Questo rapporto descrive lo screening di diversi detergenti per la preparazione del GPCR visivo, rhodopsin, e il suo complesso con mini-Go. Sono dimostrati metodi biochimici che caratterizzano la qualità del complesso nelle diverse fasi durante la purificazione. Questo protocollo può essere generalizzato ad altri complessi proteici della membrana per i loro futuri studi strutturali.
La chiave per determinare le strutture cristalline dei complessi proteici della membrana è la qualità del campione prima della cristallizzazione. In particolare, la scelta del detergente è fondamentale, perché influisce sia sulla stabilità che sulla monodispersità del complesso. Recentemente abbiamo determinato la struttura cristallina di uno stato attivo di rodopsina bovina accoppiata ad una proteina G ingegnerizzata, mini-Go, a risoluzione 3,1. Qui, abbiamo descritto in dettaglio la procedura per ottimizzare la preparazione del complesso rhodopsin-mini-Go. La rodopsina a stato scuro è stata preparata in detersivi classici e di glicole neopentyl (NPG), seguiti da una formazione complessa con mini-Go sotto esposizione alla luce. La stabilità della rodopsina è stata valutata dalla spettroscopia visibile all’ultravioletto (UV-VIS), che monitora la ricostituzione in rodopsina del ligando sensibile alla luce, 9-cis retina. La cromatografia automatizzata ad esclusione di dimensioni (SEC) è stata utilizzata per caratterizzare la monodisità della rodopsina e il rhodopsin–mini-Go complesso. L’elettroforesi SDS-polyacritilmide (SDS-PAGE) ha confermato la formazione del complesso identificando un rapporto molare 1:1 tra rodopsina e mini-Go dopo aver macchiato il gel con Coomassie blue. Dopo aver convalidato in modo incrociato tutti questi dati analitici, abbiamo eliminato i detergenti inadatti e abbiamo continuato con il miglior detergente candidato per la preparazione e la cristallizzazione su larga scala. Un ulteriore problema è sorto dall’eterogeneità della N-glycosylation. La rodopsina espressa eterologamente è stata osservata su SDS-PAGE per avere due diverse popolazioni N-glicosylalate, che probabilmente avrebbero ostacolato la cristallogenesi. Pertanto, sono stati testati diversi enzimi deglycosylation e l’endoglycosidase F1 (EndoF1) ha prodotto rodopsina con una singola specie di N-glycosylation. Con questa pipeline strategica per caratterizzare la qualità delle proteine, la preparazione delcomplesso rhodopsin-mini-G o è stata ottimizzata per fornire la struttura cristallina. Questa era solo la terza struttura cristallina di un complesso di segnalazione di proteine GPCR-G. Questo approccio può anche essere generalizzato per altre proteine della membrana e per i loro complessi per facilitare la preparazione del campione e la determinazione della struttura.
Determinare le strutture cristalline delle proteine della membrana e dei loro complessi è sempre stato difficile a causa delle difficoltà nell’ottenere cristalli ben diffracting. A differenza delle proteine solubili, le proteine integrali della membrana comprendono un nucleo idrofobico che attraversa la membrana cellulare. Per rimuovere le proteine della membrana dalla membrana cellulare in un tampone acquoso, i detergenti devono essere utilizzati per formare una micelle detergente-proteina, sostituendo così i lipidi intorno al nucleo idrofobico delle proteine della membrana. La stabilità, l’attività e l’integrità delle proteine della membrana dipendono direttamente dalle proprietà chimiche e strutturali del detergente1e le proprietà del detergente determinano anche le dimensioni della micelle. Una grande micelle detergente può occlare le superfici idrofili di una piccola proteina membrana, impedendo così la cristallizzazione a causa della mancanza di contatti cristallini quando si utilizza il metodo di diffusione del vapore. Una piccola micelle detergente è vantaggiosa per la cristallografia, ma i detergenti a catena corta sono di solito più dure e quindi portano alla destabilizzazione e all’aggregazione della proteina della membrana. Pertanto, prima della cristallizzazione, è indispensabile una procedura aggiuntiva di screening del detersivo, in genere mirata a detergenti più corti che mantengono ancora la stabilità proteica.
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono proteine della membrana integrali contenenti sette eliche transmembrane. I GP esistono in due stati principali, o uno stato inattivo stabilizzato da agonisti inversi o antagonisti, o uno stato attivo legato ad un agonista e stabilizzato da una proteina G, anche se è probabile che tra questi due estremi esistano una moltitudine di sottostati. La determinazione della struttura dei GP si è inizialmente concentrata sugli stati inattivi legati agli agonisti inversi e agli antagonisti a causa della loro maggiore stabilità rispetto agli stati attivi2. Quando i GPCR sono attivati su un legame agonista, i recettori sono altamente dinamici e una fessura si forma transitoriamente sul volto citoplasmatico del recettore per l’accoppiamento proteico G. Si pensa che questo dinamismo sia il motivo per cui i GPCR legati agli agonisti sono spesso più instabili dello stato inattivo. Pertanto, diventa essenziale vagliare i detergenti appropriati per lo stato conformazionale del recettore in fase di studio, perché è probabile che saranno necessari detergenti più lievi per studiare uno stato attivo rispetto a uno stato inattivo.
In questo rapporto, utilizziamo il GPCR visivo, il rodopsina bovino3e il suo complesso con la proteina mini-Go 4,5 per gli esperimenti di screening del detersivo, che rappresentano rispettivamente lo stato inattivo e attivo. Lo screening del detersivo si è concentrato sui detergenti classici per maltoside e glucosio e sui detergenti alnetilo glicole (NPG). In questo contesto, un detergente classico è costruito da un gruppo di teste di zucchero e una catena alchino, mentre i detergenti di tipo NPG contengono due detergenti classici identici che vengono fusi da un carbonio quaternario all’interfaccia tra gli zuccheri e le catene alchil6,7,8.
Un flusso di lavoro sperimentale è stato progettato a partire dalla purificazione della rodopsina in diversi detergenti, seguita dalla formazione delcomplesso rodopessi-mini-G o e termina con la caratterizzazione del complesso utilizzando diversi metodi (Figura 1). Per lo stato inattivo della rodopsina, la ricostituzione del ligando sensibile alla luce 9-cis retina è stata monitorata dalla spettroscopia a visibile ultravioletta (UV-VIS). Lo spettro rivela lo stato fisicochimico della retina ed è indicativo del suo ambiente nella tasca legante retiico-retico della rodopsina. La cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) è stata impiegata per valutare la monodispersità della rodopina purificata e la formazione del complesso rhodopsin–mini-Go. Poiché SEC differenzia le molecole proteiche per dimensioni e forma, la popolazione proteica aggregata può essere identificata man mano che si elilutano nel volume vuoto. Per confermare una formazione complessa, le frazioni della SEC sono state valutate dall’elettroforesi gel (SDS-PAGE) sodio dodecyl-polyacrilia per confermare la presenza sia di rodopsina che di mini-Go.
Un altro fattore che deve essere considerato sono le modifiche post-traduzionali (PTM) sulle proteine della membrana. PTM come l’N-glicosilazione sono spesso osservati sulle proteine della membrana eucabolica prodotte nei sistemi di espressione delle cellule di mammiferi e insetti. Un ceppo nilicoso limitato delle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) è stato sviluppato dalla delezione della codifica genica N-acetylglucosinyltransferasas I (GnTI), con conseguente omogeneo N-glicosylation di GlcNAc2Man5 presso il sito di consenso Asn-X-Ser/Thr. Anche se N-glicosilazione può essere prevenuta mutando un residuo di aminoacido nel sito di consenso, questo può anche alterare la funzione della proteina o l’efficienza del ripiegamento. Nella rodopsina bovina, la mutazione del residuo N-glicosilato Asn15 porta a un ripiegamento errato e alla riduzione dell’attivazione della proteina G9,10. La rodopsina utilizzata in questa relazione è stata espressa nella linea cellulare HEK 293 GnTI-carente. Tuttavia, SDS-PAGE ha mostrato la presenza di due specie di rodopsina. Questa eterogeneità potrebbe impedire la formazione di cristalli e quindi è stato testato il deglycosylation usando peptidi-N-glycosidase F (PNGase F) e endoglycosidase F1 (Endo F1). Il prodotto declisco è stato caratterizzato da SDS-PAGE e spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS) per identificare il livello di glicosilazione e la sua omogeneità.
Il successo nella cristallizzazione delle proteine si basa fortemente sul campione proteico, in particolare le proteine della membrana e i loro complessi a causa della complicazione causata dai detergenti. Questo rapporto dimostra lo screening del detersivo e la valutazione della qualità del campione per i complessi di segnalazione delle proteine GPCR-mini-G. Una varietà di metodi sono stati ampiamente utilizzati per studiare la proprietà biochimica delle proteine della membrana, ad esempio, l’analisi della termostabilità utilizzando coloranti fluorescenti16,17, analisi vincolante per rilevare la formazione complessa misurando il cambiamento nel segnale di fluorescenza del metaforo18 o il trasferimento di energia di risonanza con biosensori19. Tuttavia, gli ambienti chimici utilizzati in questi metodi sono molto diversi da quelli per la preparazione di un campione di cristallizzazione, o le proteine sono a una concentrazione più bassa di mille volte per la misurazione basata sulla fluorescenza, o le proteine sono incorporate nei bistrati lipidici o in una condizione detergente fissa. In questo protocollo, i metodi utilizzati sono standardizzati anche nella preparazione di campioni su larga scala prima della cristallizzazione. Pertanto, i parametri ottimizzati possono essere facilmente trasferiti per la preparazione in scala di cristallizzazione senza ulteriori ulteriori controlli e ottimizzazioni importanti.
L’obiettivo di questo protocollo è ottimizzare la preparazione di un complesso proteico stabile e omogeneo GPCR-mini-G per la cristallizzazione del vapore e la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. Il protocollo integra una serie di metodi per valutare qualitativamente l’impatto del detersivo e della deglycoslation durante la preparazione del rodopsino-mini-Go complesso. Rodopsina in stato inattivo e stato attivato dalla luce legato con e senza il peptide trasducina è stato cristallizzato quando purificato nei detergenti octil glucosio (C8G)20,21,22 e C9G23,24. Come il rhodopsin-mini-Go complesso purificato in C8G e C9G non produceva cristalli (dati non mostrati), abbiamo poi esplorato una più ampia gamma di altri detergenti utilizzando la strategia descritta (Figura 1). Sfruttando la sensibilità alla luce della rodopsina, potremmo molto seguire la ricostituzione della retina a lunghezze d’onda diverse da 280 nm. Sia nella spettroscopia UV-VIS che nella SEC, abbiamo rilevato una retina a 380 nm o 488 nm. Tuttavia, la maggior parte delle proteine della membrana non hanno un cromoforo così conveniente per seguire la funzionalità durante la purificazione. Altre opzioni potrebbero essere di rendere rilevabile un ligando aggiungendo un cromoforo rilevabile nella luce o utilizzando i sottosaggi di legame radioligando e termico25 .
La rodopsina ha un peso molecolare di 40 kDa. A causa della massa di detersivo che lega, il suo peso molecolare apparente sulla SEC è di circa 120 kDa. Non sorprende quindi che il legame di mini-Go (24 kDa) non sia stato facilmente rilevato sulla SEC, in quanto ciò richiederebbe la differenziazione delle proteine con masse apparenti di 120 kDa e 144 kDa. L’analisi delle frazioni SEC da parte di SDS-PAGE è stata quindi utilizzata per confermare la purezza del campione e la formazione complessa. Anche se i profili SEC mostrano un netto spostamento sulla formazione complessa, si raccomanda comunque di eseguire l’analisi SDS-PAGE per confermare la formazione complessa con partner di legame corretti piuttosto che altri contaminanti proteici compurificati.
Sia il rodopsino che il mini-Go sono stati purificati in quantità di milligrammo, il che ha permesso l’uso di un rilevamento a bassa sensibilità dei complessi, come l’assorbimento UV-VIS durante la statterina DI SEC e Commassie Blue dei gel SDS-PAGE. Quando i campioni sono limitati, si dovrebbe utilizzare un rilevamento più sensibile, come un depuratore LC dotato di un rilevatore di fluorescenza per tracciare i segnali di orptofano dalla proteina (eccitazione 280 nm, 350 nm di emissione) e colorazione argento per i gel SDS-PAGE. Un altro approccio potrebbe essere quello di fondere una proteina fluorescente, come la proteina a fluorescenza verde (GFP) alla proteina di interesse, che consentirebbe anche il rilevamento anche durante l’espressione proteica26, ma dovrebbe essere rimossa prima della cristallizzazione.
È essenziale garantire che la proteina purificata sia anche priva di eterogeneità derivanti da PPM variabili. Nel caso qui descritto, le due popolazioni di rodopsina osservate sui gel SDS-PAGE sono state caratterizzate come aventi uno o due N-glicani. La modifica variabile di una proteina potrebbe impedire la formazione di cristalli ben diffranti, quindi abbiamo deglycosylated rhodopsin. L’endoglycosidase Endo F1 è stato l’effetto più efficace che l’endogidasi è stato testato e il trattamento ha portato a una singola specie di recettore unglycosylated, mentre PNGase F ha rimosso solo parzialmente i glicani sulla rodopsina e ha provocato una miscela di rodopsina completamente poco glycosylated o con un N-glycan è rimasto. Il rodopsina senza deglycosylase è stato cristallizzato con successo3,27,28, e il N-glycan su rodopsina Asn15 è importante formare il contatto cristallo in quei casi. Nel caso di rodopina-mini-Go, è necessario rimuovere N-glicani da Endo F1 per ottenere cristalli. Non esiste una regola standardizzata per deglilare le proteine di interesse prima della cristallizzazione, ma la rimozione delle PTM heteenose dovrebbe essere considerata quando le proteine non riescono a cristallizzarsi dopo lunghe prove di cristallizzazione.
I dati e la metodologia qui descritti ci hanno guidato a scegliere OGNG come il detergente preferito per la cristallizzazione del rodopsino-mini-Go complesso a causa delle sue piccole dimensioni micelle e della sua capacità di stabilizzare il complesso. Abbiamo anche usato Endo F1 per garantire che la rodopsina purificata fosse una specie omogenea. I cristalli sono stati successivamente ottenuti e abbiamo determinato la struttura cristallina a 3,1 x4dollari, che era solo la terza struttura cristallina di un complesso di segnalazione proteica GPCR-G14,29.
Per le proteine della membrana legate e senza una proteina partner, dovrebbero essere considerate come due proteine diverse. Una proteina in diversi stati funzionali ha conformazioni diverse ed è a diversi livelli di energia. Pertanto, si consiglia di ottimizzare il protocollo di preparazione per ogni stato funzionale in quanto il parametro per lo stato inattivo potrebbe non essere completamente trasferibile allo stato attivato. Inoltre, per non parlare del cambiamento nella proprietà della proteina complicato legando una proteina partner. Il protocollo utilizza metodi standardizzati per preparare un campione di cristallizzazione per preparare la proteina della membrana inattiva in diversi detergenti, seguita dall’attivazione delle proteine e dalla formazione complessa, e per caratterizzare la qualità delle proteine. Pertanto, questo protocollo può essere facilmente generalizzato ad altre proteine della membrana e ai loro complessi per studi strutturali con modifica minore.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Professor Gebhard F. X. Schertler per il suo sostegno a lungo termine in questo progetto, dr. Roger J.P. Dawson e Hoffmann La Roche per il supporto nella coltura cellulare. Questo lavoro è stato sponsorizzato dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (concede 210030_153145 e 310030B_173335 a GFXS) e dal finanziamento alla CGT da parte del Consiglio europeo della ricerca (EMPSI, 339995) e del Consiglio per la ricerca medica (MRC U105197215). FP riconosce il Pfth srl attraverso il Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) e i programmi ETH Femtosecond e Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB e CJT riconoscono il sostegno finanziario a lungo termine dell’Istituto Paul Scherrer.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |