Summary
מוצג כאן פרוטוקול לביסוס אוטם פונטינה חריף במודל חולדה באמצעות גירוי חשמלי עם פעימה אחת.
Abstract
אוטם פונטינה הוא תת-סוג השבץ הנפוץ ביותר במחזור הדם האחורי, בעוד שחסר מודל מכרסמים המחקה אוטם פונטינה. בתנאי כאן הוא פרוטוקול להקמת מודל חולדה בהצלחה של אוטם פונטינה חריפה. עכברושים במשקל של כ-250 גרם משמשים, ובדיקה עם נדן מבודד מוזרקת לסונים באמצעות מערכת סטריאוטקסית. פצע מיוצר על ידי גירוי חשמלי עם פעימה אחת. הציון של לונגה, הציון של בורדרסון, ובדיקת איזון הקורה משמשים להערכת גירעונות נוירולוגיים. בנוסף, בדיקת somatosensory להסרת דבק משמש כדי לקבוע את תפקוד sensorimotor, ואת בדיקת מיקום הגפיים משמש כדי להעריך proprioception. סריקות MRI משמשות לאחר מכן כדי להעריך את האוטם בvivio, וכתמים TTC משמש כדי לאשר את האוטם במבחנה. כאן, אוטם מוצלח מזוהה כי הוא ממוקם על בסיס anterolateral של פונים rostral. לסיכום, שיטה חדשה מתוארת כדי לבסס מודל אוטם פונטין חריפה חולדה.
Introduction
מאז שנות ה-80, דגם חסימת העורקים המוחיים האמצעי (MCAO) המושרה על ידי נימי סיליקון נמצא בשימוש נרחב במחקר שבץ בסיסי1. שיטות אחרות (כלומר, תפירה של ענף אחד של MCA2 ואוטם מוקד המושרה פוטוכימית) שימשו גם. מודלים אלה כבר כונה מודלים שבץ מבוססי MCA תרמו רבות לחקירות של מנגנונים פתופיזיולוגיים הבסיסיים שבץ וטיפולים פוטנציאליים. למרות שיש מגבלות של מודליםניסיוניים אלה 3,4, שיטות אלה שימשו מעבדות רבות5,6. מודלים מבוססי MCA קו מייצגים קו במחזור הקדמי; עם זאת, כמה דיווחים חקרו מודלים מחקים שבץ במחזור האחורי7.
ישנם הבדלים משמעותיים בין האטיולוגיה, מנגנונים, ביטוי קליני, ופרוגנוזה בין משיכות זרימת הדם הקדמי והאחורי8. לכן, אין אפשרות להחיל את התוצאות הנגזרות מדגמי קו מחזור קדמיים על שבץ מחזור אחורי. לדוגמה, חלון זמן ההתרמה למחזור הקדמי הוארך ל- 6 שעות, עם חלק קטן של מחקרים המשתרעים עד 24 שעות בהתבסס על ממצאיהדמיה 9. עם זאת, חלון הזמן למחזור הדם האחורי עשוי להיות ארוך יותר מ- 24 שעות, על פי דיווחיםקודמים 10 וחוויות קליניות שלנו. חלון זמן התרעה מוארך זה חייב להיחקר ואושר נוסף במודלים ניסיוניים.
לגבי משיכות מחזור הדם האחורי, אוטם פונטינה הוא תת הסוג הנפוץ ביותר, מהווה 7% מכל מקרי שבץ איסכמי11,12. על פי טופוגרפיה אוטם, אוטם פונטינה מחולקים אוטם פונטינה מבודד ולא מבודד13. אוטמי פונטינה מבודדים מסווגים לשלושה סוגים המבוססים על המנגנונים הבסיסיים: מחלת עורקים גדולים (LAD), מחלת ענף עורקים בסילאר (BABD) ומחלת עורקים קטנים (SAD). הידע על המנגנונים, הביטוי והאבחנה של אוטם פונטינה נגזר מחקירות קליניות שלמקרים 14. עם זאת, מודל מכרסמים מחקה אוטם פונטינה נחקר פחות.
במחקרים קודמים, לפזר את הפציעה של גזע המוח מעורבים פונים נחקר7. קבוצה אחת ניסתה ליצור מודל אוטם פונטינה באמצעות קשירה של עורק הבזיליקום (BA)15. קבוצה אחרת השתמשה בתפר מונופילמנט ניילון 10-0 כדי לתפור באופן סלקטיבי ארבע נקודות של BA proximalבאופן סלקטיבי 16. מודל זה מחקה LAD, אבל רוב אוטמי פונטינה נובעים BABD ו SAD. בנוסף, קשירה סלקטיבית של BA הוא ניתוח מסובך ויש לו שיעור מוות גבוה.
מסופק כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור קל לביצוע, בקלות לשכפל, ומודל חולדה מוצלח של אוטם פונטינה חריפה על ידי גירוי חשמלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסד ושימוש של בית החולים המזוהה השני של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו, מוסד מוכר על ידי AAALACi. החולדות סופקו על ידי מרכז בעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית הדרומית.
1. בעלי חיים
- השתמש זכר בוגר Sprague-Dawley חולדות במשקל 250 ± 10 גרם.
- בעת ההובלה, להאוס את החולדות לפחות שבוע לפני הניתוח בתנאים סביבתיים מבוקרים עם טמפרטורת סביבה של 25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 65%, ו 12 h /12 h / מחזור אור / כהה.
- ספקו מזון ומים אד libitum.
2. הקמת אוטם בפונים
- שקלו את החולדות לפני הניתוח והעריכו את הביצועים הנוירולוגיים בהתאם לבדיקות ההתנהגות המתוארות להלן (סעיף 3).
- מחממים מראש את משטח החימום מיד לפני ההרדמה.
- חבר את מקדחה הגולגולת למחזיק על המסגרת הסטריאו-קסית.
- תוך-אפרטון להזריק את החולדות עם 50 מ"ג/ק"ג קטמין ו 5 מ"ג/ק"ג xylazine. בדוק אם אין תגובה לצביטת בהון.
- הר העכברוש על המסגרת הסטריאו-קסית בתנוחה נוטה. מקם את הסורגים מעל תעלת האוזן כדי לאבטח את הראש. ודא כי הגולגולת נשמרת אופקית כדי למנוע כל הטיה של הזריקה.
- לשמור על הרדמה על ידי isoflurane (100% חמצן, 2.5% איזופלוראן) באמצעות חיבור קונוס האף סטריאוטקסי עבור חולדות עם כניסת ויציאות שקע. לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות משטח חימום ולפקח על הטמפרטורה לאורך כל ההליך.
- השתמש במשחה לעיניים כדי למנוע ייבוש קרנית. השתמש במגרסה כדי לצבוט מעט את כפות הרגליים כדי להבטיח שאין תגובה לכאב.
- לגלח את השיער של הגולגולת עם גילוח מיקרו. למרוח קרצוף כירורגי כלורקסידין באופן מעגלי החל באתר החתך הכירורגי ומסתובב כלפי חוץ.
- הפוך חתך 3 ס"מ קו האמצע עם אזמל מהקו של canthus לרוחב דו צדדי 0.5 ס"מ מאחורי fontanelle האחורי, אשר צריך להיות מסומן על ידי עט סמן כירורגי.
- השתמש בספוגית כותנה כדי להסיר דם.
- מניחים חתיכת סרט כירורגי מונחת על כל צד של דש העור כדי לחשוף את הקרקפת(איור 1).
- הסר בעדינות את רקמות החיבור מעצם הגולגולת עם ספוגית כותנה טבולה ב-0.9% NaCl. אם לא יוסר, רקמות החיבור ייתפסו במקדחה.
- זהה את ה"ברגמה". בחר את הנקודה המרכזית של bregma כ נקודת המוצא ולסמן אותו באמצעות עט סמן כירורגי שחור קצה.
- מקם מקדחה ב- AP 6.0 מ"מ, 2.0 מ"מ מ"מ מ"ל (טווח של 0.5-3.0 מ"מ, איור 2A).
- בצע פתיחת גולגולת (קוטר 1 מ"מ) באמצעות מקדחה אוטומטית. המשך בזהירות, כי נקודה זו קרובה לסינוסים הארסיים.
- הסר את המקדחה מהמסגרת הסטריאו-קסית.
- מניחים בדיקה 22 G עם נדן מבודד במסגרת סטריאוטקסית(איור 3A). קצה הגשוש צריך להיות ממוקם 2 מ"מ מעל הקצה הפרוקסימלי של הנדן (איור 3A,B; איור 2B).
- ודא כי נדן נכנס למוח 7 מ"מ (7 מ"מ DV, איור 2B; איור 1C.
- לקדם את הגשושלאורך נדן ( איור 1D) עד קצה הגשוש הוא 9 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח(איור 2D).
- חבר את האלקטרודות לממריץ חשמלי (איור 3C). חבר את האנודה לגשוש כפי שמצג באות 1D. חבר את הקתודה לחולדות (בדרך כלל לאוזן החולדות).
- הפעל את הממריץ החשמלי והגדר את הפרמטרים הבאים: רוחב פולס יחיד = 4,050 ms; מתח = 50 V; וזרם = 4 mA (איור 3C). במהלך גירוי חשמלי, העכברוש יפגין רעד. במחקר זה, המכשיר לא היה מופעל עבור חולדות קבוצת בקרה המשמשות לבדיקות התנהגותיות, MRI, ו TTC.
- השאר את הגשוש בעמדה למשך 5 דקות לאחר הגירוי.
- הסר את הגשוש מהמוח(איור 1F).
- השתמש במלט עצם כדי לכסות את פתיחת הגולגולת. תן למלט להתייבש לפני תפירת הפצע.
- תפר את הפצע עם 4-0 פוליאמיד תפרים. לאחר שלושה או ארבעה stiches, תיקו 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
- להזריק את החולדות עם פניצילין (0.25 מ"ל, 80 IU מדולל ב 4 מ"ל של תמיסת מלח) תוך-אפרטון כדי למנוע זיהום.
- להזריק את החולדות תת עורית עם מלוקסיאם במינון של 2 מ"ג/ק"ג ולאחר מכן לחזור על זה כל 24 שעות.
- נטרו את החולדות כל 15 דקות עד שהם ערים לגמרי והחזירו אותם לכלוב עם משטח חימום. גישה חופשית למזון ומים עד להקרבה.
הערה: כל ההליכים צריכים לפעול על פי העקרונות הכירורגיים האפטיים. לפני הניתוח, ללבוש חולצה, מסכה כירורגית וכפפות סטריליות לאחר קרצוף כירורגי של הידיים. לשמור על חומר תפר סטרילי בתוך השדה סטרילי בכל עת.
3. בדיקות התנהגותיות
- ציון לונגה17
- מניחים את החולדות על פני השולחן.
- שיא ציונים כדלקמן: 0 = אין גירעון נוירולוגי; 1 = אי הארכה מלאה של תחכום פנים, גירעון נוירולוגי מוקד מתון; 2 = חג שמאלה, גירעון נוירולוגי מוקד מתון; 3 = נפילה שמאלה, גירעון מוקד חמור; 4 = אין הליכה ספונטנית ורמה מדוכאת של תודעה.
- ברדרסון ציון18
- החזיקו את העכברוש בזנב ותנו למברות להגיע לשולחן. רטו את הציונים כדלקמן: 0 = שני הגפיים הגיעו לטבלה; 1 = רק איבר אחד מגיע לשולחן.
- מניחים את החיה על משטח מחוספס. להקליט את הציונים כדלקמן: 0 = אחיזה חזקה על פני השטח מחוספס עם התנגדות טובה כאשר דחף; 1 = התנגדות קלה לראות רק בכף רגל אחת; 2 = אין התנגדות כאשר דחף בכיוון אחד.
- מניחים את החולדה באזור סגור (18 ב - 36 אינם) ומאפשרים לו לשוטט בחופשיות. להקליט את הציונים כדלקמן: 0 = ללכת את כל אורך המתחם מבלי להקיף; 1 = ללכת לאורך כל המתחם עם הקיף; 2 = לא יכול ללכת לאורך המארז אבל יכול להקיף; 3 = לא יכול לזוז הרבה. השתמש בסכום ציוני ההערכה מכל פעילות כציון ההערכה הסופי.
- מבחן קרן איזון19
- ודא כי ההתאגות מורכבת 3 ס"מ רוחב ו 70 ס"מ אורך קרן והוא 20 ס"מ מעל הרצפה. מניחים קופסה חשוכה בקצה הרחוק של הקרן עם כניסה צרה.
- מקם מחולל רעשים לבנים ומקור אור בהיר בתחילת הקרן. הרעש והאור שימשו כדי להניע את העכברוש לחצות את הקרן ולהיכנס לתיאור השער.
- סיים את הגירויים כאשר בעלי החיים נכנסים לקופסה החשוכה. להקליט את ההשתיה כדי להגיע לתייב השער (בשניות) וביצועים אחוריים של העכברוש בעת חציית הקרן.
- להקליט את הציונים עבור כל ביצועים כדלקמן: 0 = יתרות עם יציבה יציבה; 1 = תופס את הצד של קרן; 2 = חיבוקים קרן 1 איבר נופל מקרן; 3 = חיבוקים קרן ושני גפיים ליפול קרן, או ספינים על קורה אחרי >60 s; 4 = מנסה לאזן על קרן אבל נופל לאחר >40 s; 5 = מנסה לאזן על קרן אבל נופל לאחר >20 s; ו- 6 = נופל, אין ניסיון לאזן או להיאחז בקרן לאחר <20 s.
- הסרת דבק somatosensory מבחן20
- מניחים את החולדות בתיבת פרספקס ברורה ולאפשר להם לחקור את הסביבה החדשה במשך 2 או 3 דקות.
- מניחים תווית דבק בצבע ירוק בקוטר 10 מ"מ על המשטח הפנימי של כל תכלית מעל האגודל ועל פרק כף היד.
- החזר את החולדות לקופסת הזכוכית.
- הקלט את הזמן עבור העכברוש להסיר את התווית הראשונה ואת כל התוויות האחרות, בהתאמה. אפשר מקסימום של 3 דקות. המבחן צריך להיערך 2x באימונים.
- בדיקת מיקום גפיים
- החזק את החולדות בתנוחה אופקית ומנע תנועה.
- ברגע שהעכברוש מאבד קשר עם משטח השולחן (תנועת גפיים פסיבית), למרוח גירויים מישוש וproproceptive על כף הרגל עם קצה השולחן.
- להעריך את מיקום כף הרגל (הצלחה או כישלון) על קצה השולחן.
- רמת את הציונים כדלקמן: 0 = אין מיקום; 0.5 = מיקום לא גמור ו/או מושהה; 1 = מיקום מיידי ושלם.
4. אישור אוטם על ידי MRI
- בצע את סריקת ה-MRI 24 שעות לאחר הניתוח.
- להניח את החולדה על ידי isoflurane (5% עבור אינדוקציה, 1%-1.5% עבור תחזוקה).
- אבטחו את ראש העכברוש בסיליל מערך מוח של חולדות ובשילוב עם אסיל נפח של שידור בלבד.
- שים את הבוליל ואת העכברוש בסורק ה-MRI. אבטחו את העכברוש בתוך העריסה בעזרת הסורגים בשיניים ובאוזניות.
- שמור על טמפרטורת הגוף ב- 37°C ± 0.5°C במהלך תהליך סריקת ה-MRI באמצעות ז'קט תרמי במעגל סגור.
- השתמש ברצף טייס כדי להבטיח גיאומטריה נכונה.
- אסוף סריקות משוקללות T2 באמצעות רצף הד ספין מהיר: זמן הד (TE) = 33 ms; זמן חזרה (TR) = 8,000 ms; שדה תצוגה = 30 מ"מ x 30 מ"מ; מטריצת רכישה = 512 × 512; 50 פרוסות; בעובי 0.4 מ"מ.
- לאסוף ארבע ירה ספין-אקו הדמיה dWI סריקות: זמן הד = 30.5 ms; זמן חזרה = 8000 ms; מטריקס = 96 × 96; שדה תצוגה = 25 מ"מ x 25 מ"מ; שלושה כיוונים = x, y, z; ערכי B = 0 1,000 s/mm2 ו- 1,000 s/mm2; 50 פרוסות חד-כיסיות רציפות; בעובי 0.4 מ"מ.
- החזר את החולדות לכלוב.
5. אישור אוטם על ידי כתם TTC
- להקריב את החולדות בנקודת הזמן על פי העיצוב הניסיוני. בניסוי הזה, הקרבנו את החולדות 24 שעות לאחר הניתוח.
- הכן פתרון TTC של 2% לפני ההקרבה. הוסף 0.2 גרם אבקת TTC ל-10 מ"ל PBS 0.01 M (pH 7.4). מעבירים את דילול לצלחת של 10 ס"מ מכוסה בנייר כסף ומותאם מראש ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- לחשוף את החולדה ל5% isoflurane עד אובדן הכרה. לאחר מכן, לחשוף את העכברוש CO2 (20%-30% מנפח הכלוב לפחות) עד נשימה נעצרה, ולאחר מכן לשמור על 2 דקות של חשיפה CO2.
- השתמש בסימנים הבאים כדי לאשר את המוות: אין עלייה ונפילה של החזה, אין דופק מוחשי, צבע ממברנה רירי עני, אין תגובה לצביטת בהון, שינוי צבע או אטימות בעיניים.
- לבצע נקע בצוואר הרחם.
- לאבטח את החיות על ידי הדבקת כפות על פלטפורמה סטרילית. ליצור חתך קו אמצע מעצם הבריח כדי hypogastrium וחתך רוחבי מן xiphoid שמאלה לאורך בית החזה. לעשות חתך בסרעפת גם לאורך בית החזה וחתך קו אמצע בית החזה כדי לחשוף את הלב.
- חבר את קצה המחט (27 G) למשאבת זביה המכילה PBS 0.01 M ב- 4 °C בחדר השמאלי.
הערה: הקדם את הקצה לאורך הקצה השמאלי של החדר כדי להימנע מכניסה לאטריום. הפעל את משאבת התבה כדי לוודא שהקצה נמצא בחדר השמאלי וחותכים את האטריום הימני. אם נוזל מתנקז מהנוריל, הקצה נמצא באטריום ויש לכוונן אותו או להכנסתו מחדש. - השתמש בכ- 100 מ"ל של 0.01 M PBS, מתוחזק ב- 4 °C עבור עירוי. כבה את משאבת העירוי עד שהכבד יהפוך ללבן.
- ערפו את ראשם של החולדות ותתמדו את כל המוח באמצעות המספריים והמרטיות. הסר את כל המים מפני השטח של המוח עם נייר כתמים.
- לאחסן את המוח כולו ב -80 °C במשך 1 דקות (חיתוך קטעים במוח קל יותר לאחר הקפאה).
הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם ניתן לחתוך היטב את מקטעי המוח מבלי להקפיא. - מניחים את המוח במטריצה עם הגב למעלה.
- זהה את החור במשטח המוח כפי שהוצג בדמות 1G והכנס להב בעובי 0.21 מ"מ מפלדת אל-חלד. בדרך כלל, האזור הגדול ביותר של אוטם הוא במטוס של הגשוש; לכן, יש להכניס להב אחד לאזור זה.
- הכנס את הלהבים האחרים במרווח של 2 מ"מ.
- בו זמנית להסיר את הלהבים, בבת אחת, מהמטריקס ולמקם את כל המוח עם הלהבים בתמיסת TTC בצלחת. הסר את הלהבים בזהירות.
הערה: כאן, מקטעים במוח לא הוסרו בקלות מן הנוזל כי כמה שאריות פיא מאטר על בסיס cranii הפריע למקטע. אם חלקים כלשהם נשארים במטריקס, השתמשו במיתית קטנה כדי להעביר אותם לצלחת. - מניחים את המנה עם תמיסת TTC וקטעי מוח באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
- בדוק את המנה כל 5 דקות ולוודא שאין חפיפה של מקטעים.
- להוסיף 10 מ"ל של 4% תמיסת paraformaldehyde לצלחת כדי לסיים את תגובת TTC.
- כוון את החלקים מהרוזסטרל לcaudal ולצלם.
6. סטטיסטיקה
- השתמש בתוכנה לניתוח סטטיסטי (לדוגמה, מנסרה של GraphPad) כדי לבצע בדיקת tשל סטודנט.
הערה: כל הנתונים מבוטאים כ-mean ± SE. ההבדלים בין קבוצות נקבעים עם -בדיקות tשל תלמיד דו-זנב (p < 0.05 המוגדרות כמשמעות סטטיסטית).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שש חיות היו נתונות לפרוטוקול הניתוח שתואר לעיל. קבוצת הביקורת כפי ש המוצגת באות 4 כללה שישה חולדות. פרוסות המוח המוצגות בדמות 4 נגזרו מחולדה אחת לכל קבוצה.
סריקת ה-MRI הראתה כי האוטם היה ממוקם על בסיס הפוני(איור 4א). מאז הגשוש הוזרק 2 מ"מ בצד שמאל של קו האמצע, האוטם היה ממוקם לרוחב. אוטם זה מחקה אוטם פונטינה אנטרולטרלי בחולים(איור 4א). מכיוון שהשתמשו בנתדן מבודד, לא היה אוטם מעבר לקצה הגשוש, כולל קליפת המוח, המוח הקטן והמוח האמצעי(איור 4א). תמונות DWI חשפו גם את אוטם פונטינה חריפה (איור 4A).
כתמי TTC שימשו כדי לאשר את האוטם 24 שעות לאחר הניתוח(איור 4A). בהשוואה לקבוצת הביקורת, נפח האוטם היה גבוה משמעותית(איור 4B).
ציונים התנהגותיים נמדדו לפני ואחרי הניתוח. הציונים עבור קבוצות מודל שליטה וfract לפני ואחרי הניתוח מוצגים בטבלה 1. בשל היעדר מבחן התנהגותי ספציפי המיועד לאוטם פונטינה, הציון Longa, ציון בורדרסון, ומבחן קרן איזון שימשו כדי להעריך את הגירעונות הנוירולוגיים. בנוסף, בדיקת somatosensory להסרת דבק כדי להעריך את תפקוד sensorimotor, כמו גם בדיקת מיקום גפיים כדי להעריך את proprioception.
בהשוואה לקבוצת הביקורת, החולדות עם אוטם פונטינה מוקפות שמאלה(איור 4א). היו הבדלים משמעותיים בציון Longa (2.67 ± 0.52 לעומת. 0, p < 0.05, איור 4C), ציון בורדרסון (2.67 ± 0.52 לעומת 0, p < 0.05, איור 4D ), מבחן מיקום גפיים(4.67 ± 0.52 לעומת 0, p < 0.05, איור 4E), ציון מבחן איזון קרן (118.33 ± 2.66 לעומת 10.17 ± 1.47, p < 0.05, איור 4F) והדבקים הסרת somatosensory מבחן ציון (2.33 ± 0.52 לעומת 12.0 ± 0, p < 0.05, איור 4G)בין חולדות עם אוטם פונטין חולדות קבוצת בקרה.
איור 1: מוסד אוטם. חורבגולגולת. (ב)נדן מועבר לחור. הזרקתההזרקה. הזרקתהגשוש. (ה)האנודה (חץ אדום) מחוברת. הגשושהוסר. (G)חור (חץ אדום) שמאלה על פני המוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
איור 2: מיקום הגשוש. (א) דיאגרמה סכמטית של מיקומים סטריאו-טסטריאו-סקיים: חצים מצביעים על נסיגה של מגני העור, אתר ברגמה ומיקום המקדחה. (ב) תרשים סכמטי של ההתעדן והבדיקה. (ג) מיקום קצה הת'ן הממוקם בפונים. (ד) מיקום קצה הגשוש הממוקם בפונים. (ה) עיצוב ניסיוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
איור 3: התקן לייצור נגעים. (א) נפרד מהדן והבדיקה. (ב) הגשוש בהתלת. (ג) האלקטרודה הכחולה הייתה אנודה שהייתה מחוברת לגשוש התוכי; האלקטרודה האדומה הייתה קתודה. (ד) ממריץ חשמלי. (ה) כלי ניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
איור 4: תוצאות מייצגות. (א)האוטם הוערך על ידי סריקת MRI עם רצף T2 ו DWI ב vivo ואושר על ידי כתמי TTC במבחנה 24 שעות לאחר הניתוח. אוטם פונטינה חריף הממוקם בפוני anterolateral ימין (קו מנוקד). בדיקה התנהגותית הראתה שהעכברוש הקיף את הצד ההתפלה של הנגע. (ב)נפח האוטם. ציוןארוך. ברסוןהבקיע. מבחןהצבתגפיים. מבחןאיזוןשל קרן הליכה. (ז)בדיקת somatosensory להסרת דבק. מייצגי מייצגים ממוצע ± SD (p < 0.05 לעומת קבוצת בקרה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
איור S1: אוטם לאקונאר בpons. אורך קצה הגשוש מתקצר. סריקת אם.אר.איי מראה אוטם לאקונאר בפונים הנכונים. (A)תמונת T2. (ב)תמונת DWI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני להורדה).
| חולדה לא | ציון לונגה | ציון בורדרסון | בדיקת קרן איזון | בדיקת somatosensory להסרת דבק | בדיקת מיקום גפיים | |||||
| לפני 100 | לאחר הניתוח | לפני 100 | לאחר הניתוח | לפני 100 | לאחר הניתוח | לפני 100 | לאחר הניתוח | לפני 100 | לאחר הניתוח | |
| אוטם פונטינה 1 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| אוטם פונטינה 2 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 4 | 8 | 120 | 12 | 3 |
| אוטם פונטינה 3 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 5 | 8 | 116 | 12 | 2 |
| אוטם פונטינה 4 | 0 | 3 | 0 | 3 | 0 | 4 | 6 | 120 | 12 | 2 |
| אוטם פונטינה 5 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 5 | 7 | 114 | 12 | 2 |
| אוטם פונטינה 6 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 5 | 7 | 120 | 12 | 3 |
| שליטה 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| שליטה 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | 12 | 12 |
| שליטה 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 8 | 12 | 12 |
| שליטה 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 11 | 12 | 12 |
| שליטה 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 9 | 12 | 12 |
| שליטה 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 12 | 12 | 12 |
טבלה 1: תוצאות התנהגותיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול ליצירת מודל עכברוש אוטם פונטינה חריפה. מודל זה יכול לשמש למחקר על פרוגנוזה ושיקום (כולל כאב כרוני לאחר שבץ) בחולים שבץ פונטינה.
ישנן מספר נקודות חוזק של שיטה זו. ראשית, הוא מספק מודל חולדה של אוטם פונטינה חריפה עבור מחקרים עתידיים. כאמור, אוטם פונטינה הוא תת-סוג שבץ נפוץ שקיבל פחות תשומת לב. חסרון גדול של מחקר שבץ היה חוסר מודל אוטם פונטינה ספציפי. שנית, בהשוואה למודל עכברוש אוטם פונטינה הקיים על ידי קשירה של BA15,16, מודל זה ניתן להתאים כדי לשנות את המיקום ואת הנפח של האוטם על פי העיצוב הניסיוני. לדוגמה, ניתן לשנות את אורך הקצה כך שהאוטם משתרע מפני השטח של הפוני, כפי שנעשה כאן.
לחלופין, ניתן להתבסס אוטם לאקונארי בפוני על ידי קיצור אורך קצה הגשוש(איור משלים 1). אוטמות במקומות שונים של הפונים (כלומר, אוטם פונטין אנטרומדיאלי) ובמישורי פוני שונים (כלומר, מישורים עלונים, אמצעים ונמוכים) ניתן ליצור גם על פי העיצוב הטופוגרפי. במודל זה, נבחר מטוס הפונטין העליון. שלישית, קל לבסס מודל זה ויש לו אחוזי הצלחה גבוהים. קשירה של BA לא יכול לייצר אוטם בשל מחזורההבטחות הפוטנציאלי 15, אבל מודל זה מבסס את האוטם בשיעור הצלחה גבוה, אשר חיוני עבור מודלים מחקר אמינים.
קיימות כמה מגבלות של שיטה זו. ראשית, האוטם במודל זה הוא לא שבץ אמיתי. שבץ מוחי הוא תוצאה של נגעים בכלי הדם, הפרעה לתכולת הדם, או תפקוד לקוי של ויסות זרימת הדם המוחית. האוטם נוצר על ידי פצע בפונים שאינו מתרחש באופן ספונטני. במילים אחרות, אין אפשרות להשתמש במודל זה כדי לטפל במדוע הקו מתרחש ב- pons. שנית, דגם זה דורש ציוד מיוחד, כגון התקן לייצור נגעים ומערכת סטריאו-קסית.
לסיכום, הממצאים מוכיחים את הצלחתו של מודל זה בהקמת מודל ניסיוני של שבץ פונס אקוטי. בהתבסס על מודל חדשני זה, אובדן התא וכתוצאה מכך אובדן ופרוגנוזה של אוטם פונטינה חריפה ניתן לחקור עוד יותר ולאפשר התפתחויות טיפוליות עתידיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (81471181 ו 81870933) לי. ג'יאנג והקרן הלאומית למדע של סין (מס ' 81601011), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (לא. BK20160345) לג'יי ז'ו ועל ידי התוכנית המדעית של ועדת הבריאות העירונית של גואנגג'ואו (20191A011083) עד Z. Qiu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 sucture | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgical instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | Wear mask when using the system | |
| Bone cement | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Cured clamp | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| General tissue scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 217181101 | |
| Lesion Making Device | Shanghai Yuyan | Making a lesion | |
| MRI system | Bruker Biospin | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Probe | Anke | Need some modification | |
| Q-tips | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | ||
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | Surgical instrument | |
| TTC | Sigma-Aldrich | BCBW5177 | For infarction confirmation in vitro |
References
- Zhu, J., et al. Suppression of local inflammation contributes to the neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 in rats with cerebral ischemia. Neuroscience. 202, 342-351 (2012).
- Xu, X., et al. MicroRNA-1906, a Novel Regulator of Toll-Like Receptor 4, Ameliorates Ischemic Injury after Experimental Stroke in Mice. Journal of Neuroscience. 37, 10498-10515 (2017).
- McBride, D. W., Zhang, J. H. Precision Stroke Animal Models: the Permanent MCAO Model Should Be the Primary Model, Not Transient MCAO. Translational Stroke Research. , (2017).
- Liu, F., McCullough, L. D. Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 464701 (2011).
- Jiang, Y., et al. A new approach with less damage: intranasal delivery of tetracycline-inducible replication-defective herpes simplex virus type-1 vector to brain. Neuroscience. 201, 96-104 (2012).
- Lopez, M. S., Vemuganti, R. Modeling Transient Focal Ischemic Stroke in Rodents by Intraluminal Filament Method of Middle Cerebral Artery Occlusion. Methods in Molecular Biology. 1717, 101-113 (2018).
- Pais-Roldan, P., et al. Multimodal assessment of recovery from coma in a rat model of diffuse brainstem tegmentum injury. NeuroImage. 189, 615-630 (2019).
- Merwick, A., Werring, D. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 348, 3175 (2014).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 Hours after Stroke with a Mismatch between Deficit and Infarct. The New England Journal of Medicine. 378, 11-21 (2018).
- Wilkinson, D. A., et al. Late recanalization of basilar artery occlusion in a previously healthy 17-month-old child. Journal of Neurointerventional Surgery. 10, 17 (2018).
- Huang, R., et al. Stroke Subtypes and Topographic Locations Associated with Neurological Deterioration in Acute Isolated Pontine Infarction. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases: The Official Journal of National Stroke Association. 25, 206-213 (2016).
- Jiang, Y., et al. In-stent restenosis after vertebral artery stenting. International Journal of Cardiology. 187, 430-433 (2015).
- Huang, J., et al. Topographic location of unisolated pontine infarction. BMC Neurology. 19, 186 (2019).
- Banerjee, G., Stone, S. P., Werring, D. J. Posterior circulation ischaemic stroke. The British Medical Journal. 361, 1185 (2018).
- Wojak, J. C., DeCrescito, V., Young, W. Basilar artery occlusion in rats. Stroke: A Journal of Cerebral Circulation. 22, 247-252 (1991).
- Namioka, A., et al. Intravenous infusion of mesenchymal stem cells for protection against brainstem infarction in a persistent basilar artery occlusion model in the adult rat. Journal of Neurosurgery. , 1-9 (2018).
- Jiang, Y., et al. Intranasal brain-derived neurotrophic factor protects brain from ischemic insult via modulating local inflammation in rats. Neuroscience. 172, 398-405 (2011).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Experiments in Translational and Stroke. 2, 13 (2010).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
- Wen, Z., et al. Optimization of behavioural tests for the prediction of outcomes in mouse models of focal middle cerebral artery occlusion. Brain Research. 1665, 88-94 (2017).
