Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.
De sleutel tot het bepalen van kristalstructuren van membraaneiwitcomplexen is de kwaliteit van het monster voorafgaand aan kristallisatie. In het bijzonder is de keuze van het wasmiddel van cruciaal belang, omdat het zowel de stabiliteit als de monodispersitie van het complex beïnvloedt. We hebben onlangs bepaald de kristalstructuur van een actieve toestand van boviene rododenine gekoppeld aan een ontworpen G-eiwit, mini-Go, op 3.1 Å resolutie. Hier beschrijven we de procedure voor het optimaliseren van de voorbereiding van het rododen-mini-Go complex. Dark-state rododenwerd bereid in klassieke en neopentylglycol (NPG) detergenten, gevolgd door complexe vorming met mini-Go onder lichte blootstelling. De stabiliteit van de rododenwerd beoordeeld door ultraviolet zichtbare (UV-VIS) spectroscopie, die de reconstructie van ropsine van de lichtgevoelige ligand, 9-cis retinal monitort. Geautomatiseerde grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) werd gebruikt om de monodispersie van rododenen en de rododen-mini-Go complex karakteriseren. SDS-polyacrylamide elektroforese (SDS-PAGE) bevestigde de vorming van het complex door een 1:1 kiesverhouding tussen rododen en mini-Go te identificeren na het bevlekken van de gel met Coomassie blauw. Na het kruisvalideren van al deze analytische gegevens, elimineerden we ongeschikte wasmiddelen en gingen we verder met de beste kandidaat-wasmiddel voor grootschalige voorbereiding en kristallisatie. Een bijkomend probleem deed zich voort uit de heterogeniteit van N-glycosylation. Heterologe uitgedrukte rododenine werd waargenomen op SDS-PAGE om twee verschillende N-glycosylated bevolking en die waarschijnlijk crystallogenese zouden hebben belemmerd. Daarom werden verschillende deglycosylation enzymen getest, en endoglycosidase F1 (EndoF1) geproduceerd rotopsin met een enkele soort N-glycosylation. Met deze strategische pijplijn voor het karakteriseren van eiwitkwaliteit werd de voorbereiding van het ropsine-mini-Go complex geoptimaliseerd om de kristalstructuur te leveren. Dit was slechts de derde kristalstructuur van een GPCR-G eiwitsignaleringscomplex. Deze aanpak kan ook worden gegeneraliseerd voor andere membraaneiwitten en hun complexen om monstervoorbereiding en structuurbepaling te vergemakkelijken.
Het bepalen van kristalstructuren van membraaneiwitten en hun complexen is altijd een uitdaging geweest vanwege problemen bij het verkrijgen van goed diffracting kristallen. In tegenstelling tot oplosbare eiwitten bestaan integrale membraaneiwitten uit een hydrofobe kern die het celmembraan overspant. Om membraaneiwitten uit het celmembraan te verwijderen in waterige buffer, moeten detergenten worden gebruikt om een wasmiddel-eiwit micelle te vormen, waardoor de lipiden rond de hydrofobe kern van membraaneiwitten worden vervangen. Stabiliteit, activiteit en integriteit van membraaneiwitten zijn direct afhankelijk van de chemische en structurele eigenschappen van het wasmiddel1, en de eigenschappen van het wasmiddel bepalen ook de grootte van de micelle. Een grote wasmiddel micelle kan occlude de hydrofiele oppervlakken van een klein membraan eiwit, waardoor kristallisatie te wijten aan het ontbreken van kristal contacten bij het gebruik van damp diffusie methode. Een kleine wasmiddel micelle is voordelig voor kristallografie, maar korte keten detergenten zijn meestal harder en dus leiden tot destabilisatie en aggregatie van het membraan eiwit. Daarom is vóór kristallisatie een extra wasmiddelscreeningsprocedure onmisbaar, meestal gericht op kortere detergentia die de eiwitstabiliteit nog steeds handhaven.
G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn integrale membraaneiwitten die zeven transmembraan a-helices bevatten. GPCRs bestaan in twee belangrijke staten, ofwel een inactieve toestand gestabiliseerd door omgekeerde agonisten of antagonisten, of een actieve staat gebonden aan een agonist en gestabiliseerd door een G-eiwit, hoewel het waarschijnlijk is dat een veelheid van substaten bestaan tussen deze twee uitersten. Structuur bepaling van GPCRs aanvankelijk gericht op inactieve staten gebonden aan inverse agonisten en antagonisten als gevolg van hun hogere stabiliteit dan actieve toestanden2. Wanneer GPCRs worden geactiveerd op agonist binding, de receptoren zijn zeer dynamisch, en een gespleten vormen van voorbijgaande aard op het cytoplasmatische gezicht van de receptor voor G eiwitkoppeling. Er wordt gedacht dat deze dynamiek is de reden waarom agonist-gebonden GPCRs zijn vaak instabieler dan de inactieve toestand. Daarom wordt het essentieel om te screenen op detergentia die geschikt zijn voor de conformatietoestand van de onderzochte receptor, omdat het waarschijnlijk is dat mildere detergentia nodig zullen zijn voor het bestuderen van een actieve toestand in vergelijking met een inactieve toestand.
In dit rapport gebruiken we de visuele GPCR, runderrocoopine3en het complex met mini-Go-eiwit 4,5 voor de experimenten met wasmiddelscreening, die respectievelijk de inactieve toestand en de actieve toestand vertegenwoordigen. De wasmiddelscreening richtte zich op de klassieke alkyl maltoside en glucoside detergenten en de neopentylglycol (NPG) detergenten. In dit verband is een klassiek wasmiddel opgebouwd uit een suikerhoofdgroep en een alkylketen, terwijl de npg-typedetergenten twee identieke klassieke detergentia bevatten die worden gesmolten door een quaternaire koolstof op het raakvlak tussen de suikers en de alkylketens6,7,8.
Een experimentele workflow werd ontworpen vanaf de zuivering van robeto in verschillende detergenten, gevolgd door de vorming van de rododen-mini-Go complex en eindigend met de karakterisering van het complex met behulp van verschillende methoden (Figuur 1). Voor de inactieve toestand van rododenwerd de reconstructie van het lichtgevoelige ligand 9-cis retinal gecontroleerd door ultraviolet zichtbaar (UV-VIS) spectroscopie. Het spectrum onthult de fysischchemische toestand van het netvlies en is indicatief voor zijn omgeving in de netvliesbindende zak van rododen. De chromatografie van de grootte werd gebruikt om monodispersity van gezuiverde rododenine evenals vorming van rhodopsin-mini-Go complex te beoordelen. Als SEC onderscheidt eiwitmoleculen door hun grootte en vorm, geaggregeerde eiwitpopulatie kan worden geïdentificeerd als ze uitsteken in de leegte volume. Om de complexe vorming te bevestigen, werden fracties van SEC beoordeeld door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) om de aanwezigheid van zowel rododenals mini-Gote bevestigen.
Een andere factor die moet worden overwogen is post-translationele wijzigingen (PTM) op het membraan eiwitten. PTM zoals N-glycosylation worden vaak waargenomen op eukaryotische membraaneiwitten geproduceerd in zoogdier- en insectencelexpressiesystemen. Een beperkte N-glycosylation stam van de menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen werd ontwikkeld door verwijdering van het gen codering N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), wat resulteert in homogene N-glycosylation door GlcNAc2Man5 op de consensus site Asn-X-Ser / Thr. Hoewel N-glycosylation kan worden voorkomen door het muteren van een aminozuurresidu in de consensussite, kan dit ook de functie van het eiwit of de efficiëntie van het vouwen veranderen. Bij runderropsine leidt mutatie van het N-glycosylated residu Asn15 tot onjuiste vouwen en verminderde G-eiwitactivering9,10. De rododenine gebruikt in dit rapport werd uitgedrukt in HEK 293 GnTI-tekort cellijn. SDS-PAGE toonde echter de aanwezigheid van twee soorten rododen. Deze heterogeniteit kon kristalvorming voorkomen en daarom werd deglycosylation met peptide-N-glycosidase F (PNGase F) en endoglycosidase F1 (Endo F1) getest. Het deglycosylated product werd gekenmerkt door SDS-PAGE en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) om het niveau van glycosylation en de homogeniteit ervan te identificeren.
Het succes in eiwitkristallisatie is sterk afhankelijk van het eiwitmonster, met name membraaneiwitten en hun complexen als gevolg van de complicatie veroorzaakt door detergentia. Dit rapport toont wasmiddelscreening en evaluatie van de monsterkwaliteit voor GPCR-mini-G eiwitsignaleringscomplexen. Een verscheidenheid van methoden zijn op grote schaal gebruikt om de biochemische eigenschap van membraan eiwitten te bestuderen, bijvoorbeeld, thermostabiliteit test met behulp van tl-kleurstoffen16,17, bindende test om complexe vorming te detecteren door het meten van de verandering in tryptofaanfluorescentie signaal18 of de resonantie energie overdracht met biosensoren19. Echter, de chemische omgevingen die in deze methoden zijn heel anders dan die voor de voorbereiding van een kristallisatie monster, ofwel eiwitten zijn op een duizend-voudige lagere concentratie voor fluorescentie-gebaseerde meting, of eiwitten zijn ingebed in lipide bilagen of in een vaste wasmiddel voorwaarde. In dit protocol worden de gebruikte methoden ook gestandaardiseerd in grootschalige monsterbereiding vóór kristallisatie. Daarom kunnen de geoptimaliseerde parameters eenvoudig worden overgedragen voor kristallisatie-schaal voorbereiding zonder verdere grote screening en optimalisatie.
Het doel van dit protocol is het optimaliseren van de voorbereiding van een stabiel en homogeen GPCR-mini-G eiwitcomplex voor dampdiffusiekristallisatie en structuurbepaling door röntgenkristallografie. Het protocol integreert een reeks methoden om de impact van wasmiddel en deglycosylation tijdens de voorbereiding van het rododen-mini-Go-complex kwalitatief te evalueren. Rhodopsine in inactieve toestand en licht-geactiveerde toestand gebonden met en zonder de transducine peptide is gekristalliseerd wanneer gezuiverd in de detergentia octyl glucoside (C8G)20,21,22 en C9G23,24. Aangezien het rhodopsine-mini-Go-complex gezuiverd in C8G en C9G geen kristallen opleverde (niet getoonde gegevens), hebben we vervolgens een breder scala aan andere detergentia onderzocht met behulp van de beschreven strategie (figuur 1). Door gebruik te maken van de lichtgevoeligheid van rododen, zouden we heel goed de reconstructie van het netvlies kunnen volgen op andere golflengten dan 280 nm. In zowel UV-VIS spectroscopie als SEC, ontdekten we retinale op ofwel 380 nm of 488 nm. De meeste membraaneiwitten hebben echter niet zo’n handig chromophore om de functionaliteit tijdens de zuivering te volgen. Andere opties zouden zijn om een ligand detecteerbaar te maken door het toevoegen van een licht-detecteerbare chromophore of door gebruik te maken van radioligand-binding en thermische verschuiving assays25.
Rhodopsine heeft een moleculair gewicht van 40 kDa. Als gevolg van de massa van het wasmiddel bindt, zijn schijnbare moleculaire gewicht op SEC is ongeveer 120 kDa. Het is dan ook geen verrassing dat de binding van mini-Go (24 kDa) niet gemakkelijk werd gedetecteerd op SEC, omdat dit differentiatie van eiwitten met schijnbare massa’s van 120 kDa en 144 kDa noodzakelijk zou maken. Analyse van SEC-fracties door SDS-PAGE werd daarom gebruikt om de zuiverheid van de monsters en de complexe vorming te bevestigen. Zelfs als SEC-profielen een duidelijke verschuiving vertonen bij complexe vorming, wordt het nog steeds aanbevolen om SDS-PAGE-analyse uit te voeren om de complexe vorming met de juiste bindende partners te bevestigen in plaats van andere medegezuiverde eiwitverontreinigingen.
Zowel rododenine en mini-Go werden gezuiverd in milligram hoeveelheden, die het gebruik van lage gevoeligheid detectie van de complexen, zoals UV-VIS absorptie tijdens SEC en Commassie Blauwe vlekken van SDS-PAGE gels toegestaan. Wanneer monsters beperkt zijn, moet meer gevoelige detectie worden gebruikt, zoals een LC-reiniger die is uitgerust met een fluorescentiedetector om tryptofaansignalen van het eiwit (280 nm excitatie, 350 nm emissie) en zilvervlekken voor SDS-PAGE gels te traceren. Een andere benadering zou zijn om een fluorescerend eiwit, zoals groene fluorescentie-eiwit (GFP) te versmelten tot het eiwit van belang, dat ook detectie mogelijk zou maken, zelfs tijdens eiwitexpressie26, maar het moet worden verwijderd voordat kristallisatie.
Het is essentieel om ervoor te zorgen dat het gezuiverde eiwit ook vrij is van heterogeniteit als gevolg van variabele PTM’s. In het hier beschreven geval werden de twee populaties van ropsine waargenomen op SDS-PAGE gels gekarakteriseerd als een of twee N-glycanen. Variabele modificatie van een eiwit zou de vorming van goed diffracting kristallen mogelijk voorkomen, dus hebben we daarom rhodopsinde. De endoglycosidase Endo F1 was het meest effect endoglycosidase getest en behandeling leidde tot een enkele soort van niet-gecosylated receptor, terwijl PNGase F slechts gedeeltelijk verwijderd van de glycanen op rotoropsin en resulteerde in een mengsel van rododenine volledig ongezellig of met een N-glycan bleef. Rhodopsine zonder deglycosylase behandeling is met succes gekristalliseerd3,,27,28, en de N-glycan op rhodopsin Asn15 is belangrijk om kristal contact te vormen in die gevallen. In het geval van rododen-mini-Go, is het noodzakelijk om N-glycans door Endo F1 te verwijderen om kristallen te verkrijgen. Er is geen gestandaardiseerde regel om eiwitten van belang te deglycosylate voor kristallisatie, maar verwijdering van heterogene PTM’s moet worden overwogen wanneer eiwitten niet kristalliseren na uitgebreide kristallisatie proeven.
De gegevens en methodologie die hier beschreven leidde ons naar OGNG kiezen als de meest geprefereerde wasmiddel voor kristallisatie van de rododen-mini-Go complex vanwege de kleine micelle grootte en de mogelijkheid om het complex te stabiliseren. We gebruikten Ook Endo F1 om ervoor te zorgen dat de gezuiverde rododenwasseren een homogene soort was. Kristallen werden vervolgens verkregen en we bepaalden de kristalstructuur tot ~ 3.1 Å4, dat was slechts de derde kristalstructuur van een GPCR-G eiwit signalering complex14,29.
Voor membraaneiwitten gebonden met en zonder partnereiwit, moeten ze worden beschouwd als twee verschillende eiwitten. Een eiwit in verschillende functionele toestanden heeft verschillende conformaties en is op verschillende energieniveau. Daarom wordt aanbevolen om het voorbereidingsprotocol voor elke functionele status te optimaliseren, aangezien de parameter voor de inactieve toestand mogelijk niet volledig overdraagbaar is naar de geactiveerde status. Ook, niet te vergeten de verandering in de eiwiteigenschap gecompliceerd door het binden van een partner eiwit. Het protocol maakt gebruik van methoden die zijn gestandaardiseerd voor de voorbereiding van een kristallisatiemonster om inactief membraaneiwit in verschillende detergenten voor te bereiden, gevolgd door eiwitactivering en complexe vorming, en om de eiwitkwaliteit te karakteriseren. Zo kan dit protocol gemakkelijk worden gegeneraliseerd tot andere membraaneiwitten en hun complexen voor structurele studies met kleine modificatie.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken prof. dr. Gebhard F. X. Schertler voor zijn langdurige steun in dit project, Dr. Roger J.P. Dawson en Hoffmann La Roche voor ondersteuning in de celcultuur. Dit werk werd gesponsord door de Swiss National Science Foundation (subsidies 210030_153145 en 310030B_173335 aan GFXS), en financiering aan CGT van de European Research Council (EMPSI, 339995) en de Medical Research Council (MRC U105197215). FP erkent ETH Zürich via het National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) en de ETH Femtosecond en Attosecond Science and Technology (ETH FAST) programma’s. FP, JM, AB en CJT erkennen financiële steun op lange termijn van het Paul Scherrer Institute.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |