Denne rapporten beskriver screening av ulike vaskemidler for å forberede den visuelle GPCR, rhodopsin, og dens kompleks med mini-Go. Biokjemiske metoder som karakteriserer kvaliteten på komplekset på forskjellige stadier under rensing er demonstrert. Denne protokollen kan generaliseres til andre membranproteinkomplekser for deres fremtidige strukturelle studier.
Nøkkelen til å bestemme krystallstrukturer av membranproteinkomplekser er kvaliteten på prøven før krystallisering. Spesielt er valget av vaskemiddel kritisk, fordi det påvirker både stabiliteten og monodispersiteten til komplekset. Vi har nylig bestemt krystallstrukturen til en aktiv tilstand av storfe rhodopsin kombinert med et konstruert G-protein, mini-Go, på 3.1 Å oppløsning. Her beskriver vi prosedyren for å optimalisere utarbeidelsen av rhodopsin-mini-Go-komplekset. Mørktilstand rhodopsin ble tilberedt i klassiske og neopentylglykol (NPG) vaskemidler, etterfulgt av kompleks dannelse med mini-Go under lyseksponering. Stabiliteten til rhodopsin ble vurdert av ultrafiolett synlig (UV-VIS) spektroskopi, som overvåker rekonstitueringen til rhodopsin av den lysfølsomme liganden, 9-cis retinal. Automatisert størrelseseksklonografi (SEC) ble brukt til å karakterisere polydopsinets monifikelse og rhodopsin-mini-Go-komplekset. SDS-polyakrylamidelektroforese (SDS-PAGE) bekreftet dannelsen av komplekset ved å identifisere et 1:1 molar-forhold mellom rhodopsin og mini-Go etter farging av gelen med Coomassie blå. Etter å ha kryssvalidert alle disse analytiske dataene, eliminerte vi uegnede vaskemidler og fortsatte med det beste kandidatvaskemiddelet for storskala forberedelse og krystallisering. Et ekstra problem oppsto fra heterogeniteten av N-glykosylering. Heterologously-uttrykt rhodopsin ble observert på SDS-PAGE å ha to forskjellige N-glycosylated populasjoner, som sannsynligvis ville ha hindret krystallogenes. Derfor ble forskjellige deglykosyleringsenzymer testet, og endoglycosidase F1 (EndoF1) produserte rhodopsin med en enkelt art av N-glykosylering. Med denne strategiske rørledningen for å karakterisere proteinkvalitet, ble utarbeidelsen av rhodopsin-mini-Go-komplekset optimalisert for å levere krystallstrukturen. Dette var bare den tredje krystallstrukturen til et GPCR-G proteinsignalkompleks. Denne tilnærmingen kan også generaliseres for andre membranproteiner og deres komplekser for å lette prøveforberedelse og strukturbestemmelse.
Å bestemme krystallstrukturer av membranproteiner og deres komplekser har alltid vært utfordrende på grunn av vanskeligheter med å oppnå velfungerende krystaller. I motsetning til oppløselige proteiner utgjør integrerte membranproteiner en hydrofobe kjerne som strekker seg over cellemembranen. For å fjerne membranproteiner fra cellemembranen i vandig buffer, må vaskemidler brukes til å danne en vaskemiddel-protein micelle, og dermed erstatte lipidene rundt den hydrofobe kjernen av membranproteiner. Stabilitet, aktivitet og integritet av membranproteiner er direkte avhengig av de kjemiske og strukturelle egenskapene tilvaskemiddelet 1, og vaskemiddelets egenskaper bestemmer også størrelsen på micelle. En stor vaskemiddel micelle kan okkupere hydrofile overflater av en liten membran protein, og dermed hindre krystallisering på grunn av mangel på krystallkontakter ved bruk av dampdiffusjonsmetode. En liten vaskemiddelmicelle er en fordel for krystallografi, men korte kjedevaskemidler er vanligvis strengere og fører derfor til destabilisering og aggregering av membranproteinet. Derfor, før krystallisering, en ekstra vaskemiddel screening prosedyre er uunnværlig, vanligvis rettet mot kortere vaskemidler som fortsatt opprettholder protein stabilitet.
G protein-koblet reseptorer (GPCRs) er integrertmembran proteiner som inneholder syv transmembrane a-helices. GPCRs eksisterer i to hovedstater, enten en inaktiv tilstand stabilisert av inverse agonister eller antagonister, eller en aktiv tilstand bundet til en agonist og stabilisert av et G-protein, selv om det er sannsynlig at en rekke understater eksisterer mellom disse to ytterpunktene. Struktur bestemmelse av GPCRs opprinnelig fokusert på inaktive stater bundet til inverse agonister og antagonister på grunn av deres høyere stabilitet enn aktive stater2. Når GPCRs aktiveres ved agonist binding, reseptorene er svært dynamisk, og en kløft dannes midlertidig på cytoplasmatisk ansikt av reseptoren for G proteinkobling. Det antas at denne dynamikken er grunnen til at agonist-bundet GPCRs er ofte mer ustabilenn den inaktive tilstanden. Derfor blir det viktig å screene for vaskemidler som passer for reseptorens konformasjonstilstand under studien, fordi det er sannsynlig at mildere vaskemidler vil være nødvendig for å studere en aktiv tilstand sammenlignet med en inaktiv tilstand.
I denne rapporten bruker vi den visuelle GPCR, storfe rhodopsin3, og dens komplekse med mini-Go protein4,5 for vaskemiddel screening eksperimenter, som representerer inaktiv tilstand og aktiv tilstand, henholdsvis. Vaskemiddelscreeningen fokuserte på de klassiske alkylmaltosid- og glukosidvaskemidlene og neopentylglykol (NPG) vaskemidler. I denne sammenheng en klassisk vaskemiddel er bygget av en sukker hodegruppe og en alkyl kjede, mens NPG type vaskemidler inneholder to identiske klassiske vaskemidler som er smeltet sammen av en kvartær karbon på grensesnittet mellom sukker og alkyl kjeder6,7,8.
En eksperimentell arbeidsflyt ble designet fra rensing av rhodopsin i forskjellige vaskemidler, etterfulgt av dannelse av rhodopsin-mini-Go-komplekset og slutter med karakterisering av komplekset ved hjelp av flere metoder (Figur 1). For den inaktive tilstanden til rhodopsin ble rekonstituering av lysfølsom ligand 9-cis retinal overvåket av ultrafiolett synlig (UV-VIS) spektroskopi. Spekteret avslører den fysikalske tilstanden til netthinnen og indikerer miljøet i retinal bindingslommen av rhodopsin. Størrelse eksklusjon kromatografi (SEC) ble ansatt for å vurdere monodispersitet av renset rhodopsin samt dannelse av rhodopsin-mini-Go kompleks. Som SEC skiller proteinmolekyler etter størrelse og form, kan aggregert proteinpopulasjon identifiseres som de elute i tomrommet volum. For å bekrefte kompleks dannelse ble fraksjoner fra SEC vurdert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) for å bekrefte tilstedeværelsen av både rhodopsin og mini-Go.
En annen faktor som må vurderes er post-translational modifikasjoner (PTM) på membranproteiner. PTM som N-glykosylering observeres ofte på eukaryyotiske membranproteiner produsert i pattedyr- og insektcelleuttrykkssystemer. En begrenset N-glykosyleringstamme av humane embryonale nyre293 (HEK293) celler ble utviklet ved sletting av genkodingn N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), noe som resulterte i homogen N-glykosylering av GlcNAc2Man5 på konsensusstedet Asn-X-Ser/Thr. Selv om N-glykosylering kan forhindres ved å mutere en aminosyrerester i konsensusområdet, kan dette også endre funksjonen til proteinet eller effektiviteten av folding. I storfe rhodopsin fører mutasjon av N-glykosylerte rester Asn15 til feil folding og redusert G proteinaktivering9,10. Rhodopsin en gang i denne rapporten ble uttrykt i HEK 293 GnTI-mangelfull cellelinje. SDS-PAGE viste imidlertid tilstedeværelsen av to arter av rhodopsin. Denne heterogeniteten kan forhindre krystalldannelse og derfor deglykosylering ved hjelp av peptid-N-glykosidase F (PNGase F) og endoglycosidase F1 (Endo F1) ble testet. Det deglykosylerte produktet var preget av SDS-PAGE og flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) for å identifisere nivået av glykosylering og homogenitet.
Suksessen i proteinkrystallisering er sterkt avhengig av proteinprøven, spesielt membranproteiner og deres komplekser på grunn av komplikasjonen forårsaket av vaskemidler. Denne rapporten demonstrerer vaskemiddelscreening og evaluering av prøvekvaliteten for GPCR-mini-G proteinsignalkomplekser. En rekke metoder har blitt mye brukt til å studere den biokjemiske egenskapen til membranproteiner, for eksempel termostabilitetsanalyse ved hjelp av fluorescerende fargestoffer16,17, bindende analyse for å oppdage kompleks dannelse ved å måle endringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergioverføring med biosensorer19. Imidlertid er de kjemiske miljøene som brukes i disse metodene ganske forskjellige fra de for å forberede en krystalliseringsprøve, enten proteiner er på tusen ganger lavere konsentrasjon for fluorescensbasert måling, eller proteiner er innebygd i lipidbilag eller i en fast vaskemiddeltilstand. I denne protokollen er de brukte metodene også standardisert i storskala prøveforberedelse før krystallisering. Derfor kan de optimaliserte parametrene enkelt overføres for krystalliseringsskalaforberedelse uten ytterligere større screening og optimalisering.
Målet med denne protokollen er å optimalisere utarbeidelsen av et stabilt og homogent GPCR-mini-G proteinkompleks for dampdiffusjonkrystallisering og strukturbestemmelse ved røntgenkrystallografi. Protokollen integrerer et sett med metoder for å kvalitativt evaluere virkningen av vaskemiddel og deglykosylering under fremstilling av rhodopsin-mini-Go-komplekset. Rhodopsin ved inaktiv tilstand og lysaktivert tilstand bundet med og uten transducinpeptidet har blitt krystallisert når renset i vaskemiddelet octyl glukosid (C8G)20,,21,,22 og C9G23,24. Siden rhodopsin–mini-Go-komplekset som ble renset i C8G og C9G ikke ga krystaller (data som ikke ble vist), utforsket vi deretter et bredere spekter av andre vaskemidler ved hjelp av den beskrevne strategien (Figur 1). Ved å dra nytte av lysfølsomheten til rhodopsin, kunne vi veldig godt følge rekonstitueringen av retinal ved andre bølgelengder enn 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi og SEC oppdaget vi retinal på enten 380 nm eller 488 nm. Imidlertid har de fleste membranproteiner ikke en så praktisk kromofor å følge funksjonalitetunder rensing. Andre alternativer ville være å gjøre en ligand påviselig ved å legge til en lys-påviselig kromofor eller ved hjelp av radioligand-bindende og termisk skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvekt på 40 kDa. På grunn av massen av vaskemiddel det binder, er den tilsynelatende molekylvekten på SEC ca 120 kDa. Det er dermed ingen overraskelse at bindingen av mini-Go (24 kDa) ikke lett ble oppdaget på SEC, da dette ville nødvendiggjøre differensiering av proteiner med tilsynelatende masser på 120 kDa og 144 kDa. Analyse av SEC-fraksjoner ved SDS-PAGE ble derfor brukt til å bekrefte prøverenhet og kompleks dannelse. Selv om SEC-profiler viser et klart skifte ved kompleks dannelse, anbefales det fortsatt å utføre SDS-PAGE-analyse for å bekrefte den komplekse formasjonen med korrekte bindende partnere i stedet for andre co-renset proteinforurensninger.
Både rhodopsin og mini-Go ble renset i mg mengder, noe som tillot bruk av lav følsomhet deteksjon av komplekser, som UV-VIS absorpsjon under SEC og Commassie Blue farging av SDS-PAGE geler. Der prøvene er begrenset, bør mer følsom deteksjon brukes, for eksempel en LC-renser utstyrt med en fluorescensdetektor for å spore tryptofansignaler fra proteinet (280 nm eksitasjon, 350 nm utslipp) og sølvfarging for SDS-PAGE geler. En annen tilnærming ville være å smelte et fluorescerende protein, for eksempel grønt fluorescensprotein (GFP) til proteinet av interesse, noe som også ville tillate deteksjon selv under proteinuttrykk26, men det bør fjernes før krystallisering.
Det er viktig å sikre at det rensede proteinet også er fritt for heterogenitet som oppstår fra variable PTMs. I saken som er beskrevet her, ble de to populasjonene av rhodopsin observert på SDS-PAGE geler karakterisert som å ha enten en eller to N-glykaner. Variabel endring av et protein vil potensielt forhindre dannelse av godt diffracting krystaller, så vi derfor deglycosylated rhodopsin. Endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testet og behandling førte til en enkelt art av unglykosylert reseptor, mens PNGase F bare delvis fjernet glykaner på rhodopsin og resulterte i en blanding av rhodopsin fullt unglycosylated eller med en N-glycan forble. Rhodopsin uten deglycosylase behandling har blitt vellykket krystallisert3,27,28, og N-glycan på rhodopsin Asn15 er viktig å danne krystallkontakt i disse tilfellene. I tilfelle av rhodopsin-mini-Go, er det nødvendig å fjerne N-glykaner av Endo F1 for å få krystaller. Det er ingen standardisert regel for å deglykolate proteiner av interesse før krystallisering, men fjerning av heterogene PTMs bør vurderes når proteiner ikke klarer å krystallisere etter omfattende krystalliseringsstudier.
Dataene og metodikken som er beskrevet her, førte oss til å velge OGNG som det mest foretrukne vaskemiddelet for krystallisering av rhodopsin-mini-Go-komplekset på grunn av sin lille micellestørrelse og dens evne til å stabilisere komplekset. Vi brukte også Endo F1 for å sikre at renset rhodopsin var en homogen art. Krystaller ble senere oppnådd, og vi bestemte krystallstrukturen til ~ 3.1 Å4, som bare var den tredje krystallstrukturen til et GPCR-G proteinsignalkompleks14,29.
For membranproteiner bundet med og uten partnerprotein, bør de betraktes som to forskjellige proteiner. Et protein ved forskjellige funksjonelle tilstander har forskjellige konformasjoner og er på forskjellig energinivå. Derfor anbefales det å optimalisere klargjøringsprotokollen for hver funksjonstilstand, da parameteren for inaktiv tilstand kanskje ikke kan overføres helt til aktivert tilstand. Også for ikke å nevne endringen i proteinegenskapen komplisert ved å binde et partnerprotein. Protokollen bruker metoder som er standardisert for å forberede en krystalliseringsprøve for å forberede inaktivt membranprotein i forskjellige vaskemidler, etterfulgt av proteinaktivering og kompleks dannelse, og for å karakterisere proteinkvalitet. Dermed kan denne protokollen lett generaliseres til andre membranproteiner og deres komplekser for strukturelle studier med mindre modifikasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler for hans langsiktige støtte i dette prosjektet, Dr. Roger J.P. Dawson og Hoffmann La Roche for støtte i cellekultur. Dette arbeidet ble sponset av Swiss National Science Foundation (tilskudd 210030_153145 og 310030B_173335 til GFXS), og finansiering til CGT fra European Research Council (EMPSI, 339995) og Medical Research Council (MRC U105197215). FP anerkjenner ETH Zürich gjennom National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) og ETH Femtosecond og Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programmer. FP, JM, AB og CJT anerkjenner langsiktig økonomisk støtte fra Paul Scherrer Institute.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |