Summary
Her beskriver vi metoder ved hjelp av tidsforløp, fasekontrastmikroskopi til bildemusbosatteperitoneal makrofager i en kjemotaktisk komplement C5a gradient. Protokollene kan utvides til andre immunceller.
Abstract
Chemotaxis er reseptormediert veiledning av celler langs en kjemisk gradient, mens chemokinese er stimulering av tilfeldig cellemotilitet av et kjemikalie. Chemokinesis og chemotaxis er grunnleggende for mobilisering og distribusjon av immunceller. For eksempel kan chemokiner (kjemotaktiske cytokiner) raskt rekruttere sirkulerende nøytrofiler og monocytter til ekstravaskulære steder av betennelse. Kjemoattractant reseptorer tilhører den store familien av G protein-koblet reseptorer. Hvordan kjemoattractant (dvs. ligand) gradienter direkte cellemigrasjon via G protein-koblet reseptor signalering er ennå ikke fullt ut forstått. Innen immunologi er nøytrofiler populære modellceller for å studere chemotaxis in vitro. Her beskriver vi en todimensjonal (2D) chemotaxis analyse skreddersydd for musbosatte makrofager, som tradisjonelt har vært vanskeligere å studere. Makrofager beveger seg i et sakte tempo på ~ 1 μm / min på en 2D-overflate og er mindre godt egnet for point-source migrasjon analyser (f.eks migrasjon mot spissen av en mikropipette fylt med kjemoattractant) enn nøytrofiler eller Dictyostelium discoideum, som beveger en størrelsesorden raskere. Mye brukt Transwell analyser er nyttige for å studere kjemotaktisk aktivitet av forskjellige stoffer, men gir ikke informasjon om celle morfologi, hastighet, eller kjemotaktisk navigasjon. Her beskriver vi en tidsforløpmikroskopibasert makrofagchemotaxis analyse som tillater kvantifisering av cellehastighet og kjemotaktisk effektivitet og gir en plattform for å avgrense transdusere, signalveier og effektorer av chemotaxis.
Introduction
Immunceller migrerer vanligvis singly på en 2D-overflate i en amoeboid mote1,2,som innebærer gjentatte sykluser av fremspring av fronten, integrin-mediert celle adhesjon, og tilbaketrekking av baksiden. Et nødvendig trinn er cellepolarisering, der celler danner foran og bak ender3. Chemotaxis starter med påvisning av kjemoattractants av G protein-koblet reseptorer og et komplekst signalnettverk mediert av membran-forankret heterotrimeric G proteiner og små monomeric G proteiner, samt fosfolipid-bundet guanin nukleotid utvekslingfaktorer (GEFs)4,5. Aktivering av Rho GTPases av Cdc42 og Rac underfamilier indusere fremspring på forsiden6 og medlemmer av Rho subfamily, spesielt RhoA, aktivere sammentrekning av de bakre5,7. I et tredimensjonalt (3D) miljø er integrins i stor grad overflødige for leukocytter migrasjon og RhoA blir viktigere for å klemme celler gjennom trange passasjer8, mens Cdc42- eller Rac-indusert Arp2/3 aktivering fortsatt er viktig for kjemotaktisk styring9,10.
Immunceller kan møte forskjellige kjemoattractants, spesielt i innstillingene for vevskade, patogen invasjon, og betennelse. De endogene kjemoattractants uttrykt på phagocytes utfyller C3a og C5a, genereres raskt ved aktivering av komplementkaskade, og gjenkjennes av komplement C3a og C5a reseptorer. Tilsvarende, nekrotiske celler rekruttere phagocytes via formyl peptid reseptorer, som gjenkjenner mitokondrier-avledet samt bakterier-avledet formyl peptider11. Immunceller uttrykker også G protein-koblet reseptorer for chemokiner, en stor familie av kjemoattractant peptider involvert i regulering av immuncellehandel under både homeostase og betennelse. Chemokines er klassifisert i fire grupper avhengig av avstanden til de to første cystein (C) rester: C, CC, CXC, og CX3C cytokiner, hvor X er en aminosyre. Dermed må in vivo immunceller reagere hensiktsmessig på svært komplekse romlige og temporale signaler, noe som gjør studiet av chemotaxis til en skremmende oppgave. Nedenfor gir vi en kort historie med chemotaxis, som begynte med intravitale bildemetoder.
Studien av leukocytter chemotaxis dateres tilbake til 188812, da øyelege Theodorologist Karl Gustav Leber tydelig beskrev den rettede migrasjonen av leukocytter til, og akkumulering på, steder av betennelse i en modell av mykotisk (sopp) keratitt. Leber understreket at tiltrekningen av overflødige leukocytter av patogene stoffer er viktig for eliminering av skadelige mikroorganismer via fagocytose, som hadde blitt beskrevet av Metchnikoff (også kjent som Metschnikoff) tidligere i samme tiår13. In vivo eksperimenter ble også utført på 1920-tallet av Clark og Clark14,15, som utnyttet gjennomsiktigheten av rumpetroll og viste at steril betennelse indusert av croton olje14 eller andre irriterende15 forårsaket leukocytter å holde seg til blodkar, etterfulgt av diapdesis (transendothelial migrasjon) og rask migrasjon gjennom vevsområdene mot itantrri. I vitro eksperimenter ved hjelp av mikrocinematografi metoden utviklet av Jean Comandon16 viste at leukocytter migrerte mot en partikkelkjemoattractant kilde som bakterier17. På den tiden var de molekylære identitetene til kjemotaktiske faktorer ukjente. På 1960-tallet innså Stephen Boyden18 at teknikker for å studere kjemotaktisk aktivitet av løselige stoffer manglet. Han utviklet et kammer, senere kjent som Boyden-kammeret, med to rom adskilt av en filterpapirmembran. En cellesuspensjon legges til det øvre rommet, og teststoffet legges til enten begge rommene eller bare i det nedre rommet. Etter en inkubasjonsperiode fjernes filtermembranen, og cellene er faste og farget. Ved å sammenligne hvor mange celler som migrerer over filtermembranen mot den nedre brønnen med teststoffet i begge rom, i verken rom, eller bare i det nedre rommet, kan kjemotaktisk aktivitet bestemmes. Transwell analyser er fortsatt populære i dag og har blitt endret på ulike måter, inkludert bruk av forskjellige polykarbonatmembraner med definerte porestørrelser og tettheter19,20. En stor ulempe med Transwell-analyser er at det er upraktisk å visualisere celler som migrerer direkte, og migrasjonsbanen over membranen overstiger vanligvis ikke diameteren på en immuncelle.
Sally H. Zigmond utviklet et chemotaxis kammer21 som gjorde det mulig å visualisere både gradientdannelse og cellemorfologi ved hjelp av fluorescerende fargestoffer. Kammeret består av en plexiglass (akryl) lysbilde med to parallelle lineære brønner, hver med et volum på ~ 100 μL, atskilt med en 1 mm bred bro 3-10 μm under det øvre planet av lysbildet. En coverslip seeded med celler er invertert og plassert på lysbildet slik at den strekker seg over de to brønnene. Etter tillegg av et kjemoattractant til en av brønnene, dannes en bratt kjemoattractant gradient over broen, vanligvis innen 30–90 min. Humane polymoromukukytter (granulocytter) i Zigmond-kammeret observeres orientere seg mot kjemoattractant. Variasjoner av Zigmond-kammeret er rapportert, inkludert Dunn22 og Insall23 kamre, som begge bruker en coverslip seeded med celler plassert over to brønner atskilt med en 1 mm bred bro. Dunn-kammeret består av konsentriske brønner adskilt av en sirkulær bro, mens Insall-kammeret er tettere knyttet til Zigmond-kammeret, men gir broer med to forskjellige bredder, 0, 5 mm og 1 mm. En ny chemotaxis kammer, kalt μ-Slide Chemotaxis og produsert av plast injeksjon molding, ble beskrevet av Zemgel et al.24. Chemotaxis kammeret består av to 40 μL reservoarer atskilt med en 1 mm bred kanal med en lengde på 2 mm og en høyde på 70 μm. Bunnen av kammeret er dannet av en gassgjennomtrengelig, tynn plastark med samme tykkelse og optiske egenskaper av en Nr. 1,5 glass coverslip24. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjelp av μ-Slide Chemotaxis kammeret for å visualisere migrering av mus bosatt peritoneal makrofager for opptil 14 timer i en kjemotaktisk (komplement C5a) gradient.
Protocol
Protokollene følger retningslinjene til vår lokale forskningsetiske komité, samt retningslinjene for dyrepleie.
MERK: Figur 1 viser en arbeidsflyt for chemotaxis-analysen.
1. Forhåndsutfylling av Chemotaxis-lysbilder
-
Forfyll 1 mm brede og 2 mm lange tilkoblingskanaler av en eller to chemotaxis lysbilder ved hjelp av modifisert RPMI 1640 HEPES medium, bestående av bikarbonatfrie RPMI 1640 medium som inneholder 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 10 % varmeinaktivert føtal storfeserum (FBS) og antibiotika som penicillin (100 E/ml) og streptomycin (100 μg/ml), tilberedt ved å fortynne 100x penicillin/streptomycin, og 1 μg/ml lipopolysakkarid (fra E. coli)og en Toll-lignende reseptor 4 ligand brukt for å aktivere cellene.
- Plasser en chemotaxis slide (Figur 2A) i en rund (10 cm diameter) cellekulturrett, både forvarmet til 37 °C, og sett parabolen på en oppvarmet (37 °C) aluminiumblokk. Sett pluggene inn i portene 1 og 4 (Figur 2B).
MERK: En aluminiumsblokk som opprettholdes ved 37 °C og plasseres inne i lamiklassstrømningshetten er nyttig for å forberede chemotaxis kamre. Ideelt sett bør den oppvarmede blokken gi et flatt arbeidsområde og brønner for ulike rør, for eksempel 50 ml rør og 2 ml mikrocentrifugerør. - Bruk en 10–200 μL pipettespiss med skrått tips, deponer 15 μL modifisert RPMI 1640 HEPES-medium i fylleport 3 (Figur 2B). Deretter, med volumet fortsatt satt til 15 μL og kontrollknappen på (2–20 μL volum) pipette trykket inn, sett pipettespissen inn i port 2 og aspirere 15 μL med en moderat rask hastighet (figur 2B). Dette vil forfylle 1 mm x 2 mm tilkoblingskanal (observasjonsområde), samt de to flankerende forsyningskanalene (mellom det sentrale observasjonsområdet og portene 2 og 3). Dekk fylleporter 2 og 3 med caps.
- Etter forhåndspåfylling plasserer du chemotaxis-lysbildene på et stativ som holdes i et lukket fuktighetskammer innenfor en ellers tørr og CO2-friinkubator ved 37 °C.
MERK: Det er viktig å bruke riktig pipettespiss for å fylle chemotaxis-lysbildet. En skråpipettespissen kiler inn i toppen av fylleporten, mens ofte brukte spisse pipettespisser kan settes dypere inn i fylleporten og kan øke motstanden mot væskestrømmen.
- Plasser en chemotaxis slide (Figur 2A) i en rund (10 cm diameter) cellekulturrett, både forvarmet til 37 °C, og sett parabolen på en oppvarmet (37 °C) aluminiumblokk. Sett pluggene inn i portene 1 og 4 (Figur 2B).
2. Isolering av musebosatte peritoneale makrofager
- Ofre en 3–4 måneder gammel mus ved hjelp av en høy konsentrasjon av den flyktige bedøvelsesisofluran (>5% i luft) eller karbondioksid25, etterfulgt av livmorhalsforvridning. Tap av rettende refleks hos gnagere korrelerer med bevissthetstap hos mennesker26. Rengjør musens mage med 80% etanol i vann og lag deretter et 1–2 cm midtlinjet hudsnitt ved hjelp av kirurgisk saks med stumpe spisser. Skrell huden tilbake for å eksponere den underliggende bukveggen.
- Sett et 24 G plastkateter inn i bukhulen. Ved hjelp av en 5 ml plastsprøyte, lavage hulrommet ved hjelp av 2 x 4,5 ml iskald Hank bufret saltløsning (HBSS), uten Ca2 + og Mg2 +. La rundt 0,5 ml gjenværende HBSS i sprøyten, slik at vevet utilsiktet suges på tuppen av kateteret kan utvises.
- Overfør det lavaged medium, vanligvis 8-8,5 ml totalt, til en 14 ml polypropylen rundt bunnrøret. Sentrifugerrøret ved 300 x g i 6,5 min ved romtemperatur.
MERK: Det runde bunnrøret gjør at supernatanten kan dekanteres fullstendig og reduserer celleklumpen. - Kast supernatanten og resuspender peritonealcellene (vanligvis ~ 4 x 106 celler per mus) i 200 μL modifisert RPMI 1640 HEPES-medium. Fortynn en prøve av cellesuspensjonen 1:20 og bruk en telleenhet, for eksempel et Neubauer forbedret tellekammer, til å telle cellene. Deretter fortynner cellesuspensjonen til en endelig konsentrasjon på 10 x 106 celler/ml og opprettholder cellene i en rund bunn 2 ml polypropylenmikrocentrifugerør ved 37 °C ved hjelp av en oppvarmet aluminiumsblokk (se MERK i trinn 1.1.1).
3. Seeding Peritoneal Celler i Chemotaxis Slides
- Etter pipettering opp og ned 5x med pipettevolumet satt til 100 μL (eller ved halvparten av fjæringsvolumet) for å redusere klumping, sett forsiktig 10 μL av cellesuspensjonen i port 3 i et chemotaxiskammer (figur 2C). Plasser pipettespissen i port 2 og trekk cellesuspensjonen langsomt inn i tilkoblingskanalen (Figur 2C). Så snart cellesuspensjonen er innført, fjerner du pluggene i port 1 og 4, noe som vil bidra til å stoppe strømmen av cellesuspensjonen. Plasser caps på alle fire fylleporter.
- Gjenta trinn 3.1 for alle chemotaxis kamre. Ved hjelp av et lite invertert mikroskop og en 10x fasekontrastobjektiv linse, inspiser chemotaxis lysbildene for uønskede luftbobler.
- Plasser chemotaxis lysbildene seeded med peritonealceller i et fuktighetskammer ved 37 °C i 2–3 timer.
4. Fylle reservoarene og legge til kjemoattractant
- Inspiser observasjonsområdet (kanal som forbinder de to 40 μL reservoarene) ved hjelp av et omvendt mikroskop.
MERK: På dette stadiet vil celletettheten være høyere enn etter fylling av reservoarene, fordi svakt sperrende celler, hovedsakelig CD19+ celler (B1-celler), vil bli vasket ut av observasjonsområdet under fyllingsprosedyren (figur 2C-E). - Plasser pluggene i fylleportene 1 og 2 (Figur 2D). Sørg for at fylleport 3 er fylt til toppen med middels og fri for luftbobler. Bruk en steril 27 G sprøytekanyle til å løsne uønskede luftbobler, om nødvendig.
- Bruk en mekanisk pipette med 10–100 μL volum, aspirerte ~60 μL modifisert RPMI 1640 HEPES-medium og plasser pipettespissen i fylleport 3. Bruk voluminnstillingsringen på pipetten til å sakte og jevnt injisere medium i beholderen slik at mediet når toppen av fylleporten 4 etter 1–2 min (figur 2D).
- Fyll det andre reservoaret. Flytt støpselet fra port 1 og sett den langsomt inn i port 3 (Figur 2D). Deretter aspirere ~ 50 μL av modifisert RPMI 1640 HEPES medium og plasser pipettespissen i fylleport 4. Bruk voluminnstillingsringen til 10–100 μL volumpipette til å sakte og jevnt injisere medium i det andre reservoaret slik at mediet når toppen av fylleporten 1 etter 1–2 min (figur 2D).
- Plasser 495 μL modifisert RPMI 1640 HEPES medium i en (rund bunn) 2 ml mikrocentrifugerør og tilsett 5 μL patentblå V (lageroppløsning: 10 mg/ml i fosfatbufret saltvann [PBS]), et blått fargesett som brukes som visuell indikator på konsentrasjonsgradientdannelse. Bland med kort virvlende. Tilsett 5,4 μL rekombinant mus komplement C5a (lagerløsning: 50 μg/ml i PBS med 0,1% storfe serum albumin) og bland med kort virvlende.
- Deponer 15 μL blå, komplement C5a-holdig medium i fylleport 1 (Figur 3A), etter å ha sørget for at den grunne depresjonen på toppen av porten er middels fri (ellers kan fallet søle).
- Sett en 10–200 μL pipettespiss inn i påfyllingsport 4 og roter volumet langsomt og stødig voluminnstillingsringen på pipetten på 10–100 μL for å trekke dråpeblått, komplementer C5a-holdig medium inn i det motsatte reservoaret (Figur 3B). Luft vil begynne å gå inn i den korte vertikale kolonnen med fyllingsport 1. Trekk inn luft til væskeluftgrensesnittet er midtveis i den vertikale kolonnen, og sett deretter en plugg langsomt inn i porten.
- Løft pipetten forsiktig fra port 4, og bruk den andre hånden for å sikre at skyvet forblir festet på plass. Til slutt, sakte plugg port 4 (Figur 3B).
- Inspiser chemotaxis-lysbildet på et omvendt mikroskop.
MERK: De resterende tilhengerne i observasjonsområdet bør hovedsakelig være makrofager. Dette kan bekreftes ved hjelp av fluorescerende merket anti-F4/80 antistoffer (F4/80 er en bestemt markør for musemakrofager). B-celler kan identifiseres ved hjelp av fluorescerende merket anti-CD19 antistoffer og F4/80-/ CD19- celler kan oppdages ved hjelp av en blå fluorescerende nukleinsyre flekk (Figur 4).
5. Imaging Macrophage Migration etter time-lapse, fasekontrast mikroskopi
- Plasser en chemotaxis lysbilde på scenen av et omvendt mikroskop utstyrt med en scene inkubator. Hold temperaturen ved 37 °C.
- Bilde 1 mm x 2 mm observasjonsområdet ved hjelp av en 10x fasekontrastobjektiv og fokuser på makrofaglamellipodia: tynne, arklignende membranfremspring. Ta bilder i 14 timer med en hastighet på 1 ramme hvert 2.
6. Analyse av tidsforløpsbilder
- Analyser tidsforløp, fasekontrastbilder ved hjelp av automatisert bildeanalyseprogramvare eller manuell sporing plugin, produsert av Fabrice P. Cordelières, for ImageJ.
MERK: Automatiserte sporingsprogrammer kan brukes til å analysere celler som er avbildet av enten tidsforløp, fasekontrast eller fluorescensmikroskopi. Den Java-baserte programvaren iTrack4U produsert av Cordelières et al.27 kan for eksempel brukes til automatisert cellesporing og analyse ved hjelp av tidsforløp, fasekontrast eller fluorescensbilder som inndata. Manuell sporing er mer tidkrevende, men sporene som genereres av ImageJ plugin Manuell sporing kan importeres direkte og automatisk analyseres av ImageJ plugin Chemotaxis og Migration Tool28,29.
Representative Results
Et skjematisk diagram av chemotaxis lysbildet som brukes for tidsforløp videomikroskopi av mus peritoneale makrofager migrerer i en kjemotaktisk gradient vises i figur 2A. Lysbildet inneholder tre chemotaxis kamre, som hver har fire fylleporter. Porter kan lukkes individuelt ved hjelp av pluggene som vises over lysbildet. Alternativt kan en ikke-tetningshette plasseres over en frakoblet port for å opprettholde sterilitet. Etter at du har plugget porter 1 og 4, kan observasjonsområdet (1 mm bred x 2 mm lang x 70 μm høykanal som forbinder de to reservoarene) mellom portene 2 og 3, forhåndsutfylles med medium ved å plassere et 15 μL-fall i port 3 og aspirasjon med en 2–20 μL volumpipette ved port 2 (figur 2B). En suspensjon av mus bosatt peritoneal celler (10 x 106 celler / ml) ble sådd inn i observasjonsområdet ved å plassere en 10 μL dråpe suspensjon i port 3 og sakte aspirering på port 2 (Figur 2C). Et typisk bilde av celler som er sett i observasjonsområdet tatt av fasekontrastmikroskopi ved hjelp av et målobjektiv på 10 x, vises i figur 2C. Etter inkubering i 2–3 timer ble chemotaxis-lysbildet langsomt fylt med medium (Figur 2D). Etter å ha plugget porter 1 og 2, ble medium sakte injisert via port 3 til det dukket opp fra port 4. Deretter ble pluggen byttet fra port 1 til port 3, og deretter ble det andre reservoaret fylt ved å sakte injisere medium via port 4 til den dukket opp ved port 1. På dette stadiet ble celler i observasjonsområdet inspisert på nytt ved hjelp av et omvendt mikroskop (Figur 2E). Ved å sammenligne bilder kort tid før (Figur 2C) og etter (Figur 2E) fylling av reservoarene, hadde opptil to tredjedeler av cellene blitt vasket ut av observasjonsområdet. Vanligvis ble svakt tilhenger cd19+ celler (B1 celler) vasket ut og de resterende cellene var overveiende F4/80+ celler (makrofager). Dette ble demonstrert ved fluorescensmikroskopi etter merking av hver celletype med fluorescerende merkede spesifikke antistoffer (figur 4). I figur 4Able nyisolerte musebosatte peritoneale celler merket med grønne fluorescerende fluorofor-konjugerte anti-F4/80 antistoffer og røde fluorescerende fluorofor-konjugerte anti-CD19 antistoffer, og kjernen ei celler ble merket med en blå fluorescerende nukleinsyreflekk. F4/80 er en bestemt markør for musemakrofager30, mens CD19 er en B-cellemarkør. Figur 4B viser F4/80+ celler avbildet ved å spinne disk konfokal mikroskopi i observasjonsområdet i et chemotaxis kammer. Cellene ble merket etter en natt chemotaxis analyse registrert av time-lapse, fasekontrast mikroskopi.
Komplement C5a (kjemoattractant) ble introdusert til ett av de to reservoarene ved å plassere en 15 μL dråpe medium som inneholder 0,54 μg/ml (rekombinant mus) komplement C5a og 10 μg/ml Patent Blue V i fylleport 1 (Figur 3A) etter plugging porter 2 og 3. Kjemoattractantmediet ble langsomt trukket inn i reservoaret ved langsom aspirasjon med en pipette via port 4. Figur 3B viser diffusjonen av det blå farge etter å ha tegnet 15 μL-fallet i et reservoar. Patent Blue V ble brukt som en indirekte visuell indikator på kjemoattractant diffusjon. Komplement C5a molekyler er betydelig større enn de av Patent Blue V (9,0 kDa versus 0,57 kDa) og diffusere saktere. Etter diffusjon av komplement C5a i reservoaret var konsentrasjonen ~ 0,2 μg/ml (15 μL/40 μL [reservoarvolum] x 0,54 μg/ml = 0,2 μg/ml), tilsvarende ~ 22,5 nM. En beskjeden bratt gradient dannet over observasjonsområdet etter 3 timer og fortsatte å øke, og nådde et maksimum på rundt 12 t31. Figur 3C viser overføringssporene til makrofager som migrerer i en komplement C5a-gradient, mellom 6–12 timer etter at du har lagt til kjemoattractanten. Cellehastighet og kjemotaktisk effektivitet, indeksert som y-FMI (y-forward migration index; område: -1 til +1) og x-FMI, av individuelle makrofager ble beregnet fra overføringsplottene (figur 3D). Figur 3D viser også en overføringsplott produsert etter normalisering av startpunktet for hvert overføringsspor til X = 0 og Y = 0 under boksplottene. Innfelt i overføringsplottet viser hvordan y-FMI ble beregnet for hvert overføringsspor.
Figur 1: Arbeidsflyten til chemotaxis-analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Håndtering av chemotaxis lysbilder. (A) En 3D-visning av et chemotaxis-lysbilde med fire plugger og fire caps. Lysbildet inneholder tre chemotaxis kamre, som hver består av to 40 μL reservoarer forbundet med en 1 mm x 2 mm kanal, som er 70 μm høy, betegnet observasjonsområdet. (B) Tilkoblingskanalen strekker seg i begge ender til å fylle portene 2 og 3. Etter å ha satt plugger inn i fylleporter 1 og 4, ble observasjonsområdet forhåndsfylt med middels (rød) ved å bruke en dråpe medium til port 3 og aspirering ved port 2 med en 10-200 μL pipettespiss. Deretter ble det brukt caps på port 2 og 3 før du inkuberte lysbildet ved 37 °C og preparerte cellesuspensjonen. (C) Observasjonsområdet, hvor kjemoattractantgradienten ble dannet, ble seedet med makrofager ved å bruke en 10 μL dråpe musbosattperitonealceller ved port 3 og sakte aspirering ved port 2. Sklien ble deretter inkubert i et fuktighetskammer ved 37 °C i 2–3 timer. Fasekontrastbildet som vises til høyre, innhentet via et målobjektiv på 10 x 10 x, viser peritoneale celler etter seeding og inkubasjon ved 37 °C i 2 h. Skalabar = 500 μm. (D) Chemotaxis kamre ble fylt med medium ved å plugge porter 1 og 2 og deretter sakte injisere medium via port 3 til den dukket opp ved port 4. Langsom og jevn fylling kan oppnås ved å dreie voluminnstillingsringen på en volumpipette på 20–100 μL. Etter å ha fylt det første reservoaret, kan det andre reservoaret fylles ved å plugge porter 2 og 3 og deretter sakte injisere medium ved port 4 til det kommer frem i port 1. (E) Fasekontrastbilde av det samme observasjonsområdet vist ovenfor (C) etter fylling av de to reservoarene. Skalabar = 500 μm. Grafiske elementer levert av Elias Horn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Chemotaxis analyse. (A) Kjemoattractant ble introdusert til en av de to reservoarene i et chemotaxis kammer ved å bruke en 15 μL dråpe medium som inneholder 0,54 μg / ml komplement C5a og 10 μg / ml Patent Blue V til å fylle port 1, etterfulgt av langsom aspirasjon ved port 4. (B) I utgangspunktet etter å ha blitt trukket inn i reservoaret, hadde det blå, kjemoattractantholdige mediet en omtrent omvendt dråpeform, og deretter sakte diffust i hele reservoaret. (C) Overføringsspor av makrofager som migrerer i en kjemoattractant (komplement C5a) gradient mellom 6-12 h etter innføring av kjemoattractant til en av reservoarene. Retningen på gradienten er angitt til høyre. Slutten på hvert overføringsspor angis av en fylt sirkel. (D)Blox-tomter av hastighet, x-FMI (x-forward migration index) og y-FMI (y-forward migration index), en indeks av kjemotaktisk effektivitet som varierer fra -1 til +1. Data ble innhentet ved analyse av 25 makrofagoverføringsspor. Makrofager i nedre halvdel av observasjonsområdet og viser forskyvning av minst én cellebredde over 6 timer ble tilfeldig valgt for analyse. Nedenfor er en tomt av overføringsspor etter normalisering av startpunktet til X = 0 og Y = 0. Chemotaxis-indeksen (y-FMI) ble beregnet ved å dele nettoforskyvningen langs Y-aksen (d) med den akkumulerte lengden (l) for overføringsbanen, som skjematisk vist. Grafiske elementer i panel A og B levert av Elias Horn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescerende bilder av levende mus bosatt peritoneal celler oppnådd ved spinning disk konfokal mikroskopi. (A) Utvidet fokusbilde (lyseste punktsammenslåing av alle Z-fly) av nyisolerte museperitonealceller merket med grønne fluorescerende anti-F4/80 (makrofagmarkør) antistoffer, røde fluorescerende anti-CD19 (B-cellemarkør) antistoffer og en blå fluorescerende nukleinsyreflekk. Skala bar = 10 μm. (B) Snapshot (enkelt Z-plan) av F4/80+ celler (makrofager) i observasjonsområdet av en chemotaxis kammer tatt etter en overnatting chemotaxis analyse. Cellene ble merket med grønne fluorescerende anti-F4/80 antistoffer og en blå fluorescerende nukleinsyreflekk. Komplementet C5a og Patent Blue V gradienter ble vasket ut av cellemerkingsprosedyren, noe som forklarer hvorfor det øvre reservoaret i det skjematiske diagrammet i chemotaxiskammeret ikke er blått. Skalabar = 10 μm. Grafisk element levert av Elias Horn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Intravital imaging dateres tilbake til 1800-tallet og gir et middel til å studere oppførselen til levende immunceller i sitt naturlige miljø. Men selv med dagens avanserte mikroskopi og genetiske teknikker er det vanskelig å studere responsen fra celler til spesifikke kjemoattractants in vivo. For å omgå dette problemet, utviklet Boyden18 Transwell-analyser på 1960-tallet, men disse endepunktanalysene ga ikke visualisering av hvordan celler faktisk migrerte mot kjemoattractants, noe som gjør det vanskelig å skille chemokinesis, stimulert tilfeldig migrasjon av et kjemisk signal32, og chemotaxis, migrasjon mot høyere konsentrasjoner av kjemiske stimuli fra hverandre33. Dette problemet ble løst ved å designe ulike åpne kamre med en bro, vanligvis 1 mm bred, som ligger mellom to reservoarer og tilgjengelig med en objektiv linse21,,22,23. Påføring av en omvendt dekselslip, seeded med tilhengerceller, lukker kamrene og kjemoattractant lagt til et av reservoarene diffuserover broen til det motsatte reservoaret, og skaper en konsentrasjonsgradient. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjelp av samme prinsipp, men ved hjelp av et lukket kammer med fire fylleporter. Ved hjelp av dette systemet og tidsforløp, fasekontrastmikroskopi, utviklet vi en analyse til bilde mus bosatt peritoneale makrofager migrerer i en kjemotaktisk komplement C5a gradient31,,34,35,36. Denne analysen, kombinert med knockout musemodeller, viste seg medvirkende i undersøkelsen av rollene til ulike Rho GTPases og motorproteiner i makrofag morfologi, motilitet, og chemotaxis31,34,35,36,37. Vi har også brukt denne tilnærmingen til å bilde menneskelige perifere blod monocytter migrere på en 2D overflate eller i en 3D kollagen type Jeg matrise38. Videre er analysen egnet for mus benmarg-avledet makrofager eller makrofager avledet fra betinget udødeliggjort myelogen forløperceller39,40. Vi har tidligere brukt polytetrafluoretylen (PTFE) poser med luer adaptere til kultur benmargsceller og få makrofager34. Fordelen med PTFE poser er at cellene lett kan resuspenderes og klar til bruk etter å ha plassert posen på is i 20-30 min. Merk at vi forutfyller chemotaxis lysbildeobservasjonsområdet før vi introduserer cellene. Denne tilnærmingen har fordelen at uønskede luftbobler senere kan skylles ut (med variabel suksess) og det forhåndsfuktede observasjonsområdet muliggjør langsom innføring av en cellesuspensjon ved pipettering. Forhåndspåfylling øker imidlertid sannsynligheten for at mediet delvis vil strømme inn i ett eller begge de flankerte reservoarene, noe som vil fremme såing av celler utenfor observasjonsområdet. Alternativt kan cellesuspensjonen bli direkte pipetted inn i et tørt observasjonsområde, men uønskede luftbobler kan ikke senere utvises.
Bukhulen i musen inneholder to hovedpopulasjoner av celler: F4/80+ makrofager og (mindre) CD19+ B-celler, med et forhold på ca. 1:2 (Figur 4A). Disse to cellepopulasjonene står for over 95% av peritoneale hulromceller, mens de gjenværende F4/80-/ CD19- cellene vanligvis kan identifiseres som CD11c+ celler (dendrittiske celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svakt tilhengerk.h.-celler vaskes ut av observasjonsområdet under fylling av reservoarene med mediet (Figur 2). Etter å ha lagt til kjemoattractant til ett av de to reservoarene, kan tidsforløp, fasekontrastmikroskopi brukes til å bilde de gjenværende cellene (makrofager) som migrerer i en utviklende kjemoattractantgradient. Dannelsen av komplementet C5a gradient i observasjonsområdet, via diffusjon fra ett reservoar til det andre, kan simuleres ved hjelp av et fluorescerende farge med lignende molekylvekt. En god erstatning for rekombinant mus supplement C5a (spådd molekylvekt, 9,0 kDa) er fluorescerende merket dextran (10 kDa)31. Ved hjelp av konfokal mikroskopi kan fluorescensgradienten i den smale kanalen (observasjonsområdet) som forbinder de to reservoarene i chemotaxis-lysbildet måles med faste intervaller og konsentrasjonsprofiler på de forskjellige tidspunktene plottes24,31. Vi legger rutinemessig til en nonfluorescerende, blå farge (Patent Blue V) til kjemoattractant medium for å gi en praktisk visuell indikator på diffusjon og gradient formasjon. Innen 1 time etter innføring av 15 μL blå, kjemoattractantholdig medium i et reservoar, ser reservoaret jevnt blått ut, og i henhold til Ficks diffusjonslover vil en gradient dannes over det smale observasjonsområdet som forbinder reservoarene (figur 3B). Flere dager er nødvendig for at solute (blå farge eller kjemoattractant) skal bli jevnt fordelt.
Fluorescensmikroskopi kan erstattes med mikroskopi med fasekontrast, noe som gir fordeler for automatisert cellesporing, fordi fluorescerende merkede celler lett kan skilles fra bakgrunnen. En annen fordel er at spesifikke populasjoner av immunceller kan spores selektivt etter merking av overflatemarkører med fluorescerende antistoffer. Vi brukte denne tilnærmingen til bilde menneskelig perifert blod CD14+ celler (monocytter) migrerer i en kjemotaktisk fMLP (N-formylmethionine-leucyl-fenyl-fenylalanin) gradient38. På samme måte kan fluorescerende anti-F4/80 antistoffer brukes til å bilde musmakrofager som migrerer i en kjemotaktisk komplement C5a gradient. Fototoksisitet er en potensiell ulempe ved bruk av fluorescensavbildning41. Dette kan reduseres med ulike måter42, inkludert bruk av fluoroforer begeistret med lengre bølgelengder og legge antioksidanter til mediet. Alternativt kan merkede celler i utgangspunktet identifiseres ved fluorescensmikroskopi og deretter avbildet av tidsforløp, fasekontrastmikroskopi. Men i praksis kan celler som beveger seg ved moderat lave hastigheter, for eksempel ~ 1 μm / min (makrofager) eller ~ 4 μm / min (monocytter), periodisk avbildet av fluorescensmikroskopi med intervaller på minutter, som tolereres godt38. Vi har tidligere brukt fluorescensmikroskopi og chemotaxis lysbildet beskrevet her for 3D chemotaxis analyser38,43. I dette tilfellet ble begge reservoarene forhåndsfylt med middels og 15 μL kjemoattractantholdig medium trukket inn i et av reservoarene umiddelbart før langsomt pipettering fluorescerende merkede celler suspendert i medium som inneholder kollagen type I inn i observasjonsområdet. Den vanskelige delen av denne prosedyren er håndteringen av kollagen type I, som er konsentrert i sur løsning. PH av kollagen løsningen må nøytraliseres ved tillegg av alkalisk løsning før du blander den iskalde kollagenløsningen med cellesuspensjonen. Overføring av kollagencelleblandingen til en inkubator ved 37 °C vil initiere kollagenpolymerisering. Under inkubasjon bør lysbildet sakte roteres rundt sin lange akse slik at cellene forblir jevnt fordelt i X-, Y- og Z-aksen retninger mens kollagen polymeriserer seg til en gel. En relatert lukket chemotaxis lysbilde egnet for 3D chemotaxis analyser, med seks plugger i stedet for fire plugger, har nylig blitt beskrevet29. Dette systemet gjør at kollagencelleblandingen kan innføres i observasjonsområdet før de uavhengig fyller hvert av de flankerte reservoarene, fordi hvert reservoar har to fylleporter, i stedet for en enkelt port.
Oppsummert beskriver vi en sanntids chemotaxis analyse som gjør det mulig å visualisere celler navigere i en kjemotaktisk gradient over en periode på 6 eller flere timer. Her fokuserer vi på makrofager, som spiller store roller i inflammatoriske sykdommer, men har vært underrepresentert i sanntid chemotaxis analyser sammenlignet med raskere bevegelige celler som nøytrofiler og Dictyostelium amoebae.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend (HA 3271/3-2) fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M. Chemotaxis in leukocytes. Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
