Este relatório descreve a triagem de diferentes detergentes para a preparação do GPCR visual, a rodopsina e seu complexo com mini-Go. São demonstrados métodos bioquímicos caracterizando a qualidade do complexo em diferentes estágios durante a purificação. Este protocolo pode ser generalizado para outros complexos proteicos de membrana para seus futuros estudos estruturais.
A chave para determinar estruturas cristalinas de complexos proteicos de membrana é a qualidade da amostra antes da cristalização. Em particular, a escolha do detergente é fundamental, pois afeta tanto a estabilidade quanto a monodispersão do complexo. Recentemente determinamos a estrutura cristalina de um estado ativo de rodopsina bovina acoplada a uma proteína G projetada, mini-Go,a 3.1 Å resolução. Aqui, detalhamos o procedimento para otimizar a preparação do complexo rhodopsin-mini-Go. A roddopsina de estado escuro foi preparada em detergentes clássicos e neopentyl glicol (NPG), seguido por formação complexa com mini-Go exposição à luz. A estabilidade da rodopsina foi avaliada pela espectroscopia ultravioleta visível (UV-VIS), que monitora a reconstituição em rodopsina do ligante sensível à luz, 9-cis retinal. A cromatografia automatizada de exclusão de tamanho (SEC) foi usada para caracterizar a monodispersidade da roddopsina e do complexo rhodopsin-mini-Go. A eletroforese SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) confirmou a formação do complexo identificando uma razão molar 1:1 entre a rodopsina e a mini-Go após a coloração do gel com azul Coomassie. Depois de cruzar todos esses dados analíticos, eliminamos detergentes inadequados e continuamos com o melhor detergente candidato para preparação e cristalização em larga escala. Um problema adicional surgiu da heterogeneidade da N-glicosilona. A roddopsina heterosamente expressa foi observada na SDS-PAGE para ter duas populações diferentes de N-glicosilada, o que provavelmente teria dificultado a cristalogênese. Portanto, diferentes enzimas de deglicosilação foram testadas, e a endoglicose F1 (EndoF1) produziu rodopsina com uma única espécie de N-glicosilação. Com este pipeline estratégico para caracterizar a qualidade da proteína, a preparação docomplexo rhodopsin-mini-G foi otimizada para entregar a estrutura cristalina. Esta foi apenas a terceira estrutura cristalina de um complexo de sinalização proteica GPCR-G. Essa abordagem também pode ser generalizada para outras proteínas de membrana e seus complexos para facilitar a preparação da amostra e a determinação da estrutura.
Determinar estruturas cristalinas de proteínas de membrana e seus complexos sempre foi desafiador devido a dificuldades na obtenção de cristais bem difradores. Em contraste com as proteínas solúveis, as proteínas de membrana integral compreendem um núcleo hidrofóbico que abrange a membrana celular. Para remover proteínas de membrana da membrana celular em tampão aquoso, os detergentes devem ser usados para formar uma micela detergente-proteína, substituindo assim os lipídios ao redor do núcleo hidrofóbico das proteínas de membrana. Estabilidade, atividade e integridade das proteínas de membrana dependem diretamente das propriedades químicas e estruturais do detergente1, e as propriedades do detergente também determinam o tamanho da micela. Uma grande micela detergente pode ocluir as superfícies hidrofílicas de uma pequena proteína de membrana, impedindo assim a cristalização devido à falta de contatos de cristal ao usar o método de difusão de vapor. Uma pequena micela detergente é vantajosa para a cristalografia, mas detergentes de cadeia curta são geralmente mais resistentes e, portanto, levam à desestabilização e agregação da proteína da membrana. Portanto, antes da cristalização, um procedimento adicional de triagem de detergentes é indispensável, tipicamente visando detergentes mais curtos que ainda mantêm a estabilidade proteica.
Os receptores g acoplados à proteína (GPCRs) são proteínas de membrana integral contendo sete helicos transmembranas. Os GPCRs existem em dois estados principais, seja um estado inativo estabilizado por agonistas inversos ou antagonistas, ou um estado ativo ligado a um agonista e estabilizado por uma proteína G, embora seja provável que existam uma multidão de subestados entre esses dois extremos. A determinação estrutural dos GPCRs inicialmente se concentrou em estados inativos ligados a agonistas inversos e antagonistas devido à sua maior estabilidade do que os estados ativos2. Quando os GPCRs são ativados sobre a ligação agonista, os receptores são altamente dinâmicos, e uma fissura se forma transitoriamente na face citoplasmática do receptor para acoplamento de proteína G. Acredita-se que esse dinamismo é o motivo pelo qual os GPCRs agonistas são muitas vezes mais instáveis do que o estado inativo. Portanto, torna-se essencial a triagem de detergentes apropriados para o estado conformacional do receptor em estudo, pois é provável que detergentes mais leves sejam necessários para estudar um estado ativo em comparação com um estado inativo.
Neste relatório, utilizamos o GPCR visual, a rodopsina bovina3, e seu complexo com mini-Go proteína4,5 para os experimentos de triagem de detergentes, representando o estado inativo e o estado ativo, respectivamente. A triagem de detergentes concentrou-se nos detergentes clássicos alquil maltoside e glucoside e nos detergentes neopentyl glicol (NPG). Neste contexto, um detergente clássico é construído a partir de um grupo de cabeça de açúcar e uma cadeia alquil, enquanto os detergentes do tipo NPG contém dois detergentes clássicos idênticos que são fundidos por um carbono quaternário na interface entre os açúcares e as cadeias alquilas6,7,8.
Um fluxo de trabalho experimental foi projetado a partir da purificação da rodopsina em diferentes detergentes, seguido pela formação do complexo rhodopsin-mini-Go e terminando com a caracterização do complexo utilizando vários métodos (Figura 1). Para o estado inativo da rodopsina, a reconstituição do lige sensível à luz 9-cis foi monitorada por espectroscopia ultravioleta visível (UV-VIS). O espectro revela o estado físico-químico da retina e é indicativo de seu ambiente no bolsão de ligação da retina de rodopsina. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi empregada para avaliar a monodispersidade da roddopsina purificada, bem como a formação do complexo rhodopsin-mini-Go. À medida que a SEC diferencia as moléculas de proteínas pelo seu tamanho e forma, a população de proteínas agregadas pode ser identificada à medida que elas eluiam no volume vazio. Para confirmar a formação complexa, as frações da SEC foram avaliadas por eletroforese de gel de sulfato de dodecil-poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar a presença de rhodopsin e mini-Go.
Outro fator que precisa ser considerado são as modificações pós-translacionais (PTM) nas proteínas da membrana. PtM como n-glicosilação são freqüentemente observados em proteínas de membrana eucariótica produzidas em sistemas de expressão de células de mamíferos e insetos. Uma cepa limitada de N-glicosilação das células do rim embrionário humano 293 (HEK293) foi desenvolvida pela exclusão da codificação genética N-acetilglucosaminyltransferase I (GnTI), resultando em N-glicosilação homogênea por GlcNAc2Homem5 no local de consenso Asn-X-Ser/Thr. Embora a n-glicosilação possa ser prevenida pela mutação de um resíduo de aminoácidos no local de consenso, isso também pode alterar a função da proteína ou a eficiência da dobra. Na rodopsina bovina, a mutação do resíduo N-glicosilado Asn15 leva à dobra incorreta e à ativação reduzida da proteína G9,10. A rodopsina utilizada neste relatório foi expressa na linha celular hek 293 gnti-deficiente. No entanto, a SDS-PAGE mostrou a presença de duas espécies de rodopsina. Essa heterogeneidade poderia prevenir a formação de cristais e, portanto, a deglicosidação utilizando peptídeo-N-glicosidase F (PNGase F) e endoglicolicosidase F1 (Endo F1) foi testada. O produto deglicosilado foi caracterizado pela Espectrometria sds-PAGE e cromatografia líquida de massa (LC-MS) para identificar o nível de glicosia e sua homogeneidade.
O sucesso na cristalização proteica depende fortemente da amostra de proteínas, especialmente proteínas de membrana e seus complexos devido à complicação causada pelos detergentes. Este relatório demonstra a triagem de detergentes e a avaliação da qualidade da amostra para os complexos de sinalização proteica GPCR-mini-G. Uma variedade de métodos tem sido amplamente utilizada para estudar a propriedade bioquímica de proteínas de membrana, por exemplo, ensaio de termoestabilidade usando corantes fluorescentes16,17, ensaio de ligação para detectar formação complexa medindo a mudança no sinal de fluorescência triptofano18 ou a transferência de energia de ressonância com biosensores19. No entanto, os ambientes químicos utilizados nesses métodos são bastante diferentes daqueles para preparar uma amostra de cristalização, ou as proteínas estão em uma concentração mil vezes menor para medição baseada em fluorescência, ou proteínas são incorporadas em bicamadas lipídicas ou em uma condição de detergente fixo. Neste protocolo, os métodos utilizados também são padronizados na preparação da amostra em larga escala antes da cristalização. Portanto, os parâmetros otimizados podem ser facilmente transferidos para a preparação em escala de cristalização sem maior esceleção e otimização.
O objetivo deste protocolo é otimizar a preparação de um complexo proteico GPCR-mini-G estável e homogêneo para cristalização da difusão de vapor e determinação da estrutura por cristalografia de raios-X. O protocolo integra um conjunto de métodos para avaliar qualitativamente o impacto do detergente e da deglicosiladurante durante a preparação do complexo rhodopsin-mini-Go. A rodopsina em estado inativo e estado ativado pela luz ligado com e sem o peptídeo transducina foi cristalizada quando purificada nos detergentes octyl glucoside (C8G)20,21,22 e C9G23,24. Como o complexo rhodopsin-mini-Go purificado em C8G e C9G não produziu cristais (dados não mostrados), então exploramos uma gama mais ampla de outros detergentes usando a estratégia descrita (Figura 1). Aproveitando a sensibilidade à luz da rodopsina, poderíamos muito bem acompanhar a reconstituição da retina em comprimentos de onda diferentes de 280 nm. Tanto na espectroscopia UV-VIS quanto na SEC, detectamos a retina em 380 nm ou 488 nm. No entanto, a maioria das proteínas de membrana não tem um cromóforo tão conveniente para seguir a funcionalidade durante a purificação. Outras opções seriam tornar um liganddetectável adicionando um cromóforo detectável à luz ou usando ensaios de radioligação e mudança térmica25.
Rhodopsin tem um peso molecular de 40 kDa. Devido à massa de detergente que liga, seu peso molecular aparente na SEC é de cerca de 120 kDa. Não é surpresa, portanto, que a ligação de mini-Go (24 kDa) não tenha sido facilmente detectada na SEC, pois isso exigiria diferenciação de proteínas com massas aparentes de 120 kDa e 144 kDa. A análise das frações sec por SDS-PAGE foi, portanto, utilizada para confirmar a pureza da amostra e a formação complexa. Mesmo que os perfis da SEC mostrem uma clara mudança na formação complexa, ainda é recomendável realizar a análise sds-PAGE para confirmar a formação complexa com parceiros de ligação corretos em vez de outros contaminantes proteicos co-purificados.
Tanto a rodopsina quanto a mini-Go foram purificadas em quantidades de miligramas, o que permitiu o uso de detecção de baixa sensibilidade dos complexos, como a absorção uv-VIS durante a SEC e a coloração azul commassie de géis SDS-PAGE. Quando as amostras são limitadas, deve-se usar uma detecção mais sensível, como um purificador LC equipado com um detector de fluorescência para rastrear sinais de triptofano da proteína (emissão de 280 nm, emissão de 350 nm) e coloração de prata para géis SDS-PAGE. Outra abordagem seria fundir uma proteína fluorescente, como a proteína de fluorescência verde (GFP) à proteína de interesse, que também permitiria a detecção mesmo durante a expressão proteica26, mas deve ser removida antes da cristalização.
É essencial garantir que a proteína purificada também esteja livre da heterogeneidade decorrente de PTMs variáveis. No caso descrito aqui, as duas populações de rodopsina observadas em géis SDS-PAGE foram caracterizadas como tendo um ou dois N-glicanos. A modificação variável de uma proteína potencialmente impediria a formação de cristais bem difradores, por isso deglicoizamos a roddopsina. A endoglicemia Endo F1 foi o maior efeito testado e o tratamento levou a uma única espécie de receptor não aconchegante, enquanto PNGase F apenas removeu parcialmente os glicanos na rodopsina e resultou em uma mistura de rodopsina totalmente não aconchegante ou com um N-glicano permaneceu. A rhodopsina sem tratamento de deglicosilase foi cristalizada com sucesso3,27,28, e o N-glicano na rhodopsin Asn15 é importante para formar contato cristalino nesses casos. No caso da rhodopsina-mini-Go,é necessário remover n-glicanos por Endo F1 para obter cristais. Não há uma regra padronizada para deglicosilizar proteínas de interesse antes da cristalização, mas a remoção de PTMs heterogêneos deve ser considerada quando as proteínas não se cristalizam após extensos ensaios de cristalização.
Os dados e a metodologia descritos aqui nos guiaram a escolher o OGNG como o detergente preferido para a cristalização do complexo rhodopsin-mini-Go devido ao seu pequeno tamanho de micela e sua capacidade de estabilizar o complexo. Também usamos o Endo F1 para garantir que a rodopsina purificada fosse uma espécie homogênea. Os cristais foram posteriormente obtidos e determinamos a estrutura cristalina para ~3.1 Å4, que era apenas a terceira estrutura cristalina de um complexo de sinalização proteica GPCR-G14,29.
Para proteínas de membrana ligadas com e sem proteína parceira, elas devem ser consideradas como duas proteínas diferentes. Uma proteína em diferentes estados funcionais tem diferentes conformações e está em diferentes níveis de energia. Portanto, recomenda-se otimizar o protocolo de preparação para cada estado funcional, pois o parâmetro para o estado inativo pode não ser totalmente transferível para o estado ativado. Além disso, sem mencionar a mudança na propriedade proteica complicada pela vinculação de uma proteína parceira. O protocolo utiliza métodos padronizados para o preparo de uma amostra de cristalização para preparar proteína de membrana inativa em diferentes detergentes, seguido de ativação proteica e formação complexa, e para caracterizar a qualidade da proteína. Assim, este protocolo pode ser facilmente generalizado para outras proteínas de membrana e seus complexos para estudos estruturais com pequenas modificações.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler por seu apoio de longo prazo neste projeto, Dr. Roger J.P. Dawson e Hoffmann La Roche pelo apoio na cultura celular. Este trabalho foi patrocinado pela Swiss National Science Foundation (bolsas 210030_153145 e 310030B_173335 ao GFXS), e financiamento para a CGT do Conselho Europeu de Pesquisa (EMPSI, 339995) e do Conselho de Pesquisa Médica (MRC U105197215). A FP reconhece o ETH Zürich através do Centro Nacional de Competência em Pesquisa Molecular Ultrarfast Ciência e Tecnologia (NCCR MUST) e dos programas ETH Femtosecond e Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB e CJT reconhecem o apoio financeiro de longo prazo do Instituto Paul Scherrer.
1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
C9G | Anatrace | N324 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
DDM | Anatrace | D310 | |
DM | Anatrace | D322 | |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | – | |
LMNG | Anatrace | NG310 | |
Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
OGNG | Anatrace | NG311 | |
PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | – |