Denne rapport beskriver screening af forskellige rengøringsmidler til forberedelse af den visuelle GPCR, rhodopsin, og dens kompleks med mini-Go. Biokemiske metoder, der karakteriserer kompleksets kvalitet på forskellige stadier under rensningen, påvises. Denne protokol kan generaliseres til andre membran protein komplekser for deres fremtidige strukturelle undersøgelser.
Nøglen til bestemmelse af krystalstrukturer af membranproteinkomplekser er kvaliteten af prøven før krystallisering. Valget af vaskemiddel er især kritisk, fordi det påvirker både kompleksets stabilitet og monodispersitet. Vi har for nylig bestemt krystal struktur af en aktiv tilstand af kvæg rhodopsin koblet til en manipuleret G protein, mini-Go, på 3,1 Å opløsning. Her beskriver vi proceduren for optimering af præparatet af rhodopsin-mini-Go-komplekset. Dark-state rhodopsin blev fremstillet i klassiske og neopentylglycol (NPG) rengøringsmidler, efterfulgt af kompleks dannelse med mini-Go under lyseksponering. Stabiliteten af rhodopsin blev vurderet ved ultraviolet-synlig (UV-VIS) spektroskopi, som overvåger rekonstitution i rhodopsin af den lysfølsomme ligand, 9-cis retinal. Automatiseret størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) blev brugt til at karakterisere monodispersiteten afo rhodopsin og rhodopsin-mini-G o-komplekset. SDS-polyacrylamid elektroforese (SDS-PAGE) bekræftede dannelsen af komplekset ved at identificere en 1:1 molære forhold mellem rhodopsin og mini-Go efter farvning gelmed Coomassie blå. Efter krydsvalidering af alle disse analytiske data eliminerede vi uegnede rengøringsmidler og fortsatte med det bedste kandidatvaskemiddel til storstilet forberedelse og krystallisering. Et yderligere problem opstod fra heterogenitetnen af N-glycosylation. Heterologt udtrykt rhodopsin blev observeret på SDS-PAGE at have to forskellige N-glycosylated populationer, som sandsynligvis ville have hindret krystallogenese. Derfor blev forskellige deglycosylation enzymer testet, og endoglycosidase F1 (EndoF1) produceret rhodopsin med en enkelt art af N-glycosylation. Med denne strategiske pipeline til karakterisering af proteinkvalitet blev forberedelsen af rhodopsin-mini-Go-komplekset optimeret til at levere krystalstrukturen. Dette var kun den tredje krystal struktur af en GPCR-G protein signalering kompleks. Denne fremgangsmåde kan også generaliseres for andre membranproteiner og deres komplekser for at lette prøveforberedelse og strukturbestemmelse.
Bestemmelse krystal strukturer af membran proteiner og deres komplekser har altid været udfordrende på grund af vanskeligheder med at opnå godt diffracting krystaller. I modsætning til opløselige proteiner udgør integrerede membranproteiner en hydrofob kerne, der spænder over cellemembranen. For at fjerne membranproteiner fra cellemembranen til vandig buffer skal der anvendes rengøringsmidler til at danne en vaskemiddelproteinmicelle, hvorved lipiderne omkring membranproteiners hydrofobe kerne erstattes. Membranproteiners stabilitet, aktivitet og integritet afhænger direkte afvaskemidlet1′kemiske og strukturelle egenskaber , og vaskemidlets egenskaber bestemmer også micelles størrelse. En stor vaskemiddel micelle kan okkludere de hydrofile overflader af en lille membran protein, og dermed forhindre krystallisering på grund af manglen på krystal kontakter, når du bruger damp diffusion metode. En lille vaskemiddel micelle er fordelagtig tii i krystallografi, men korte kæde vaskemidler er normalt hårdere og derfor føre til destabilisering og aggregering af membranproteinet. Derfor, før krystallisering, en ekstra vaskemiddel screening procedure er uundværlig, typisk rettet mod kortere rengøringsmidler, der stadig opretholde protein stabilitet.
G proteinkoblede receptorer (GPCR’ er) er integrerede membranproteiner, der indeholder syv transmembrane a-helices. GPCRs findes i to hovedstater, enten en inaktiv tilstand stabiliseret af inverse agonister eller antagonister, eller en aktiv tilstand bundet til en agonist og stabiliseret af et G-protein, selv om det er sandsynligt, at et væld af sub-stater eksisterer mellem disse to yderpunkter. Struktur bestemmelse af GPCRs oprindeligt fokuseret på inaktive stater bundet til inverse agonister og antagonister på grund af deres højere stabilitet end aktive stater2. Når GPCRs aktiveres ved agonistbinding, er receptorerne meget dynamiske, og en kløft danner forbigående på receptorens cytoplasmatiske ansigt for G-proteinkobling. Det menes, at denne dynamik er grunden til agonist-bundet GPCRs er ofte mere ustabil end den inaktive tilstand. Derfor bliver det vigtigt at screene for vaskemidler, der er egnede til den undersøgte receptors konformationstilstand, fordi det er sandsynligt, at mildere rengøringsmidler vil være nødvendige for at studere en aktiv tilstand sammenlignet med en inaktiv tilstand.
I denne rapport bruger vi den visuelle GPCR, bovin rhodopsin3, og dens kompleks med mini-Go protein4,5 til vaskemiddel screening eksperimenter, der repræsenterer den inaktive tilstand og aktiv tilstand, henholdsvis. Screeningen af vaskemiddel fokuserede på de klassiske alkyl maltoside- og glucosiderengøringsmidler og neopentylglycol (NPG) rengøringsmidler. I denne sammenhæng er et klassisk vaskemiddel bygget af en sukkerhovedgruppe og en alkylkæde, mens vaskemidler af NPG-typen indeholder to identiske klassiske vaskemidler, der smeltes af et kvaterarisk kulstof i grænsefladen mellem sukker- og alkylkæderne6,7,8.
En eksperimentel arbejdsgang blev designet ud fra rensning af rhodopsin i forskellige rengøringsmidler, efterfulgt af dannelse af rhodopsin-mini-Go kompleks og slutter med karakterisering af komplekset ved hjælp af flere metoder (Figur 1). For den inaktive tilstand af rhodopsin, rekonstitution af den lysfølsomme ligand 9-cis retinal blev overvåget af ultraviolet-synlige (UV-VIS) spektroskopi. Spektret afslører den fysisk-kemiske tilstand af retinal og er tegn på dens miljø i retinal bindende lomme af rhodopsin. Størrelseseksklometografi (SEC) blev anvendt til at vurdere monodispersitet af renset rhodopsino samt dannelse af rhodopsin-mini-G o-komplekset. Som SEC differentierer protein molekyler efter deres størrelse og form, aggregerede protein population kan identificeres som de eluere i tomrummet volumen. For at bekræfte kompleks dannelse, fraktioner fra SEC blev vurderet af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) for at bekræfte tilstedeværelsen af både rhodopsin og mini-Go.
En anden faktor, der skal overvejes, er posttranslationelle modifikationer (PTM) på membranproteinerne. PTM såsom N-glycosylation er ofte observeret på eukaryote membran proteiner produceret i pattedyr og insekt celle ekspressionssystemer. En begrænset N-glycosylation stamme af den menneskelige embryonale nyre 293 (HEK293) celler blev udviklet ved sletning af genet kodning N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), hvilket resulterer i homogen N-glycosylation af GlcNAc2Man5 på konsensus stedet Asn-X-Ser/Thr. Selvom N-glycosylation kan forebygges ved at mutere en aminosyrerester på konsensusstedet, kan dette også ændre proteinets funktion eller effektiviteten af foldning. I bovin rhodopsin fører mutationen af den N-glycosylated rest Asn15 til forkert foldning og reduceret G-proteinaktivering9,10. Den rhodopsin, der anvendes i denne rapport, blev udtrykt i cellen HEK 293 GnTI-mangelfuld. Men, SDS-PAGE viste tilstedeværelsen af to arter af rhodopsin. Denne heterogenitet kunne forhindre krystaldannelse og derfor deglycosylation ved hjælp af peptid-N-glycosidase F (PNGase F) og endoglycosidase F1 (Endo F1) blev testet. Det deglycosylated produkt var kendetegnet ved SDS-PAGE og flydende kromatografi-masse spektrometri (LC-MS) til at identificere niveauet af glycosylation og dens homogenitet.
Succesen med proteinkrystallisering er stærkt afhængig af proteinprøven, især membranproteiner og deres komplekser på grund af komplikationforårsaget af rengøringsmidler. Denne rapport demonstrerer screening af vaske- og rengøringsmidler og evaluering af prøvekvaliteten for GPCR-mini-G-proteinsignalkomplekser. En række forskellige metoder er blevet udbredt til at studere den biokemiske egenskab af membranproteiner, for eksempel termostabilitetsanalyse ved hjælp af fluorescerende farvestoffer16,17, bindende analyse til påvisning af kompleks dannelse ved at måle ændringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergioverførsel med biosensorer19. Men de kemiske miljøer, der anvendes i disse metoder er helt forskellige fra dem til fremstilling af en krystallisering prøve, enten proteiner er på en tusind gange lavere koncentration for fluorescens-baseret måling, eller proteiner er indlejret i lipid tolag eller i en fast vaskemiddel tilstand. I denne protokol er de anvendte metoder også standardiseret i storstilet prøveforberedelse før krystallisering. Derfor kan de optimerede parametre nemt overføres til krystalliseringsskalaforberedelse uden yderligere større screening og optimering.
Formålet med denne protokol er at optimere præparatet af et stabilt og homogent GPCR-mini-G-proteinkompleks til krystallisering af dampdiffusion og konstruktionsbestemmelse ved røntgenkrystallografi. Protokollen integrerer et sæt metoder til kvalitativt at vurdere virkningen af vaskemiddel og deglycosylation under udarbejdelsen af rhodopsin-mini-Go kompleks. Rhodopsin ved inaktiv tilstand og lysaktiveret tilstand, der er bundet til og uden transducinpeptid, er blevet krystalliseret, når det renses i vaske- og rengøringsmidlerne octyl glucoside (C8G)20,21,22 og C9G23,24. Da rhodopsin-mini-Go o-komplekset, der er renset i C8G og C9G, ikke gav krystaller (data, der ikke blev vist), undersøgte vi derefter en bredere vifte af andre vaske- og rengøringsmidler ved hjælp af den beskrevne strategi (figur 1). Ved at drage fordel af lysfølsomheden af rhodopsin, kunne vi meget vel følge rekonstitution af retinal ved bølgelængder andre end 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi og SEC, vi opdaget retinal på enten 380 nm eller 488 nm. Men de fleste membranproteiner har ikke en så praktisk chromophore at følge funktionalitet under rensning. Andre muligheder ville være at gøre en ligand påviselig ved at tilføje en letpåviselig chromophore eller ved hjælp af radioligand-binding og termiske skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvægt på 40 kDa. På grund af massen af vaskemiddel det binder, dens tilsyneladende molekylvægt på SEC er omkring 120 kDa. Det er derfor ingen overraskelse, at bindingen af mini-Go (24 kDa) ikke var let opdaget på SEC, da dette ville nødvendiggøre differentiering af proteiner med tilsyneladende masser af 120 kDa og 144 kDa. Analyse af SEC fraktioner ved SDS-PAGE blev derfor brugt til at bekræfte prøven renhed og kompleks dannelse. Selv hvis SEC profiler viser et klart skift ved kompleks dannelse, anbefales det stadig at udføre SDS-PAGE analyse for at bekræfte den komplekse dannelse med korrekte bindende partnere i stedet for andre co-renset protein forurenende stoffer.
Både rhodopsin og mini-Go blev renset i milligram mængder, som gjorde det muligt at anvende lav følsomhed påvisning af komplekserne, såsom UV-VIS absorption under SEC og Commassie Blue farvning af SDS-PAGE geler. Hvis prøverne er begrænsede, bør der anvendes mere følsom detektion, såsom en LC-renser udstyret med en fluorescensdetektor til sporing af tryptofansignaler fra proteinet (280 nm excitation, 350 nm emission) og sølvfarvning for SDS-PAGE geler. En anden fremgangsmåde ville være at smelte et fluorescerende protein, såsom grøn fluorescens protein (GFP) til protein af interesse, som også ville gøre det muligt påvisning selv under proteinudtryk26, men det bør fjernes før krystallisering.
Det er vigtigt at sikre, at det rensede protein også er fri for heterogenitet som følge af variable PTM’er. I det tilfælde, der er beskrevet her, blev de to populationer af rhodopsin observeret på SDS-PAGE geler karakteriseret som havende enten en eller to N-glycaner. Variabel ændring af et protein vil potentielt forhindre dannelsen af velspredende krystaller, så vi derfor deglycosylated rhodopsin. Den endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testet og behandling førte til en enkelt art af ulysglyceret receptor, mens PNGase F kun delvist fjernet glycaner på rhodopsin og resulterede i en blanding af rhodopsin fuldt ulyksiveret eller med en N-anglycerig forblev. Rhodopsin uden deglycosylase behandling er blevet med succes krystalliseret3,27,28, og N-glycan på rhodopsin Asn15 er vigtigt at danne krystal kontakt i disse tilfælde. I tilfælde af rhodopsin-mini-Go,er det nødvendigt at fjerne N-glycaner af Endo F1 at opnå krystaller. Der er ingen standardiseret regel til at deglycosylate proteiner af interesse før krystallisering, men fjernelse af heterogene PTMs bør overvejes, når proteiner undlader at krystallisere efter omfattende krystallisering forsøg.
De data og metoder, der er beskrevet her guidede os til at vælge OGNG som den mest foretrukne vaskemiddel til krystallisering af rhodopsin-mini-Go kompleks på grund af sin lille micelle størrelse og dets evne til at stabilisere komplekset. Vi brugte også Endo F1 til at sikre, at renset rhodopsin var en homogen art. Krystaller blev efterfølgende opnået, og vi bestemmes krystal struktur til ~ 3,1 Å4, som kun var den tredje krystal struktur af en GPCR-G protein signalering kompleks14,29.
For membranproteiner, der er bundet med og uden partnerprotein, bør de betragtes som to forskellige proteiner. Et protein i forskellige funktionelle tilstande har forskellige konformiteter og er på forskellige energiniveauer. Det anbefales derfor at optimere forberedelsesprotokollen for hver funktionel tilstand, da parameteren for inaktiv tilstand muligvis ikke kan overføres fuldt ud til den aktiverede tilstand. Også, for ikke at nævne ændringen i protein egenskab kompliceret ved at binde en partner protein. Protokollen bruger metoder, der er standardiseret til fremstilling af en krystalliseringsprøve til at forberede inaktivt membranprotein i forskellige vaske- og rengøringsmidler, efterfulgt af proteinaktivering og kompleks dannelse, og til at karakterisere proteinkvaliteten. Således kan denne protokol let generaliseres til andre membranproteiner og deres komplekser til strukturelle undersøgelser med mindre ændringer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler for hans langsigtede støtte i dette projekt, Dr. Roger JP Dawson og Hoffmann La Roche for støtte i cellekultur. Dette arbejde blev sponsoreret af Swiss National Science Foundation (tilskud 210030_153145 og 310030B_173335 til GFXS), og finansiering til CGT fra Det Europæiske Forskningsråd (EMPSI, 339995) og Medical Research Council (MRC U105197215). FP anerkender ETH Zürich gennem Det Nationale Center for Kompetence inden for Forskning Molekylær Ultrahurtig Videnskab og Teknologi (NCCR MUST) og ETH Femtosecond og Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programmer. FP, JM, AB og CJT anerkender langsigtet finansiel støtte fra Paul Scherrer Institute.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |