारण बनते हैं। इसलिए, क्रिस्टलीकरण से पहले, एक अतिरिक्त डिटर्जेंट स्क्रीनिंग प्रक्रिया अपरिहार्य है, आमतौर पर छोटे डिटर्जेंट को लक्षित करती है जो अभी भी प्रोटीन स्थिरता बनाए रखती है।
जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) अभिन्न झिल्ली प्रोटीन होते हैं जिनमें सात ट्रांसमेम्ब्रेन ए-हेलिक्स होते हैं। GPCRs दो मुख्य राज्यों में मौजूद हैं, या तो एक निष्क्रिय राज्य विलोम agonists या विरोधी, या एक सक्रिय राज्य एक पीड़ावादी और एक जी प्रोटीन द्वारा स्थिर करने के लिए बाध्य द्वारा स्थिर है, हालांकि यह संभावना है कि उप राज्यों की एक भीड़ इन दो चरम सीमाओं के बीच मौजूद हैं । जीपीसीएर का संरचना निर्धारण शुरू में सक्रिय राज्यों की तुलना में अधिक स्थिरता के कारण नास्तिकों और विरोधियों को उलटा करने के लिए बाध्य निष्क्रिय राज्यों पर केंद्रित था। जब जीपीसीआरएस एगोनिस्ट बाइंडिंग पर सक्रिय होते हैं, तो रिसेप्टर्स अत्यधिक गतिशील होते हैं, और जी प्रोटीन युग्मन के लिए रिसेप्टर के साइटोप्लाज्मिक चेहरे पर एक फांक रूप क्षणिक रूप ों का रूप लेते हैं। यह सोचा जाता है कि यह गतिशीलता है क्यों पीड़ावादी-बाध्य GPCRs अक्सर निष्क्रिय राज्य की तुलना में अधिक अस्थिर हैं । इसलिए, अध्ययन के तहत रिसेप्टर की संरचना की स्थिति के लिए उपयुक्त डिटर्जेंट के लिए स्क्रीन करना आवश्यक हो जाता है, क्योंकि यह संभावना है कि निष्क्रिय स्थिति की तुलना में सक्रिय राज्य का अध्ययन करने के लिए मामूली डिटर्जेंट की आवश्यकता होगी।
इस रिपोर्ट में, हम दृश्य GPCR, गोजातीय रोडोपसिन3का उपयोग करें, और इसके जटिल मिनी जीओ प्रोटीन4,,5 डिटर्जेंट स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए, निष्क्रिय राज्य और सक्रिय राज्य का प्रतिनिधित्व, क्रमशः । डिटर्जेंट स्क्रीनिंग शास्त्रीय एल्किल माल्टोसाइड और ग्लूकोसाइड डिटर्जेंट और नेलोटिल ग्लाइकोल (एनपीजी) डिटर्जेंट पर केंद्रित थी। इस संदर्भ में, एक शास्त्रीय डिटर्जेंट एक चीनी सिर समूह और एक एल्किल श्रृंखला से बनाया गया है, जबकि एनपीजी प्रकार के डिटर्जेंट में दो समान शास्त्रीय डिटर्जेंट होते हैं जो शर्करा और एल्किल चेन6,7,7,8के बीच इंटरफेस पर एक क्वाटररी कार्बन से जुड़े होते हैं।
एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह विभिन्न डिटर्जेंट में रोडोप्सिन की शुद्धि से शुरू किया गया था, जिसके बाद रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स का गठन किया गया था और कई तरीकों(चित्रा 1)का उपयोग करके परिसर के लक्षण वर्णन के साथ समाप्त हुआ था। रोडोप्सिन की निष्क्रिय स्थिति के लिए, प्रकाश संवेदनशील लिगामेंट और 9-सीआईएस रेटिना के पुनर्गठन की निगरानी पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। स्पेक्ट्रम रेटिना की भौतिक रासायनिक स्थिति का पता चलता है और रोडोप्सिन की रेटिना बाध्यकारी जेब में अपने पर्यावरण का संकेत है । शुद्ध रोडोप्सिन की एकाफैलता का आकलन करने के साथ-साथ रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के गठन के लिए आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) नियोजित किया गया था। चूंकि एसईसी प्रोटीन अणुओं को उनके आकार और आकार से अलग करता है, इसलिए कुल मिश्रित प्रोटीन आबादी की पहचान की जा सकती है क्योंकि वे शून्य मात्रा में एकत्र ित होते हैं। जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए, एसईसी के अंशों का मूल्यांकन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा किया गया था ताकि रोडोप्सिन और मिनी-जीओदोनों की उपस्थिति की पुष्टि की जा सके।
एक अन्य कारक जिस पर विचार करने की आवश्यकता है वह झिल्ली प्रोटीन पर ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है। पीटीएम जैसे एन-ग्लाइकोसिलेशन अक्सर स्तनधारी और कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणालियों में उत्पादित यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन पर मनाया जाता है। मानव भ्रूणीय गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं का एक सीमित एन-ग्लाइकोसिलेशन तनाव जीन एन्कोडिंग एन-एसिटिलग्लूकोजेमिनेलट्रांसफरेज़ I (GnTI) को हटाने के द्वारा विकसित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप आम सहमति स्थल Asn-X-Ser/Thr पर GlcNAc2Man5 द्वारा समरूप एन-ग्लाइकोसिलेशन हालांकि एन-ग्लाइकोसिलेशन को आम सहमति साइट में अमीनो एसिड अवशेषों को म्यूट करके रोका जा सकता है, यह प्रोटीन के कार्य या तह की दक्षता को भी बदल सकता है। गोजातीय रोडोप्सिन में, एन-ग्लाइकोसिलेटेड अवशेष Asn15 का उत्परिवर्तन गलत तह और कम जी प्रोटीन सक्रियण9,,10की ओर जाता है। इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किए गए रोडोप्सिन को एचईके 293 जीएनपीआई-कमी सेल लाइन में व्यक्त किया गया था। हालांकि, एसडीएस-पेज ने रोडोप्सिन की दो प्रजातियों की उपस्थिति दिखाई । यह विषमता क्रिस्टल गठन को रोक सकती है और इसलिए पेप्टाइड-एन-ग्लाइकोसिडेस एफ (पीएनगास एफ) और एंडोग्लिकोसिडेस एफ 1 (एंडो एफ 1) का परीक्षण किया गया था। डिग्लाइकोसिलेटेड उत्पाद को ग्लाइकोसिलेशन के स्तर और इसकी एकरूपता की पहचान करने के लिए एसडीएस-पेज और लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) की विशेषता थी।
प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में सफलता दृढ़ता से प्रोटीन के नमूने, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और डिटर्जेंट की वजह से जटिलता के कारण उनके परिसरों पर निर्भर करती है। यह रिपोर्ट जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग परिसरों के लिए डिटर्जेंट स्क्रीनिंग और नमूना गुणवत्ता के मूल्यांकन को दर्शाती है। झिल्ली प्रोटीन की जैव रासायनिक संपत्ति का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंटरंगों 16,,17का उपयोग करके थर्मोस्टेबिलिटी परख, ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस सिग्नल18 या बायोसेंसर19के साथ अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में परिवर्तन को मापने के द्वारा जटिल गठन का पता लगाने के लिए बाध्यकारी परख। हालांकि, उन तरीकों में उपयोग किए जाने वाले रासायनिक वातावरण क्रिस्टलीकरण नमूना तैयार करने के लिए उन लोगों से काफी अलग हैं, या तो प्रोटीन फ्लोरेसेंस-आधारित माप के लिए एक हजार गुना कम एकाग्रता पर होते हैं, या प्रोटीन लिपिड बाइलेयर में या एक निश्चित डिटर्जेंट स्थिति में एम्बेडेड होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, क्रिस्टलीकरण से पहले बड़े पैमाने पर नमूना तैयारकरने में उपयोग किए गए तरीकों को भी मानकीकृत किया जाता है। इसलिए, अनुकूलित मापदंडों को आगे की बड़ी स्क्रीनिंग और अनुकूलन के बिना क्रिस्टलीकरण-पैमाने की तैयारी के लिए आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण के लिए एक स्थिर और सजातीय जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन परिसर की तैयारी को अनुकूलित करना है। प्रोटोकॉल रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी के दौरान डिटर्जेंट और डिग्लाइकोसिलेशन के प्रभाव का गुणात्मक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तरीकों का एक सेट एकीकृत करता है। डिटर्जेंट ऑक्टाइल ग्लूकोसाइड (सी8जी)20,,21,,22 और सी9जी23,,24में शुद्ध होने पर निष्क्रिय अवस्था और प्रकाश सक्रिय राज्य में रोडोप्सिन को सघन किया गया है । चूंकि C8G और C9G में शुद्ध रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स क्रिस्टल (डेटा नहीं दिखाया गया) का परिणाम नहीं था, इसलिए हमने वर्णित रणनीति(चित्र ा 1)का उपयोग करके अन्य डिटर्जेंट की एक व्यापक श्रृंखला का पता लगाया। रोडोप्सिन की हल्की संवेदनशीलता का लाभ उठाकर, हम बहुत अच्छी तरह से 280 एनएम के अलावा तरंगदैर्ध्य में रेटिना के पुनर्गठन का पालन कर सकते हैं। यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसईसी दोनों में, हमने 380 एनएम या 488 एनएम पर रेटिना का पता लगाया। हालांकि, अधिकांश झिल्ली प्रोटीन में शुद्धिकरण के दौरान कार्यक्षमता का पालन करने के लिए इतना सुविधाजनक गुणसूत्र नहीं होता है। अन्य विकल्प यह होगा कि हल्के-सेक्ट्रेट क्रोमोफोर जोड़कर या रेडियोलिगलैंड-बाइंडिंग और थर्मल शिफ्ट परख25का उपयोग करके एक लिगामेंट का पता लगाने योग्य बनाया जाए ।
रोडोप्सिन का आणविक वजन 40 केडीए है। डिटर्जेंट के द्रव्यमान के कारण यह बांधता है, एसईसी पर इसका स्पष्ट आणविक वजन लगभग 120 केडीए है। इस प्रकार यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि एसईसी पर मिनी-जीओ (24 केडीए) की बाध्यकारी का आसानी से पता नहीं चला था, क्योंकि इससे 120 केडीए और 144 केडीए की स्पष्ट जनता के साथ प्रोटीन के अंतर की आवश्यकता होगी। इसलिए एसडीएस-पेज द्वारा एसईसी अंशों का विश्लेषण नमूना शुद्धता और जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए किया गया था। यहां तक कि अगर एसईसी प्रोफाइल जटिल गठन पर स्पष्ट बदलाव दिखाते हैं, तो भी अन्य सह-शुद्ध प्रोटीन संदूषकों के बजाय सही बाध्यकारी भागीदारों के साथ जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए एसडी-पेज विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
रोडोप्सिन और मिनी-जीओ दोनों को मिलीग्राम मात्रा में शुद्ध किया गया था, जिसने परिसरों के कम संवेदनशीलता का पता लगाने की अनुमति दी, जैसे एसईसी के दौरान यूवी-विज़ अवशोषण और एसडीएस-पेज जैल के कॉममासी ब्लू धुंधला। जहां नमूने सीमित हैं, अधिक संवेदनशील पता लगाने का उपयोग किया जाना चाहिए, जैसे कि प्रोटीन (280 एनएम उत्तेजना, 350 एनएम उत्सर्जन) और एसडीएस-पेज जैल के लिए चांदी के धुंधला होने से ट्रिप्टोफान संकेतों का पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस डिटेक्टर से लैस एलसी प्यूरीफायर। एक अन्य दृष्टिकोण यह होगा कि ब्याज के प्रोटीन के लिए ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को फ्यूज किया जाए, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति26 के दौरान भी पता लगाने की अनुमति देगा लेकिन इसे क्रिस्टलीकरण से पहले हटा दिया जाना चाहिए ।
यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि शुद्ध प्रोटीन भी चर पीटीएमएस से उत्पन्न विषमता से मुक्त हो। यहां वर्णित मामले में, एसडीएस-पेज जैल पर देखे गए रोडोप्सिन की दो आबादी को या तो एक या दो एन-ग्लाइकान होने के रूप में चिह्नित किया गया था। प्रोटीन का परिवर्तनीय संशोधन संभावित रूप से अच्छी तरह से विवर्तित क्रिस्टल के गठन को रोकदेगा, इसलिए हम इसलिए रोडलाइकोसिन को डिग्लाइकोसिलेटेड करदेंगे। एंडोग्लाइकोसिदास एंडो एफ 1 सबसे अधिक प्रभाव था एंडोग्लिकोसिडास परीक्षण और उपचार के कारण अनलाइकोसिडेनेटेड रिसेप्टर की एक प्रजाति हुई, जबकि पीएनगासे एफ ने केवल आंशिक रूप से रोडोप्सिन पर ग्लाइकान हटा दिया और इसके परिणामस्वरूप रोडोप्सिन का मिश्रण पूरी तरह से अनलाइकोसिलेटेड या एक एन-ग्लाइकैन के साथ बना रहा। डेग्लिकोसिलाज़ उपचार के बिना रोडोप्सिन को सफलतापूर्वक3,,27,,28को सघन किया गया है, और रोडोप्सिन Asn15 पर एन-ग्लाइकन उन मामलों में क्रिस्टल संपर्क बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। रोडोप्सिन-मिनी-जीओके मामले में, क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एंडो एफ 1 द्वारा एन-ग्लाइकान को हटाना आवश्यक है। क्रिस्टलीकरण से पहले ब्याज के प्रोटीन को डिग्लाइकोसिलेट करने के लिए कोई मानकीकृत नियम नहीं है, लेकिन जब प्रोटीन व्यापक क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के बाद क्रिस्टलाइज करने में विफल हो जाते हैं तो विषम पीटीएमएस को हटाने पर विचार किया जाना चाहिए ।
यहां वर्णित डेटा और कार्यप्रणाली ने हमें अपने छोटे मिसेल आकार और परिसर को स्थिर करने की क्षमता के कारण रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के क्रिस्टलीकरण के लिए सबसे पसंदीदा डिटर्जेंट के रूप में ओएनजी को चुनने के लिए निर्देशित किया। हमने यह सुनिश्चित करने के लिए एंडो एफ1 का भी उपयोग किया कि शुद्ध रोडोप्सिन एक सजातीय प्रजाति थी। क्रिस्टल बाद में प्राप्त किए गए और हमने क्रिस्टल संरचना को ~ 3.1 Å4तक निर्धारित किया, जो केवल जीपीसीआर-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स14,,29की तीसरी क्रिस्टल संरचना थी।
एक साथी प्रोटीन के साथ और बिना बंधे झिल्ली प्रोटीन के लिए, उन्हें दो अलग-अलग प्रोटीन माना जाना चाहिए। विभिन्न कार्यात्मक राज्यों में एक प्रोटीन अलग-अलग संरचनाएं हैं और विभिन्न ऊर्जा स्तर पर हैं। इसलिए, प्रत्येक कार्यात्मक राज्य के लिए तैयारी प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि निष्क्रिय-राज्य के लिए पैरामीटर सक्रिय राज्य में पूरी तरह से स्थानांतरित नहीं हो सकता है। इसके अलावा, एक साथी प्रोटीन बाध्यकारी द्वारा जटिल प्रोटीन संपत्ति में परिवर्तन का उल्लेख नहीं है । प्रोटोकॉल उन तरीकों का उपयोग करता है जो विभिन्न डिटर्जेंट में निष्क्रिय झिल्ली प्रोटीन तैयार करने के लिए क्रिस्टलीकरण नमूना तैयार करने के लिए मानकीकृत हैं, इसके बाद प्रोटीन सक्रियण और जटिल गठन, और प्रोटीन की गुणवत्ता की विशेषता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को मामूली संशोधन के साथ संरचनात्मक अध्ययन ों के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों को आसानी से सामान्यीकृत किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम इस परियोजना में दीर्घकालिक समर्थन के लिए प्रो डॉ गेभर्ड एफ एक्स शेरलर, डॉ रोजर जेपी डासन और हॉफमैन ला रोशे को सेल कल्चर में समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । यह काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 210030_153145 और GFXS को 310030B_173335 अनुदान) द्वारा प्रायोजित किया गया था, और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (EMPSI, ३३९९९५) और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC U105197215) से CGT के लिए धन । एफपी अनुसंधान आणविक अल्ट्राफास्ट विज्ञान और प्रौद्योगिकी (एनसीसीआर MUST) और ETH Femtosecond और Attosecond विज्ञान और प्रौद्योगिकी (ETH फास्ट) कार्यक्रमों में क्षमता के राष्ट्रीय केंद्र के माध्यम से ETH Zürich स्वीकार करते हैं । एफपी, जेएम, एबी और सीजेटी पॉल शेहेर इंस्टीट्यूट से दीर्घकालिक वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं ।
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |