このレポートでは、視覚GPCR、ロドプシン、およびmini-G oを用いた複合体を調製するための異なる洗剤のスクリーニングについて説明します。精製中の異なる段階での複合体の品質を特徴付け生化学的方法が実証されている。このプロトコルは、将来の構造研究のために他の膜タンパク質複合体に一般化することができる。
膜蛋白質複合体の結晶構造を決定する鍵は、結晶化前の試料の品質です。特に、洗浄剤の選択は、複合体の安定性および単分散性の両方に影響を及ぼすため、極めて重要である。我々は最近、3.1 Å分解能で、操作されたGタンパク質mini-Goに結合したウシロドプシンの活性状態の結晶構造を決定した。ここでは、ロドプシン-mini-G複合体の調製を最適化する手順を詳しく説明します。暗黒状態のロドプシンは、古典的およびネオペンチルグリコール(NPG)洗剤で調製し、続いて光暴露下でmini-Goとの複合体形成を行った。ロドプシンの安定性は、光感受性リガンド、9-シスレチのロドプシンへの再構成を監視する紫外線可視(UV-VIS)分光法によって評価された。自動サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、ロドプシンとロドプシン-mini-G複合体の単分散性を特徴付けるために使用されました。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)は、クーマシーブルーでゲルを染色した後、ロドプシンとミニGoの間に1:1モル比を同定することにより、複合体の形成を確認した。この分析データをすべて相互検証した後、不適当な洗剤を排除し、大規模な調製と結晶化のための最良の候補洗剤を継続しました。N-グリコシル化の不均一性から、さらに問題が生じた。異種発現ロドプシンは、SDS-PAGEで2つの異なるN-グリコシル化集団を有することが観察され、これはおそらく結晶発生を妨げているであろう。そこで、異なる脱グリコシル化酵素を試験し、N-グリコシル化の単一種を有するロドプシンを産生したE1(EndoF1)との異なる分解酵素を試験した。タンパク質の品質を特性化するためのこの戦略的パイプラインにより、ロドプシン-mini-Go複合体の調製は、結晶構造を提供するために最適化されました。これは、GPCR-Gタンパク質シグナル伝達複合体の3番目の結晶構造に過ぎなかった。このアプローチは、他の膜タンパク質およびその複合体に対して一般化して、サンプル調製および構造決定を容易にすることができる。
膜タンパク質の結晶構造とその複合体の決定は、十分に拡散する結晶を得ることが困難であるため、常に困難でした。可溶性タンパク質とは対照的に、一体性膜タンパク質は、細胞膜に及ぶ疎水性コアを含む。細胞膜から水溶液バッファーに膜タンパク質を除去するために、洗剤を使用して洗浄剤-タンパク質ミセルを形成し、膜タンパク質の疎水性コアの周りの脂質を置き換える必要があります。膜タンパク質の安定性、活性および完全性は、洗剤1の化学的および構造的特性に直接依存し、洗浄剤の特性もミセルの大きさを決定する。大きな洗剤ミセルは、小さな膜タンパク質の親水性表面を閉塞させ、蒸気拡散法を用いた場合の結晶接触の欠如による結晶化を防止する。小さな洗剤ミセルは結晶学に有利であるが、短鎖洗剤は通常より厳しいので、膜タンパク質の不安定化および凝集をもたらす。したがって、結晶化の前に、追加の洗剤スクリーニング手順が不可欠であり、典型的には、タンパク質の安定性を維持する短い洗剤を標的とする。
Gタンパク質共役受容体(GPCRs)は、7つの膜貫通a-ヘリックスを含む一体性膜タンパク質である。GPDRは、逆アゴニストまたはアンタゴニストによって安定化された不活性状態、またはアゴニストに結合し、Gタンパク質によって安定化された活性状態の2つの主要な状態に存在するが、これら2つの極端な間に多数のサブ状態が存在する可能性が高い。GPCRsの構造決定は、当初、活動状態よりも高い安定性のために逆アゴニストおよびアンタゴニストに結合された非活動状態に焦点を当てた2.GPDRがアゴニスト結合時に活性化されると、受容体は非常に動的であり、裂け目はGタンパク質結合のための受容体の細胞質面上で一過性に形成される。このダイナミズムは、アゴニスト結合型GPCRsが非アクティブ状態よりもしばしば不安定である理由であると考えられている。したがって、研究中の受容体の立体構造状態に適した洗剤をスクリーニングすることが不可欠となり、非活動状態に比べて活性状態を研究するためには、穏やかな洗剤が必要となる可能性が高いからである。
本報告では、視覚GPCR、ウシロドプシン3、およびミニGoタンパク質44、55との複合体をそれぞれ非活性状態と活性状態を表す洗剤スクリーニング実験に用いる。この界面活性剤スクリーニングは、古典的なアルキルマルトシドおよびグルコシド洗浄剤およびネオペンチルグリコール(NPG)洗浄剤に焦点を当てた。この文脈では、古典的な洗剤は糖頭グループとアルキル鎖から構築され、NPG型洗剤は糖とアルキル鎖66、7、87,の界面で4次炭素によって融合された2つの同一の古典的な洗剤を含んでいる。
実験ワークフローは、異なる洗剤中のロドプシンの精製から始まり、続いてロドプシン-mini-G複合体の形成とo、いくつかの方法を用いた複合体の特性化で終わる(図1)。ロドプシンの不活性状態に関しては、光感受性リガンド9-シスレチの再構成を紫外線可視(UV-VIS)分光法によってモニタリングした。スペクトルは、レチナルの物理化学的状態を明らかにし、ロドプシンのレチナル結合ポケット内のその環境を示しています。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、精製ロドプシンの単分散性とロドプシン-mini-Go複合体の形成を評価するために採用された。SECはタンパク質分子の大きさと形状を区別するため、凝集したタンパク質集団は、空隙体積に溶出して同定することができます。複雑な形成を確認するために、SECからの分画を、ドドプシンとミニGoの両方の存在を確認するために、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。
考慮する必要があるもう一つの要因は、膜タンパク質の翻訳後修飾(PTM)です。N-グリコシル化などのPTMは、哺乳類および昆虫細胞発現系で産生される真核細胞膜タンパク質にしばしば観察される。ヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞の限定N-グリコシル化株は、N-アセチルグルコサミン転移酵素I(GnTI)をコードする遺伝子の欠失によって開発され、コンセンサス部位Asn-X-Ser/ThrにおいてGlcNAc2Man5による均質なN-グリコシル化を生じた。25N-グリコシル化は、コンセンサス部位でアミノ酸残基を変異させることによって防止できるが、これはまた、タンパク質の機能または折りたたみの効率を変える可能性がある。ウシロドプシンにおいて、N-グリコシル化残基Asn15の変異は、誤った折りたたみとGタンパク質活性化9,1010を減少させる。本報告で用いたロドプシンは、HEK 293 GnTI欠損細胞株で表した。しかし、SDS-PAGEは2種のロドプシンの存在を示した。この不均一性は結晶形成を防ぐことができ、従ってペプチドN-グリコシダーゼF(PNGasee F)およびエンドグリコシダーゼF1(Endo F1)を用いた脱グリコシル化が試験された。脱糖物は、糖質のレベルとその均質性を同定するために、SDS-PAGEと液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)によって特徴付けられていた。
タンパク質の結晶化の成功は、タンパク質サンプル、特に洗剤による合併症による膜タンパク質とその複合体に強く依存しています。本レポートでは、GPCR-mini-Gタンパク質シグナル伝達複合体のサンプル品質の洗剤スクリーニングと評価を行う。膜蛋白質の生化学的性質を研究するために幅広く用いられている様々な方法が、例えば、蛍光色素16、17を用いた熱安定性アッセイ、17トリプトファン蛍光シグナル18の変化を測定して複合体形成を検出する結合アッセイ、またはバイオセンサ19による共鳴エネルギー伝達を測定する。19しかし、これらの方法で使用される化学環境は、結晶化試料を調製するための環境とは全く異なり、タンパク質は蛍光ベースの測定のために1000倍低い濃度にあるか、またはタンパク質が脂質二重層または1つの固定洗剤状態に埋め込まれている。このプロトコルでは、結晶化前の大規模なサンプル調製法でも使用法が標準化されている。したがって、最適化されたパラメータは、さらなる主要なスクリーニングおよび最適化なしに結晶化スケール調製のために容易に移すことができる。
このプロトコルの目的は、X線結晶学による蒸気拡散結晶化と構造決定のための安定した均質なGPCR-mini-Gタンパク質複合体の調製を最適化することです。このプロトコルは、ロドプシン-mini-Go複合体の調製中に、洗剤と脱糖剤の影響を定性的に評価するための一連の方法を統合しています。トランスデュシンペプチドの有無にかかわらず結合した不活性状態および光活性化状態でのロドプシンは、オクチルグルコシド(C8G)20、21、22,21および22C9G23、24の洗剤で精製された23,24際に結晶化されている。20C8GとC9Gで精製されたロドプシン-ミニGo複合体は結晶を生み出さなかったので(データは示さない)、我々は説明した戦略を用いて他の洗剤のより広い範囲を探求した(図1)。ロドプシンの光感度を利用することで、280nm以外の波長でのレチナルの再構成に非常によく従うことができました。UV-VIS分光法とSECの両方で、380 nmまたは488nmのいずれかでレチンを検出しました。しかし、ほとんどの膜タンパク質は、精製中の機能性に従うような便利な発膜を有していない。他の選択肢は、光検出可能な色素色素を添加することによって、または放射性リガンド結合および熱シフトアッセイ25を用いて、リガンドを検出可能にすることであろう。
ロドプシンは40kDaの分子量を有する。洗浄剤の質量のためにそれが結合し、SEC上のその見かけの分子量は約120 kDaである。したがって、120 kDaと144 kDaの見かけの質量を有するタンパク質の分化を必要とするため、SEC上でmini-Go(24 kDa)の結合が容易に検出されなかったことは驚くべきことではありません。SDS-PAGEによるSEC画分の分析は、サンプルの純度および複雑な形成を確認するために使用された。SECプロファイルが複雑な形成時に明確なシフトを示したとしても、SDS-PAGE分析を行い、他の共精製タンパク質汚染物質ではなく、正しい結合パートナーとの複合体形成を確認することが推奨されます。
ロドプシンとミニGoの両方をミリグラム量で精製し、SEC中のUV-VIS吸収およびSDS-PAGEゲルのコンマシーブルー染色などの複合体の低感度検出を使用することを可能にした。サンプルが限られている場合、タンパク質からのトリプトファン信号(280 nm励起、350nmの放出)およびSDS-PAGEゲルの銀染色を追跡するために蛍光検出器を装備したLC浄化器など、より敏感な検出を使用する必要があります。もう1つのアプローチは、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質を目的のタンパク質に融合させることであり、タンパク質発現26中でも検出を可能にするが、結晶化する前に除去する必要がある。
精製されたタンパク質が可変PTMから生じる不均一性も含まないことを保証することが不可欠です。ここで説明した場合、SDS-PAGEゲル上で観察されたロドプシンの2つの集団は、1つまたは2つのN-グリカンのいずれかを有すると特徴付けられていた。タンパク質の可変的な修飾は、潜在的によく拡散性の結晶の形成を妨げるので、我々は脱グリコシル化ロドプシンを。このEndoグリコリシダーゼのEndo F1は、試験した最も効果の高い末グリコシダーゼであり、治療は単一種の無糖化受容体につながり、PNGase Fはロドプシン上のグリカンを部分的に除去し、ロドプシンの混合物を完全に無糖化または1つのN-グリカンで残した。脱糖酵素処理を行わないロドプシンは33、27、28、27,28およびロドプシンAsn15上のN-グリカンを結晶化することは、これらの場合に結晶接触を形成するために重要である。ロドプシン-ミニGoの場合、結晶を得るためには、Endo F1によるN-グリカンを除去する必要があります。結晶化前に目的のタンパク質を脱糖する規則は標準化されていませんが、タンパク質が広範な結晶化試験の後に結晶化に失敗した場合は、異種のPTMの除去を考慮する必要があります。
ここで説明したデータと方法論は、小さなミセルサイズと複合体を安定化させる能力により、ロドプシン-mini-G複合体の結晶化に最も好ましい洗浄剤としてOGNGを選択するよう導いた。また、精製ロドプシンが均質な種であることを確認するために、Endo F1を使用しました。その後結晶が得られ、その結晶構造は、GPCR-Gタンパク質シグナル伝達複合体14,2929の3番目の結晶構造である~3.1Å4と決定した。4
パートナータンパク質の有無にかかわらず結合する膜タンパク質の場合、それらは2つの異なるタンパク質と見なされるべきです。異なる機能状態のタンパク質は、異なる立体構造を有し、異なるエネルギーレベルにある。したがって、非アクティブ状態のパラメータとして機能状態ごとに準備プロトコルを最適化することが推奨され、アクティブ状態に完全に移行できない場合がある。また、パートナータンパク質と結合することで複雑なタンパク質特性の変化は言うまでもない。このプロトコルは、結晶化サンプルを調製するために標準化された方法を使用して、異なる洗剤で不活性膜タンパク質を調製し、続いてタンパク質活性化と複雑な形成を行い、タンパク質の品質を特徴付けます。したがって、このプロトコルは、他の膜タンパク質およびその複合体に容易に一般化して、軽微な改変を伴う構造研究を行うことができる。
The authors have nothing to disclose.
ゲブハルト・F・X・シャートラー教授の長期的な支援、ロジャー・J・P・ドーソン博士、ホフマン・ラ・ロシュ教授の細胞培養支援に感謝します。この研究は、スイス国立科学財団(GFXSへの助成金210030_153145と310030B_173335)、欧州研究評議会(EMPSI、339995)および医学研究評議会(MRC U105197215)からのCGTへの資金提供によって後援されました。FPは、国立研究分子超高速科学技術能力センター(NCCR MUST)およびETHフェムト秒・アト秒科学技術(ETH FAST)プログラムを通じてETHチューリッヒを認めています。FP、JM、AB、CJTは、ポール・シェラー研究所からの長期的な財政支援を認めています。
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |