Summary
Her beskriver vi metoder ved hjælp af time-lapse, fase-kontrast mikroskopi til billedmus hjemmehørende peritoneal makrofager i en kemotaktisk supplement C5a gradient. Protokollerne kan udvides til andre immunceller.
Abstract
Kemotaxis er receptor-medieret vejledning af celler langs en kemisk gradient, mens chemokineis er stimulering af tilfældig cellemotilitet af et kemikalie. Chemokinesis og kemotaxis er afgørende for mobilisering og indsættelse af immunceller. For eksempel, chemokines (kemotaktiske cytokiner) kan hurtigt rekruttere cirkulerende neutrofiler og monocytter til ekstravaskulære steder af inflammation. Kemoattractant receptorer tilhører den store familie af G protein-koblede receptorer. Hvordan kemoattractant (dvs. ligand) gradienter direkte celle migration via G protein-koblet receptor signalering er endnu ikke fuldt forstået. Inden for immunologi, neutrofiler er populære modelceller til at studere kemotaxis in vitro. Her beskriver vi en real-time to-dimensionelle (2D) chemotaxis assay skræddersyet til mus hjemmehørende makrofager, som traditionelt har været vanskeligere at studere. Makrofager bevæger sig i et langsomt tempo på ~ 1 μm/min på en 2D-overflade og er mindre velegnede til punktkildemigrationsanalyser (f.eks. migration mod spidsen af en mikropipette fyldt med kemoattractant) end neutrofiler eller Dictyostelium discoideum, som bevæger sig hurtigere. Udbredte Transwell-analyser er nyttige til at studere de forskellige stoffers kemotaktiske aktivitet, men giver ikke oplysninger om cellemorfologi, hastighed eller kemotaktisk navigation. Her beskriver vi en time-lapse mikroskopi-baseret makrofag chemotaxis assay, der giver mulighed for kvantificering af cellehastighed og kemotaktisk effektivitet og giver en platform til at afgrænse transducers, signal veje, og effektorer af kemotaxis.
Introduction
Immunceller vandrer typisk singly på en 2D-overflade i en amøbe mode1,2,som indebærer gentagne cyklusser af fremspring af fronten, integrin-medieret celle vedhæftning, og tilbagetrækning af den bageste. Et forudsætningstrin er cellepolarisering, hvor celler danner for- og bagende3. Kemotaxis starter med påvisning af kemoattractanter ved G-protein-koblede receptorer og et komplekst signalnetværk medieret af membranforankrede heterotrimære G-proteiner og små monomeriske G-proteiner samt fosfolipid-bundet guanine nukleotid udvekslingsfaktorer (GEF'er)4,5. Aktivering af Rho GTPases af Cdc42 og Rac underfamilier fremkalde fremspring på forsiden6 og medlemmer af Rho underfamilie, især RhoA, aktivere sammentrækning af den bageste5,7. I et tredimensionelt (3D) miljø er integriner i vid udstrækning overflødige for leukocytmigration, og RhoA bliver vigtigere for at presse celler gennem smalle passager8, mens Cdc42- eller Rac-induceret Arp2/3 aktivering fortsat er vigtig for kemotaktiskstyring9,10.
Immunceller kan stå over for forskellige kemoattractants, især i indstillingerne for vævsskade, patogen invasion, og betændelse. De endogene chemoattractants udtrykt på fagocytter supplerer C3a og C5a, er hurtigt genereret ved aktivering af komplemenlikat, og er anerkendt ved supplement C3a og C5a receptorer. Tilsvarende nekrotiske celler rekruttere fagocytter via formyl peptid receptorer, som anerkender mitokondrier-afledt samt bakterier-afledte formyl peptider11. Immunceller udtrykker også G protein-koblede receptorer for chemokiner, en stor familie af kemoattractant peptider involveret i reguleringen af immuncellehandel under både homøostase og inflammation. Chemokiner klassificeres i fire grupper afhængigt af afstanden mellem de to første cystein (C) restkoncentrationer: C, CC, CXC og CX3C cytokiner, hvor X er en aminosyre. Således in vivo immunceller nødt til at reagere hensigtsmæssigt på meget komplekse rumlige og tidsmæssige signaler, hvilket gør studiet af kemotaxis en skræmmende opgave. Nedenfor giver vi en kort historie om kemotaxis, som begyndte med intravital billeddannelse tilgange.
Undersøgelsen af leukocyt chemotaxis daterer sig tilbage til 188812, når øjenlæge Theodor Karl Gustav Leber klart beskrevet den direkte migration af leukocytter til, og ophobning på, steder af betændelse i en model af mykotisk (svampe) keratitis. Leber understregede, at tiltrækningaf overskydende leukocytter ved hjælp af patogen-afledte stoffer er vigtig for eliminering af skadelige mikroorganismer via fagocytose, som var blevet beskrevet af Metchnikoff (også kendt som Metschnikoff) tidligere i samme årti13. In vivo eksperimenter blev også udført i 1920'erne af Clark og Clark14,15, der benyttede sig af gennemsigtigheden af haletudser og viste, at steril inflammation induceret af croton olie14 eller andre lokalirriterende15 forårsaget leukocytter til at overholde blodkarrene, efterfulgt af diapedese (transendotel migration) og hurtig migration gennem vævet rum mod lokalirriterende. In vitro-eksperimenter ved hjælp af mikrofilmmetoden udviklet af Jean Comandon16 viste, at leukocytter migrerede til en partikelkemoattractantkilde såsom bakterier17. På det tidspunkt var de molekylære identiteter af kemotaktiske faktorer ukendt. I 1960'erne erkendte Stephen Boyden18, at der manglede teknikker til at studere opløselige stoffers kemotaktiske aktivitet. Han udtænkte et kammer, senere kendt som Boyden kammer, med to rum adskilt af et filter papir membran. Der tilsættes en cellesuspension i det øverste rum, og teststoffet tilsættes enten begge rum eller kun til det nederste rum. Efter en inkubationsperiode fjernes filtermembranen, og cellerne fastgøres og farves. Ved at sammenligne, hvor mange celler der vandrer hen over filtermembranen mod den nederste brønd med teststoffet i begge rum, i ingen af rummene eller kun i det nederste rum, kan kemotaktiskaktivitet bestemmes. Transwell assays er stadig populære i dag og er blevet ændret på forskellige måder, herunder brugen af forskellige polycarbonat membraner med definerede pore størrelser og tætheder19,20. En stor ulempe ved Transwell assays er, at det er upraktisk at direkte visualisere celler migrerer og migration sti på tværs af membranen typisk ikke overstiger diameteren af en immuncelle.
Sally H. Zigmond udviklede et kemotaxiskammer21, der muliggjorde visualisering af både gradientdannelse og cellemorfologi ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Kammeret består af et plexiglas (akryl) dias med to parallelle lineære brønde, hver med et volumen på ~ 100 μL, adskilt af en 1 mm bred bro 3-10 μm under det øverste plan af diaset. En coverslip seedet med celler er omvendt og placeret på diaset, således at det spænder over de to brønde. Efter tilsætning af en kemoattractant til en af brøndene, en stejl kemoattractant gradient former over broen, typisk inden for 30-90 min. Human polymorfonukleare leukocytter (granulocytter) i Zigmond kammer observeres orientere sig mod kemoattractant. Variationer af Zigmond kammeret er blevet rapporteret, herunder Dunn22 og Insall23 kamre, som begge bruger en coverslip seedet med celler placeret på tværs af to brønde adskilt af en 1 mm bred bro. Dunnkammeret består af koncentriske brønde adskilt af en cirkulær bro, mens Insall kammeret er tættere forbundet med Zigmond kammer, men giver broer af to forskellige bredder, 0,5 mm og 1 mm. En roman kemotaxis kammer, kaldes μ-Slide Chemotaxis og fremstillet af plast sprøjtestøbning, blev beskrevet af Zemgel et al.24. Kemotaxiskammeret består af to 40 μL reservoirer adskilt af en 1 mm bred kanal med en længde på 2 mm og en højde på 70 μm. Bunden af kammeret er dannet af en gas gennemtrængelig, tynd plastfolie med samme tykkelse og optiske egenskaber af en Nr. 1,5 glas dækslip24. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjælp af μ-Slide Chemotaxis kammer til at visualisere migration af mus hjemmehørende peritoneal makrofager i op til 14 timer i en kemotaktisk (supplement C5a) gradient.
Protocol
Protokollerne følger retningslinjerne fra vores lokale forskningsetiske komité samt retningslinjerne for dyrepleje.
BEMÆRK: Figur 1 viser en arbejdsgang af kemotaxis assay.
1. Prefilling Chemotaxis Slides
-
Forfyld de 1 mm brede og 2 mm lange forbindelseskanaler på en eller to kemotaksdias ved hjælp af modificeret RPMI 1640 HEPES-medium bestående af bikarbonatfri RPMI 1640 medium indeholdende 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES), 10% varmeinaktiveret fosterkvægserum (FBS) og antibiotika såsom penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ml), fremstillet ved fortynding af 100x penicillin/streptomycin og 1 μg/ml lipopolysaccharid (fra E. coli)og en toll-lignende receptor 4 ligand, der anvendes for at aktivere cellerne.
- Placer en kemotaxis slide (Figur 2A) i en rund (10 cm diameter) celle kultur parabol, både forvarmet til 37 °C, og sæt skålen på en opvarmet (37 °C) aluminium blok. Sæt stik i port 1 og 4 (Figur 2B).
BEMÆRK: En aluminiumblok, der holdes ved 37 °C og placeres inde i laminarstrømmen, er nyttig til fremstilling af kemotaxiskamre. Ideelt set bør den opvarmede blok give et fladt arbejdsområde og brønde til forskellige rør, såsom 50 ml rør og 2 ml mikrocentrifugerør. - Ved hjælp af en 10-200 μL pipettespids med en skråspids skal 15 μL modificeret RPMI 1640 HEPES-medium deponeres i påfyldningsport 3 (Figur 2B). Dernæst skal pipettespidsen sættes i port 2 med volumen, der stadig er indstillet til 15 μL, og kontrolknappen på (2-20 μL-volumen) trykket ned, og pipettespidsen indsættes i port 2 og aspirere 15 μL ved en moderat hurtig hastighed (figur 2B). Dette vil forfylde 1 mm x 2 mm forbindelseskanalen (observationsområdet) samt de to flankerende forsyningskanaler (mellem henholdsvis det centrale observationsområde og port 2 og 3). Dæk påfyldningsport2 og 3 med hætter.
- Efter forfyldning anbringes kemotaxisgliderne på et stativ, der opbevares i et lukket fugtighedskammer i et ellers tørt og CO2-fritinkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge den korrekte pipettespids til påfyldning af kemotaxisdiaset. En skrå pipettespids kiler ind i toppen af påfyldningsporten, mens almindeligt anvendte spidse pipettespidser kan indsættes dybere i påfyldningsporten og i høj grad øge modstanden mod væskeflow.
- Placer en kemotaxis slide (Figur 2A) i en rund (10 cm diameter) celle kultur parabol, både forvarmet til 37 °C, og sæt skålen på en opvarmet (37 °C) aluminium blok. Sæt stik i port 1 og 4 (Figur 2B).
2. Isolering af mus Resident peritoneal makrofager
- Ofre en 3-4 måneder gammel mus ved hjælp af en høj koncentration af flygtige anæstesi isofluran (> 5% i luften) eller kuldioxid25, efterfulgt af cervikal dislokation. Tab af retterefleksen hos gnavere korrelerer med tab af bevidsthed hos mennesker26. Rengør musens mave med 80% ethanol i vand og lav derefter et 1-2 cm midterliniesion ved hjælp af kirurgisk saks med stumpe spidser. Træk huden tilbage for at eksponere den underliggende bugvæg.
- Sæt et 24 G plastkateter ind i bughulen. Ved hjælp af en 5 ml plastsprøjte skal hulrummet lavages med 2 x 4,5 ml iskold Hanks buffersaltopløsning (HBSS) uden Ca2+ og Mg2+. Lad ca. 0,5 ml resterende HBSS stå i sprøjten, så væv, der uforvarende suges ud på kateterets spids, utilsigtet kan udstødes.
- Overfør lavaged medium, typisk 8-8,5 ml i alt, i en 14 ml polypropylen runde bund rør. Røret centrifugeres ved 300 x g i 6,5 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det runde bundrør gør det muligt at dekantere supernatanten fuldt ud og reducerer celleklumpning. - Supernatanten kasseres, og de peritoneale celler (typisk ~4 x 106 celler pr. mus) kasseres i 200 μL modificeret RPMI 1640 HEPES-medium. Fortynd en prøve af cellesuspensionen 1:20 og brug en tælleanordning, såsom et Neubauer forbedret tællekammer, til at tælle cellerne. Dernæst fortyndes cellesuspensionen til en endelig koncentration på 10 x 106 celler/ml, og cellerne holdes i et rundt nederstt 2 ml polypropylenmikrocentrifugerør ved 37 °C ved hjælp af en opvarmet aluminiumsblok (se NOTE i trin 1.1.1).
3. Seeding peritoneal celler i Chemotaxis Slides
- Efter pipettering af cellesuspensionen op og ned 5x med pipettevolumen et 100 μL (eller ved halvdelen af suspensionen) for at reducere sammenklumpningen, skal 10 μL af cellesuspensionen forsigtigt sættes i port 3 i et kemotaxiskammer (Figur 2C). Anbring pipettespidsen i port 2, og træk langsomt cellesuspensionen ind i forbindelseskanalen (Figur 2C). Så snart cellesuspensionen er indført, skal du fjerne stikkene i port 1 og 4, hvilket vil bidrage til at standse strømmen af cellesuspensionen. Placer hætter på alle fire påfyldningsporte.
- Gentag trin 3.1 for alle kemotaxiskamre. Ved hjælp af en lille omvendt mikroskop og en 10x fase-kontrast objektiv linse, inspicere kemotaxis dias for uønskede luftbobler.
- Kemotaxis-objektglas, der er sået med peritoneale celler, anbringes i et fugtighedskammer ved 37 °C i 2-3 timer.
4. Påfyldning af reservoirer og tilføjelse chemoattractant
- Undersøg observationsområdet (kanal, der forbinder de to 40 μL reservoirer) ved hjælp af et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: På dette stadium vil celletætheden være højere end efter påfyldning af reservoirerne, fordi svagt klæbende celler, overvejende CD19+ celler (B1 celler), vil blive vasket ud af observationsområdet under påfyldningsproceduren (Figur 2C-E). - Sæt propperne i påfyldningsport 1 og 2 (Figur 2D). Sørg for, at påfyldningsport 3 fyldes op til toppen med medium og fri for luftbobler. Brug en steril 27 G sprøjtenål til at løsne uønskede luftbobler, hvis det er nødvendigt.
- Ved hjælp af en mekanisk pipette på 10-100 μL, der kan aspirere ~60 μL modificeret RPMI 1640 HEPES-medium og anbringes pipettespidsen i påfyldningsport 3. Brug lydstyrkeindstillingsringen på pipetten til langsomt og støt at injicere medium i beholderen, således at mediet når toppen af påfyldningsporten 4 efter 1-2 min.
- Fyld det andet reservoir. Flyt stikket fra port 1, og sæt det langsomt i port 3 (Figur 2D). Dernæst aspirate ~ 50 μL af modificerede RPMI 1640 HEPES medium og placere pipette spidsen i påfyldning sport 4. Brug volumenindstillingsringen på 10-100 μL volumenpipette til langsomt og støt at injicere medium i det andet reservoir, således at mediet når toppen af påfyldningsporten 1 efter 1-2 min (Figur 2D).
- 495 μL modificeret RPMI 1640 HEPES-medium anbringes i et (rund bund) 2 ml mikrocentrifugerør og tilsættes 5 μL Patent Blue V (stamopløsning: 10 mg/ml i fosfat-buffered saltvand [PBS]), et blåt farvestof, der anvendes som visuel indikator for koncentrationgradientdannelse. Bland ved kort vortexing. Der tilsættes 5,4 μL rekombinantmuskomplement C5a (stamopløsning: 50 μg/ml i PBS med 0,1% kvægserumalbumin) og blandes ved kort vortexing.
- Aflejr 15 μL blå, komplement C5a-indeholdende medium til påfyldningsport 1 (Figur 3A), efter at have sørget for, at den lave fordybning øverst på porten er medium fri (ellers kan dråben spillover).
- Sæt en 10-200 μL pipettespids ind i påfyldningsport 4, og drej langsomt og støt volumenindstillingsringen på 10-100 μL volumenpipette for at trække dråben af blå, komplementerC5a-holdige medium ind i det modsatte reservoir (Figur 3B). Luft vil begynde at komme ind i den korte lodrette kolonne af påfyldning sport 1. Tegn luft ind, indtil væskeluftgrænsefladen er midtvejs i den lodrette kolonne, og sæt derefter langsomt et stik ind i porten.
- Løft forsigtigt pipetten fra port 4 med den anden hånd for at sikre, at slæden forbliver fastgjort. Endelig skal der langsomt tilsluttes port 4 (Figur 3B).
- Undersøg kemotaxis dias på en omvendt mikroskop.
BEMÆRK: De resterende hængende celler i observationsområdet bør overvejende være makrofager. Dette kan bekræftes ved hjælp af fluorescerende mærkede anti-F4/80 antistoffer (F4/80 er en specifik markør for musemakrofager). B-celler kan identificeres ved hjælp af fluorescerende mærkede anti-CD19 antistoffer og F4/80-/CD19- celler kan detekteres ved hjælp af en blå fluorescerende nukleinsyre plet (Figur 4).
5. Imaging Makrofag migration af Time-lapse, Fase-kontrast Mikroskopi
- Placer en kemotaxis dias på scenen af en omvendt mikroskop udstyret med en fase inkubator. Temperaturen holdes ved 37 °C.
- Billede 1 mm x 2 mm observationsområde ved hjælp af en 10x fase-kontrast objektiv linse og fokusere på makrofag lamellipodia: tynde, ark-lignende membran fremspring. Tag billeder i 14 timer med en hastighed på 1 ramme hver 2 min.
6. Analyse af Time-lapse Billeder
- Analysér time-lapse, fase-kontrast billeder ved hjælp af automatiseret billedanalyse software eller Manuel Tracking plugin, produceret af Fabrice P. Cordelières, for ImageJ.
BEMÆRK: Automatiserede sporingsprogrammer kan bruges til at analysere celler, der er afbildet af enten time-lapse, fasekontrast eller fluorescensmikroskopi. For eksempel kan java-baseret software iTrack4U produceret af Cordelières et al.27 bruges til automatiseret cellesporing og -analyse ved hjælp af time-lapse, fasekontrast eller fluorescensbilleder som input. Manuel sporing er mere tidskrævende, men de spor, der genereres af ImageJ plugin Manuel sporing kan importeres direkte og automatisk analyseres af ImageJ plugin Chemotaxis og Migration Tool28,29.
Representative Results
Figur 2Aviser et skematisk diagram over kemotaxisdiaset , der anvendes til time-lapse-videomikroskopi af museperitoneale makrofager, der migrerer i et kemotaktisk gradient . Diaset indeholder tre chemotaxis kamre, som hver har fire påfyldning havne. Porte kan lukkes individuelt ved hjælp af de stik, der vises over sliden. Alternativt kan en ikke-forsegling hætte placeres over en unplugged port for at opretholde sterilitet. Efter tilslutning af port 1 og 4 kan observationsområdet (1 mm bredt x 2 mm lang x 70 μm høj kanal, der forbinder de to reservoirer) mellem port 2 og 3, fyldes med medium ved at placere en 15 μL dråbe i port 3 og aspirere med en 2-20 μL volumenpipette i port 2 (Figur 2B). En suspension af museresidente peritoneale celler (10 x 106 celler/ml) blev sået ind i observationsområdet ved at placere en 10 μL dråbe suspension i port 3 og langsomt aspirere i port 2 (Figur 2C). Et typisk billede af celler, der er seedet i observationsområdet taget ved mikroskopi med fasekontrast ved hjælp af en 10x objektiv, er vist i figur 2C. Efter inkubering i 2-3 timer blev kemotaxis-diaset langsomt fyldt med medium (Figur 2D). Efter tilslutning af port 1 og 2 blev mediet langsomt injiceret via port 3, indtil det kom ud af port 4. Derefter blev stikket skiftet fra port 1 til port 3, og derefter blev det andet reservoir fyldt ved langsomt at indsprøjte medium via port 4, indtil det kom frem i port 1. På dette stadium blev celler i observationsområdet geninspiceret ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 2E). Ved at sammenligne billeder kort før (figur 2C) og efter (figur 2E) var fyldning af reservoirerne blevet vasket ud af observationsområdet. Generelt blev svagt klæbende CD19+ celler (B1-celler) vasket ud, og de resterende celler var overvejende F4/80+ celler (makrofager). Dette blev påvist ved fluorescensmikroskopi efter mærkning af hver celletype med fluorescerende mærkede specifikke antistoffer (figur 4). I figur 4Ablev friskisolerede museresidente peritoneale celler mærket med grønne fluorescerende fluorophore-konjugerede anti-F4/80 antistoffer og røde fluorescerende fluorophore-konjugerede anti-CD19-antistoffer, og cellernes kerner blev mærket med en blå fluorescerende nukleinsyreplet. F4/80 er en specifik markør for musemakrofager30, mens CD19 er en B-cellemarkør. Figur 4B viser F4/80+ celler afbildet ved roterende disk konfokal mikroskopi i observationsområdet af en kemotaxis kammer. Cellerne blev mærket efter en natten chemotaxis assay registreres af time-lapse, fase-kontrast mikroskopi.
Supplement C5a (kemoattractant) blev introduceret til en af de to reservoirer ved at placere en 15 μL dråbe medium indeholdende 0,54 μg/ml (rekombinant mus) supplere C5a og 10 μg/ml Patent Blue V til påfyldningsport 1 (Figur 3A) efter tilslutning af port 2 og 3. Chemoattractantmediet blev langsomt trukket ind i reservoiret ved langsom aspiration med en pipette via port 4. Figur 3B viser udbredelsen af det blå farvestof efter at have trukket 15 μL-dråben i et reservoir. Patent Blue V blev brugt som en indirekte visuel indikator for kemoattractant diffusion. Komplement C5a molekyler er betydeligt større end patent Blå V (9,0 kDa versus 0,57 kDa) og diffuse langsommere. Efter diffusion af komplementet C5a i reservoiret var koncentrationen ~0,2 μg/ml (15 μL/40 μL [reservoirvolumen] x 0,54 μg/ml = 0,2 μg/ml), svarende til ~22,5 nM. En beskeden stejl gradient dannet over observationsområdet efter 3 timer og fortsatte med at stige, og nåede et maksimum på omkring 12 h31. Figur 3C viser migrationssporene for makrofager, der migrerer i et supplement til C5a-gradienten, mellem 6-12 timer efter tilføjelse af kemoattractanten. Cellehastighed og kemotaktisk effektivitet, indekseret som y-FMI (y-forward migration index; interval: -1 til +1) og x-FMI, af individuelle makrofager blev beregnet ud fra migration plots (Figur 3D). Figur 3D viser også et overførselsområde, der er produceret efter normalisering af startpunktet for hvert trækspor til X = 0 og Y = 0 under boksområderne. Starten i overførselsplottet viser, hvordan y-FMI blev beregnet for hvert overførselsspor.
Figur 1: Arbejdsgangen for kemotaxis assay. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Håndtering af kemotaxisdias. (A) En 3D-visning af en kemotaxis dias med fire stik og fire hætter. Diaset indeholder tre kemotaxiskamre, som hver består af to 40 μL reservoirer forbundet med en 1 mm x 2 mm kanal, som er 70 μm høj, kaldes observationsområdet. (B) Tilslutningskanalen strækker sig i begge ender til påfyldning af port 2 og 3. Efter isætning af propper i påfyldningsport 1 og 4 blev observationsområdet fyldt med medium (rød) ved at anvende en dråbe medium til port 3 og aspirere i port 2 med en 10-200 μL pipettespids. Efterfølgende blev der påført hætter på port 2 og 3, før der blev inkuberet diaset ved 37 °C og klargjorde cellesuspensionen. (C) Observationsområdet, hvor den dannede kemoattractantgradient blev seedet med makrofager ved at anvende en 10 μL dråbe museresidente peritoneale celler i port 3 og langsomt indsugning i port 2. Diaset blev derefter inkuberet i et fugtighedskammer ved 37 °C i 2-3 timer. Det fasekontrastbillede, der vises til højre, og som er opnået via en objektiv linse på 10x, viser peritoneale celler efter såning og inkubation ved 37 °C i 2 timer. Skalastang = 500 μm. (D) Chemotaxiskamre blev fyldt med medium ved at tilslutte port 1 og 2 og derefter langsomt injicere medium via port 3, indtil det opstod i port 4. Langsom og stabil fyldning kan opnås ved at dreje volumenindstillingsringen på en 20-100 μL volumenpipette. Efter påfyldning af det første reservoir kan det andet reservoir fyldes ved at tilslutte port 2 og 3 og derefter langsomt injicere medium i port 4, indtil det kommer frem i port 1. (E) Fasekontrastbillede af det samme observationsområde som vist ovenfor (C) efter påfyldning af de to reservoirer. Scale bar = 500 μm. Grafiske elementer fra Elias Horn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Chemotaxis assay. (A)Chemoattractant blev introduceret til et af de to reservoirer i et kemotaxiskammer ved at anvende et 15 μL dråbe medium indeholdende 0,54 μg/ml supplement C5a og 10 μg/ml Patent Blue V til påfyldning af port 1 efterfulgt af langsom aspiration i port 4. (B) I første omgang efter at være blevet trukket ind i reservoiret den blå, chemoattractant-holdige medium havde en nogenlunde omvendt dråbe form, og derefter langsomt spredt i hele reservoiret. (C) Migration spor af makrofager migrerer i en kemoattractant (supplement C5a) gradient mellem 6-12 h efter indførelse af kemoattractant til en af reservoirerne. Retningen af gradienten er angivet til højre. Slutningen af hvert overflytningsspor angives med en udfyldt cirkel. (D) Blox-hastighedsområder, x-FMI (x-forward migration index) og y-FMI (y-forward migration index), et indeks over kemotaktisk effektivitet, der spænder fra -1 til +1. Data blev indhentet ved analyse af 25 makrofagmigrationspor. Makrofager i den nederste halvdel af observationsområdet og viser forskydning af mindst én cellebredde over 6 timer blev tilfældigt udvalgt til analyse. Nedenfor er et plot af migration spor efter normalisering af startpunktet til X = 0 og Y = 0. Kemotaxisindekset (y-FMI) blev beregnet ved at dividere nettoforskydningen langs Y-aksen (d) med den akkumulerede længde (l) af overflytningsstien, som det er vist skematisk. Grafiske elementer i paneler A og B leveret af Elias Horn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescerende billeder af levende mus hjemmehørende peritoneal celler opnået ved spinning disk konfokale mikroskopi. (A) Udvidet fokusbillede (lysest punkt sammenfletning af alle Z-fly) af friskisolerede museperitoneale celler mærket med grønne fluorescerende anti-F4/80 (makrofagsmarkør) antistoffer, røde fluorescerende anti-CD19 (B-cellemarkør) antistoffer og en blå fluorescerende nukleinsyreplet. Skalabjælke = 10 μm. (B) Snapshot (enkelt Z-plan) af F4/80+ celler (makrofager) i observationsområdet for et kemotaxiskammer taget efter en dag til daglig kemotaxisanalyse. Celler blev mærket med grønne fluorescerende anti-F4/80 antistoffer og en blå fluorescerende nukleinsyre plet. Supplementet C5a og Patent Blue V gradienter blev vasket ud af cellemærkningsproceduren, hvilket forklarer, hvorfor det øverste reservoir i det skematiske diagram af kemotaxiskammeret ikke er blåt. Skalabar = 10 μm. Grafisk element leveret af Elias Horn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Intravital billeddannelse går tilbage til 1800-tallet og giver et middel til at studere adfærdlevende immunceller i deres naturlige miljø. Men selv med nutidens avancerede mikroskopi og genetiske teknikker er det vanskeligt at studere cellernes respons på specifikke kemoattractanter in vivo. For at omgå dette problem udviklede Boyden18 Transwell-analyser i 1960'erne, men disse slutpunktsanalyser gav ikke visualisering af, hvordan celler faktisk migrerede til kemoattractanter, hvilket gjorde det vanskeligt at skelne chemokinesis, stimuleret tilfældig migration med et kemisk cue32, og chemotaxis, migration mod højere koncentrationer af kemiske stimuli fra hinanden33. Dette problem blev løst ved at designe forskellige åbne kamre med en bro, typisk 1 mm bred, beliggende mellem to reservoirer og tilgængelig e en objektiv linse21,22,23. Anvendelse af en omvendt dække slip, seedet med hængende celler, lukker kamre og kemoattractant føjet til en af reservoirerne spreder over broen til den modsatte reservoir, hvilket skaber en koncentration gradient. Her beskriver vi en kemotaxis analyse ved hjælp af samme princip, men ved hjælp af et lukket kammer byder på fire påfyldning havne. Ved hjælp af dette system og time-lapse, fase-kontrast mikroskopi, vi udviklet en analyse til billedmus hjemmehørende peritoneal makrofager migrerer i en kemotaktisk supplement C5a gradient31,34,35,36. Denne analyse, kombineret med knockout mus modeller, viste sig at være medvirkende til undersøgelsen af rollerne af forskellige Rho GTPases og motoriske proteiner i makrofag morfologi, motilitet, og kemotaxis31,34,35,36,37. Vi har også brugt denne tilgang til billede menneskelige perifere blod monocytter migrerer på en 2D overflade eller i en 3D kollagen type I matrix38. Desuden er analysen velegnet til museknoglemarvsafledte makrofager eller makrofager afledt af betinget udødeliggjorte myeloid prækursorceller39,40. Vi har tidligere brugt polytetrafluorethylen (PTFE) poser med luer adaptere til kultur knoglemarvsceller og få makrofager34. Fordelen ved PTFE poser er, at cellerne let kan resuspenderes og klar til brug efter at have lagt posen på is i 20-30 min. Bemærk, at vi prefill chemotaxis slide observation område, før du indfører cellerne. Denne fremgangsmåde har den fordel, at uønskede luftbobler efterfølgende kan skylles ud (med variabel succes) og det forudbesøgte observationsområde muliggør langsom indførelse af en cellesuspension ved pipettering. Præfyldning øger dog sandsynligheden for, at mediet delvist vil strømme ind i en eller begge flankerende reservoirer, hvilket vil fremme såning af celler uden for observationsområdet. Alternativt kan cellesuspensionen føres direkte ind i et tørt observationsområde, men uønskede luftbobler kan ikke efterfølgende udvises.
Musens bughulen indeholder to hovedpopulationer af celler: F4/80+ makrofager og (mindre) CD19+ B-celler i et forhold på ca. 1:2 (Figur 4A). Disse to cellepopulationer tegner sig for over 95% af bughulen celler, mens de resterende F4/80-/ CD19- celler kan normalt identificeres som CD11c+ celler (dendritiske celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svagt klæbende B-celler vaskes ud af observationsområdet under påfyldning af reservoirerne med mediet (figur 2). Efter at have tilføjet kemoattractant til en af de to reservoirer, kan time-lapse, fase-kontrast mikroskopi bruges til at forestille de resterende celler (makrofager) migrerer i en udviklende kemoattractant gradient. Dannelsen af den supplerende C5a gradient i observationsområdet, via diffusion fra det ene reservoir til det andet, kan simuleres ved hjælp af et fluorescerende farvestof med lignende molekylvægt. En god erstatning for rekombinant mus supplement C5a (forudsagt molekylvægt, 9,0 kDa) er fluorescerende mærket dextran (10 kDa)31. Ved hjælp af konfokal mikroskopi kan den fluorescensgradient i den smalle kanal (observationsområdet), der forbinder chemotaksdiasets toreservoirer,måles med faste intervaller , og koncentrationsprofiler på de forskellige tidspunkter kan afbildes24,31. Vi tilføjer rutinemæssigt et nonfluorescerende, blåt farvestof (Patent Blue V) til det kemoattractantmedium for at give en praktisk visuel indikator for diffusion og gradientdannelse. Inden for 1 time efter at have indført 15 μL blåt, chemoattractantholdigt medium i et reservoir, fremstår reservoiret ensartet blåt, og ifølge Ficks diffusionslove vil der dannes en gradient i det snævre observationsområde, der forbinder reservoirerne (figur 3B). Flere dage er nødvendige for den opløste (blå farvestof eller kemoattractant) at blive jævnt fordelt.
Fluorescensmikroskopi kan erstattes af fasekontrastmikroskopi, hvilket giver fordele til automatiseret cellesporing, fordi fluorescerende mærkede celler let kan skelnes fra baggrunden. En anden fordel er, at specifikke populationer af immunceller selektivt kan spores efter mærkning overflade markører med fluorescerende antistoffer. Vi brugte denne tilgang til billede menneskelige perifere blod CD14+ celler (monocytter) migrerer i en chemotactic fMLP (N-formylmethionin-leucyl-phenylalanin) gradient38. Tilsvarende, fluorescerende anti-F4/80 antistoffer kan bruges til at billedet mus makrofager migrerer i en kemotaktisk supplement C5a gradient. Fototoksicitet er en potentiel ulempe ved at bruge fluorescens imaging41. Dette kan reduceres på forskellige måder42, herunder ved hjælp af fluorophores ophidset med længere bølgelængder og tilføje antioxidanter til mediet. Alternativt kan mærkede celler i første omgang identificeres ved fluorescensmikroskopi og efterfølgende afbildes ved time-lapse-mikrokopi af fasekontrast. I praksis kan celler, der bevæger sig med moderat lave hastigheder, såsom ~1 μm/min (makrofager) eller ~4 μm/min (monocytter), dog periodisk afbildes ved fluorescensmikroskopi med intervaller på minutter, hvilket tåles godt38. Vi har tidligere brugt fluorescens mikroskopi og kemotaxis dias beskrevet her for 3D chemotaxis assays38,43. I dette tilfælde blev begge reservoirer fyldt med medium og 15 μL chemoattractant-holdige medium blev trukket ind i en af reservoirerne umiddelbart før langsomt pipettering fluorescerende mærkede celler suspenderet i medium indeholdende kollagen type I i observationsområdet. Den vanskelige del af denne procedure er håndteringaf kollagen type I, som er koncentreret i sur opløsning. Kollagenopløsningens pH-analyse skal neutraliseres ved tilsætning af alkalisk opløsning, før den iskolde kollagenopløsning blandes med cellesuspensionen. Overførsel af kollagen-celle blandingen til en inkubator ved 37 °C vil indlede kollagen polymerisering. Under inkubationen skal slæden langsomt roteres omkring sin lange akse, så cellerne forbliver jævnt fordelt i X-, Y- og Z-aksens retninger, mens kollagenpolymeriserer til en gel. En beslægtet lukket chemotaxis dias egnet til 3D chemotaxis assays, med seks stik i stedet for fire stik, er for nylig blevet beskrevet29. Dette system gør det muligt at indføre kollagencelleblandingen i observationsområdet, før hver af de flankerende reservoirer fyldes uafhængigt, fordi hvert reservoir har to påfyldningsporte i stedet for en enkelt port.
Sammenfattende beskriver vi en realtidskemotaxis-analyse, der gør det muligt at visualiseringaf celler, der navigerer i en kemotaktisk gradient over en periode på 6 eller flere timer. Heri fokuserer vi på makrofager, som spiller en stor rolle i inflammatoriske sygdomme, men har været underrepræsenteret i realtid chemotaxis assays sammenlignet med hurtigere bevægelige celler som neutrofiler og Dictyostelium amøbe.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud (HA 3271/3-2) fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M. Chemotaxis in leukocytes. Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
