本报告描述了不同的洗涤剂的筛选,以准备视觉GPCR,红蛋白,其复合与微型Go。演示了在纯化过程中不同阶段对复杂质量进行特征的生化方法。该协议可以推广为其他膜蛋白复合物,用于其未来的结构研究。
确定膜蛋白复合物晶体结构的关键是结晶前样品的质量。特别是,洗涤剂的选择是至关重要的,因为它影响复杂的稳定性和单分散性。我们最近确定了牛红豆素活性状态的晶体结构,与工程G蛋白,迷你Go,在3.1°分辨率。在这里,我们详细介绍了优化红蛋白-迷你Go复合物制备的过程。暗状态红黄素是在经典和新苯二醇(NPG)洗涤剂中制备的,随后在光线照射下形成具有微型Go的复杂形成。紫外可见(UV-VIS)光谱仪对多松子的稳定性进行了评估,该光谱监测光敏配体的红斑蛋白,9-cis视网膜的重组。自动大小排除色谱(SEC)用于描述红蛋白和红蛋白-迷你Go复合物的单扩散性。SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)在用库马西蓝色染色凝胶后,确定了红斑蛋白和迷你Go之间的1:1摩尔比,从而证实了该复合物的形成。在交叉验证所有这些分析数据后,我们消除了不合适的洗涤剂,并继续使用用于大规模制备和结晶的最佳候选洗涤剂。另一个问题来自N-糖基化的异质性。在SDS-PAGE上观察到异质表达的红蛋白有两种不同的N-糖基化种群,这很可能阻碍晶体生成。因此,测试了不同的去酶酶,并且EndoglycosidaseF1(EndoF1)产生多糖酶与单一种类的N-糖基酶。通过这种蛋白质质量特征化的战略管道,对多普辛-迷你Go复合体的制备进行了优化,以提供晶体结构。这只是GPCR+G蛋白信号复合物的第三个晶体结构。该方法还可以为其他膜蛋白及其复合物进行推广,以促进样品制备和结构测定。
由于难以获得衍射晶体,因此确定膜蛋白及其复合物的晶体结构一直具有挑战性。与可溶性蛋白质相比,整体膜蛋白构成跨越细胞膜的疏水性核心。为了将细胞膜中的膜蛋白去除为水缓冲液,必须使用洗涤剂来形成洗涤剂蛋白云母,从而取代膜蛋白的疏水性核心周围的脂质。膜蛋白的稳定性、活性和完整性直接取决于洗涤剂1的化学和结构特性,洗涤剂的特性也决定了云母的大小。大型洗涤剂云母可以遮挡小膜蛋白的亲水表面,从而防止在使用蒸汽扩散方法时缺乏晶体接触而结晶。小洗涤剂云洗剂对晶体学有利,但短链洗涤剂通常较苛刻,因此会导致膜蛋白的不稳定和聚集。因此,在结晶之前,额外的洗涤剂筛选程序是必不可少的,通常针对仍然保持蛋白质稳定性的较短的洗涤剂。
G蛋白耦合受体(GPCRs)是含有七种跨膜异卵物的集成膜蛋白。GPCRs存在于两种主要状态,要么是由反前体或拮抗剂稳定的非活动状态,要么是与激动剂结合并由G蛋白稳定而存在的活性状态,尽管这两个极端之间可能存在多种子状态。GPCR 的结构确定最初侧重于与反逆论者和敌对者结合的非活动状态,由于其稳定性高于活动状态2。当GPCR在激动剂结合时激活时,受体是高度动态的,并且裂解在G蛋白耦合受体的细胞质表面暂时形成。据认为,这种活力是为什么受激动的GPCR往往比非活动状态更不稳定的原因。因此,筛选适合所研究受体的构象状态的洗涤剂变得至关重要,因为与非活动状态相比,研究活性状态可能需要较温和的洗涤剂。
在本报告中,我们使用视觉GPCR,牛红蛋白3,其复合与微型Go蛋白44,55进行洗涤剂筛选实验,分别代表非活性状态和活性状态。洗涤剂筛选侧重于经典的烷基麦芽糖苷和糖苷洗涤剂和新苯二醇(NPG)洗涤剂。在此背景下,经典洗涤剂由糖头组和烷基链构建,而NPG型洗涤剂包含两种相同的经典洗涤剂,在糖和烷基链66、7、87,8之间的界面上由四元碳融合。
设计了一个实验工作流程,从不同洗涤剂中杜松子酶的纯化开始,然后形成红豆蛋白-迷你-Go复合物,最后使用几种方法对复合物进行表征(图1)。对于多普辛的非活性状态,光敏感配体9-cis视网膜的重组通过紫外线可见(UV-VIS)光谱监测。光谱揭示了视网膜的物理化学状态,并指示其环境在杜松素的视网膜结合口袋。尺寸排除色谱(SEC)用于评估纯正红蛋白的单次分散以及红蛋白-迷你-Go复合物的形成。当SEC根据蛋白质分子的大小和形状进行区分时,聚合的蛋白质群可以识别为在空隙体积中。为了确认复杂地层,通过硫酸钠硫酸盐-多丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对SEC的分数进行评估,以确认红糖素和微型Go的存在。
需要考虑的另一个因素是膜蛋白的翻译后修饰 (PTM)。PTM,如N-glycosy化,经常在哺乳动物和昆虫细胞表达系统产生的真核膜蛋白上观察到。人类胚胎肾293(HEK293)细胞的有限N-糖基化菌株是通过删除编码N-乙酰二醇酰胺酶I(GnTI)的基因而形成的,导致GlcNAc2Man5在共识站点Asn-X-Ser/Thr中形成均质的N-glycic化。虽然N-糖基化可以通过在共识位点中突变氨基酸残留物来预防,但这也可能改变蛋白质的功能或折叠效率。在牛罗多普素中,N-糖基化残留物Asn15的突变导致不正确的折叠和减少G蛋白活化9,9,10。本报告中使用的多辛在HEK 293 GnTI缺乏细胞系中表达。然而,SDS-PAGE显示了两种红蛋白的存在。这种异质性可以防止晶体形成,因此使用肽-N-糖苷酸F(PNGase F)和原体糖酶F1(Endo F1)进行去糖化。脱糖化产物的特点是SDS-PAGE和液相色谱质谱(LC-MS),以识别糖基化水平及其同质性。
蛋白质结晶的成功很大程度上依赖于蛋白质样本,特别是膜蛋白及其复合物,由于洗涤剂引起的并发症。本报告演示了 GPCR-mini-G 蛋白信号复合物的洗涤剂筛选和评估样品质量。多种方法已广泛应用于研究膜蛋白的生化特性,例如,使用荧光染料16、17,17进行热稳定性测定,结合测定,通过测量锥形荧光信号18的变化或生物传感器的共振能量传递19来检测复杂地层。然而,这些方法中使用的化学环境与制备结晶样品的环境大不相同,要么蛋白质的浓度低千倍,用于荧光测量,要么蛋白质嵌入脂质双层或一种固定洗涤剂条件下。在该协议中,在结晶前的大规模样品制备中也对所使用的方法进行了标准化。因此,优化的参数可以很容易地转移到结晶尺度制备,而无需进一步的主要筛选和优化。
该协议的目的是优化制备稳定、均匀的GPCR-迷你G蛋白复合物,通过X射线晶体学进行蒸汽扩散结晶和结构测定。该协议集成了一套方法,以定性地评估洗涤剂和脱糖在制备红糖酶-迷你Go复合物过程中的影响。在洗涤剂中纯化的辛氏醇(C8G)20、21、22和C9G20,21,22 23、24,24时,在非活性状态和光活状态与传感器肽结合和未结合的光活性肽已经结晶。由于在C8G和C9G中纯化的红蛋白-mini-Go复合物没有产生晶体(数据未显示),我们使用所述策略探索了更广泛的其他洗涤剂(图1)。通过利用红蛋白的光敏度,我们很可能遵循280nm以外的波长视网膜的重组。在UV-VIS光谱和SEC中,我们在380nm或488nm处检测到视网膜。然而,大多数膜蛋白在纯化过程中没有如此方便的色光来遵循功能。其他选择是添加可检测光的色光或使用放射性配体结合和热移测定25来检测配体。
罗多普辛的分子量为40 kDa。由于它结合的洗涤剂质量,它在SEC上的明显分子量约为120 kDa。因此,在 SEC 上不容易检测到微型 Go (24 kDa) 的结合,这并不奇怪,因为这需要分化表面质量为 120 kDa 和 144 kDa 的蛋白质。因此,SDS-PAGE对SEC分数进行分析,以确认样品纯度和复杂地层。即使 SEC 配置文件在复杂地层上有明显变化,仍建议执行 SDS-PAGE 分析,以使用正确的结合伙伴(而不是其他共纯纯蛋白污染物)确认复杂形成。
多面胶和微型Go均以毫克量纯化,允许对复合物使用低灵敏度检测,如在SEC和SDS-PAGE凝胶的Commassie蓝色染色过程中吸收UV-VIS。在样品有限的情况下,应使用更灵敏的检测,例如配备荧光检测器的LC净化器,用于跟踪来自蛋白质的色氨酸信号(280 nm 激发,350 nm 发射)和 SDS-PAGE 凝胶的银染色。另一种方法是将荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP)与感兴趣的蛋白质融合,这种蛋白质即使在蛋白质表达26期间也能检测,但在结晶前也应将其去除。
必须确保纯化蛋白也不含可变PTM引起的异质性。在此描述的案例中,在SDS-PAGE凝胶上观察到的两个红豆蛋白酶种群被定性为有一两种N-甘油。蛋白质的可变修饰可能会阻止衍射晶体的形成,因此我们去糖化的红蛋白酶。endogcosidase Endo F1是最有效的endogcosidas酶测试和治疗导致单一种类的未糖化受体,而PNGase F只部分去除红豆素上的甘油,导致红豆素完全无糖化或与一个N-甘油的混合物。未经脱糖酶处理的红豆蛋白已成功结晶3,3,27,28,,28和红糖酶Asn15上的N-甘油是重要的形成晶体接触在这些情况下。在多糖酶-迷你Go的情况下,有必要通过Endo F1去除N-甘油以获得晶体。在结晶之前,没有去糖化蛋白质的标准化规则,但当蛋白质在广泛的结晶试验后无法结晶时,应考虑去除异质PTM。
此处描述的数据和方法引导我们选择 OGNG 作为多普辛-迷你Go复合物结晶的首选洗涤剂,因为它的云母体积小,能够稳定复合物。我们还使用 Endo F1 来确保纯化的红蛋白是一种同质物种。晶体随后被获得,我们确定晶体结构为+3.1×4,这只是4GPCR_G蛋白信号复合体14,29,29的第三个晶体结构。
对于与伴侣蛋白结合和没有伴侣蛋白的膜蛋白,它们应被视为两种不同的蛋白质。不同功能状态下的蛋白质具有不同的一致性,并且处于不同的能量水平。因此,建议优化每个功能状态的准备协议,因为非活动状态的参数可能无法完全传输到激活状态。此外,更何况蛋白质属性的变化复杂的结合伙伴蛋白。该协议采用标准化的方法制备结晶样品,以制备不同洗涤剂中的非活性膜蛋白,然后进行蛋白质活化和复杂形成,并表征蛋白质质量。因此,这种协议可以很容易地推广到其他膜蛋白及其复合物,进行结构研究,进行细微的修改。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢格布哈德·舍尔特勒博士对这个项目的长期支持,罗杰·道森博士和霍夫曼·拉罗什博士在细胞培养方面给予的支持。这项工作由瑞士国家科学基金会赞助(向GFXS提供210030*153145和310030B_173335),欧洲研究理事会(EMPSI,339995)和医学研究委员会(MRC U105197215)向CGT提供资金。FP通过国家分子超快科学和技术研究中心(NCCR MUST)和ETH飞秒和Atto秒科学和技术(ETH FAST)项目确认苏黎世ETH。FP、JM、AB 和 CJT 承认保罗·舍勒研究所提供的长期财政支持。
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |