Summary
Dieses Protokoll beschreibt die klinisch implementierbare Vorbereitung von hochwertigen PBMC- und Plasma-Bioproben am klinischen Studienort, die für die translationale Biomarkeranalyse verwendet werden können.
Abstract
Die Analyse von Biomarkern im peripheren Blut wird in klinischen Studien immer wichtiger, um den Nachweis eines Mechanismus zur Bewertung der Wirkungen der Behandlung zu erbringen und die Dosis- und Zeitplaneinstellung von Therapeutika zu steuern. Aus einer einzigen Blutentnahme können periphere mononukleäre Blutzellen isoliert und verarbeitet werden, um Proteinmarker zu analysieren und zu quantifizieren, und Plasmaproben können für die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA, Zytokinen und Plasmametabolomik verwendet werden. Längsschnittproben aus einer Behandlung geben Aufschluss über die Evolution eines gegebenen Proteinmarkers, den Mutationsstatus und die immunologische Landschaft des Patienten. Dies kann nur erreicht werden, wenn die Verarbeitung des peripheren Blutes effektiv an klinischen Stellen durchgeführt wird und die Proben vom Krankenbett bis zur Bank ordnungsgemäß konserviert werden. Hier stellen wir ein optimiertes Allzweckprotokoll vor, das an klinischen Standorten zur Gewinnung von PBMC-Pellets und Plasmaproben in multizentrischen klinischen Studien implementiert werden kann und es klinischen Fachkräften in Krankenhauslabors ermöglicht, unabhängig von ihrem technischen Fachwissen erfolgreich qualitativ hochwertige Proben bereitzustellen. Es werden auch alternative Protokollvariationen vorgestellt, die für spezifischere nachgelagerte Analysemethoden optimiert sind. Wir wenden dieses Protokoll an, um Protein-Biomarker gegen DNA-Schadensreaktion (DDR) auf röntgenbestrahltem Blut zu untersuchen, um die Eignung des Ansatzes in onkologischen Umgebungen zu demonstrieren, in denen DDR-Medikamente und / oder Strahlentherapie praktiziert wurden, sowie in präklinischen Stadien, in denen mechanistische Hypothesentests erforderlich sind.
Introduction
Die Arzneimittelentwicklung zielt darauf ab, neue Therapeutika für unerfüllte medizinische Bedürfnisse und gezieltere, personalisierte Medizin bereitzustellen. Mehrere Arzneimittelmechanismen werden aktiv untersucht, einschließlich enzymatischer Hemmung wie Kinase1, Protease2oder Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Inhibitoren3, Proteindegrader4, therapeutische Antikörper5und Antikörper-konjugierte Medikamente (ADCs)6, unter vielen anderen. Ein Beispiel für die Bemühungen, bessere Behandlungen in der Onkologie zu erhalten, ist die Verwendung von Kinasehemmern mit dem Ziel, die Signalkaskaden zu stoppen, die Krebszellen vermehren1,7. Die Messung der für diese Kinasen spezifischen Substratephosphorylierung ist der beste pharmakodynamische Biomarker, um den Wirkungsmechanismus dieser Inhibitoren zu quantifizieren8. Andere Medikamente können die Expression eines bestimmten Proteins modulieren, und in diesem Fall ist es von größter Bedeutung, die Konzentrationsänderungen ihres Zielproteins während des gesamten Behandlungsverlaufs longitudinal quantifizieren zu können. Daher ist unabhängig von den Eigenschaften eines Arzneimittels oder einer Pathologie die Bewertung von Biomarkern zur Feststellung der pharmakokinetischen (PK) / pharmakodynamischen (PD) Beziehung zwischen Arzneimittelexposition und Zielmodulation die beste Praxis in der frühen klinischen Entwicklung und ermöglicht die Bestimmung einer sicheren und tolerierten pharmakologisch aktiven Dosis / Liste9.
Während in der onkologischen klinischen Entwicklung die Biomarkeranalyse in Biopsien der beste Rahmen sein könnte, um den Nachweis des Mechanismus eines Arzneimittels zu erbringen, ist die Anzahl der verfügbaren Biopsien in einer Studie in der Regel ziemlich begrenzt10,11. Alternativ sind periphere Blutproben für klinische Studien sehr wertvoll, da sie ein minimalinvasives Verfahren beinhalten, schnell und einfach zu erhalten sind, um die Längsschnittanalyse zu erleichtern, kostengünstiger sind als Biopsien und umfangreiche Informationen für die Echtzeitüberwachung des Ergebnisses einer Behandlung liefern. Ein zusätzlicher Vorteil bei der Bewertung von PD-Biomarkern im peripheren Blut ist die Fähigkeit, das Biosample zu verwenden, um PK auch zu quantifizieren, was die Genauigkeit bei der Bestimmung der quantitativen PK/PD-Beziehungen und der anschließenden PK/PD-Modellierung ermöglicht12,13. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus Vollblut können isoliert werden, um Proteinmarker zu untersuchen, die entweder Veränderungen in ihrem Expressionsniveau oder in ihren post-translationalen Modifikationen erfahren. Darüber hinaus können PBMCs für Immunphänotypisierungszwecke14,15, Immunfunktionalitätsassays wie die Beurteilung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC)16 und die epigenetische Analyse durch RNA-Isolierung verwendet werden. Ebenso kann Plasma aus Vollblut verwendet werden, um Zytokine zu quantifizieren, um die immunologische Reaktion eines Patienten zu charakterisieren, metabolische Studien durchzuführen und auch zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) zu isolieren und zu sequenzieren, um die klonale Entwicklung der Krankheit unter Selektion aus dem therapeutischen Wirkstoff zu überwachen, was häufig eine mechanistische Grundlage für die Behandlungsresistenzbietet 17,18,19, die die Entwicklung nachfolgender Generationen von Therapeutika ermöglicht20. Schließlich ermöglicht die Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) aus peripherem Blut die Beurteilung des Krankheitsverlaufs durch longitudinale Enumeration, DNA/RNA-Sequenzierung und Protein-Biomarker-Analyse21. Obwohl diese Isolierung mit dem hier beschriebenen Protokoll22kompatibel ist, macht die geringe Häufigkeit von CTCs in vielen Krebsarten und frühen Stadien der Krankheit die Verwendung von spezialisierten Röhrchen besser geeignet, um den CTC-Abbau zu minimieren23.
In den letzten Jahren hat die Verwendung von Flüssigbiopsien die in klinischen Studien erhaltenen Informationen verbessert, und PBMC-Sammlungen wurden in viele Studien aufgenommen, um die Zielbindung und den Nachweis des Mechanismus entweder direkt in Tumorzellen für einige Arten von hämatologischen Malignomen oder auf den PBMCs selbst als PD-Surrogate von Tumorzellen zu überwachen24,25,26. Die Vorbereitung hochwertiger Proben wirkt sich positiv auf die Bestimmung der sichersten und wirksamsten Behandlung für eine bestimmte Pathologie aus, aber nach unserer Erfahrung wurde die Qualität von PBMC-Präparaten, die von verschiedenen klinischen Standorten erhalten wurden, einer großen Qualitätsvariabilität ausgesetzt, was zu Proben führte, die für den Zweck der nachgelagerten Analyse nicht geeignet sind. Dies hat sich auf die Menge der PD-Daten ausgewirkt, die aus diesen Studien gesammelt werden konnten.
Hier beschreiben wir detailliert ein einfach zu befolgendes Protokoll, das zeigt, wie sowohl PBMCs als auch Plasmaproben aus einer einzigen Blutentnahme in einer klinischen Umgebung effizient isoliert werden können. Das Protokoll basiert auf den Anweisungen des Herstellers der mononukleären Zellvorbereitungsröhrchen, die Modifikationen enthalten, bei denen reale Erfahrungen Schwierigkeiten bei der Protokollausführung aufgezeigt haben, wie sie von klinischen Standorten gemeldet wurden, wie z. B. Zentrifugationsprobleme, Verarbeitungsverzögerungen und Probentransfer zu Kryovialen. Es gibt alternative kommerziell verfügbare Methoden zur Verwendung von mononukleären Zellpräparationsröhrchen auf der Grundlage der Dichtegradiententrennung unter Verwendung von Polysaccharidlösungen mit oder ohne Barriere, die die Lösung vom Blut trennt27. Wenn die betreffende klinische Stelle bereits über gute Erfahrung mit diesen alternativen Methoden verfügt, kann dieses Protokoll akzeptabel durch diese ersetzt werden. In solchen Fällen können zwei Faktoren berücksichtigt werden: Einige alternative Methoden erfordern einen Transfer von Vollblut aus einem Entnahmeröhrchen in ein separates Präparationsröhrchen, wobei ein zusätzlicher Transfer von humanem primärem biologischem Material ein leicht erhöhtes Sicherheitsrisiko darstellen kann, und der Erfolg von Methoden ohne Barrieren, die das Blut von der Polysaccharidlösung trennen, hängt von kritischen Schritten ab, wie z. B. der Schichtung der Blutprobe auf dem Dichtegradientenmedium, das die Entwicklung eines verfeinerten technischen Fachwissens erfordert, das in einem Krankenhauslabor nicht immer zu finden ist. Ungeachtet der vorstehenden Punkte sind die Gesamtlebensfähigkeit und zellerholung zwischen diesen Techniken vergleichbar15,28. Die Wahl der Methodik hängt daher etwas von früheren technischen Erfahrungen ab, aber in unseren Händen können mononukleäre Zellpräparationsröhrchen erfolgreich in einem breiten klinischen Kontext eingesetzt werden und sind ansonsten unsere Empfehlung.
Während ein Endpunkt dieses Protokolls die Herstellung von PBMC-Pellets für die Weiterverarbeitung zu Lysaten ist, könnten andere endgültige Anwendungen der PBMC-Sammlung implementiert werden, wie die Isolierung von Nukleinsäuren oder die Herstellung von PBMC-Abstrichen oder PBMC-Blöcken, die für immunhistochemische (IHC) Methoden geeignet sind. Da jedes Biosample von Patienten zumindest auf einer gewissen Ebene ein invasives Verfahren darstellt, maximiert dieses Protokoll das nützliche Material aus jeder Probe, indem es auch Plasma isoliert, das für Zytokinanalysen, metabolomische Studien oder ctDNA-Sequenzierung verwendet werden kann.
Die Analyse peripherer Biomarker in onkologischen Studien ist eine der vielen Anwendungen von PBMC-Lysaten. Ein Beispiel ist die Bewertung der DNA-Schadensreaktion (DDR) bei Behandlungen wie Chemotherapie, Strahlentherapie oder der Verwendung von Inhibitoren von Enzymen, die an der DDR beteiligt sind, wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase-verwandten Kinasen (PIKKs)7 und PARPs3,13. Ziel dieser Behandlungen ist es, DNA-Schäden in proliferierenden Zellen zu erhöhen, was eine hohe Toxizität in Zellen mit beeinträchtigten DDR-Mechanismen und Zellzyklus-Checkpoints wie Krebszellen erzeugt. Hier präsentieren wir ein Beispiel mit einer Studie von DDR-Biomarkern in peripherem Blut, das Röntgenstrahlen ausgesetzt ist.
Protocol
Die Einwilligung des Patienten nach Aufklärung und die vollständige Einhaltung der einschlägigen nationalen Ethikanforderungen in jeder Gerichtsbarkeit, z. B. des Human Tissues Act (HTA – Vereinigtes Königreich, 2004) und des Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA – Vereinigte Staaten, 1996) sind obligatorisch. Stellen Sie sicher, dass Sie eine vollständig dokumentierte ethische Genehmigung haben, bevor Sie mit der Arbeit an vom Menschen stammenden Materialien beginnen. Das bei der Optimierung dieses Protokolls verwendete Blut wurde mit entsprechender Zustimmung des Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (Ethikreferenz 16/EE/0459, Studie CRF494, Unterstudie 001) zur Verfügung gestellt, das von der NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Großbritannien, im Rahmen einer Liefervereinbarung über humanbiologische Proben mit dem National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre durchgeführt wird. Die AstraZeneca Biobank in Großbritannien ist von der Human Tissue Authority (Lizenznummer 12109) lizenziert und verfügt über die Zulassung des National Research Ethics Service Committee (NREC) als Research Tissue Bank (RTB) (REC Nr. 17/NW/0207).
1. Allgemeine Vorbereitungsanleitung
HINWEIS: Alle Arbeiten mit nicht fixiertem menschlichem Material wie Blut, Plasma und PBMCs in diesem Protokoll müssen unter der Annahme erfolgen, dass diese Materialien potenziell infektiöse Agenzien enthalten können, und müssen daher unter geeigneten Vorsichtsmaßnahmen für die biologische Sicherheit durchgeführt werden. Bei Patienten, die als negativ auf bekannte Krankheitserreger getestet wurden, gehen Sie nicht davon aus, dass die Proben nicht infektiös sind und daher dennoch geeignete Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen. Abfallprodukte, die aus diesen Materialien entstehen, sollten mit den gleichen Biosicherheitsvorkehrungen behandelt und gemäß den lokalen Vorschriften entsorgt werden.
- Wählen Sie zwischen den beiden Arten von mononukleären Zellpräparationsröhrchen, die entweder Natriumcitrat oder Natriumherparin als Antikoagulanzien verwenden. Für viele nachgelagerte Anwendungen können diese beiden Antikoagulanzien austauschbar verwendet werden, aber beide Antikoagulanzien sollten getestet werden, bevor eines für die Studie ausgewählt wird.
- Kennzeichnen Sie ein 8 ml mononukleäres Zellpräparationsröhrchen, das für die Blutentnahme verwendet werden soll, mit dem codierten Ausweis des Patienten. Halten Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur (18-25 °C).
- Lagern Sie 1x PBS bei Raumtemperatur (18-25 °C). Verwenden Sie 30 ml pro Zubereitung.
- Stellen Sie sicher, dass Röhrchen für separate Plasmaproben und das Kryovial für die PBMC-Probe genau mit eindeutigen Identifikatoren gekennzeichnet sind, wie im entsprechenden Abschnitt des Laborhandbuchs angegeben.
- Wenn PBMCs zur Überwachung phosphorylierter Proteine verwendet werden, bereiten Sie PBS vor, das mit Phosphataseinhibitoren ergänzt wird: Mischen Sie 5 ml PBS mit 50 μL Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2 + 50 μL Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3. Frisch zubereiten und bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren.
- Wenn PBMCs kryokonserviert werden sollen, bereiten Sie 1 ml Gefriermischung pro Probe vor, indem Sie 90% FBS + 10% DMSO mischen.
2. PBMC-Sammlung (Abbildung 1A)
- 8 ml Blut in das mononukleäre Zellpräparationsröhrchen mit der vom Hersteller beschriebenen Standardtechnik ziehen. Kehren Sie das Röhrchen 8 bis 10 Mal vorsichtig um, um das gerinnungshemmende Additiv mit Blut zu mischen. Nicht schütteln, um Hämolyse zu vermeiden. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem das Blut entnommen wurde.
- Nach dem Sammeln das Röhrchen aufrecht bei Raumtemperatur bis zur Zentrifugation lagern. Verarbeiten Sie die Proben so schnell wie möglich, idealerweise innerhalb einer Stunde nach dieser Blutentnahme, jedoch nicht später als 4 Stunden nach der Entnahme. Notieren Sie den Zeitpunkt, wenn Sie mit der Verarbeitung des Blutes beginnen.
- Unmittelbar vor der Zentrifugation die Blutprobe durch sanftes Kehren des Röhrchens 8 bis 10 weitere Male neu mischen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen/blutprobenröhrchen in einem horizontalen Rotor (Ausschwenkkopf) bei 1.500 – 1.800 x g für 30 min bei Raumtemperatur (18-25 °C). Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche richtig ausbalanciert sind.
Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über das Protokoll und repräsentative Bilder der Zentrifuge. (A) Schematischer Überblick über das Protokoll zur Herstellung von PBMCs und Plasma. *Bei Zeitdruck kann Schritt 2.4 auf 20 min verkürzt und die Schritte 3.3 bis 3.6 entfernt werden. ** Nehmen Sie bei Bedarf ein Aliquot, um Zellen zu zählen. 2 zusätzliche Zentrifugationsschritte, die für die ctDNA-Analyse/Metabolomik (B) erforderlich sind, Bild einer ausschwenkenden Rotorzentrifuge für Schritt 2.4. (C) Bild des Rotors, der zwei Eimer enthält, die die Adapter zum Spinnen mononukleärer Zellvorbereitungsröhrchen enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: x g (auch als RCF, relative Zentrifugaleinheiten bezeichnet) und RPM (Umdrehungen pro Minute) sind unterschiedliche Einheiten. Stellen Sie die Zentrifuge auf x g (RCF) ein. Nutzen Sie für die Konvertierung den Online-Rechner (siehe Materialtabelle). Wenn nur ein Rotor mit festem Winkel verfügbar ist, führen Sie diesen Schritt 10 minuten lang bei 1.500 – 1.800 x gdurch.
- Überprüfen Sie nach der Zentrifugation das Vorhandensein einer dunkelroten Schicht unter der Barriere (die hauptsächlich rote Blutkörperchen enthält) und 2 Schichten über der Barriere. Die oberste Schicht ist das Plasma (strohfarben) und die weißliche Schicht darunter ist die Buffy-Schicht, die die PBMCs enthält. Diese Schichten können leicht unterschieden werden, wenn man die Röhre vor einem dunklen/ schwarzen Hintergrund betrachtet.
Abbildung 2: Röhrchen zur Isolierung von PBMCs. (A) Bild der Röhrchen vor der Zentrifugation (Schritt 2.4), entweder leer (links) oder bluthaltig (rechts). (B) Erfolgreiche Trennung der PBMC-Schicht nach Zentrifugation (Schritt 2.5). (C) Bild der PBMC-Schicht nach zentrifugation und ein wenig Plasma übrig, um sicherzustellen, dass alle PBMCs gesammelt werden (Schritt 2.7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
HINWEIS: Wenn diese Schichten nicht sichtbar sind, deutet dies wahrscheinlich auf einen Fehler beim Einrichten der Zentrifugationseinheiten hin. Stellen Sie sicher, dass der richtige Zentrifugenadapter verwendet wird und das richtige "x g" eingestellt ist. Wiederholen Sie Schritt 2.4.
- Verwenden Sie unmittelbar nach der Zentrifugation eine serologische Pipette, um etwa die Hälfte des Plasmas in ein markiertes 15 mL großes konisches Zentrifugenröhrchen mit Kappe zu übertragen, wobei darauf zu achten ist, die PBMC-Schicht (ca. 4-5 ml) nicht zu stören. Lagern Sie dieses Röhrchen mit Plasma vorübergehend auf nassem Eis, um es später in Schritt 4 zu verwenden. Vorerst beiseite legen.
- Sammeln Sie die gesamte PBMC-Schicht mit einer Pasteur-Pipette, indem Sie die Pipette in die Zellschicht legen und in ein anderes konisches Zentrifugenröhrchen mit Kappe von 15 ml Größe überführen. Es ist akzeptabel, bei Bedarf auch eine kleine Menge Plasma zu nehmen, um die gesamte PBMC-Schicht vollständig zu erhalten. Das Volumen beträgt in der Regel 1-2 mL. Fahren Sie sofort mit Schritt 3 fort.
3. PBMC-Waschschritte
HINWEIS: Der Zweck der Waschschritte besteht darin, Restplättchen und Plasma aus dem PBMC-Pellet zu verdünnen und zu entfernen. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur (18-25 °C) durchgeführt werden.
- Fügen Sie dem PBMC-Rohr PBS mit Raumtemperatur hinzu, um das Volumen auf 15 ml zu erhöhen. Kappen Sie die Röhre. Mischen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen 5 Mal vorsichtig umkehren.
- Zentrifuge für 15 min bei 300 x g. Beachten Sie, dass dies eine viel sanftere Zentrifugation ist als die anfängliche Zentrifugation.
- Visualisieren Sie das Pellet, indem Sie das Rohr vor einem dunklen/ schwarzen Hintergrund betrachten. Entfernen Sie den Überstand durch Vakuumabsaugung oder mit einer Pipette (Abbildung 3A). Entsorgen Sie den Überstand und hinterlassen Sie ein Volumen von etwa 500 μL über dem weißlich gefärbten PBMC-Pellet.
Abbildung 3: PBMC-Pellets. (A) Pellet, das im ersten Waschschritt 3.3 erhalten wird. (B) Pellet isoliert in der zweiten Wäsche (Schritt 3.7). (C) Pellet mit hohem Hämolysespiegel, das aus Blut gewonnen wird, das später als 4 h aus der in der zweiten Wäsche isolierten Blutentnahme verarbeitet wurde (Schritt 3.6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Zellpellet vorsichtig im Restüberstand auf und ab pipettieren.
- Fügen Sie zusätzliche 1x PBS hinzu, um die Lautstärke auf 10 ml zu erhöhen. Kappen Sie die Röhre. Mischen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig 5x umkehren. Wenn die Zellzählung im Studienprotokoll erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 3.5.1 fort, falls dies nicht erforderlich ist, wechseln Sie direkt zu Schritt 3.6.
- Nehmen Sie ein Aliquot von 40 μL der re-suspendierten Zellen und mischen Sie es mit 40 μL Trypanblau. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
- Zentrifuge die Suspension aus Schritt 3.5 für 10 min bei 300 x g. Entfernen Sie so viel Überstand, wie vernünftigerweise möglich ist, ohne das Zellpellet zu stören.
- Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig den verbleibenden Überstand über dem Zellpellet, indem Sie mit einer Pasteur-Pipette mit feiner Spitze oder einer Mikropipette pipettieren, ohne das Zellpellet zu stören. Lassen Sie nach Abschluss dieses Schritts wenig bis keine Flüssigkeit über dem Pellet. Wenn der Endpunkt dieses Protokolls ein PBMC-Pellet ist, wechseln Sie zu Schritt 3.8; Wenn der Endpunkt kryokonservierte PBMCs sind, fahren Sie mit Schritt 3.10 fort.
- Fügen Sie dem Pellet 50 μL neues PBS (oder das in Schritt 1.5 hergestellte ergänzte PBS, falls zutreffend für Ihren Endpunkt) hinzu und pipetten Sie es vorsichtig mit einer Mikropipette auf und ab, um alle Zellen homogen wieder auf und ab zu resuspendieren. Die gesamte Zellsuspension auf ein markiertes 1,5 ml Kryovial geben und sofort auf nasses Eis legen, bis die Proben eingefroren sind.
- Gefrieren Sie die markierten Proben, indem Sie sie in flüssigen Stickstoff oder direkt in Trockeneis geben. Zellen können auch bei -80 °C Gefrierschrank mit Zellgefrierboxen eingefroren werden. In diesem Fall die Boxen vollständig in -80 °C vorverteilen, bevor Sie die Zellröhrchen hinzufügen. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem Zellpellets eingefroren wurden. Sobald die Zellen gefrieren, bei -80 °C lagern, auf Trockeneis eingefroren versenden.
- Optional können die PBMCs zur Kryokonservierung das Pellet in 1 ml der Gefriermischung (Schritt 1.6) erneut suspendieren und in ein markiertes Kryovial überführen. Fahren Sie wie in Schritt 3.9 beschrieben fort, aber in diesem Fall ist es nur akzeptabel, Zellengefrierboxen zum Einfrieren der Proben zu verwenden. Übergabe an flüssigen Stickstoff für den Versand und die Lagerung, nachdem Sie mindestens 24 Stunden in der Gefrierbox waren.
4. Schritte der Plasmavorbereitung (Abbildung 1A)
- Nach der Lagerung der PBMC-Pellets bei -80 °C wird nun das Plasma-Aliquot vorbereitet, das in Schritt 2.6 auf nassem Eis zwischengelagert wurde. Führen Sie die folgenden Zentrifugationsschritte durch, um das Plasma zu klären, wenn der Zweck der Probe die ctDNA-Analyse ist, andernfalls fahren Sie direkt mit Schritt 4.2 fort.
- Zentrifugieren Sie das Plasma für 10 min bei 1.600 - 2.000 x g bei 4 – 8 °C in einem Rotor mit festem Winkel (oder 15 min in einem ausschwenkenden Rotor).
- Pipetieren Sie vorsichtig den Plasmaüberstand ab, achten Sie darauf, kein Pellet zu stören und in ein neues 15-ml-Röhrchen zu überführen. Entsorgen Sie das Röhrchen mit dem pelletierten Material.
- Zentrifugieren Sie das Plasma für 10 min bei 1.600 - 2.000 x g bei 4 – 8 °C in einem Rotor mit festem Winkel (oder 15 min in einem ausschwenkenden Rotor).
- Übertragen Sie den Plasmaüberstand vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, kein pelletiertes Material zu stören. Entsorgen Sie das Röhrchen mit dem pelletierten Material.
HINWEIS: Wenn keine gekühlte Zentrifuge verfügbar ist, halten Sie die Zellen zwischen jedem Spin 5 Minuten auf Eis oder zentrifugieren Sie Proben in einem kühlen Raum.
- Plasma in 1 ml Aliquoten in 5 frische 2 ml Mikroröhrchen überführen. Verwenden Sie weniger als 5 Durchstechflaschen, wenn nicht genügend Plasma vorhanden ist, um 5 Durchstechflaschen mit 1 ml Aliquoten zu füllen, und es wird erwartet, dass die letzte Durchstechflasche weniger als 1 ml Plasma enthält. Wenn mehr als 5 ml Plasma vorhanden sind, verwerfen Sie den Rest. Zeichnen Sie das Gesamtvolumen des Plasmas in jeder Röhre auf.
- Die Plasmaaliquots sofort aufrecht einfrieren, indem sie bei -80 °C gelagert werden.
5. Musterversand
- Versenden Sie sowohl PBMC-Pellets als auch Plasmaproben auf Trockeneis.
- Stellen Sie sicher, dass die Probe vor und während des Versands nicht aufgetaut wird. Packen Sie ausreichend Trockeneis mit den Proben ein, um sicherzustellen, dass sie während des gesamten Versandprozesses gefroren bleiben, unter Berücksichtigung möglicher Verzögerungen, die während des Transports auftreten können.
6. Vollblutbestrahlung und Western-Blot-Analyse von DDR-Biomarkern (Abbildung 4A)
HINWEIS: Dies ist eine Ex-vivo-Behandlung, die in den meisten Fällen in der Klinik nicht erforderlich ist, aber diese Experimente sind eine wertvolle explorative Strategie, um geeignete klinische Biomarker zu finden. Blutproben sollten so schnell wie möglich nach der Entnahme behandelt werden, um beste Ergebnisse zu erzielen.
- Wärmen Sie den Röntgenschrank auf. Kennzeichnen Sie drei 15-ml-Röhrchen als 0, 0,2 bzw. 7 Gy.
- Nehmen Sie drei mononukleäre Zellpräparationsröhrchen, die frisch entnommenes Blut von einer einzelnen Person enthalten, und nach vorsichtigem Invertieren der Röhrchen 8 bis 10 Mal das Blut in die drei 15-ml-Röhrchen übertragen.
- Legen Sie die 0,2 Gy-Röhre in den Röntgenschrank, schließen Sie die Tür und tragen Sie die Dosis von 0,2 Gy auf die Röhre auf, indem Sie die Regalnummer und die Dosis auswählen. Wenden Sie die 7 Gy-Strahlendosis auf das 7-Gy-Röhrchen an, indem Sie die im Schrank ausgewählte Dosis anpassen.
- Die drei Röhrchen bei 37 °C eine Stunde lang inkubieren.
- Übertragen Sie das Blut zurück in die mononukleären Zellpräparationsröhrchen und führen Sie das PBMC-Vorbereitungsprotokoll für ein klinisches Setting von Schritt 2.4 bis Schritt 3.8 durch.
- Fügen Sie jedem der Zellpellets ein Volumen des Lysepuffers hinzu, das mit Protease- und Phosphataseinhibitoren gleich dem Zellpelletvolumen (in diesem Fall 70 μL RIPA-Puffer) entspricht, pipetten Sie auf und ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Beschallen Sie die Proben, wenn ein Ultraschallator verfügbar ist (3 Zyklen, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), alternativ spritzen Sie die Proben, um die Nukleinsäuren zu brechen, um die Viskosität in der Probe zu beseitigen.
- Zentrifugiert die Proben für 10 min bei ≥ 15.000 x g,bei 4 °C. Übertragen Sie jeden Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen, bewerten Sie qualitativ den Grad der Hämolyse (visuelle Inspektion) und messen Sie die Proteinkonzentration mit einer bevorzugten Methode.
- Mischen Sie 40 μg Gesamtlysat mit einem Probenladepuffer, der SDS und Probenreduktionsmittel enthält. Proben 5 min in einem Hitzeblock kochen.
- Laden Sie 20 μg jeder Probe pro Lane in dupliziert in ein 4-12% Bis-Tris-Proteingel und führen Sie eine SDS-PAGE aus.
- Nach der Trennung die Proteine mit einem handelsüblichen System (20 V, 10 min) auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit 5 % Milch in TBST blockieren.
- Schneiden Sie die Membran bei den relevanten Molekülgrößen und inkubieren Sie mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C (siehe Materialtabelle für Antikörper und Verdünnungen).
- Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Membranen 3 Mal mit TBST für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Mit den HRP-konjugierten sekundären Antikörpern 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 3 mal mit TBST für 5 min waschen.
- Wenden Sie das ECL-Reagenz an und analysieren Sie die erhaltenen Bilder relativ zum HRP-Signal.
Representative Results
Um die Qualität der PBMC-Präparate in unseren klinischen Studien zu verbessern, haben wir ein Protokoll mit prägnanten, klaren Schritten erstellt, die von Krankenhauslaborfachleuten unabhängig von ihrem molekularbiologischen Hintergrund und ihren Laborfähigkeiten befolgt werden können. Wir haben das Protokoll des Herstellers angepasst und Änderungen an den Schritten vorgenommen, bei denen Ausführungsprobleme identifiziert oder von klinischen Standorten gemeldet wurden, die an verschiedenen multizentrischen klinischen Studien beteiligt waren. Das Protokoll kann jedoch weiter optimiert werden, um spezifischen Anforderungen gerecht zu werden, wie z.B. Zeitbeschränkungen am klinischen Standort oder Art der nachgelagerten Analysen (siehe Ergänzungsdatei). Wir zeigen, dass die DDR in PBMCs analysiert werden kann, indem spezifische Biomarker auf DNA-Schäden durch Strahlung untersucht werden.
Die häufigsten Anfragen, die wir von klinischen Standorten erhalten haben, beziehen sich auf die Zentrifugationsschritte, die sich direkt darauf auswirken, PBMCs erfolgreich isolieren und das endgültige PBMC-Pellet erhalten zu können. Die Verwendung der geeigneten Art von Ausschwenkkopf-Rotorzentrifuge (Abbildung 1B, C) ist der Schlüssel zum Erfolg des Protokolls. Wenn jedoch nur eine Rotorzentrifuge mit festem Winkel am klinischen Standort verfügbar ist, empfehlen wir, Schritt 2.4 in einem Rotor mit festem Winkel am gleichen RCF wie bei einem Ausschwenkkopfrotor durchzuführen, jedoch nur für 10 Minuten. Dadurch wird sichergestellt, dass eine PBMC-Schicht vom Plasma getrennt wird (siehe Abbildung 2B,C). Während die Schichtung von Blut auf einem Dichtegradiententrennmittel eine Abbremszentrifugation erfordert, kann Blut in mononukleären Zellpräparationsröhrchen aufgrund des Vorhandenseins einer Gelbarriere in der Röhre, die die Erhaltung der PBMC-Schicht gewährleistet, die von den dichteren Blutbestandteilen getrenntist,mit Bremsen zentrifugiert werden27,28.
Aus der Zentrifugation von Blut im 8-ml-Röhrchenformat wurden mindestens 4 ml hochwertiges, nicht verdünntes Plasma gewonnen, das für seine Verwendung in spezialisierten Analysen wie ctDNA-Sequenzierung oder Metabolomik-Studien29,30 (optionale Schritte 4.1.1-4.1.4) weiter geklärt werden konnte. Die Menge der isolierten PBMCs, die Größe der Pellets und die Hämolyse oder die Kontamination der roten Blutkörperchen waren weitere Bedenken, die von klinischen Standorten und Der Analyse von Proben kamen. Die Anzahl der Zellen, die aus 8 ml Blut gewonnen wurden, war je nach Patient und Krankheitseinstellung variabel, aber im Allgemeinen ist das erhaltene Pellet klein und hat eine transparente/weiße Färbung (Abbildung 3A, B). Aufgrund dieser Eigenschaften ist es wichtig, das Pellet vor einem dunklen Hintergrund zu visualisieren, um seine versehentliche Aspiration während der Waschschritte (2.5 und 3.3) zu vermeiden. Manchmal können Pellets aufgrund einer Kontamination der roten Blutkörperchen eine gewisse rote Färbung aufweisen (Abbildung 3C), was sich negativ auf die Qualität der Zubereitung auswirkt. Um den Verlust kleiner Pellets wie in Abbildung 3zu vermeiden, wird die Übertragung des PBMC-Pellets auf ein Kryovial durch Schritt 3.7 erleichtert, bei dem das PBMC-Pellet in 50 μL PBS resuspendiert wird.
Die typische Ausbeute bei der Verwendung dieser Röhrchen und Blut von gesunden Personen liegt zwischen 7 und 21 x10 6 Zellen für 8 ml und einer Zellerholung zwischen 70 und 80%, wie es unsere Erfahrung ist und wie es zuvor gezeigt wurde27,28. Dies hängt sowohl von der anzahl der einzelnen Zellen als auch vom Operator ab und ist vergleichbar mit den Zellzahlen und Zellrückgewinnungswerten, die mit anderen Methoden unter Verwendung des Dichtegradienten (einschließlich Systemen mit Röhrchen mit einer Trennbarriere) erhalten werden15,27,28. Ein anschauliches Beispiel für die Variation der Anzahl der mit dieser Methode isolierten PBMCs in Abhängigkeit von der Krankheitseinstellung ist die Analyse von PBMC-Markern bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL). Die Anzahl der Zellen, die bei Anwendung dieses Protokolls aus einem mononukleären Zellpräparationsröhrchen mit 8 ml gewonnen wurden, variierte zwischen 1,62 x10 4 und 1,99 x 109 in 45 Proben von 7 Patienten in Studie NCT0332827331 (Tabelle 1). Ein verwandter Parameter ist die Proteinkonzentration der PBMC-Lysate, die mit dieser Methode erhalten wird, und dies hängt von der Anzahl der isolierten Zellen und der Effizienz der Proteinextraktion ab. Die in Abschnitt 6 lysierten Zellpellets wurden mit RIPA-Puffer und Beschallung erzeugt (Schritt 6.6). Die Resuspension der Zellpellets in ihrem gleichen Volumen an Lysepuffer führt normalerweise zu einem Konzentrationsbereich von 3 bis 10 mg / ml, und in diesem speziellen Beispiel waren die Lysatkonzentrationen 6,8, 8,3 und 8,6 mg / ml für 0, 0,2 bzw. 7 Gy. Dies unterliegt jedoch einer hohen Variabilität bei der Aufnahme von Proben von klinischen Standorten, die nicht optimal vorbereitet wurden, der Erkrankung des Patienten und dem Vorhandensein von Hämoglobin durch Kontamination der roten Blutkörperchen. Zum Beispiel müssen sehr kleine Pellets in einem Volumen des Lysepuffers resuspendiert werden, das größer als das Zellpelletvolumen ist, um sowohl die Proteinkonzentrationsmessung als auch die nachgeschaltete Biomarkeranalyse zu ermöglichen, was zu mehr verdünnten Proben führt. In einem solchen Fall, wenn eine Probenkonzentration unter 1 mg / ml liegt, kann dies aufgrund dieses hohen Verdünnungsfaktors eine Herausforderung darstellen, Assays wie Western Blot durchzuführen. Im Gegensatz dazu variierte in den zuvor genannten CLL-Proben das Volumen des Lysepuffers, der zur Resuspendierung der Zellpellets hinzugefügt wurde, zwischen 50 und 500 μL, und die Proteinkonzentration reichte von 1,62 bis 19,77 mg/ml (Tabelle 1).
Wenn Proben eine Kontamination der roten Blutkörperchen oder eine Hämolyse aufweisen (Abbildung 3C), wird die Proteinkonzentration des PBMC-Lysats aufgrund der Aufnahme von Hämoglobin aus den Erythrozyten überschätzt. Dies ist der Grund, warum man eine visuelle Inspektion und Annotation solcher Proben durchführen sollte, wie in Schritt 6.7 des Protokolls beschrieben. Das Überladen der Probe kann das Vorhandensein von Hämoglobin bei der Durchführung der Biomarkeranalyse kompensieren, soweit eine Belastungskontrolle im Assay enthalten ist. Andere quantitativere Methoden zur Messung der Hämolyse könnten implementiert werden, wie z.B. die Messung der Absorption bei 414 nm32.
Die DDR wurde in PBMCs analysiert, die nach diesem klinischen Protokoll erhalten wurden. Um eine Situation zu veranschaulichen, die DNA-schädigende klinische Behandlungen wie Strahlentherapie oder Chemotherapie nachahmt, wurde Vollblut von gesunden Freiwilligen ex vivo einer Röntgenstrahlung unterzogen (Abbildung 4A). Ionisierende Strahlung (IR) wie Röntgenstrahlen induziert verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Die DNA-Schadenserfassung dieser Läsionen aktiviert PIKKs wie Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM), ATM und Rad3-related (ATR) und DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK), die DNA-Reparaturmechanismen wie homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologe Endbeinung (NHEJ) aktivieren. Die Aktivierung von ATM durch das Vorhandensein von DSBs erfolgt durch seine Rekrutierung an Schadensstellen durch den MRN-Komplex (MRE11-RAD50-NBS1), was zu einer ATM-Autophosphorylierung an mehreren Rückständen, einschließlich Ser1981, führt. Aktiviertes ATM wiederum phosphoryliert die Komponenten des MRN-Komplexes und anderer Proteine wie der Histonvariante H2AX auf Ser139 (wobei pSer139-H2AX auch als γH2AX bekannt ist), um eine strukturelle Veränderung des Chromatins aus dem DSB zu fördern, die die Rekrutierung anderer DDR-Faktorenerleichtert 33. PBMCs reagieren trotz ihrer geringen Proliferationsrate auf ionisierende Strahlung und Massenspektrometriemethoden haben es ermöglicht, die Hochregulation von phosphoryliertem Ser635 auf RAD50 durch ATM zu quantifizieren. Diese Phosphorylierung wird in Gegenwart von ATM-Inhibitoren reduziert und RAD50 pS635 wurde durch Immunhistochemie weiter als pharmakodynamischer Biomarker für klinische ATM-Inhibitor-Behandlungen in Tumoren validiert8. Um das Ansprechen von PBMCs auf Strahlung zu bewerten, wurde Blut von gesunden Probanden verschiedenen IR-Dosen unterzogen und Proben nach einer 1-h-Inkubation bei 37 °C entnommen(Abbildung 4A). Zu diesem Zweck wurde Blut in Kunststoffröhrchen überführt, um eine Verringerung der Ausbeute der PBMC-Isolierung aufgrund hoher Temperaturen zu vermeiden (Schritt 6.2). Wir analysierten, wie ATM aktiviert wurde, indem wir uns nicht nur die zuvor gemeldeten RAD50 pS635, sondern auch ATM pS1981 und γH2AX ansahen. In den drei untersuchten Fällen wurde eine Zunahme dieser post-translationalen Modifikationen bei höheren IR-Dosen beobachtet (Abbildung 4B). Interessanterweise war die Phosphorylierung von ATM und RAD50 bei der niedrigen Dosis von 0,2 Gy erheblich, was darauf hindeutet, dass diese post translationalen Modifikationen als PD-Biomarker für Behandlungen mit der Erzeugung von DNA-DSBs mit einem guten Dynamikbereich nicht nur in Tumorproben, sondern auch in peripherem Blut untersucht werden können. Dies ermöglicht die Überwachung des PD-Ansprechens auf die Behandlung durch die Erfassung von Längsproben während des Behandlungsverlaufs. Der Zeitpunkt von der Blutentnahme bis zur Verarbeitung der Proben ist entscheidend, um sicherzustellen, dass diese Signalkaskaden immer noch aktiv sind, da Verzögerungen in der Verarbeitung die Kinetik solcher Kaskaden beeinflussen und man die als Phosphomarker verwendeten Phosphorylierungsereignisse übersehen könnte.
Abbildung 4: PBMCs, die nach dem vorliegenden klinischen Protokoll aus ex vivo bestrahltem Blut isoliert wurden, zeigen Biomarker an, um über das Ausmaß der durch die Behandlung verursachten DNA-Schäden zu informieren. (A) Schematischer Überblick über das Protokoll zur Herstellung von PBMCs und zur Analyse der DDR bei Vollblutbestrahlung. *2 zusätzliche Zentrifugationsschritte, die für die ctDNA-Analyse/Metabolomik erforderlich sind. (B) Western Blot zeigt dosisabhängige Hochregulation von DDR-Phospho-Biomarkern in PBMCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Probe | Anzahl PBMCs/ 8 ml Blut | Ergänztes RIPA-Puffervolumen (μL) | Endkonzentration (mg/ml) |
| A.1 | 39100000 | 70 | 12.16 |
| A.2 | 97400000 | 100 | 4.54 |
| A.3 | 233000000 | 150 | 7.63 |
| A.4 | 316000000 | 150 | 16.87 |
| A.5 | 387000000 | 150 | 12.60 |
| A.6 | 459000000 | 150 | 12.71 |
| A.7 | 414000000 | 200 | 15.67 |
| A.8 | 253000000 | 150 | 14.56 |
| A.9 | 509000000 | 300 | 10.67 |
| B.1 | 15200000 | 70 | 2.96 |
| B.2 | 10500000 | 50 | 4.59 |
| B.3 | 13200000 | 50 | 3.99 |
| B.4 | 34800000 | 100 | 10.41 |
| B.5 | 1620000 | 70 | 7.11 |
| B.6 | 70200000 | 100 | 9.26 |
| B.7 | 65400000 | 100 | 12.10 |
| B.8 | 91100000 | 150 | 11.82 |
| C.1 | 6330000 | 70 | 4.04 |
| C.2 | 4400000 | 150 | 19.77 |
| C.3 | 68000000 | 100 | 8.96 |
| C.4 | 35100000 | 50 | 9.30 |
| C.5 | 35400000 | 70 | 10.55 |
| C.6 | 99200000 | 100 | 16.19 |
| D.1 | 402000000 | 70 | 7.23 |
| D.2 | 826000000 | 300 | 16.95 |
| D.3 | 1990000000 | 300 | 14.87 |
| D.4 | 1000000000 | 300 | 18.34 |
| D.5 | 1160000000 | 400 | 16.13 |
| D.6 | 806000000 | 400 | 19.40 |
| E.1 | 302000000 | 300 | 13.86 |
| E.2 | 990000000 | 500 | 19.04 |
| E.3 | 1200000000 | 400 | 17.13 |
| F.1 | 4010000 | 50 | 1.62 |
| F.2 | 5170000 | 50 | 2.84 |
| F.3 | 2810000 | 50 | 3.69 |
| F.4 | 3700000 | 75 | 3.62 |
| F.5 | 3460000 | 70 | 4.03 |
| F.6 | 7060000 | 50 | 3.32 |
| G.1 | 60700000 | 70 | 6.57 |
| G.2 | 82100000 | 150 | 7.78 |
| G.3 | 30500000 | 70 | 8.28 |
| G.4 | 134000000 | 100 | 15.14 |
| G.5 | 91900000 | 100 | 8.61 |
| G.6 | 372000000 | 150 | 15.88 |
| G.7 | 574000000 | 200 | 15.01 |
| Longitudinale PBMC-Proben für 7 Patienten | |||
Tabelle 1: Zellzahl und Proteinkonzentration von PBMC-Pellets von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL). Die in dieser Tabelle dargestellten Daten entsprechen 45 PBMC-Proben von 7 CLL-Patienten, die an der Studie NCT03328273 teilnahmen, die in mononukleären Zellpräparationsröhrchen gesammelt wurden. Dabei handelt es sich um Originaldaten, die anhand von Stichproben aus der zitierten Studie31 generiert wurden.
Zusatzdatei: Alternative Protokolloptionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Hochwertige Präparate aus PBMCs und Plasma, die robust und reproduzierbar an klinischen Studienstellen hergestellt werden können, sind von unschätzbarem Wert, um periphere prädiktive und pharmakodynamische translationale Biomarkerendpunkte für klinische Studien zu informieren. Hier haben wir ein kurzes, klares Protokoll bereitgestellt, das die typischerweise problematischen Schritte behandelt, die bisher anfällig für Ausführungsfehler in einer klinischen Studie waren. Das Protokoll kann jedoch weiter optimiert werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen, wie z.B. Zeitbeschränkungen am klinischen Standort oder Art der nachgelagerten Analysen (siehe Ergänzungsdatei).
Zu diesem Zweck haben wir gezeigt, wie sowohl PBMCs als auch Plasma aus Vollblut mit mononukleären Zellpräparationsröhrchen isoliert werden können, um gefrorene PBMC-Pellets und gefrorenes Plasma herzustellen, die für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen geeignet sind. Wir haben auf besonders kritische Protokollschritte aufmerksam gemacht, die die Zentrifugation und Identifizierung der PBMC-Schicht in Schritt 2.5 und PBMC-Pellets in den Schritten 3.3 und 3.6 beinhalten. In der Vergangenheit sind klinische Stellen oft schief gelaufen, indem die Zentrifuge auf die richtigen Einheiten einstellt (ein RCF- oder x-g-Wert mit einem RPM-Wert verwechselt wird), wodurch die Verarbeitung von Blutproben, die Temperatur und das Vorhandensein großer Mengen PBS über dem gefrorenen Zellpellet verzögert werden. In den meisten Zentrifugenrotoren führt die irrtümliche Eingabe eines x-g-Wertes als Drehzahleinstellung zu einer signifikanten Unterzentrifugation mit einer daraus resultierenden schlecht definierten oder fehlenden PBMC-Schicht und zu einer möglichen versehentlichen PBMC-Entsorgung während der Waschschritte aufgrund ineffizienter Zellpelletierung. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass eine PBMC-Schicht trotz Verwendung der richtigen Zentrifugationseinstellungen und des Rotoradapters nicht sichtbar ist, wenn der Patient eine Leukopenie entwickelt hat. Dieser Zustand kann Patienten betreffen, die aufgrund einer Chemotherapie oder Strahlentherapie an onkologischen Studien teilnehmen, und sollte in Betracht gezogen werden. Ein weiterer kritischer Punkt, der im Protokoll klargestellt wurde, ist, dass die Proben innerhalb von 1-2 h nach der Blutentnahme verarbeitet werden müssen, um die Möglichkeit einer Hämolyse zu verringern, die sich negativ auf das Protokoll auswirkt. Darüber hinaus reduziert das Ziel, die Proben während der ersten Stunde der Blutentnahme zu verarbeiten, die Ex-vivo-Variabilität, die einen großen Einfluss auf pharmakokinetische Auslesungen und auf Biomarker haben kann, die von der Blutkonservierung oder aktiven Signalwegen betroffen sind, wie der in Abbildung 4gezeigte Fall . Verzögerungen bei der Probenverarbeitung können sich auch nachteilig auf die Zelllebensfähigkeit auswirken, wenn Zellen kryokonserviert werden34. Ein weiterer Faktor, der sowohl die Ausbeute als auch die Kontamination der roten Blutkörperchen beeinflussen kann, ist die Lager- und Zentrifugationstemperatur, die bei Raumtemperatur (18-25 °C) gehalten werden sollte. Niedrigere Temperaturen erhöhen die Dichte des Dichtegradientenmediums, was zu einem höheren Grad an roter Blutkörperchen und Granulozytenkontamination führt, da diese Zellen nicht so gut aggregieren. Auf der anderen Seite führen höhere Temperaturen dazu, dass PBMCs zwischen aggregierten Erythrozyten eingeschlossen werden, wodurch die Ausbeute der Zubereitung15,27,28verringert wird. Und schließlich ist es entscheidend, dass nicht mehr als 50-100 μL Flüssigkeit mit dem Zellpellet im Kryovial vorhanden sind, da dies die Konzentration von Proteinlysaten, die bei der Nachverarbeitung dieser PBMC-Präparate erhalten werden, negativ beeinflusst. Ein Überschuss an Flüssigkeit überdünnt Proben, was zu Lysaten mit sehr niedriger Proteinkonzentration führt, die für die Biomarkeranalyse nicht geeignet sind. Darüber hinaus wird die Erhaltung post translationaler Modifikationen beeinträchtigt und die Effizienz der Lyse wird ebenfalls stark reduziert.
Mononukleäre Zellpräparationsröhrchen wurden ausgewählt, da sie die einfachste Möglichkeit bieten, sowohl PBMCs als auch Plasma in einer einzigen Blutentnahme für klinische Studien mit unserer Erfahrung ausgezeichneter Reproduzierbarkeit zu isolieren. Die Blutverarbeitung erfordert keine gut ausgebildeten Bediener, und die Verwendung eines einzigen Röhrchens beseitigt die Notwendigkeit, das Blut zu verdünnen und in ein anderes Röhrchen zu übertragen, wodurch das Gefahrenrisiko verringert wird. verkürzt das Protokoll aufgrund der Durchführung der Zentrifugationsschritte mit eingeschalteten Bremsen; und alle Reagenzien befinden sich in der Röhre, was die Variabilität reduziert. Unserer Erfahrung nach überwiegen diese Vorteile die höheren Kosten dieser Röhrchen im Vergleich zu anderen klassischen Methoden, die nur die Verwendung eines Dichtegradiententrennmittels27,28 umfassen (£ 410 pro 60 Einheiten, während Lymphoprep Medium für 66 50-ml-Präparate £ 215 beträgt). Sie sind in zwei Arten von Antikoagulanzien erhältlich, Heparin und Citrat, die beide bei der Aufrechterhaltung der Funktionalität der isolierten PBMCs35vergleichbar sind, daher wird die Wahl eines Antikoagulans gegenüber dem anderen auf einem möglichen Einfluss von Heparin oder Citrat in den nachgelagerten Biomarkerstudien basieren. Während gezeigt wurde, dass EDTA-Röhrchen im Vergleich zu Heparin oder Citrat13die höchste PBMC-Isolationsausbeute bieten, gleicht der Vorteil der Benutzerfreundlichkeit der Reinrohrmanipulation diese Überlegung aus. Wenn Zytokine analysiert werden sollen, können Antikoagulanzien eine Wirkung auf die im Plasma nachgewiesenen Werte haben, daher sollten beide Antikoagulanzien getestet werden, bevor eines für die klinische Studie ausgewählt wird36. Wenn das Plasma für Metabolomik-Studien verwendet werden soll, wäre die Verwendung von Heparin als Antikoagulans bevorzugt37. Daher bleibt dem Endnutzer oder dem translationalen Wissenschaftler der klinischen Studie nur noch der Punkt, ob Citrat oder Heparin für ihre Zwecke besser geeignet ist, sobald die Kosten bewertet wurden.
Während die Vorteile der Verwendung von Zellpräparationsröhrchen im Vergleich zu den Einschränkungen, die sie darstellen (höhere Kosten und Verfügbarkeit einer begrenzten Palette von Antikoagulanzien), zahlreich sind, kann die Haupteinschränkung der Verwendung von PBMCs oder Plasma zur Gewinnung von PD-Biomarkern in klinischen Studien, insbesondere in der Onkologie, in keinem Zusammenhang mit der Isolationsmethode stehen. Mit Ausnahme von hämatologischen Krebsarten, bei denen der Tumor direkt aus peripherem Blut entnommen wird, sind Plasma und PBMCs bei anderen Krebsindikationen Ersatzgewebe, die den Primärtumor nicht unbedingt nachahmen. Peripheres Gewebe darf das Genom und epigenom nicht mit dem Primärtumor teilen, daher beschränkt sich die periphere Analyse von Biomarkern, die von einer spezifischen Tumormutation abhängig sind, hauptsächlich auf die ctDNA-Analyse (aus Plasma) oder CTCs (durch nachfolgende Sortierung der PBMC-Schicht). Darüber hinaus sind Signalkaskaden, die die Tumorproliferation antreiben oder dazu beitragen, im peripheren Blut möglicherweise nicht so aktiv. Diese Herausforderung kann durch die Anwendung von Biomarker-Entdeckungsansätzen für Blut8 zur Identifizierung alternativer Biomarker oder durch die Kopplung von Ex-vivo-Behandlungen mit der Isolierung von Plasma38 undPBMC-Präparaten 26überwunden werden.
Im aktuellen Protokoll können gefrorene PBMC-Pellets leicht außerhalb der klinischen Stelle verarbeitet werden, um Proteinlysate zu erhalten, die durch Western Blotting oder ELISA-Techniken bewertet werden können. Alternative Methoden zur Verwendung von PBMCs zur Aktivierung von IHC-Methoden wurden ebenfalls vorgestellt (Supplementary File). Darüber hinaus haben wir auch die Möglichkeit der Kryokonservierung von PBMCs (siehe Ergänzungsdatei)für das Immunzellmonitoring, eine relevante Anwendung in der Onkologie, mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren und ADCs, die zunehmend in klinischen Studien getestet werden, detailliert beschrieben. Die Beurteilung von Immunfunktionen wie ADCC16 und Immunphänotypisierung sind Anwendungen, die mit kryokonservierten PBMCs kompatibel sind, die aus mononukleären Zellpräparationsröhrchen isoliert wurden15. Es gibt einen Vorbehalt bei der Kryokonservierung, da sie die Herunterregulierung bestimmter Oberflächen- und interner Marker fördern und bestimmte Zellfunktionen beeinträchtigen kann, jedoch ist die PBMC-Kryokonservierung der einzige praktikable Weg, um diese Assays aufgrund von Zeitbeschränkungen bei der Handhabung von Proben von mehreren klinischen Standorten bis zur Verarbeitung in externen Laborsdurchzuführen 14,15, und diese nachteiligen Auswirkungen können durch gute Auftaumethoden und Ruhezeiten erheblich überwunden werden39.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier bereitgestellte Protokoll die zuverlässige Vorbereitung von PBMCs und Plasmaproben in jeder klinischen Einrichtung mit gemeinsamen Geräten und Materialien ermöglicht, so dass translationale Endpunkte aus peripherem Blut in globalen klinischen Studien robust ermöglicht werden können.
Schließlich zeigen wir, wie die Analyse von PBMC-Lysaten die Reaktion auf DNA-schädigende Wirkstoffe mechanistisch beeinflussen kann, indem eine dosisabhängige post-translationale Modifikation wichtiger DDR-Faktoren gezeigt wird, die zur Gestaltung der klinischen Entwicklung verwendet werden kann. Eine vorausschauende Implementierung von Methoden, die quantitativer sind als Western Blotting (z.B. Massenspektrometrie40)und weniger Inputmaterial benötigen (wie kapillares Western Blotting und ELISA), würde dazu beitragen, diese präklinischen Ergebnisse in Richtung einer robusteren, systematischeren Auswertung von PBMC-Patientenproben zu bewegen.
Disclosures
Alle Autoren sind oder waren Mitarbeiter und Stakeholder von AstraZeneca. VM ist ein Mitarbeiter von Acerta Pharma, besitzt Aktien von AstraZeneca und Gilead Sciences.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern der Translational Medicine bei AstraZeneca Oncology Research and Early Development für ihr Feedback zum Protokoll, insbesondere Hedley Carr, Tammie Yeh und Nathan Standifer für ihre Beratung zur Plasmavorbereitung für die ctDNA-Analyse, zur PBMC-Isolierung und zur PBMC-Kryokonservierung bzw. Immunphänotypisierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
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