Summary
פרוטוקול זה מפרט הכנה קלינית ליישום של דגימות PBMC ופלזמה באיכות גבוהה באתר הניסוי הקליני שניתן להשתמש בהן לניתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.
Abstract
ניתוח של סמנים ביולוגיים בדם היקפי הופך להיות חשוב יותר ויותר בניסויים קליניים כדי להקים הוכחה של מנגנון כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול, ולעזור להנחות את המינון ואת הגדרת לוח הזמנים של טיפולים. מהגרלת דם אחת, ניתן לבודד ולעבד תאים מונונוקאריים בדם היקפי כדי לנתח ולכמת סמני חלבון, ודגימות פלזמה יכולות לשמש לניתוח דנ"א גידולי במחזור, ציטוקינים ומטבולומי פלזמה. דגימות אורך מטיפול מספקות מידע על האבולוציה של סמן חלבון נתון, מצב המוטציה והנוף החיסוני של המטופל. זה יכול להיות מושגת רק אם העיבוד של הדם ההיקפי מתבצע ביעילות באתרים קליניים ודגימות נשמרים כראוי מן המיטה לספסל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב לשימוש כללי שניתן ליישם באתרים קליניים להשגת כדורי PBMC ודגימות פלזמה בניסויים קליניים רב מרכזיים, שיאפשר לאנשי מקצוע קליניים במעבדות בית החולים לספק בהצלחה דגימות באיכות גבוהה, ללא קשר לרמת המומחיות הטכנית שלהם. וריאציות פרוטוקול חלופיות מוצגות גם הן הממוטבות לשיטות אנליטיות ספציפיות יותר במורד הזרם. אנו מיישמים פרוטוקול זה לחקר סמנים ביולוגיים של חלבונים נגד תגובת נזקי DNA (DDR) על דם מוקרן ברנטגן כדי להדגים את התאמת הגישה בהגדרות אונקולוגיות שבהן תרגלו תרופות DDR ו/או הקרנות, כמו גם בשלבים פרה-קליניים שבהם נדרשת בדיקת השערה מכנית.
Introduction
פיתוח תרופות נועד לספק טיפולים חדשים המטפלים בצרכים רפואיים בלתי מעורערים ורפואה ממוקדת ומותאם אישית יותר. מנגנוני תרופות מרובים נמצאים תחת חקירה פעילה כולל עיכוב אנזימטי כגון קינאז1, פרוטאז2, או פולי (ADP-ריבוז) מעכבי פולימראז (PARP)3, משפילי חלבון4, נוגדנים טיפוליים5, ותרופות הקשורות לנוגדנים (ADCs) 6 ,ביןרבים אחרים. דוגמה למאמצים להשיג טיפולים טובים יותר באונקולוגיה היא השימוש במעכבי קינאז במטרה לעצור את מפל האיתות השומר על תאים סרטניים מתרבים1,7. מדידת רמות זרחון מצע ספציפי קינאזים אלה הוא הסמן הביולוגי הפרמקודינמי הטוב ביותר לכמת את מנגנון הפעולה של מעכבים אלה8. תרופות אחרות עשויות לווסת את הביטוי של חלבון נתון, ובמקרה זה היכולת לכמת את השינויים בריכוז חלבון היעד שלהם לאורך כל הטיפול היא בעלת חשיבות עליונה. לכן, ללא תלות במאפיינים של תרופה או פתולוגיה, הערכה של סמנים ביולוגיים כדי להקים את הפרמקוקינטיקה (PK)/ פרמקודינמיקה (PD) הקשר בין חשיפה לתרופות אפנון היעד הוא הנוהג הטוב ביותר בפיתוח קליני מוקדם ומאפשר קביעת מינון בטוח וסובלני פרמקולוגי פעיל / לוח זמנים9.
בעוד בפיתוח קליני אונקולוגי, ניתוח סמנים ביולוגיים ביופסיות עשוי להיות ההגדרה הטובה ביותר כדי להקים הוכחה של מנגנון של תרופה, מספר הביופסיות הזמינות בניסוי הוא בדרך כלל מוגבל למדי10,11. לחלופין, דגימות דם היקפיות הן בעלות ערך רב לניסויים קליניים משום שהן כרוכות בהליך זעיר פולשני, מהירות וקלות להשגת ניתוח אורך מקל, זולות יותר מביופסיות ומספקות מידע עצום לניטור בזמן אמת של תוצאות הטיפול. יתרון נוסף להערכת סמנים ביולוגיים PD בדם היקפי היא היכולת להשתמש בביו-סמפל גם לכמת PK המאפשר דיוק בקביעת יחסים כמותיים PK / PD ומידול PK / PD הבאים12,13. תאים מונו-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מדם שלם יכולים להיות מבודדים כדי לחקור סמני חלבון, אשר חווים שינויים ברמת הביטוי שלהם או בשינויים שלאחר התרגום שלהם. בנוסף, PCBMCs יכול לשמש למטרות אימונופנוטיפינג14,15, בדיקות פונקציונליות החיסון כגון הערכת cytotoxicity הסלולר תלויי נוגדנים (ADCC)16 וניתוח אפיגנטי באמצעות בידוד RNA. כמו כן, פלזמה מדם שלם יכולה לשמש לכימות ציטוקינים כדי לאפיין את התגובה החיסונית של המטופל, לבצע מחקרים מטבוליים, וגם לבודד ולרצף במחזור DNA הגידול (ctDNA) לניטור האבולוציה שיבוט של המחלה תחת הבחירה של הסוכן הטיפולי, לעתים קרובות מתן בסיס מכני להתנגדות לטיפול17,18,19 המאפשר התפתחות של הדורות הבאים של טיפולים20. לבסוף, בידוד של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מדם היקפי מאפשר הערכה של התקדמות המחלה על ידי ספירה אורך, רצף DNA / RNA וניתוח סמן ביולוגי חלבון21. למרות בידוד זה תואם את הפרוטוקול המתוארבזאת 22, השפע הנמוך של CTCs בסוגי סרטן רבים בשלבים מוקדמים של המחלה עושה את השימוש בצינורות מיוחדים מתאים יותר למזעור השפלה CTC23.
בשנים האחרונות, השימוש בביופסיות נוזליות שיפר את המידע שהושג בניסויים קליניים ואוסף PBMC נכלל במחקרים רבים כדי לפקח על מעורבות היעד והוכחת מנגנון או ישירות בתאי הגידול עבור סוגים מסוימים של ממאירויות המטולוגיות, או על המחשבים עצמם כפונדקאי PD של תאים סרטניים24,25,26. הכנת דגימות באיכות גבוהה משפיעה באופן חיובי על קביעת הטיפול הבטוח והיעיל ביותר לפתולוגיה נתונה אך מניסיוננו, איכות ההכנות של PBMC המתקבלות מאתרים קליניים שונים נתונה לשונות רחבה באיכות וכתוצאה מכך דגימות שאינן מתאימות לצורך ניתוח במורד הזרם. זה השפיע על כמות נתוני PD שניתן לאסוף ממחקרים אלה.
כאן אנו מתארים בפירוט פרוטוקול קל למעקב שמראה כיצד לבודד ביעילות הן PBMCs ודגימות פלזמה מתיקו דם יחיד בסביבה קלינית. הפרוטוקול מבוסס על ההוראות שמספק היצרן של צינורות הכנת התאים המונו-גרעיניים, המשלבים שינויים שבהם הניסיון בעולם האמיתי הדגיש קשיים בביצוע פרוטוקולים כפי שדווחו על ידי אתרים קליניים, כגון בעיות צנטריפוגה, עיכובים בעיבוד והעברת מדגם לקריוביאלים. ישנן שיטות זמינות מסחרית חלופיות לשימוש בצינורות הכנת תאים מונונוקולריים המבוססים על הפרדת שיפוע צפיפות באמצעות פתרונות פוליסכריד עם או בלי מחסום המפריד בין הפתרון לדם27. אם האתר הקליני הרלוונטי כבר מנוסה היטב במתודולוגיות חלופיות אלה, ניתן להחליף פרוטוקול זה באופן מקובל במתודולוגיות אלה. במקרים כאלה, ניתן לשקול שני גורמים: כמה שיטות חלופיות דורשות העברת דם שלם מצינור איסוף לצינור הכנה נפרד שבו העברה נוספת של חומר ביולוגי ראשוני אנושי עשויה להוות סיכון בטיחותי מוגבר במקצת, והצלחת שיטות ללא מחסומים המפרידים בין הדם לתמיסת הפוליסכריד מסתמכת על צעדים קריטיים כגון שכבות דגימת הדם על מדיום הדרגתי צפיפות הדורש פיתוח של רמה מעודנת של מומחיות טכנית לא תמיד נמצא במעבדה בבית החולים. למרות הנקודות לעיל, הכדאיות הכוללת והתאוששות התאים דומות בין טכניקות אלה15,28. הבחירה במתודולוגיה תלויה במידת מה בניסיון הטכני הקודם, אך בידינו ניתן להשתמש בהצלחה בצינורות הכנת תאים מונונוקולריים בהקשר קליני רחב והם ההמלצה שלנו, אחרת.
בעוד נקודת קצה אחת של פרוטוקול זה היא לייצר כדורי PBMC לעיבוד נוסף לתוך lysates, יישומים סופיים אחרים של אוסף PBMC יכול להיות מיושם, כגון בידוד של חומצות גרעין, או לייצר כתמי PBMC או בלוקים PBMC מתאים immunohistochemistry (IHC) שיטות. חשוב לציין, מאז כל biosample נלקח מהחולים מייצג הליך פולשני ברמה מסוימת לפחות, פרוטוקול זה ממקסם את החומר השימושי מכל מדגם על ידי גם בידוד פלזמה אשר ניתן להשתמש בהם עבור ניתוחי ציטוקינים, מחקרים מטבולומיים או רצף ctDNA.
הניתוח של סמנים ביולוגיים היקפיים בניסויים אונקולוגיים הוא אחד היישומים הרבים של ליטסטים PBMC. דוגמה אחת היא הערכה של תגובת נזק DNA (DDR) בטיפולים כגון כימותרפיה, הקרנות או שימוש במעכבי אנזימים המעורבים ב- DDR כגון phosphatidylinositol-3 קינאז הקשורות קינאז (PIKKs)7 ו PARPs3,13. מטרת טיפולים אלה היא להגדיל את נזקי הדנ"א בתאים המתרבים, מה שיוצר רעילות גבוהה בתאים עם מנגנוני DDR לקויים ומחסומים מחזור התא, כגון תאים סרטניים. כאן אנו מציגים דוגמה עם מחקר של סמנים ביולוגיים DDR בדם היקפי נתון צילומי רנטגן.
Protocol
הסכמה מושכלת של המטופל ועמידה מלאה בדרישות האתיקה הלאומיות הרלוונטיות בכל תחום שיפוט, למשל, חוק הרקמות האנושיות (HTA – בריטניה, 2004) וחוק הניידות והאחריות של ביטוח הבריאות (HIPAA – ארצות הברית, 1996) הם חובה. ודא שיש אישור אתי מתועד במלואו לפני תחילת כל עבודה על חומרים שמקורם בבני אדם. דם המשמש באופטימיזציה של פרוטוקול זה סופק בהסכמה מתאימה של פאנל רפואה מתקדמת מתנדבים (VAMP) (התייחסות אתית 16/EE/0459, מחקר CRF494, תת מחקר 001) המנוהל על ידי מתקן המחקר הקליני NIHR קיימברידג ', קיימברידג ', בריטניה, תחת הסכם אספקת דגימות ביולוגיות אנושיות עם המכון הלאומי לחקר הבריאות (NIHR) קיימברידג ' מרכז מחקר ביו רפואי. AstraZeneca Biobank בבריטניה מורשה על ידי רשות הרקמות האנושית (רישיון מס '12109) ויש לו אישור הוועדה הלאומית לשירות האתיקה של המחקר (NREC) כבנק רקמת מחקר (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. הדרכת הכנה כללית
הערה: כל עבודה עם חומר אנושי לא משועבד כגון הדם, הפלזמה והמחשבים האישיים בפרוטוקול זה חייבת לפעול תחת ההנחה שחומרים אלה עשויים לשאת חומרים שעלולים להיות זיהומיות ולכן יש לבצעם תחת אמצעי זהירות מתאימים של בטיחות ביולוגית. עבור חולים שנבדקו שליליים עבור פתוגנים ידועים, לא להניח דגימות אינן זיהומיות ולכן אמצעי זהירות מתאימים עדיין חייב להיות מיושם. מוצרי פסולת המופקים מחומרים אלה יש לטפל באותם אמצעי זהירות biosafety ולהיפטר על פי הכללים המקומיים.
- בחר בין שני סוגים של צינורות הכנת תאים mononuclear לנצל גם נתרן ציטראט או נתרן הפרין כמו נוגדי קרישה. עבור יישומים רבים במורד הזרם אלה שני נוגדי קרישה ניתן להשתמש לסירוגין אבל שני נוגדי קרישה צריך להיבדק לפני בחירת אחד לניסוי.
- תווית אחת 8 מ"ל צינור הכנת תא מונונוקולרי לשמש לאיסוף הדם עם מזהה מקודד של המטופל. שמור את הצינורות בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס).
- יש לאחסן 1x PBS בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס). יש להשתמש ב-30 מ"ל להכנה.
- ודא צינורות עבור דגימות פלזמה נפרדות cryovial עבור מדגם PBMC מסומנים במדויק עם מזהים ייחודיים, כפי שצוין בסעיף המתאים של מדריך המעבדה.
- אם PBMCs הולכים לשמש כדי לפקח על חלבונים phosphorylated, להכין PBS בתוספת מעכבי פוספטאז: לערבב 5 מ"ל של PBS עם 50 μL של קוקטייל מעכבי פוספטאז 2 + 50 μL של קוקטייל מעכבי פוספטאז 3. מכינים טריים ושומרים על הקרח עד לשימוש.
- אם מחשבים אישיים הולכים להיות cryopreserved, להכין תערובת הקפאה 1 מ"ל לכל מדגם על ידי ערבוב 90% FBS + 10% DMSO.
2. אוסף PBMC (איור 1A)
- לצייר 8 דם מ"ל לתוך צינור הכנת תא מונונוקולרי באמצעות הטכניקה הסטנדרטית המתוארת על ידי היצרן. הפוך את הצינור בעדינות 8 עד 10 פעמים כדי לערבב את התוסף נוגד קרישה עם דם. אל תנער כדי למנוע המוליזה. להקליט את הזמן שבו הדם נמשך.
- לאחר האיסוף, יש לאחסן את הצינור זקוף בטמפרטורת החדר עד לצנטריפוגה. לעבד את הדגימות בהקדם האפשרי, באופן אידיאלי בתוך שעה אחת של איסוף הדם הזה, אבל לא יאוחר מ 4 שעות לאחר איסוף. רשום את העיתוי בעת תחילת עיבוד הדם.
- מיד לפני צנטריפוגה רמיקס דגימת הדם על ידי בעדינות היפוך הצינור 8 עד 10 פעמים נוספות.
- צנטריפוגה הצינור / דם מדגם צינורות ברוטור אופקי (ראש מתנדנד) ב 1,500 – 1,800 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס). ודא כי כל הצינורות מאוזנים כראוי.
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול והתמונות הייצוגיות של הצנטריפוגה. (A)סקירה סכמטית של הפרוטוקול להכנת מחשבים אישיים ופלזמה. *אם קיימים אילוצי זמן, ניתן לקצר את שלב 2.4 ל- 20 דקות וניתן להסיר את שלבים 3.3 עד 3.6. ** קח aliquot לספור תאים, במידת הצורך. 2 שלבי צנטריפוגה נוספים הנדרשים לניתוח ctDNA / metabolomics (B) תמונה של צנטריפוגה רוטור ראש מתנדנד להגדיר לשלב 2.4. (C) תמונה של הרוטור, הכולל שני דליים המכילים את המתאמים לסובב צינורות הכנת תאים מונונוקולריים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הערה: x g (המכונה גם RCF, יחידות צנטריפוגליות יחסיות) ו- RPM (מהפכות לדקה) הן יחידות שונות. הקפד להגדיר את הצנטריפוגה עבור x g (RCF). השתמש במחשבון המקוון (ראה טבלת חומרים)עבור ההמרה. אם רק רוטור בזווית קבועה זמין, בצע שלב זה במשך 10 דקות ב 1,500 – 1,800 x g.
- לאחר צנטריפוגה, בדוק את נוכחותה של שכבה אדומה כהה מתחת למחסום (המכילה בעיקר תאי דם אדומים), ו -2 שכבות מעל המחסום. השכבה העליונה היא הפלזמה (בצבע קש) והשכבה הלבנבן שמתחתיה היא המעיל הבאפי המכיל את המחשבים האישיים. ניתן להבחין בקלות בין שכבות אלה בעת הצגת הצינור על רקע כהה/שחור.
איור 2: צינורות לבידוד מחשבים אישיים. (A)תמונה של הצינורות לפני צנטריפוגה (שלב 2.4), ריק (שמאל) או המכיל דם (ימין). (B)הפרדה מוצלחת של שכבת PBMC לאחר צנטריפוגה (שלב 2.5). (C) תמונה של שכבת PBMC לאחר צנטריפוגה וקצת פלזמה שנותרה כדי להבטיח שכל המחשבים האישיים נאספים (שלב 2.7). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הערה: אם שכבות אלה אינן גלויות, סביר להניח שהדבר מצביע על שגיאה בהגדרת יחידות הצנטריפוגה. ודא שנעשה שימוש במתאם הצנטריפוגה הנכון וש"x g" הנכון מוגדר. חזור על שלב 2.4.
- מיד לאחר צנטריפוגה, להשתמש פיפטה סרולוגית להעביר כמחצית הפלזמה לתוך צינור צנטריפוגה חרוט בגודל 15 מ"ל עם כובע, תוך הקפדה לא להפריע לשכבת PBMC (כ 4-5 מ"ל). לאחסן באופן זמני צינור זה עם פלזמה על קרח רטוב לשמש בהמשך השלב 4. מניחים בצד לעת עתה.
- לאסוף את כל שכבת PBMC עם פיפטה פסטר על ידי הצבת פיפטה בתוך שכבת התאים ולהעביר צינור צנטריפוגה חרוט בגודל 15 מ"ל שונה עם כובע. מקובל גם לקחת כמות קטנה של פלזמה, במידת הצורך, כדי לקבל לחלוטין את כל שכבת PBMC. אמצעי האחסון הוא בדרך כלל 1-2 מ"ל. המשך מיד עם השלב 3 להלן.
3. צעדי כביסה PBMC
הערה: מטרת שלבי הכביסה היא לדלל ולהסיר שאריות טסיות רישוי ופלזמה מן גלולת PBMC. כל שלבי הצנטריפוגה צריכים להתבצע בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס).
- הוסף PBS טמפרטורת החדר לצינור PBMC כדי להביא את עוצמת הקול ל 15 מ"ל. תכסה את הצינור. מערבבים תאים על ידי היפוך עדין של הצינור 5 פעמים.
- צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 300 x גרם. שים לב כי מדובר בצנטריפוגה עדינה בהרבה מהצנטריפוגה הראשונית.
- דמיין את גלולה על ידי צפייה בצינור על רקע כהה / שחור. הסירו את ה-supernatant על ידי שאיפת ואקום או עם פיפטה (איור 3A). השלך את supernatant משאיר נפח של כ 500 μL מעל גלולה PBMC בצבע לבנבן.
איור 3: כדורי PBMC. (A)גלולה השיגה בשלב הכביסה הראשון 3.3. (B)גלולה מבודדת בכביסה השנייה (שלב 3.7). (ג)גלולה עם רמה גבוהה של המוליזה המתקבלת מדם מעובד מאוחר יותר מ 4 שעות מן הדם לצייר מבודד בכביסה השנייה (שלב 3.6). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- Resuspend גלולת התא על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה ב supernatant שיורית.
- הוסף PBS 1x נוסף כדי להביא את עוצמת הקול ל 10 מ"ל. תכסה את הצינור. מערבבים את התאים על ידי היפוך הצינור בעדינות 5x. אם ספירת תאים נדרשת בפרוטוקול המחקר עבור לשלב 3.5.1, אם אין צורך לעבור ישירות לשלב 3.6.
- קח 40 μL aliquot של התאים המושעים מחדש ומערבבים עם 40 μL של כחול trypan. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
- צנטריפוגה ההשעיה משלב 3.5 במשך 10 דקות ב 300 x g. הסר כמו על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה התא.
- בזהירות להסיר ולהשליך כל supernatant שנותר מעל גלולת התא על ידי pipetting באמצעות פיפטה פסטר קצה עדין או micropipette מבלי להפריע גלולה התא. השאירו מעט נוזל מעל גלולה לאחר השלמת שלב זה. אם נקודת הקצה של פרוטוקול זה היא גלולה PBMC לעבור לשלב 3.8; אם נקודת הקצה היא מחשבי PCBM שמורים, עבור לשלב 3.10.
- הוסף 50 μL של PBS חדש (או PBS בתוספת מוכן בשלב 1.5 אם רלוונטי לנקודת הקצה שלך) לכדור פיפטה למעלה ולמטה בעדינות באמצעות micropipette כדי resuspend הומוגנית כל התאים. מעבירים את כל המתלה התא ל- cryovial שכותרתו 1.5 מ"ל ומניחים מיד על קרח רטוב עד להקפאת הדגימות.
- להקפיא את הדגימות שכותרתו על ידי הצבת אותם חנקן נוזלי או ישירות בקרח יבש. ניתן גם להקפיא תאים במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות קופסאות הקפאת תאים. במקרה זה, prechill תיבות לחלוטין ב -80 מעלות צלזיוס לפני הוספת צינורות התא. תעד את הזמן שבו כדורי תא הוקפאו. לאחר התאים להקפיא, לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, הספינה קפואה על קרח יבש.
- באופן אופציונלי, כדי cryopreserve PBMCs להשעות מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של תערובת ההקפאה (שלב 1.6) ולהעביר cryovial שכותרתו. המשך כמתואר בשלב 3.9, אבל, במקרה זה, זה מקובל רק להשתמש תיבות הקפאת תאים כדי להקפיא את הדגימות. מעבירים לחנקן נוזלי למשלוח ואחסון לאחר היותם בקופסת ההקפאה למשך 24 שעות לפחות.
4. שלבי הכנת פלזמה (איור 1A)
- בעקבות -80 °C אחסון של כדורי PBMC, עכשיו להכין את aliquot פלזמה שאוחסן באופן זמני על קרח רטוב בשלב 2.6. בצע את שלבי הצנטריפוגה הבאים כדי להבהיר את הפלזמה אם מטרת המדגם היא ניתוח ctDNA, אחרת לעבור ישירות לשלב 4.2.
- צנטריפוגה הפלזמה במשך 10 דקות ב 1,600 - 2,000 x גרם ב 4 - 8 מעלות צלזיוס ברוטור בזווית קבועה (או 15 דקות ברוטור מתנדנד).
- בזהירות פיפטה את supernatant פלזמה, נזהר לא להפריע כל גלולה ולהעביר צינור חדש 15 מ"ל. השלך את הצינור המכיל את החומר כדורי.
- צנטריפוגה הפלזמה במשך 10 דקות ב 1,600 - 2,000 x גרם ב 4 - 8 מעלות צלזיוס ברוטור בזווית קבועה (או 15 דקות ברוטור מתנדנד).
- בזהירות להעביר את הפלזמה supernatant לצינור חדש 15 מ"ל, להיות בטוח לא להפריע כל חומר כדורי. השלך את הצינור המכיל את החומר כדורי.
הערה: אם צנטריפוגה בקירור אינה זמינה, יש לשמור את התאים על הקרח למשך 5 דקות בין כל סיבוב, או דגימות צנטריפוגה בחדר קר.
- העברת פלזמה ב 1 aliquots מ"ל לתוך 5 טרי 2 microtubes מ"ל. השתמש פחות מ 5 בקבוקונים אם אין מספיק פלזמה כדי למלא 5 בקבוקונים עם 1 aliquots מ"ל וצפוי כי הבקבוקון האחרון יכיל פחות מ 1 פלזמה מ"ל. אם יש יותר מ 5 פלזמה מ"ל, להשליך את השארית. רשום את הנפח הכולל של פלזמה בכל צינור.
- להקפיא מיד את aliquots פלזמה זקוף, על ידי אחסון אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
5. משלוח לדוגמה
- שלח כדורי PBMC ודגימות פלזמה על קרח יבש.
- ודא שהדגימה אינה מופשרת לפני המשלוח ובמהלכו. לארוז מספיק קרח יבש עם הדגימות כדי להבטיח שהם נשארים קפואים למשך כל תהליך המשלוח, בהתחשב בעיכובים אפשריים שעלולים להתרחש במעבר.
6. הקרנת דם שלמה וניתוח כתמים מערביים של סמנים ביולוגיים של DDR (איור 4A)
הערה: זהו טיפול אקס ויו שלא יידרש ברוב המקרים במרפאה, אך ניסויים אלה הם אסטרטגיית גישוש בעלת ערך למציאת סמנים ביולוגיים קליניים מתאימים. דגימות דם יש לטפל בהקדם האפשרי בעת איסוף כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.
- תחמם את ארון הרנטגן. תווית שלוש צינורות 15 מ"ל כמו 0, 0.2 ו 7 Gy, בהתאמה.
- קח שלושה צינורות הכנת תאים מונונוקולריים המכילים דם שנמשך טרי מאדם אחד ולאחר היפוך עדין של הצינורות 8 עד 10 פעמים להעביר את הדם לשלושת צינורות 15 מ"ל.
- מניחים את הצינור 0.2 Gy בארון הרנטגן, לסגור את הדלת ולהחיל 0.2 מנה Gy על הצינור על ידי בחירת מספר המדף ואת המינון. החל 7 מינון קרינה Gy על הצינור 7 Gy על ידי התאמת המינון שנבחר בארון.
- דגירה שלושת הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
- העבר את הדם בחזרה לצינורות ההכנה לתאים מונונוקולריים ובצע את פרוטוקול ההכנה של PBMC באשר להגדרה קלינית משלב 2.4 לשלב 3.8.
- הוסף נפח של מאגר תמוגה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז שווה נפח גלולה התא (במקרה זה 70 μL של מאגר RIPA) לכל כדורי התא, פיפטה למעלה ולמטה דגירה על קרח במשך 10 דקות. Sonicate את הדגימות אם sonicator זמין (3 מחזורים, 30 s ON / 30 s OFF, 4 מעלות צלזיוס), לחילופין מזרק את הדגימות כדי לשבור את חומצות הגרעין כדי למנוע צמיגות במדגם.
- צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב ≥ 15,000 x g, ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים כל סופרנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל, מעריכים באופן איכותי את רמת ההמוליזה (בדיקה ויזואלית) ומודדים את ריכוז החלבון לפי כל שיטה מועדפת.
- מערבבים 40 מיקרוגרם של lysate הכולל עם מאגר טעינה מדגם המכיל SDS וסוכן הפחתת מדגם. מרתיחים דגימות במשך 5 דקות בגוש חום.
- טען 20 מיקרוגרם מכל דגימה לנתיב בכפילות בג'ל חלבון ביס-טריס 4-12% והפעל SDS-PAGE.
- לאחר ההפרדה, להעביר את החלבונים קרום nitrocellulose באמצעות מערכת זמינה מסחרית (20 V, 10 דקות) ולחסום עם 5 % חלב TBST.
- חותכים את הממברנה בגדלים המולקולריים הרלוונטיים ואת הדגירה עם הנוגדנים העיקריים לילה ב 4 מעלות צלזיוס (ראה טבלה של חומרים לנוגדנים ודילול).
- הסר את הנוגדנים העיקריים ולשטוף את הממברנות 3 פעמים עם TBST במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים HRP במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 פעמים עם TBST במשך 5 דקות.
- החל את מגיב ECL ולנתח את התמונות שהושגו יחסית לאות HRP.
Representative Results
כדי לשפר את איכות ההכנות PBMC בניסויים הקליניים שלנו, יצרנו פרוטוקול עם צעדים תמציתיים וברורים שניתן לעקוב אחריהם על ידי אנשי מעבדה בבית החולים, ללא תלות ברקע הביולוגיה המולקולרית שלהם וכישורי מעבדה. התאמנו את פרוטוקול היצרן המשלב שינויים בשלבים שבהם בעיות ביצוע זוהו או דווחו מאתרים קליניים המעורבים בניסויים קליניים מרובי מרכזים שונים. עם זאת, ניתן למטב את הפרוטוקול עוד יותר כדי לעמוד בדרישות ספציפיות, כגון אילוצי זמן באתר הקליני או סוג של ניתוחים במורד הזרם (ראה קובץ משלים). אנו מראים כי DDR ניתן לנתח PBMCs על ידי התבוננות סמנים ביולוגיים ספציפיים על נזק DNA שנוצר על ידי קרינה.
השאילתות הנפוצות ביותר שקיבלנו מאתרים קליניים מתייחסות לשלבי הצנטריפוגה, אשר משפיעים ישירות על היכולת לבודד בהצלחה מחשבים אישיים ולהשיג את גלולת PBMC הסופית. שימוש בסוג המתאים של צנטריפוגת רוטור ראש מתנדנדת (איור 1B,C)הוא המפתח להצלחת הפרוטוקול. עם זאת, כאשר רק צנטריפוגה רוטור בזווית קבועה זמין באתר הקליני, אנו ממליצים לבצע שלב 2.4 ברוטור בזווית קבועה באותו RCF כמו רוטור ראש מתנדנד אבל רק 10 דקות. פעולה זו מבטיחה ששכבת PBMC מופרדת מהפלזמה (ראו איור 2B,C). בעוד שכבת דם על מדיום הפרדה הדרגתית צפיפות דורש צנטריפוגה בלם, דם בצינורות הכנת תא מונונוקלר יכול להיות צנטריפוגה עם בלמים על בשל נוכחות של מחסום ג'ל בצינור המבטיח שימור של שכבת PBMC מופרד מרכיבי הדם צפופים27,28.
לפחות 4 מ"ל של איכות גבוהה, פלזמה לא מדוללת התקבלו צנטריפוגה של דם בפורמט צינור 8 מ"ל, אשר ניתן להבהיר עוד יותר לשימוש שלה בניתוחים מיוחדים כגון רצף ctDNA או מחקרים metabolomics29,30 (צעדים אופציונליים 4.1.1-4.1.4). כמות המחשבים המבודדים, גודל הכדורים והמוליזה או זיהום תאי הדם האדומים היו חששות אחרים שהגיעו מאתרים קליניים וניסיון בניתוח דגימות. מספר התאים שהתקבלו מדם של 8 מ"ל היה משתנה בהתאם למטופל ולהגדרת המחלה, אך באופן כללי גלולת הכדור המתקבלת קטנה בגודלה, ובצבע שקוף/לבן (איור 3A,B). בשל מאפיינים אלה, חשוב לדמיין את גלולה על רקע כהה, כדי למנוע את שאיפתה בשוגג במהלך שלבי לשטוף (2.5 ו 3.3). לפעמים כדורי יכול להיות קצת צבע אדום עקב זיהום תאי הדם האדומים (איור 3C), ויש לזה השפעה שלילית על איכות ההכנה. כדי למנוע אובדן כדורים קטנים כגון אלה המוצגים באיור 3, העברת גלולת PBMC ל cryovial הוא הקל על ידי שלב 3.7 שבו גלולה PBMC הוא respended ב 50 μL של PBS.
התשואה האופיינית בעת שימוש בצינורות אלה ודם מאנשים בריאים נע בין 7 ל 21 x 106 תאים עבור 8 מ"ל, והתאוששות תאים בין 70 ל 80% כפי שהוא הניסיון שלנו וכפי שהוא הוכח בעבר27,28. זה תלוי הן בספירת התאים הבודדים והן באופרטור והוא דומה למספרי התאים וערכי שחזור התאים המתקבלים בשיטות אחרות באמצעות שיפוע צפיפות (כולל מערכות המשתמשות בצינורות עם מחסום הפרדה)15,27,28. דוגמה הממחישה את השונות במספר המחשבים המבודדים בשיטה זו בהתאם להגדרת המחלה היא ניתוח סמני PBMC בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). מספר התאים התאושש מצינור הכנת תאים מונונוקולרי 8 מ"ל בעת החלת פרוטוקול זה השתנה מ 1.62 x 104 ל 1.99 x 109 ב 45 דגימות שהתקבלו 7 חולים במחקר NCT0332827331 (טבלה 1). פרמטר קשור הוא ריכוז החלבון של lysates PBMC המתקבל על ידי שיטה זו, וזה תלוי במספר התאים מבודדים ואת היעילות של מיצוי החלבון. כדורי התא lysed בסעיף 6 נוצרו עם מאגר RIPA sonication (שלב 6.6). ההשעיה מחדש של כדורי התא באותו נפח של מאגר תמוגה בדרך כלל תוצאות בטווח של ריכוזים מ 3 עד 10 מ"ג / מ"ל, ובדוגמה זו במיוחד ריכוזי lysate היו 6.8, 8.3 ו 8.6 מ"ג / מ"ל עבור 0, 0.2 ו 7 Gy, בהתאמה. עם זאת, זה נתון שונות גבוהה בעת קבלת דגימות מאתרים קליניים שלא הוכנו בצורה אופטימלית, מחלת החולה, ואת נוכחותו של המוגלובין מזיהום תאי דם אדומים. לדוגמה, כדורי קטן מאוד צריך להיות בשימוש חוזר בנפח של מאגר תמוגה גדול יותר מאשר נפח גלולה התא כדי לאפשר הן מדידת ריכוז חלבון ניתוח סמן ביולוגי במורד הזרם, וכתוצאה מכך דגימות מדוללות יותר. במקרה כזה, אם ריכוז מדגם הוא מתחת 1 מ"ג / מ"ל זה יכול להוות אתגר לבצע מבחנים כמו כתם מערבי בשל גורם דילול גבוה זה. לעומת זאת, בדגימות CLL שהוזכרו קודם לכן, נפח מאגר התמוגה שנוסף לשימוש חוזר כדורי התא נע בין 50 ל 500 μL, וריכוז החלבון משתרע מ 1.62 עד 19.77 מ"ג / מ"ל (טבלה 1).
כאשר דגימות מציגות זיהום או המוליזה של תאי דם אדומים (איור 3C), ריכוז החלבון של ליסט PBMC הופך להערכת יתר עקב הכללת המוגלובין מהאריתרוציטים. זו הסיבה מדוע יש לבצע בדיקה חזותית וביאור של דגימות כאלה, כמתואר בשלב 6.7 של הפרוטוקול. דגימת טעינה עודפת יכולה לפצות על נוכחות המוגלובין בעת ביצוע ניתוח סמנים ביולוגיים ככל בקרת טעינה כלולה בבחינה. שיטות כמותיות אחרות למדידת המוליטיזה יכולות להיות מיושמות, כגון מדידת ספיגה ב 414 ננומטר32.
DDR נותח PBMCs שהושגו בעקבות פרוטוקול קליני זה. כדי להמחיש מצב המחקה טיפולים קליניים מזיקים DNA כגון הקרנות או כימותרפיה, דם שלם של מתנדבים בריאים היה ex vivo נתון קרינת רנטגן (איור 4A). קרינה מייננת (IR) כגון צילומי רנטגן גורמת לסוגים שונים של נזק לדנ"א, כולל שברי גדילים כפולים (DSB) של DNA. חישת נזקי DNA של נגעים אלה מפעילה PIKKs כגון אטקסיה-telangiectasia מוטציה (כספומט), כספומט Rad3 הקשורים (ATR) ו קינאז חלבון תלוי DNA (DNA-PK), אשר עוסקים מנגנוני תיקון DNA כמו רקומבינציה הומולוגית (HR) או הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ). הפעלת כספומט על ידי נוכחות של DSBs מתרחשת על ידי גיוסו לאתרים של נזק על ידי MRN (MRE11-RAD50-NBS1) קומפלקס, גרימת תדלוק אוטומטי כספומט בכמה שאריות כולל Ser1981. בתורו, מופעל כספומט phosphorylates את הרכיבים של קומפלקס MRN וחלבונים אחרים כגון גרסה היסטון H2AX על Ser139 (שם pSer139-H2AX ידוע גם בשם γH2AX) כדי לקדם שינוי מבני הכרומטין פורש מן DSB המאפשר גיוס של גורמי DDR אחרים33. מחשבים מגיבים לקרינה מייננת למרות קצב התפשטות נמוך שלהם ושיטות ספקטרומטריית מסה אפשרו כימות של upregulation של phosphorylated Ser635 על RAD50 על ידי כספומט. זרחון זה מצטמצם בנוכחות מעכבי כספומט ו RAD50 pS635 קיבל תוקף נוסף כסמן ביולוגי פרמקודינמי לטיפולים מעכבי כספומט קליניים בגידולים על ידי אימונוהיסטוכימיה8. כדי להעריך את התגובה של מחשבים אישיים לקרינה, דם של מתנדבים בריאים היה נתון במינונים שונים IR ודגימות נאספו לאחר דגירה 1 שעות ב 37 °C(איור 4A). לשם כך, הדם הועבר לצינורות פלסטיק כדי למנוע הפחתת התשואה של בידוד PBMC עקב טמפרטורה גבוהה (שלב 6.2). ניתחנו כיצד כספומט הופעל לא רק על ידי התבוננות RAD50 pS635 שדווח בעבר, אלא גם כספומט pS1981 ו γH2AX. בשלושת המקרים שנבדקו נצפתה עלייה בשינויים שלאחר התרגום במינונים גבוהים יותר של IR (איור 4B). מעניין, זרחון של כספומט RAD50 היה משמעותי במינון הנמוך של 0.2 Gy, אשר מציע אלה שינויים שלאחר תרגום עשוי להיחקר באופן ריאלי כמו סמנים ביולוגיים PD לטיפולים מעורבים הדור של DSBs DNA עם טווח דינמי טוב, לא רק בדגימות גידול אלא בדם היקפי. זה מאפשר ניטור של תגובת PD לטיפול על ידי רכישת דגימות אורך במהלך הטיפול. העיתוי של משיכת הדם לעיבוד הדגימות הוא קריטי כדי להבטיח מפלים איתות אלה עדיין פעילים כמו עיכובים בעיבוד ישפיעו על הקינטיקה של מפלים כאלה ואפשר לפספס את אירועי זרחן המשמשים phosphomarkers.
איור 4: מחשבים מבודדים מדם מוקרן ex vivo בעקבות הפרוטוקול הקליני הנוכחי להציג סמנים ביולוגיים כדי ליידע על היקף הנזק DNA שנגרם על ידי הטיפול. (A)סקירה סכמטית של הפרוטוקול להכנת מחשבים אישיים וניתוח של DDR על הקרנת דם שלם. *2 שלבי צנטריפוגה נוספים נדרשים לניתוח CTDNA/מטבולומיקה. (B)כתם מערבי המציג upregulation תלוי מינון של סמנים ביולוגיים DDR phospho ב- PBMCs.
| לדוגמה | מספר מחשבים אישיים / 8 מ"ל דם | נפח מאגר RIPA בתוספת (μL) | ריכוז סופי (מ"ג/מ"ל) |
| א.1 | 39100000 | 70 | 12.16 |
| א.2 | 97400000 | 100 | 4.54 |
| א.3 | 233000000 | 150 | 7.63 |
| א.4 | 316000000 | 150 | 16.87 |
| א.5 | 387000000 | 150 | 12.60 |
| א.ו. 6 | 459000000 | 150 | 12.71 |
| א.7 | 414000000 | 200 | 15.67 |
| א.8 | 253000000 | 150 | 14.56 |
| א.9 | 509000000 | 300 | 10.67 |
| B.1 | 15200000 | 70 | 2.96 |
| B.2 | 10500000 | 50 | 4.59 |
| B.3 | 13200000 | 50 | 3.99 |
| B.4 | 34800000 | 100 | 10.41 |
| B.5 | 1620000 | 70 | 7.11 |
| B.6 | 70200000 | 100 | 9.26 |
| B.7 | 65400000 | 100 | 12.10 |
| B.8 | 91100000 | 150 | 11.82 |
| סי.1 | 6330000 | 70 | 4.04 |
| C.2 | 4400000 | 150 | 19.77 |
| C.3 | 68000000 | 100 | 8.96 |
| סי.4 | 35100000 | 50 | 9.30 |
| סי.5 | 35400000 | 70 | 10.55 |
| סי.6 | 99200000 | 100 | 16.19 |
| ד.1 | 402000000 | 70 | 7.23 |
| ד.2 | 826000000 | 300 | 16.95 |
| ד.3 | 1990000000 | 300 | 14.87 |
| ד.4 | 1000000000 | 300 | 18.34 |
| ד.5 | 1160000000 | 400 | 16.13 |
| ד.6 | 806000000 | 400 | 19.40 |
| אי.1 | 302000000 | 300 | 13.86 |
| אי.2 | 990000000 | 500 | 19.04 |
| E.3 | 1200000000 | 400 | 17.13 |
| F.1 | 4010000 | 50 | 1.62 |
| פ.2 | 5170000 | 50 | 2.84 |
| F.3 | 2810000 | 50 | 3.69 |
| F.4 | 3700000 | 75 | 3.62 |
| F.5 | 3460000 | 70 | 4.03 |
| F.6 | 7060000 | 50 | 3.32 |
| ג.1 | 60700000 | 70 | 6.57 |
| ג.2 | 82100000 | 150 | 7.78 |
| ג.3 | 30500000 | 70 | 8.28 |
| ג.4 | 134000000 | 100 | 15.14 |
| ג.5 | 91900000 | 100 | 8.61 |
| ג.ו. 6 | 372000000 | 150 | 15.88 |
| ג.7 | 574000000 | 200 | 15.01 |
| דגימות PBMC אורך המתאים 7 חולים | |||
טבלה 1: מספר תא וריכוז חלבון של כדורי PBMC מחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). הנתונים המוצגים בטבלה זו תואמים 45 דגימות PBMC מ 7 חולי CLL המשתתפים במחקר NCT03328273 שנאספו צינורות הכנת תא מונונוקולרי. אלה הם נתונים מקוריים שנוצרו באמצעות דגימות מהמחקר המצוטט31.
קובץ משלים: אפשרויות פרוטוקול חלופיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
תכשירים באיכות גבוהה של מחשבים אישיים ופלזמה שניתן להכין בצורה איתנה ושחזורית באתרי ניסויים קליניים הם לא יסולא בפז כדי ליידע את הניסוי הקליני היקפי חיזוי פרמקודינמי סמן ביולוגי נקודות קצה. כאן סיפקנו פרוטוקול קצר וברור המטפל בצעדים הבעייתיים בדרך כלל שהיו עד כה פגיעים לשגיאות ביצוע במסגרת ניסוי קליני. עם זאת, ניתן למטב את הפרוטוקול עוד יותר כדי לעמוד בדרישות ספציפיות, כגון אילוצי זמן באתר הקליני או סוג של ניתוחים במורד הזרם (ראה קובץ משלים).
למטרה זו, הראינו כיצד לבודד הן PBMCs ופלזמה מדם שלם באמצעות צינורות הכנת תאים mononuclear לייצר כדורי PBMC קפואים פלזמה קפואה מתאים למגוון של ניתוחים במורד הזרם. הפנינו את תשומת הלב לצעדי פרוטוקול קריטיים במיוחד הכוללים צנטריפוגה וזיהוי של שכבת PBMC בשלב 2.5, וכדורי PBMC בשלבים 3.3 ו- 3.6. מבחינה היסטורית, כאשר אתרים קליניים לעתים קרובות השתבשו הוא בהגדרת הצנטריפוגה ליחידות הנכונות (מבלבל ערך RCF או x g עם ערך סל"ד), עיכוב העיבוד של דגימות דם, טמפרטורה ונוכחות של כמויות גדולות של PBS מעל גלולת התא הקפוא. ברוב רוטורים צנטריפוגה בטעות הזנת ערך x g כהגדרת סל"ד יגרום משמעותית תחת צנטריפוגה עם שכבת PBMC מוגדרת או נעדרת וכתוצאה מכך, ופוטנציאל השמטת PBMC בשוגג במהלך שלבי שטיפה עקב גלולות תאים לא יעילים. עם זאת, קיימת אפשרות כי שכבת PBMC אינה גלויה למרות השימוש בהגדרות הצנטריפוגה הנכונות ומתאם רוטור אם המטופל פיתח לויקופניה. מצב זה יכול להשפיע על חולים שנרשמו לניסויים אונקולוגיים בגלל כימותרפיה או הקרנות ויש לקחת בחשבון. נקודה קריטית נוספת שהובהרה בפרוטוקול היא כי דגימות חייבות להיות מעובדות בתוך 1-2 שעות מן תיקו הדם כדי להקטין את האפשרות של המוליטיזה להשפיע לרעה על הפרוטוקול. יתר על כן, השאיפה לעבד את הדגימות בשעה הראשונה של בדיקת הדם מפחיתה את השונות ex vivo, אשר יכולה להיות השפעה רבה על קריאות פרמקוקינטיקה ועל סמנים ביולוגיים המושפעים משימור דם או מסלולי איתות פעילים, כגון המקרה המוצג באיור 4. עיכובים בעיבוד מדגם יכול להיות גם השפעה מזיקה בכדאיות התא אם התאים הולכים להיות cryopreserved34. גורם נוסף שיכול להשפיע הן על התשואה והן על זיהום תאי הדם האדומים הוא טמפרטורת האחסון והצנטריפוגה, אשר יש לשמור בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס). טמפרטורות נמוכות יותר להגדיל את הצפיפות של מדיום שיפוע צפיפות, וכתוצאה מכך רמה גבוהה יותר של תא דם אדום זיהום גרנולוציטים כמו תאים אלה אינם צוברים גם כן. מצד שני, טמפרטורות גבוהות יותר להוביל PBMCs לכודים בין אריתרוציטים מצטברים, ומכאן להפחית את התשואה של ההכנה15,27,28. ולבסוף, זה חיוני כי לא יותר מ 50-100 μL של נוזל נמצאים עם גלולה התא cryovial, כמו זה משפיע לרעה על הריכוז של כל ליזלת חלבון המתקבל בעיבוד במורד הזרם של ההכנות האלה PBMC. עודף של נוזל יהיה overdilute דגימות, המוביל lysates עם ריכוז חלבון נמוך מאוד לא מתאים לניתוח סמנים ביולוגיים. בנוסף, שימור כל שינוי לאחר התרגום ייפגע, וגם יעילות התמוגה תצומצם מאוד.
צינורות הכנת תאים Mononuclear נבחרו כפי שהם מציעים את הדרך הפשוטה ביותר לבודד הן PBMCs ופלזמה בתיקו דם אחד לניסויים קליניים עם, מניסיוננו, רבייה מעולה. עיבוד הדם אינו דורש מפעילים מיומנים מאוד, והשימוש בצינור יחיד מסיר את הצורך בדילול הדם והעברתו לצינור אחר, ומפחית את הסיכון לסכנה; מקצר את הפרוטוקול עקב ביצוע שלבי הצנטריפוגה עם בלמים מופעלים; וכל ריאגנטים נמצאים בצינור, אשר מפחית את השונות. מניסיוננו, יתרונות אלה עולים על העלות הגבוהה יותר של צינורות אלה בהשוואה לשיטות קלאסיות אחרות המרכיבות רק את השימוש באמצעי הפרדת שיפוע צפיפות27,28 (£ 410 לכל 60 יחידות בעוד לימפופראפ בינוני עבור 66 50-mL ההכנות הוא £ 215). הם זמינים בשני סוגים של נוגדי קרישה, הפרין וציטראט, שניהם דומים בשמירה על פונקציונליות של PBMCsמבודדים 35, ולכן, הבחירה של נוגד קרישה אחד על פני השני יהיה מבוסס על השפעה אפשרית של הפרין או ציטראט במחקרים סמן ביולוגי במורד הזרם. אמנם הוכח כי צינורות EDTA לספק את התשואה הגבוהה ביותר בידוד PBMC לעומת הפרין או ציטראט13, היתרון של קלות השימוש של צינור אחד בלבד מניפולציה מאוזן שיקול זה. אם ציטוקינים הולכים להיות מנותחים נוגדי קרישה יכול להיות השפעה של רמות זוהה בפלזמה, ולכן שני נוגדי קרישה צריך להיבדק לפני בחירת אחד לניסוי הקליני36. אם הפלזמה הולכת לשמש למחקרים metabolomics, באמצעות הפרין כמו נוגד קרישה יהיה מועדף37. לכן, הנקודה היחידה שנותרה למשתמש הקצה או מדען תרגום ניסוי קליני היא אם ציטראט או הפרין יהיה מתאים יותר למטרות שלהם לאחר עלויות הוערכו.
בעוד היתרונות של שימוש בצינורות הכנת תאים הם רבים בהשוואה למגבלות שהם מציבים (עלות גבוהה יותר וזמינות של מגוון מוגבל של נוגדי קרישה), המגבלה העיקרית של השימוש ב- PBMCs או פלזמה כדי להשיג סמנים ביולוגיים PD בניסויים קליניים, במיוחד באונקולוגיה, יכול להיות קשור לשיטת הבידוד. למעט סרטן המטולוגי, שבו הגידול נדגם ישירות מדם היקפי, עבור אינדיקציות סרטן אחרות פלזמה ומחשבים אישיים הם רקמות פונדקאיות אשר לא בהכרח לחקות את הגידול העיקרי. רקמה היקפית לא יכול לחלוק את הגנום ואת האפיגנום עם הגידול העיקרי, ולכן, הניתוח ההיקפי של סמנים ביולוגיים התלויים מוטציה גידול ספציפי מוגבל בעיקר ניתוח ctDNA (מפלזמה) או CTCs (על ידי מיון הבא של שכבת PBMC). בנוסף, איתות מפלים נהיגה או תרומה התפשטות הגידול לא יכול להיות פעיל כמו בדם היקפי. אתגר זה ניתן להתגבר על ידי החלת גישות גילוי סמנים ביולוגיים מיקודדם 8 כדי לזהות סמנים ביולוגיים חלופיים או צימוד ex vivo טיפולים לבידוד שלפלזמה 38 ו PBMC הכנות26.
בפרוטוקול הנוכחי כדורי PBMC קפואים ניתן לעבד בקלות את האתר הקליני לתת ליזדיטים חלבון אשר ניתן להעריך על ידי סופג המערבי או טכניקות ELISA. שיטות חלופיות לשימוש במחשבי PCMCs כדי להפוך שיטות IHC לזמינות הוצגו גם הן (קובץ משלים). בנוסף, פירטנו גם את האפשרות של cryopreserving PBMCs (ראה קובץ משלים)לניטור תאים חיסוניים, יישום רלוונטי באונקולוגיה, עם מעכבי נקודת ביקורת חיסונית ו- ADCs נבדק יותר ויותר בניסויים קליניים. ההערכה של פונקציות החיסון כגון ADCC16 ו immunophenotyping הם יישומים התואמים PBMCs cryopreserved מבודד מצינורות הכנת תאים מונונוקולריים15. יש אזהרה על cryopreservation, כפי שהוא יכול לקדם את הרגולציה כלפי מטה של משטח מסוימים סמנים פנימיים ועלול לפגוע בתפקודי תא מסוימים, אולם PBMC cryopreservation היא הדרך האפשרית היחידה לבצע מבחנים אלה בשל אילוצי זמן בעת טיפול דגימות מאתריםקליניים מרובים לעיבוד במעבדות חיצוניות14,15, ואת ההשפעות המזיקות האלה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שיטות הפשרה טובה
לסיכום, הפרוטוקול הניתן כאן יאפשר הכנה מהימנה של מחשבים אישיים ודגימות פלזמה בכל מוסד קליני עם ציוד וחומרים משותפים, כך שנקודות קצה תרגומיות מדם היקפי יוכלו להיות מופעלות באופן חזק בניסויים קליניים גלובליים.
לבסוף, אנו מדגימים כיצד הניתוח של ליסטים PBMC יכול ליידע באופן מכני את התגובה לסוכנים מזיקים לדנ"א על ידי הצגת שינוי פוסט-תרגום תלוי מינון של גורמי DDR מרכזיים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעזור לעצב את ההתפתחות הקלינית. צופה פני לעתיד, יישום של שיטות כי הם כמותיים יותר מאשר כתמים מערביים (למשל, ספקטרומטריית מסה40) ודורשים פחות חומר קלט (כגון נימי המערבי סופג ELISA) יעזור להעביר את התוצאות הפרה-קוליניות האלה לקראת חזק יותר, הערכה שיטתית יותר של דגימות חולה PBMC.
Disclosures
כל המחברים הם או היו עובדים ובעלי מניות של AstraZeneca. VM היא עובדת בחברת אקרטה פארמה, המחזיקה במניות אסטרה-זנקה וגילעד מדעים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל חברי הרפואה התרגום ב AstraZeneca מחקר אונקולוגי ופיתוח מוקדם על המשוב שלהם על הפרוטוקול, במיוחד הדלי קאר, תמי יה ונתן Standifer עבור ייעוץ על הכנת פלזמה לניתוח ctDNA, על בידוד PBMC, ו PBMC cryopreservation ו immunophenotyping, בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
References
- Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
- Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254 (2016).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
- Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
- Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
- O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
- Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
- Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
- Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
- Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
- Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182 (2015).
- Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
- Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545 (2017).
- Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
- Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
- Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
- Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
- Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
- Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
- Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
- Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
- Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
- ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
- Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
- Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
- Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
- Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
- Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
- Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
- Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).
