यह प्रोटोकॉल नैदानिक परीक्षण स्थल पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएमसी और प्लाज्मा बायोसैंपलों की नैदानिक रूप से कार्यान्वयन योग्य तैयारी का विवरण देता है जिसका उपयोग ट्रांसलेशनल बायोमार्कर विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
परिधीय रक्त में बायोमार्कर का विश्लेषण नैदानिक परीक्षणों में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है ताकि उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए तंत्र का प्रमाण स्थापित किया जा सके, और चिकित्सा विज्ञान की खुराक और अनुसूची सेटिंग में मदद मिल सके। एक रक्त ड्रा से, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और प्रोटीन मार्कर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, और प्लाज्मा नमूनों का उपयोग ट्यूमर डीएनए, साइटोकिन्स और प्लाज्मा मेटाबोलोमिक्स परिसंचारी के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उपचार से देशांतर नमूने किसी दिए गए प्रोटीन मार्कर के विकास, उत्परिवर्तनीय स्थिति और रोगी के प्रतिरक्षा परिदृश्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। यह तभी प्राप्त किया जा सकता है जब परिधीय रक्त का प्रसंस्करण नैदानिक साइटों में प्रभावी ढंग से किया जाता है और नमूनों को बिस्तर से बेंच तक ठीक से संरक्षित किया जाता है। यहां, हम एक अनुकूलित सामान्य उद्देश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे बहु-केंद्र नैदानिक परीक्षणों में पीबीएमसी छर्रों और प्लाज्मा नमूनों को प्राप्त करने के लिए नैदानिक साइटों पर लागू किया जा सकता है, जो अस्पताल प्रयोगशालाओं में नैदानिक पेशेवरों को तकनीकी विशेषज्ञता के अपने स्तर की परवाह किए बिना उच्च गुणवत्ता वाले नमूने सफलतापूर्वक प्रदान करने में सक्षम बनाएगा। वैकल्पिक प्रोटोकॉल विविधताएं भी प्रस्तुत की जाती हैं जो अधिक विशिष्ट डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए अनुकूलित होती हैं। हम एक्स-रे विकिरणित रक्त पर डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) के खिलाफ प्रोटीन बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करते हैं ताकि ऑन्कोलॉजी सेटिंग्स में दृष्टिकोण की उपयुक्तता को प्रदर्शित किया जा सके जहां डीडीआर दवाओं और/या रेडियोथेरेपी का अभ्यास किया गया है और साथ ही प्रीक्लिनिकल चरणों में जहां मशीनी परिकल्पना परीक्षण की आवश्यकता है ।
दवा विकास का उद्देश्य अपूरित चिकित्सा जरूरतों और अधिक लक्षित, व्यक्तिगत चिकित्सा को संबोधित करते हुए नए चिकित्सीय प्रदान करना है । कई दवा तंत्र सक्रिय जांच के अधीन हैं, जिनमें किनेज़1,प्रोटीज2,या पॉली (एडीपी-रिबोज) पॉलीमरेज (एआरपी) अवरोधक3,प्रोटीन विक्टर्स4,चिकित्सीय एंटीबॉडी5,और एंटीबॉडी-कंजूस्ड दवाएं (एडीसी)6,कई अन्य लोगों के बीच शामिल हैं। ऑन्कोलॉजी में बेहतर उपचार प्राप्त करने के प्रयासों का एक उदाहरण कैंसर कोशिकाओं को1,7तक पहुंचाने वाले सिग्नलिंग कैस्केड को रोकने के लक्ष्य के साथ काइनेज अवरोधकों का उपयोग है । उन किनास के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट फॉस्फोरिलेशन के स्तर को मापना सबसे अच्छा फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर है जो इन अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र की मात्रा निर्धारित करता है8. अन्य दवाएं किसी दिए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकती हैं, और उस मामले में उपचार के दौरान देशांतर में अपने लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने के नाते सर्वोपरि है। इसलिए, दवा या विकृति की विशेषताओं से स्वतंत्र, दवा जोखिम और लक्ष्य मॉड्यूलेशन के बीच फार्माकोकाइनेटिक्स (पीके)/फार्माकोडायनामिक्स (पीडी) संबंध स्थापित करने के लिए बायोमार्कर का मूल्यांकन प्रारंभिक नैदानिक विकास में सबसे अच्छा अभ्यास है और एक सुरक्षित और सहन की गई औषधीय रूप से सक्रिय खुराक/अनुसूची9के निर्धारण में सक्षम बनाता है ।
जबकि ऑन्कोलॉजी नैदानिक विकास में, बायोप्सी में बायोमार्कर विश्लेषण दवा के तंत्र का प्रमाण स्थापित करने के लिए सबसे अच्छी सेटिंग हो सकती है, परीक्षण में उपलब्ध बायोप्सी की संख्या आमतौर पर10,11तक सीमित होती है। वैकल्पिक रूप से, परिधीय रक्त के नमूने नैदानिक परीक्षणों के लिए अत्यधिक मूल्यवान हैं क्योंकि उनमें न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया शामिल है, अनुदैर्ध्य विश्लेषण को सुविधाजनक रूप से प्राप्त करने में त्वरित और आसान हैं, बायोप्सी की तुलना में कम महंगे हैं और उपचार के परिणाम की वास्तविक समय निगरानी के लिए विशाल जानकारी प्रदान करते हैं। परिधीय रक्त में पीडी बायोमार्कर का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ बायोसैंपल का उपयोग करने की क्षमता है ताकि पीके/पीडी मात्रात्मक संबंधों और बाद में पीके/पीडी मॉडलिंग12,13का निर्धारण करने में सटीकता की अनुमति देने के लिए भी पीके की मात्रा निर्धारित की जा सके । पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को प्रोटीन मार्कर का अध्ययन करने के लिए अलग किया जा सकता है, जो या तो उनके अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन या उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में अनुभव करते हैं। इसके अलावा, पीबीएमसी का उपयोग इम्यूनोफेनोटाइपिंग उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है14,15,प्रतिरक्षा कार्यक्षमता के बारे में जैसे एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी)16 और आरएनए अलगाव के माध्यम से एपिजेनेटिक विश्लेषण का आकलन करना। इसी तरह, पूरे रक्त से प्लाज्मा का उपयोग एक रोगी की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए साइटोकिन्स को निर्धारित करने, मेटाबोलिक अध्ययन करने के लिए, और चिकित्सीय एजेंट से चयन के तहत रोग के क्लोनल विकास की निगरानी के लिए ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) को अलग और अनुक्रमित करने के लिए किया जा सकता है, अक्सर उपचार प्रतिरोध के लिए एक यंत्रवादी आधार प्रदान करता है17,18,19 चिकित्सीय20की बाद की पीढ़ियों के विकास को सक्षम करता है। अंत में, परिधीय रक्त से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) के अलगाव देशांतर गणना, डीएनए/आरएनए अनुक्रमण और प्रोटीन-बायोमार्कर विश्लेषण21द्वारा रोग प्रगति के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यद्यपि यह अलगाव22में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुकूल है , लेकिन कैंसर के कई प्रकारों और रोग के शुरुआती चरणों में सीटीसी की कम बहुतायत सीटीसी के क्षरण को कम करने के लिए विशेष ट्यूबों का उपयोग अधिक उपयुक्त बनाती है23.
हाल के वर्षों में, तरल बायोप्सी के उपयोग ने नैदानिक परीक्षणों में प्राप्त जानकारी में सुधार किया है और पीबीएमसी संग्रह को कई अध्ययनों में शामिल किया गया है ताकि कुछ प्रकार के हेमेटोलॉजिकल घातक के लिए ट्यूमर कोशिकाओं में सीधे लक्ष्य सगाई और तंत्र के प्रमाण की निगरानी की जा सके, या पीबीएमसी पर खुद को ट्यूमर कोशिकाओं के पीडी सरोगेट्स के रूप में24,25, 26। उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की तैयारी सकारात्मक प्रभावों को किसी दिए गए विकृति के लिए सबसे सुरक्षित और सबसे प्रभावोत्पादक उपचार का निर्धारण करती है लेकिन हमारे अनुभव में, विभिन्न नैदानिक साइटों से प्राप्त पीबीएमसी तैयारियों की गुणवत्ता गुणवत्ता में व्यापक परिवर्तनशीलता के अधीन रही है जिसके परिणामस्वरूप नमूने नीचे विश्लेषण के उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इससे उन अध्ययनों से एकत्र किए जा सकें पीडी डेटा की मात्रा प्रभावित हुई है ।
यहां हम विस्तार से प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एक आसान वर्णन करते हैं जो दिखाता है कि नैदानिक सेटिंग में एक ही रक्त ड्रा से पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों नमूनों को कुशलतापूर्वक अलग किया जाए। प्रोटोकॉल मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों पर आधारित है, जिसमें संशोधनों को शामिल किया गया है जहां वास्तविक दुनिया के अनुभव ने नैदानिक साइटों द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल निष्पादन में कठिनाइयों को उजागर किया है, जैसे कि अपकेंद्री मुद्दों, प्रसंस्करण में देरी और क्रायोविल्स को नमूना हस्तांतरण। पॉलीसैकराइड समाधानों के साथ या बिना किसी बाधा के उपयोग के घनत्व ढाल पृथक्करण के आधार पर मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के उपयोग के लिए वैकल्पिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीके हैं जो समाधान को रक्तसेअलग करते हैं । यदि प्रासंगिक नैदानिक साइट पहले से ही इन वैकल्पिक पद्धतियों में अच्छी तरह से अनुभवी है, तो इस प्रोटोकॉल को इन के साथ स्वीकार्य रूप से प्रतिस्थापित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, दो कारकों पर विचार किया जा सकता है: कुछ वैकल्पिक तरीकों को एक संग्रह ट्यूब से एक अलग तैयारी ट्यूब में पूरे रक्त के हस्तांतरण की आवश्यकता होती है जहां मानव प्राथमिक जैविक सामग्री का एक अतिरिक्त हस्तांतरण थोड़ा बढ़ा हुआ सुरक्षा जोखिम पेश कर सकता है, और पॉलीसैकराइड समाधान से रक्त को अलग करने वाली बाधाओं के बिना तरीकों की सफलता महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर करती है जैसे कि घनत्व ढाल माध्यम पर रक्त को लेयरिंग करना, जिसमें तकनीकी विशेषज्ञता के परिष्कृत स्तर के विकास की आवश्यकता होती है। उपरोक्त बिंदुओं के बावजूद, समग्र व्यवहार्यता और सेल रिकवरी इन तकनीकों15,28केबीच तुलनीय है। इसलिए, कार्यप्रणाली का विकल्प कुछ हद तक पूर्व तकनीकी अनुभव पर निर्भर है, लेकिन हमारे हाथों में, मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों का व्यापक नैदानिक संदर्भ में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है और हमारी, अन्यथा, सिफारिश है।
जबकि इस प्रोटोकॉल का एक अंत बिंदु lysates में आगे प्रसंस्करण के लिए पीएमसी छर्रों का उत्पादन करना है, पीबीएमसी संग्रह के अन्य अंतिम अनुप्रयोगों को लागू किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लिक एसिड का अलगाव, या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विधियों के लिए उपयुक्त पीबीएमसी स्मीयरों या पीबीएमसी ब्लॉकों का उत्पादन। महत्वपूर्ण बात यह है कि चूंकि रोगियों से लिया गया प्रत्येक बायोसैंपल कम से कम कुछ स्तर पर एक आक्रामक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल प्लाज्मा को अलग करके प्रत्येक नमूने से उपयोगी सामग्री को अधिकतम करता है जिसका उपयोग साइटोकिन विश्लेषण, मेटाबोलॉमिक अध्ययन या सीटीडीएनए अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है।
ऑन्कोलॉजी परीक्षणों में परिधीय बायोमार्कर का विश्लेषण पीबीएमसी के कई अनुप्रयोगों में से एक है। इसका एक उदाहरण कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी या डीडीआर में शामिल एंजाइमों के अवरोधकों जैसे फॉस्फेटिडिलिनोसिटॉल-3 किनेस से संबंधित किनेसिस (पीआईकेके)7 और PARPs3, 13जैसे उपचारों में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का मूल्यांकन है। इन उपचारों का उद्देश्य कोशिकाओं के प्रसार में डीएनए क्षति को बढ़ाना है, जो बिगड़ा डीडीआर तंत्र और कोशिका चक्र चौकियों, जैसे कैंसर कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं में उच्च विषाक्तता उत्पन्न करता है । यहां हम एक्स-रे के अधीन परिधीय रक्त में डीडीआर बायोमार्कर के अध्ययन के साथ एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं।
पीबीएमसी और प्लाज्मा की उच्च गुणवत्ता वाली तैयारी जो नैदानिक परीक्षण स्थलों पर मजबूती और पुन: तैयार की जा सकती है, नैदानिक परीक्षण परिधीय भविष्य कहनेवाला और फार्माकोडायनामिक ट्रांसलेशनल बायोमार्कर एंडपॉइंट्स को सूचित करने के लिए अमूल्य हैं। यहां हमने एक छोटा, स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान किया है जो आम तौर पर समस्याग्रस्त कदमों को संबोधित करता है जो नैदानिक परीक्षण सेटिंग में निष्पादन त्रुटियों के लिए असुरक्षित हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल को विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे नैदानिक साइट पर समय की कमी या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के प्रकार (पूरक फ़ाइलदेखें)।
इस उद्देश्य के लिए, हमने दिखाया है कि कैसे पूरे रक्त से पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों को अलग करने के लिए मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों का उपयोग करने के लिए जमे हुए PBMC छर्रों और जमे हुए प्लाज्मा का उत्पादन करने के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की एक किस्म के लिए उपयुक्त है । हमने विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरणों की ओर ध्यान आकृष्ट किया है जिसमें कदम 2.5 में पीबीएमसी परत की अपकेंद्रण और पहचान और पीएमसी छर्रों को 3.3 और 3.6 चरणों में शामिल किया गया है। ऐतिहासिक रूप से, जहां नैदानिक साइटें अक्सर गलत हो जाती हैं, सही इकाइयों (आरपीएम मूल्य के साथ आरसीएफ या एक्स जी मूल्य को भ्रमित करना), रक्त नमूनों, तापमान और जमे हुए सेल पैलेट के ऊपर पीबीएस की बड़ी मात्रा की उपस्थिति के प्रसंस्करण में देरी करना सही इकाइयों (आरसीएफ या एक्स जी मूल्य को भ्रमित करना) के लिए अपकेंद्रित्र स्थापित करना है। अधिकांश अपकेंद्रित्र रोटरों में गलती से एक आरपीएम सेटिंग के रूप में एक्स जी मूल्य में प्रवेश करने से महत्वपूर्ण अंडर-अपकेंद्रित्र होगा जिसके परिणामस्वरूप खराब परिभाषित या अनुपस्थित पीबीएमसी परत, और संभावित अनजाने पीबीएमसी अक्षम सेप्यूटिंग के कारण धोने के कदम के दौरान त्यागने के परिणामस्वरूप। हालांकि, इस बात की संभावना है कि अगर रोगी ने ल्यूकोपेनिया विकसित किया है तो सही अपकेंद्रित्र सेटिंग्स और रोटर एडाप्टर का उपयोग करने के बावजूद पीएमसी की परत दिखाई नहीं देती है। यह स्थिति कीमोथेरेपी या विकिरण चिकित्सा के कारण ऑन्कोलॉजी परीक्षणों में नामांकित रोगियों को प्रभावित कर सकती है और इस पर विचार किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में स्पष्ट किया गया एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि नमूनों को रक्त आकर्षित से 1-2 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए ताकि प्रोटोकॉल को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने की संभावना को कम किया जा सके। इसके अलावा, रक्त ड्रा के पहले घंटे के दौरान नमूनों को संसाधित करने का लक्ष्य पूर्व वीवो परिवर्तनशीलता को कम करता है, जिसका फार्माकोकाइनेटिक्स रीडआउट में और रक्त संरक्षण या सक्रिय सिग्नलिंग मार्गों से प्रभावित बायोमार्कर पर बहुत प्रभाव पड़ सकता है,जैसे कि चित्र 4 में दिखाया गया मामला। यदि कोशिकाएं क्रायोप्रेप्रेवरी34होने जा रही हैं तो नमूना प्रसंस्करण में देरी का कोशिका व्यवहार्यता में भी हानिकारक प्रभाव पड़ सकता है . एक अन्य कारक जो उपज और लाल रक्त कोशिका संदूषण दोनों को प्रभावित कर सकता है वह भंडारण और अपकेंद्रित्र तापमान है, जिसे कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाना चाहिए। कम तापमान घनत्व ढाल माध्यम के घनत्व को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप लाल रक्त कोशिका और ग्रैनुलोसिट संदूषण की उच्च डिग्री होती है क्योंकि ये कोशिकाएं भी कुल नहीं होती हैं। दूसरी ओर, उच्च तापमान के कारण पीबीएमसी एकत्रित एरिथ्रोसाइट्स के बीच फंस जाते हैं, इसलिए तैयारी15,27,28की उपज कम हो जाती है। और अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि क्रायोवियल में सेल पेलेट के साथ 50-100 माइक्रोन से अधिक तरल मौजूद नहीं है, क्योंकि यह इन पीबीएमसी तैयारियों के डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण में प्राप्त किसी भी प्रोटीन lysates की एकाग्रता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। तरल की अधिकता नमूनों को अधिक बढ़ा देगी, जिससे बायोमार्कर विश्लेषण के लिए बहुत कम प्रोटीन एकाग्रता के साथ lysates होता है। इसके अलावा, अनुवाद के बाद के किसी भी संशोधनों का संरक्षण बिगड़ा होगा, और लाइसिस की दक्षता भी बहुत कम हो जाएगी।
मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों को चुना गया क्योंकि वे हमारे अनुभव, उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता के साथ नैदानिक परीक्षणों के लिए एक ही रक्त ड्रा में पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों को अलग करने का सबसे सीधा तरीका प्रदान करते हैं। रक्त प्रसंस्करण के लिए अत्यधिक प्रशिक्षित ऑपरेटरों की आवश्यकता नहीं होती है, और एक ट्यूब का उपयोग रक्त को पतला करने और इसके हस्तांतरण को एक अलग ट्यूब में स्थानांतरित करने की आवश्यकता को हटा देता है, जिससे जोखिम कम हो जाता है; ब्रेक के साथ अपकेंद्रित्र कदम प्रदर्शन करने के कारण प्रोटोकॉल को छोटा करता है; और सभी अभिकर् प ट्यूब में होते हैं, जो परिवर्तनशीलता को कम करते हैं। हमारे अनुभव में, ये लाभ इन ट्यूबों की उच्च लागत से अधिक हैं, जब अन्य शास्त्रीय तरीकों की तुलना में केवल घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम27,28 (£ 410 प्रति 60 इकाइयों का उपयोग शामिल है जबकि लिम्फोप्रेप माध्यम 66 50-एमएल तैयारी के लिए £ 215 है)। वे दो प्रकार के एंटीकोगुलेंट, हेपरिन और साइट्रेट में उपलब्ध हैं, जिनमें से दोनों अलग पीबीएमसी35की कार्यक्षमता को बनाए रखने में तुलनीय हैं, इसलिए, दूसरे पर एक एंटीकोगुलेंट का चुनाव डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर अध्ययनों में हेपरिन या साइट्रेट के संभावित प्रभाव पर आधारित होगा। हालांकि यह दिखाया गया है कि EDTA ट्यूब हेपरिन या साइट्रेट13की तुलना में उच्चतम पीबीएमसी अलगाव उपज प्रदान करते हैं, एक ट्यूब-केवल हेरफेर के उपयोग में आसानी का लाभ इस विचार को प्रतिसंतुलित करता है। यदि साइटोकिन्स का विश्लेषण किया जा रहा है तो एंटी-स्कंदन प्लाज्मा में पाए गए स्तरों का प्रभाव हो सकता है, इसलिए नैदानिक परीक्षण36के लिए एक का चयन करने से पहले दोनों एंटीकोगुलेंट्स का परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि प्लाज्मा का उपयोग मेटाबोलोमिक्स अध्ययन के लिए किया जा रहा है, तो एंटीकोगुलैंट के रूप में हेपरिन का उपयोगकरना 37पसंद किया जाएगा। इसलिए, अंतिम उपयोगकर्ता या नैदानिक परीक्षण अनुवाद वैज्ञानिक के लिए छोड़ दिया एकमात्र बिंदु यह है कि क्या लागत का आकलन किए जाने के बाद साइट्रेट या हेपरिन अपने उद्देश्यों के लिए अधिक उपयुक्त होगा।
जबकि सेल तैयार करने वाली ट्यूबों का उपयोग करने के लाभ उन सीमाओं की तुलना में कई हैं जो वे मुद्रा (उच्च लागत और एंटीकोगुलेंट्स की प्रतिबंधित रेंज की उपलब्धता), नैदानिक परीक्षणों में पीडी बायोमार्कर प्राप्त करने के लिए पीबीएमसी या प्लाज्मा के उपयोग की मुख्य सीमा, विशेष रूप से ऑन्कोलॉजी में, अलगाव विधि से असंबंधित हो सकती है। हेमेटोलॉजिकल कैंसर को छोड़कर, जहां ट्यूमर सीधे परिधीय रक्त से नमूना है, अन्य कैंसर संकेत प्लाज्मा और पीबीएमसी के लिए सरोगेट ऊतक हैं जो जरूरी प्राथमिक ट्यूमर की नकल नहीं करते हैं। परिधीय ऊतक प्राथमिक ट्यूमर के साथ जीनोम और एपिजेनोम साझा नहीं कर सकते हैं, इसलिए, एक विशिष्ट ट्यूमर उत्परिवर्तन पर निर्भर बायोमार्कर का परिधीय विश्लेषण मुख्य रूप से सीटीडीएनए विश्लेषण (प्लाज्मा से) या सीटीसी (पीबीएमसी परत के बाद छंटाई द्वारा) तक सीमित है। इसके अलावा, सिग्नलिंग कैस्केड ड्राइविंग या ट्यूमर प्रसार में योगदान परिधीय रक्त में उतना सक्रिय नहीं हो सकता है। इस चुनौती को बायोमार्कर खोज दृष्टिकोण लागू करके दूर किया जा सकता है जो वैकल्पिक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए रक्त8 को लक्षित करता है या प्लाज्मा38 और पीबीएमसी तैयारी26के अलगाव के लिए पूर्व वीवो उपचारों को युग्मन करता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में जमे हुए पीबीएमसी छर्रों को आसानी से नैदानिक साइट से संसाधित किया जा सकता है ताकि प्रोटीन lysates दिया जा सके जिसका मूल्यांकन पश्चिमी ब्लॉटिंग या एलिसा तकनीकों द्वारा किया जा सकता है। आईएचसी विधियों को सक्षम बनाने के लिए पीबीएमसी का उपयोग करने के वैकल्पिक तरीके भी प्रस्तुत किए गए हैं(अनुपूरक फाइल)। इसके अलावा, हमने प्रतिरक्षा कोशिका निगरानी के लिए पीबीएमएमसी (अनुपूरक फ़ाइलदेखें) क्रायोप्रेरेर्विंग की संभावना को भी विस्तृत किया है, ऑन्कोलॉजी में एक प्रासंगिक आवेदन, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों और एडीसी के साथ नैदानिक परीक्षणों में तेजी से परीक्षण किया गया है। एडीसीसी16 और इम्यूनोफेनोटाइपिंग जैसे प्रतिरक्षा कार्यों का मूल्यांकन मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब15से अलग क्रायोप्रीवरी पीबीएमसी के साथ संगत अनुप्रयोग हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन पर एक चेतावनी है, क्योंकि यह कुछ सतह और आंतरिक मार्कर के डाउन-रेगुलेशन को बढ़ावा दे सकता है और कुछ सेल कार्यों को ख़राब कर सकता है, हालांकि पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्वेशन बाहरी प्रयोगशालाओं14, 15में प्रसंस्करण के लिए कई नैदानिक साइटों से नमूनों को संभालने के समय की कमी के कारण इन परखों को करने का एकमात्र व्यवहार्य तरीका है, और इन हानिकारक प्रभावों को अच्छे विगलन विधियों और विश्राम अवधि39से बहुत दूर किया जा सकता है।
अंत में, यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल से किसी भी नैदानिक संस्थान में पीबीएमसी और प्लाज्मा नमूनों की भरोसेमंद तैयारी की अनुमति मिलेगी, जिसमें सामान्य उपकरण और सामग्री होगी ताकि परिधीय रक्त से अनुवादात्मक अंत बिंदुओं को वैश्विक नैदानिक परीक्षणों में मजबूती से सक्षम किया जा सके ।
अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि पीबीएमसी के विश्लेषण से प्रमुख डीडीआर कारकों के खुराक-निर्भर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन दिखाकर डीएनए-हानिकारक एजेंटों की प्रतिक्रिया को कैसे सूचित किया जा सकता है, जिसका उपयोग नैदानिक विकास को आकार देने में मदद करने के लिए किया जा सकता है। आगे की तलाश, उन तरीकों का कार्यान्वयन जो पश्चिमी ब्लॉटिंग (जैसे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री40)की तुलना में अधिक मात्रात्मक हैं और कम इनपुट सामग्री (जैसे केशिका पश्चिमी ब्लॉटिंग और एलिसा) की आवश्यकता होती है, इन प्रीक्लिनिकल परिणामों को पीबीएमसी रोगी नमूनों के अधिक मजबूत, व्यवस्थित मूल्यांकन की ओर ले जाने में मदद करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटोकॉल पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए एस्ट्राजेनेका ऑन्कोलॉजी रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट में ट्रांसलेशनल मेडिसिन के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से हेडली कैर, टैमी ये और नाथन स्टैंडीफर सीटीडीएनए विश्लेषण के लिए प्लाज्मा तैयारी पर सलाह के लिए, पीबीएमसी अलगाव पर, और पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्वेशन और इम्यूनोफेनोटाइपिंग, क्रमशः।
1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |