Summary
Здесь мы описываем методы, использующие замедленное, фазово-контрастную микроскопию для изображения мыши-резидента перитонеальных макрофагов в химиотаксическом дополнении градиента C5a. Протоколы могут быть распространены на другие иммунные клетки.
Abstract
Хемотаксис является рецепторо-опосредованного руководства клеток вдоль химического градиента, в то время как хемокинез является стимуляция случайной подвижности клеток химическим веществом. Хемокинез и химиотаксис имеют основополагающее значение для мобилизации и развертывания иммунных клеток. Например, хемокины (хемотаксические цитокины) могут быстро набирать циркулирующих нейтрофилов и моноцитов в внесосудистые участки воспаления. Химиоаттракторные рецепторы принадлежат к большому семейство g белковых рецепторов. Как химиоаттовантов (т.е. лиганд) градиенты прямого клеточной миграции через G белка связанных рецепторов сигнализации еще не полностью понял. В области иммунологии нейтрофилы являются популярными модельными клетками для изучения хемотаксиса в пробирке. Здесь мы описываем в режиме реального времени двумерный (2D) анализ хемотаксиса с учетом макрофагов резидентов мыши, которые традиционно были более трудными для изучения. Макрофаги движутся медленными темпами в 1 мкм/мин на 2D поверхности и менее хорошо подходят для анализа миграции точечных источников (например, миграция к кончику микропайпета, наполненного хемоатантантом), чем нейтрофилы или диктиостелий дискоид,которые движутся на порядок быстрее. Широко используемые анализы Transwell полезны для изучения химиотаксической активности различных веществ, но не предоставляют информацию о морфологии клеток, скорости или хемотаксической навигации. Здесь мы описываем замедленного микроскопии на основе макрофаг химиотаксис анализ, который позволяет количественно скорости клеток и химиотаксической эффективности и обеспечивает платформу для очертания преобразователей, сигнальных путей, и эффекторы химиотаксиса.
Introduction
Иммунные клетки обычно мигрируют покорно на 2D поверхности в амебоид моды1,2, который включает в себя повторные циклы выпячивания передней, integrin-опосредованного клеточной сливки, и опровержение тыла. Предпосылкой шага является поляризация клеток, при которой клетки образуют передние и задние концы3. Chemotaxis начинается с обнаружения химиоаттантов G белковых рецепторов и сложной сигнальной сети, опосредованной мембранными гетеротримерными белками G и небольшими мономерными белками G, а также фосфолипидными связанными нуклеотидными факторами гуанина (GEFs)4,5. Активация Rho GTPases из подсемейства Cdc42 и Rac вызывают выступы на фронте6 и члены подсемейства Rho, особенно RhoA, активируют сокращение задней5,7. В трехмерной (3D) среде, integrins в значительной степени излишним для миграции лейкоцитов и RhoA становится более важным для сжатия клеток через узкие проходы8, в то время как Cdc42- или Rac-индуцированной Arp2/3 активации остается важным для хемотаксического рулевого управления9,10.
Иммунные клетки могут столкнуться с различными химиоаттовантами, особенно в условиях повреждения тканей, патогенного вторжения и воспаления. Эндогенные хемоатратантанты, выраженные на фагоцитах, дополняют C3a и C5a, быстро генерируются активацией комплемента каскада и распознаются рецепторами C3a и C5a. Аналогичным образом, некротические клетки вербуют фагоциты через формовые пептидные рецепторы, которые распознают митохондрии, полученные, а также производные бактериями формовые пептиды11. Иммунные клетки также выражают G белковые рецепторы для хемокин, большое семейство химиоаттанантных пептолов, участвующих в регуляции торговли иммунными клетками во время гомеостаза и воспаления. Хемокины делятся на четыре группы в зависимости от интервала первых двух цистеина (C) остатков: C, CC, CXC, и CX3C цитокинов, где X является аминокислотой. Таким образом, иммунные клетки in vivo должны адекватно реагировать на очень сложные пространственные и временные сигналы, что делает изучение хемотаксиса сложной задачей. Ниже мы предоставляем краткую историю химиотаксиса, который начался с интражизненной визуализации подходов.
Изучение лейкоцитов хемотаксисвосходит восходит к 188812, когда офтальмолог Теодор Карл Густав Лебер четко описал направленную миграцию лейкоцитов в, и накопление на, места воспаления в модели микотического (грибкового) кератита. Лебер подчеркнул, что привлечение избыточных лейкоцитов патогенными веществами имеет важное значение для ликвидации вредных микроорганизмов с помощью фагоцитоза, который был описан Метчниковым (также известным как Метшников) ранее в том жедесятилетии 13. In vivo эксперименты были также выполнены в 1920-х годах Кларк и Кларк14,15,который воспользовался прозрачностью головастиков и показал, что стерильное воспаление, вызванное крутон нефти14 или других раздражителей15 вызвало лейкоцитов придерживаться кровеносных сосудов, а затем диапедеза (трансдотелиальная миграция) и быстрой миграции через ткани к раздражительным пространствам. Эксперименты в пробирке с использованием метода микрокинематографии, разработанного Джином Comandon16, показали, что лейкоциты мигрировали в сторону источника химиоаттантов твердых частиц, таких как бактерии17. В то время молекулярная идентичность хемотактических факторов была неизвестна. В 1960-х годах Стивен Бойден18 признал, что методы для изучения химиотаксической активности растворимых веществ не хватает. Он разработал камеру, впоследствии известную как камера Бойдена, с двумя отсеками, разделенными мембраной фильтровальной бумаги. В верхний отсек добавляется клеточная подвеска, а испытательное вещество добавляется либо в оба отсека, либо только в нижний отсек. После инкубационного периода мембрана фильтра удаляется, а клетки фиксируются и окрашиваются. Сравнивая, сколько клеток мигрируют через мембрану фильтра к нижней скважине с испытательным веществом в обоих отсеках, ни в одном отсеке, или только в нижнем отсеке, может быть определена химиотаксическая активность. Transwell анализы по-прежнему популярны сегодня и были изменены различными способами, в том числе использование различных поликарбонатных мембран с определенными размерами пор и плотности19,20. Основным недостатком transwell анализов является то, что это непрактично непосредственно визуализировать клетки мигрируют и путь миграции через мембрану, как правило, не превышает диаметр иммунной клетки.
Салли Х. Зигмонд разработала камеру хемотаксиса21, которая позволила визуализировать как градиентное образование, так и морфологию клеток с использованием флуоресцентных красителей. Камера состоит из плексигласа (акрилового) слайда с двумя параллельными линейными скважинами, каждая из которых имеет объем 100 евро, разделенных мостом шириной 1 мм 3-10 мкм ниже верхней плоскости слайда. Coverslip посеяны с клетками переворачивается и помещается на слайд ес так, что она охватывает две скважины. После добавления хемоатантантанта к одной из скважин, крутой градиент хемоатанта образует через мост, типично в пределах 30-90 мин. Человеческие полиморфоядерные лейкоциты (гранулоциты) в камере Зигмонда наблюдаются ориентируясь к хемоаттрактористу. Сообщалось о вариациях камеры Зигмонда, включая камеры Dunn22 и Insall23, обе из которых используют покрывало, посеянное камерами, расположенными через две скважины, разделенные мостом шириной 1 мм. Камера Dunn состоит из концентрических скважин, разделенных круговым мостом, в то время как камера Insall более тесно связана с камерой Зигмонда, но обеспечивает мосты двух разных ширин, 0,5 мм и 1 мм. Новая камера химиотерапии, названная «Скольжение хемотаксис» и изготовленная с помощью пластиковой литья инъекций, была описана Земгелем и др.24. Камера хемотаксиса состоит из двух резервуаров шириной 40 л, разделенных каналом шириной 1 мм длиной 2 мм и высотой 70 мкм. Дно камеры образовано газопроницаемым, тонким пластиковым листом с такой же толщиной и оптическими свойствами стеклянного покрытия No 1.524. Здесь мы описываем анализ хемотаксиса с помощью камеры хемотаксиса, чтобы визуализировать миграцию мышиных перитонеальных макрофагов до 14 ч в градиенте хемотаксиса (дополняющего C5a).
Protocol
Протоколы следуют руководящим принципам нашего местного комитета по этике исследований, а также руководящим принципам по уходу за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс химиотаксиса.
1. Предварительное заполнение хемотаксис слайдов
-
Заполните 1 мм в ширину и 2 мм длиной соединительных каналов одного или двух слайдов chemotaxis с использованием модифицированного RPMI 1640 HEPES среднего, состоящего из бикарбоната свободной RPMI 1640 среды, содержащей 20 мм 4-(2-гидроксиэтил)-1-piperazrazinethesulf HEPES), 10% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и антибиотики, такие как пенициллин (100 U/mL) и стрептомицин (100 мкг/мл), приготовленные путем разбавления 100x пенициллина/стрептомицина, и 1 мкг/мл липополисахарида (от кишечной палочки),и толл-подобный рецептор 4 лиганда используется для активации клеток.
- Поместите слайд chemotaxis(рисунок 2A) в круглую (10 см в диаметре) блюдо клеточной культуры, как разогретый до 37 градусов по Цельсию, и установить блюдо на подогревом (37 градусов по Цельсию) алюминиевый блок. Вставьте вилки в порты 1 и 4(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Алюминиевый блок поддерживается при 37 градусах Цельсия и помещается внутри ламинара потока капот полезен для подготовки камер хемотаксиса. В идеале, отапливаемый блок должен обеспечить плоскую рабочую зону и колодцы для различных труб, таких как 50 мл труб и 2 мл микроцентрифуговых труб. - Используя наконечник пипетки 10-200 л с спрошенным наконечником, вносите 15 зл модифицированных RPMI 1640 HEPES средних в заполнение порта 3(рисунок 2B). Далее, с объемом по-прежнему установлен на 15 Зл и кнопка управления (2-20 л объема) пипетка депрессии, вставьте пипетку наконечник в порт 2 и аспир 15 Л с умеренно быстрой скоростью(рисунок 2B). Это позволит заполнить 1 мм х 2 мм соединительного канала (зона наблюдения), а также два фланговых канала снабжения (между центральной зоной наблюдения и портами 2 и 3, соответственно). Обложка заполнения портов 2 и 3 с колпачками.
- После предварительного заполнения, место хемотаксис слайды на стойку хранится в закрытой камере влажности в противном случае сухой и CO2-бесплатный инкубатор при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать правильный наконечник пипетки для заполнения слайда хемотаксиса. Сплетенный пипетка наконечник клинья в верхней части заполнения порта, в то время как обычно используется остроконечные советы пипетки могут быть вставлены более глубоко в порт заполнения и может значительно увеличить устойчивость к потоку жидкости.
- Поместите слайд chemotaxis(рисунок 2A) в круглую (10 см в диаметре) блюдо клеточной культуры, как разогретый до 37 градусов по Цельсию, и установить блюдо на подогревом (37 градусов по Цельсию) алюминиевый блок. Вставьте вилки в порты 1 и 4(рисунок 2B).
2. Изоляция мыши резидента Перитонеальных макрофагов
- Пожертвуйте 3-4-месячной мышью, используя высокую концентрацию летучих анестетик изофлюран (Зgt;5% в воздухе) или углекислого газа25, а затем вывих шейки матки. Потеря выправителя рефлекса у грызунов коррелирует с потерей сознания у людей26. Очистите живот мыши с 80% этанола в воде, а затем сделать 1-2 см разрез кожи средней линии с помощью хирургических ножниц с тупыми кончиками. Очистите назад кожу, чтобы разоблачить основной брюшной стенки.
- Вставьте 24 G пластиковый катетер в полость перитонеальной полости. Используя пластиковый шприц калибром 5 мл, проважёте полость, используя 2 х 4,5 мл буферизированного солевого раствора Хэнка (HBSS), без Ca2 и Mg2. Оставьте около 0,5 мл остаточного HBSS в шприце, так что ткани непреднамеренно всасывается на кончиккат катетера могут быть исключены.
- Передача лавагированная среда, как правило, 8-8,5 мл в общей сложности, в 14 мл полипропилена круглой нижней трубки. Центрифуги трубки на 300 х г в течение 6,5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Круглая нижняя трубка позволяет супернатанту быть полностью декантирован и уменьшает слипание клеток. - Откажитесь от супернатанта и отрепримите перитонеальные клетки (обычно 4 х 106 ячеек на мышь) в 200 л модифицированной среды RPMI 1640 HEPES. Разбавить образец суспензии клетки 1:20 и использовать устройство подсчета, такие как Neubauer улучшение счетной камеры, для подсчета клеток. Затем разбавьте суспензию клетки до конечной концентрации 10 х 106 ячеек/мл и поддерживайте клетки в круглой нижней 2 мл полипропиленовой микроцентрифуговой трубки при 37 градусах Цельсия с помощью нагретого алюминиевого блока (см. ПРИМЕЧАНИЕ в шаге 1.1.1).
3. Посев перитонеальных ячеек в химокисты
- После pipetting подвески ячейки вверх и вниз 5x с объемом пипетки, установленной на 100 Зл (или в половине объема подвески), чтобы уменьшить слипания, аккуратно депозит 10 злиц ячеек подвески в порт 3 камеры хемотаксиса (Рисунок 2C). Поместите наконечник пипетки в порт 2 и медленно нарисуйте подвеску ячейки в соединительный канал(рисунок 2C). Как только подвеска ячейки была введена, удалите пробки в портах 1 и 4, что поможет остановить поток подвески ячейки. Поместите колпачки на все четыре заправочных порта.
- Повторите шаг 3.1 для всех камер химиотерапии. Используя небольшой перевернутый микроскоп и объектив 10-кратный фазовый контраст, проинспектировать слайды хемотаксиса на нежелательные пузырьки воздуха.
- Поместите слайды хемотаксиса, посеянные перитонеальными клетками, в камере влажности при 37 градусах по Цельсию на 2-3 ч.
4. Заполнение водоемов и добавление хемоатантантанта
- Осмотрите зону наблюдения (канал, соединяющий два резервуара 40 л) с помощью перевернутого микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе плотность клеток будет выше, чем после заполнения резервуаров, потому что слабо адептов клетки, преимущественно КЛЕТКи CD19(Клетки B1), будут вымыты из зоны наблюдения во время заполнения процедуры(рисунок 2C-E). - Место вилки в заполнения портов 1 и 2(Рисунок 2D). Убедитесь, что заполнение порта 3 заполнено доверху средним и свободным от пузырьков воздуха. Используйте стерильную шприцевую иглу 27 G, чтобы выбить нежелательные пузырьки воздуха, если это необходимо.
- Используя механическую трубу объемом 10-100 л, аспир 60 л модифицированного rpMI 1640 HEPES medium и поместите наконечник пипетки в порт заполнения 3. Используйте кольцо настройки громкости пипетки медленно и неуклонно вводить среду в резервуар так, что среда достигает верхней части заполнения порт 4 после 1-2 мин (Рисунок 2D).
- Заполните второй резервуар. Переместите вилку из порта 1 и медленно вставьте его в порт 3(рисунок 2D). Далее, аспир 50 qL модифицированного RPMI 1640 HEPES среднего и поместить пипетку наконечник в заполнение порта 4. Используйте кольцо настройки громкости 10-100 л объемпий пипетки медленно и неуклонно вводить среду во второй резервуар, так что среда достигает верхней части заполнения порт 1 после 1-2 мин (Рисунок 2D).
- Поместите 495 л модифицированного rpMI 1640 HEPES среднего в (круглое дно) 2 мл микроцентрифуговой трубки и добавить 5 л патента Blue V (запас раствор: 10 мг/мл в фосфат-буферный соленую »PBS» ), синий краситель, используемый в качестве визуального индикатора формирования града концентрации. Смешайте кратким вихрем. Добавьте 5,4 л рекомбинантной мышиной комплектации C5a (акционерное решение: 50 мкг/мл в PBS с 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и смешайте с помощью краткого вихря.
- Депозит 15 зл синего, дополнить C5a-содержащих среды в заполнении порта 1(Рисунок 3A), после убедившись, что неглубокая депрессия в верхней части порта является среднесвободным (в противном случае падение может перекинуться).
- Вставьте 10-200 л пипетки отзыв в заполнение порта 4 и медленно и неуклонно вращать объем настройки кольца 10-100 л объем пипетки, чтобы привлечь падение синего, дополнить C5a-содержащих среды в противоположном резервуаре (Рисунок 3B). Воздух начнет входить в короткую вертикальную колонку заправочного порта 1. Нарисуйте воздух до тех пор, пока интерфейс жидкости-воздуха находится на полпути в вертикальной колонке, а затем медленно вставьте вилку в порт.
- Аккуратно поднимите пипетку из порта 4, используя другую руку, чтобы убедиться, что слайд остается фиксированным на месте. Наконец, медленно подключить порт 4(Рисунок 3B).
- Осмотрите слайд хемотаксиса на перевернутом микроскопе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные клетки адептов в зоне наблюдения должны быть преимущественно макрофагами. Это может быть подтверждено с помощью флуоресцентно помеченных антител F4/80 (F4/80 является специфическим маркером для макрофагов мыши). В-клетки могут быть идентифицированы с помощью флуоресцентно помеченных антител-CD19 и F4/80-/CD19- клетки могут быть обнаружены с помощью синего флуоресцентного пятна нуклеиновой кислоты (Рисунок 4).
5. Изображение макрофагной миграции по промежуток времени, фазовая контрастная микроскопия
- Поместите слайд хемотаксиса на сцену перевернутого микроскопа, оснащенного сценическим инкубатором. Поддерживайте температуру на уровне 37 градусов по Цельсию.
- Изображение области наблюдения 1 мм х 2 мм с помощью 10-кратных фазоно-контрастных объективных объективов и сосредоточьтесь на макрофаге ламеллиподии: тонких, листоподобных мембранных выступов. Захват изображения для 14 ч со скоростью 1 кадр каждые 2 мин.
6. Анализ изображений с покадровой успеваемое
- Проанализируйте замедленное, фазово-контрастные изображения с помощью автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений или плагина ручного слежения, созданного Фабрисом. Кордельересом, для ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированные программы слежения могут использоваться для анализа клеток, изображений либо замедленной, фазовой контрастной или флуоресценцичной микроскопии. Например, программное обеспечение iTrack4U на основе Java, производимое Cordeli'res et al.27, может использоваться для автоматического отслеживания и анализа клеток с использованием замедленного, фазового контраста или флуоресценции в качестве ввода. Ручное отслеживание занимает больше времени, но треки, генерируемые подручным слежением ImageJ, могут быть непосредственно импортированы и автоматически проанализированы плагином ImageJ Chemotaxis и инструментом миграции28,29.
Representative Results
Схематическая схема слайда chemotaxis, используемая для замедленной видеомикроскопии перитонеальных макрофагов мыши, мигрирующих в хемотаксическом градиенте, показана на рисунке 2A. Слайд содержит три камеры хемотаксиса, каждая из которых имеет четыре заправочных порта. Порты могут быть индивидуально закрыты с помощью пробок, показанных над слайдом. Кроме того, крышка без герметизации может быть установлена над отключенным портом для поддержания бесплодия. После подключения портов 1 и 4, область наблюдения (1 мм в ширину х 2 мм длиной х 70 мкм высокий канал, соединяющий два резервуара) между портами 2 и 3 может быть предварительно заполнена со средним путем размещения 15 л падение в порт 3 и aspirating с 2-20 мл объем пипетка в порту 2(Рисунок 2B). Подвеска мыши резидента перитонеальных клеток (10 х 106 ячеек/мл) был посеян в области наблюдения, поместив 10 л падение подвески в порт 3 и медленно aspirating в порту 2 (Рисунок 2C). Типичное изображение клеток, посеянных в зоне наблюдения, сделанное фазоконтрастной микроскопией с помощью 10-кратного объективного объектива, показано на рисунке 2C. После инкубации в течение 2-3 ч, хемотаксис слайд медленно заполнены со средним(рисунок 2D). После подключения портов 1 и 2, среда медленно вводилась через порт 3, пока не вышла из порта 4. Затем вилка была переключена с порта 1 на порт 3, а затем второе водохранилище было заполнено медленно инъекционным средством через порт 4, пока не появилось в порту 1. На этом этапе клетки в зоне наблюдения были повторно проверены с помощью перевернутого микроскопа(рисунок 2E). Сравнивая изображения незадолго до (Рисунок 2C) и после (Рисунок 2E) заполнения резервуаров, до двух третей клеток были вымыты из зоны наблюдения. Как правило, слабо приверженные+ клетки CD19 (B1 клетки) были вымыты, а остальные клетки были преимущественно F4/80- клетки (макрофаги). Это было продемонстрировано флуоресценцией микроскопии после маркировки каждого типа клеток с флуоресцентно помечены конкретные антитела (Рисунок 4). На рисунке 4A, свежеисправенные мыши резидентов перитонеальных клеток были помечены зеленым флуоресцентным флуорофором-конъюгированных антител F4/80 и красный флуоресцентный флуорофор-конъюгированных антител анти-CD19, и ядра клеток были помечены с голубой флуоресцентной ямочной кислоты. F4/80 является специфическим маркером для макрофагов мыши30, в то время как CD19 является маркером Ячейки B. На рисунке 4B показаны клетки F4/80, изображенные вращающейся дисковой конфокальной микроскопией в зоне наблюдения камеры хемотаксиса.+ Клетки были помечены после ночного анализа химиотаксиса, записанного покадровой, фазово-контрастной микроскопии.
Дополнение C5a (химиоатантант) было введено в один из двух резервуаров, разместив 15 л капли среды, содержащей 0,54 мкг/мл (рекомбинантная мышь) дополняют C5a и 10 мкг/мл патент Blue V в порт заполнения 1 (Рисунок 3A) после подключения портов 2 и 3. Химиоатантантная среда медленно втягивалась в резервуар медленным устремлением с помощью пипетки через порт 4. На рисунке 3B показано диффузии синего красителя после рисования капли 15 л в резервуар. Патент Blue V использовался в качестве косвенного визуального индикатора диффузии химиоаттантов. Дополнить C5a молекулы значительно больше, чем у патента Blue V (9,0 kDa против 0,57 kDa) и диффузии медленнее. После распространения дополнения C5a в резервуаре его концентрация составила 0,2 мкг/мл (15 л/40 л.с. (объем водохранилища) х 0,54 мкг/мл и 0,2 мкг/мл, что эквивалентно 22,5 нм. Скромно крутой градиент образовался через зону наблюдения после 3 ч и продолжал увеличиваться, достигая максимума в 12 ч31. На рисунке 3C показаны миграционные треки макрофагов, мигрирующих в градиенте C5a, между 6-12 ч после добавления химиоатантата. Скорость клеток и химиотаксическая эффективность, проиндексированные как y-FMI (y-forward migration index; диапазон: от -1 до 1) и x-FMI, отдельных макрофагов были рассчитаны из миграционных участков(рисунок 3D). На рисунке 3D также показан миграционный участок, созданный после нормализации начальной точки каждого миграционного трека до X и 0 и 0 ниже участков коробки. Встроенная в миграционный график показывает, как был рассчитан y-FMI для каждого миграционного трека.
Рисунок 1: Рабочий процесс химиотаксиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обработка слайдов хемотаксиса. (A) 3D вид на слайд химиотерапии с четырьмя пробками и четырьмя колпачками. Слайд содержит три камеры хемотаксиса, каждая из которых состоит из двух резервуаров 40 мл, соединенных каналом высотой 1 мм х 2 мм, который высотой 70 мкм, который называется областью наблюдения. (B) Соединительный канал простирается на обоих концах до заполнения портов 2 и 3. После вставки ввиллеты в порты 1 и 4, область наблюдения была предварительно заполнена средним (красным), применяя падение среднего к порту 3 и успокоившись в порту 2 с наконечником пипетки 10-200 л. Впоследствии, колпачки были применены к портам 2 и 3 перед инкубированием слайда при 37 градусах Цельсия и подготовкой суспензии ячейки. (C) Область наблюдения, где сформировался градиент хемоатовантов, была посеяна макрофагами, применяя 10 л капли мыши резидента перитонеальных клеток в порту 3 и медленно аспирации в порту 2. Слайд затем инкубировался в камере влажности при 37 градусах по Цельсию в течение 2-3 ч. Фазовое контрастное изображение, показанное справа, полученное через 10-кратный объективный объектив, показывает перитонеальные клетки после посева и инкубации при 37 градусах по Цельсию при 2 ч. Шкала бар 500 мкм. (D) Камеры Chemotaxis были заполнены средой путем подключения портов 1 и 2, а затем медленно инъекционных среды через порт 3, пока он не появился в порту 4. Медленная и устойчивая начинка может быть достигнута путем поворота кольца настройки громкости в 20-100 л объемного пипетки. После заполнения первого резервуара, второе резервуар может быть заполнено путем подключения портов 2 и 3, а затем медленно инъекционных среды в порту 4, пока он не появится в порту 1. (E) Фазовое контрастное изображение той же области наблюдения, показанной выше (C) после заполнения двух резервуаров. Шкала бар 500 мкм. Графические элементы, предоставляемые Элиас Хорн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Химиотаксис асссс. (A) Химиоататтат был введен в один из двух резервуаров камеры химиотаксиса, применяя 15 qL падение среды, содержащей 0,54 мкг/мл дополнения C5a и 10 мкг/мл патентBlue Blue V для заполнения порта 1, а затем медленное аспирации в порту 4. (B) Первоначально после того, как втягивается в резервуар синий, химиоаттрактор-содержащих среды была примерно перевернутой формы капли, а затем медленно рассеяны по всему резервуару. (C)Миграционные треки макрофагов, мигрирующих в градиент хима химового хитрата х 6-12 ч после введения химиоатантанта в один из резервуаров. Направление градиента указывается справа. Конец каждого трека миграции указывается заполненным кругом. (D) Блокс графики скорости, X-FMI (индекс x-вперед миграции) и y-FMI (y-forward индекс миграции), индекс химиотаксической эффективности, которая колеблется от -1 до No 1. Данные были получены путем анализа 25 путей миграции макрофагов. Макрофаги в нижней половине зоны наблюдения, показывающие смещение по крайней мере одной ширины ячейки более 6 ч, были случайным образом выбраны для анализа. Ниже приведен участок миграционных путей после нормализации стартовой точки до X q 0 и Y q 0. Индекс хемотаксиса (y-FMI) был рассчитан путем деления чистого смещения вдоль оси Y-d на накопленную длину (л) пути миграции, как это было показано в схематисце. Графические элементы в панелях A и B, предоставленные Элиасом Хорном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Флуоресцентные изображения живых мышей резидентов перитонеальных клеток, полученных спиннинг диска конфокальной микроскопии. (A) Расширенное изображение фокуса (ярчайшее слияние точки всех плоскостей) свежеизолированных мышей перитонеальных клеток, помеченных зелеными флуоресцентными анти-F4/80 (макрофаг-маркер) антителами, красными флуоресцентными антителами против CD19 (маркер в ячейки) и синим флуоресцентным ядочным пятном. Шкала бар No 10 мкм. (B) Снимок (одиночный-самолет) из F4/80- клетки (макрофаги) в области наблюдения камеры хемотаксиса, принятых после ночного анализа хемотаксиса. Клетки были помечены зелеными флуоресцентными анти-F4/80 антителами и синим флуоресцентным пятном нуклеиновой кислоты. Дополняющие C5a и Патентные голубые V градиенты были вымыты процедурой маркировки клеток, что объясняет, почему верхний резервуар в схеме камеры хемотаксиса не синий. Шкала бар 10 мкм. Графический элемент, предоставляемый Элиас Хорн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Интравитальная визуализация датируется 19-м веком и предоставляет средства для изучения поведения живых иммунных клеток в их естественной среде обитания. Однако, даже при современных передовых микроскопии и генетических методах трудно изучить реакцию клеток на конкретные хемоаттракторы in vivo. Чтобы обойти эту проблему, Бойден18 разработал Transwell анализы в 1960-х годов, но эти конечные точки анализы не обеспечивают визуализацию того, как клетки на самом деле мигрировали в сторону хемоатантантантов, что затрудняет различать хемокинез, стимулировали случайные миграции химический сигнал32, и хемотаксис, миграция в сторону более высокой концентрации химических стимулов друг от друга33. Эта проблема была решена путем проектирования различных открытых камер с мостом, как правило, 1 мм в ширину, расположенный между двумя резервуарами и доступныобъективной линзы21,22,23. Применяя перевернутый слип крышки, посеянный клетками-приверженцами, закрывает камеры и хемоатантант добавляется к одному из резервуаров, диффузии через мост к противоположному водохранилище, создавая градиент концентрации. Здесь мы описываем химиотаксис асссс, используя тот же принцип, но с помощью закрытой камеры с четырьмя заполнительными портами. Используя эту систему и замедленной, фазово-контрастную микроскопию, мы разработали анализ изображения мыши резидента перитонеальных макрофагов мигрируют в хемотаксическом дополнение C5a градиент31,34,35,36. Этот анализ, в сочетании с моделями нокаут мыши, оказался полезным в исследовании роли различных Rho GTPases и моторных белков в морфологии макрофагов, подвижность, и хемотаксис31,34,35,36,37. Мы также использовали этот подход к изображению человека периферических моноцитов крови мигрируют на 2D поверхности или в 3D коллагена типа I матрицы38. Кроме того, анализ подходит для мыши костного мозга полученных макрофагов или макрофагов, полученных из условно увековеченных миелоидных клеток прекурсоров39,40. Ранее мы использовали политетрафторэтилен (PTFE) мешки с люер адаптеры для культуры клеток костного мозга и получить макрофаги34. Преимущество мешков PTFE в том, что клетки могут быть легко перевешены и готовы к использованию после размещения мешка на льду в течение 20-30 мин. Обратите внимание, что мы предзаполняем область наблюдения слайда chemotaxis перед введением клеток. Этот подход имеет то преимущество, что нежелательные пузырьки воздуха могут быть впоследствии смыты (с переменным успехом) и предварительно пропитанной области наблюдения позволяет медленное введение клеточной подвески путем пипетки. Предварительное заполнение, однако, увеличивает вероятность того, что среда частично потечет в один или оба фланговых резервуара, что будет способствовать посеву клеток за пределами зоны наблюдения. Кроме того, суспензия клеток может быть непосредственно пиппедвена в сухую зону наблюдения, но нежелательные пузырьки воздуха не могут быть впоследствии исключены.
Перитонеальная полость мыши содержит две основные популяции клеток: F4/80- макрофаги и (меньше) CD19и В-клетки, в соотношении около 1:2 (Рисунок 4A). Эти две популяции клеток составляют более 95% клеток полости перитонеальной полости, в то время как остальные F4/80-/CD19- клетки обычно могут быть идентифицированы какклетки CD11c (дендритные клетки) или КЛЕТКиCD3 (Т-клетки). Слабо приверженцы В-клеток вымываются из зоны наблюдения во время заполнения резервуаров со средой(рисунок 2). После добавления химиоатанта в один из двух резервуаров, замедленной, фазово-контрастной микроскопии могут быть использованы для изображения остальных клеток (макрофагов), мигрирующих в развивающемся градиенте хемоаантанта. Формирование градиента c5a в зоне наблюдения, путем диффузии от одного резервуара к другому, можно смоделировать с помощью флуоресцентного красителя с аналогичным молекулярным весом. Хорошей заменой рекомбинантной мыши дополнение C5a (прогнозируемый молекулярный вес, 9,0 kDa) является флуоресцентно помечены dextran (10 kDa)31. С помощью конфокальной микроскопии градиент флуоресценции в узком канале (зоне наблюдения), соединяющем два резервуара слайда хемотаксиса, может быть измерен с фиксированными интервалами, а профили концентрации в разных временных точках могут быть построены24,31. Мы регулярно добавляем нефлуоресцентный синий краситель (Patent Blue V) в химиоатантальную среду, чтобы обеспечить удобный визуальный индикатор диффузии и градиентного образования. В течение 1 ч введения 15 л синего, химиоаттракторно-содержащего среды в резервуар, резервуар появляется равномерно синий и, в соответствии с законами Fick диффузии, градиент будет формироваться через узкую зону наблюдения, соединяющую резервуары (Рисунок 3B). Несколько дней требуется для растворимый (синий краситель или химиоатант), чтобы стать равномерно распределены.
Флуоресцентная микроскопия может быть заменена фазовой контрастной микроскопией, которая дает преимущества для автоматического отслеживания клеток, поскольку флуоресцентно маркированные клетки можно легко отличить от фона. Еще одним преимуществом является то, что конкретные популяции иммунных клеток могут быть выборочно отслежены после маркировки поверхностных маркеров флуоресцентными антителами. Мы использовали этот подход к изображению человеческой периферической крови CD14- клетки (моноциты) мигрируют в хемотаксическом fMLP (N-формилметилонинин-лейпил-фенилаланин) градиент38. Аналогичным образом, флуоресцентные анти-F4/80 антитела могут быть использованы для изображения мыши макрофаги мигрируют в химиотаксическом дополнение C5a градиента. Фототоксичность является потенциальным недостатком использования флуоресценции изображения41. Это может быть уменьшено различными средствами42, в том числе с помощью флюорофоров возбужденных с более длинными длинами волн и добавление антиоксидантов в среду. Кроме того, помеченные клетки могут быть первоначально идентифицированы с помощью флуоресценции микроскопии и впоследствии изображены позаме, фазово-контрастной микроскопии. Тем не менее, на практике, клетки, движущиеся на умеренно низких скоростях, таких как 1 мкм/мин (макрофаги) или 4 мкм/мин (моноциты), могут периодически изображенияться флуоресценцией микроскопии с интервалами в минуты, который хорошо переносится38. Ранее мы использовали флуоресценцию микроскопии и химиотаксис слайд описан здесь для 3D химиотаксис анализы38,43. В этом случае оба резервуара были предварительно заполнены средой, содержащей средний и 15 км хемоатантатов, был втянут в один из резервуаров непосредственно перед тем, как медленно трубачать флуоресцентно маркированные клетки, взвешенные в среде, содержащей коллаген типа I, в зону наблюдения. Трудной частью этой процедуры является обработка коллагена типа I, который концентрируется в кислой растворе. РН раствора коллагена необходимо нейтрализовать путем добавления щелочного раствора перед смешиванием ледяного коллагена с клеточной суспензией. Передача коллагеноклеточной смеси в инкубатор при 37 градусах Цельсия инициирует полимеризацию коллагена. Во время инкубации слайд должен медленно вращаться вокруг своей длинной оси, чтобы клетки оставались равномерно распределенными в направлениях X-, Y- и No-оси, в то время как коллаген полимеризируется в гель. Связанные закрытые chemotaxis слайд подходит для 3D химиотаксис анализы, с шестью пробками вместо четырех вилки, недавно было описано29. Эта система позволяет вводить коллагено-клеточную смесь в зону наблюдения перед самостоятельной заполнением каждого из фланговых резервуаров, поскольку каждый резервуар имеет два заправочных порта, а не один порт.
Таким образом, мы описываем в режиме реального времени химиотаксис ассс, который позволяет визуализации клеток навигации в химиотаксическом градиенте в течение 6 или более часов. Здесь мы фокусируемся на макрофагах, которые играют важную роль в воспалительных заболеваниях, но были недопредставлены в анализах хемотаксиса в реальном времени по сравнению с более быстрыми движущимися клетками, такими как нейтрофилы и диктиостелии амеба.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом (HA 3271/3-2) от DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I.
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
