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Genetics

आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उच्च दक्षता उत्पादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग

Published: April 2, 2020 doi: 10.3791/60808
Automatic Translation
*1,2,3, *4,5, 6,7, 8,9,10, 8,11, 3, 8,9,10,12,13, 1
1Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 2Life Science Research Center, University of Toyama, 3Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, 4Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, 5Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, 6Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 7Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, 8Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, 9Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 10Graduate School of Media and Governance, Keio University, 11Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, 12Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, 13College of Arts and Sciences, University of Tokyo
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक कोशिका भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ-साथ एक प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधित विधि पेश करते हैं जो आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कुशल पीढ़ी के लिए फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन का उपयोग जोड़ता है।

Abstract

आनुवंशिक रूप से संशोधित (जीएम) चूहों का उपयोग जीन कार्य को समझने और मानव रोगों के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । CRISPR/Cas9 प्रणाली शोधकर्ताओं को अभूतपूर्व दक्षता, निष्ठा, और सादगी के साथ जीनोम को संशोधित करने की अनुमति देता है । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता जीएम चूहों को पैदा करने के लिए एक त्वरित, कुशल और आसान प्रोटोकॉल की मांग कर रहे हैं। यहां हम एक कोशिका भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक बेहतर विधि पेश करते हैं जो फ्रीज-गल भ्रूण की उच्च विकास दर की ओर जाता है। अनुकूलित इलेक्ट्रोपोशन स्थितियों के साथ इसे जोड़कर, यह प्रोटोकॉल कम समय के भीतर उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों के साथ नॉकआउट और दस्तक चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम अपने अनुकूलित प्रोटोकॉल का एक कदम-दर-कदम स्पष्टीकरण दिखाते हैं, जिसमें CRISPR रिएजेंट तैयारी, इन विट्रो निषेचन, क्रायोप्रिजर्वेशन और एक-सेल भ्रूण, CRISPR रिएजेंट्स का इलेक्ट्रोपोरेशन, माउस जनरेशन और संस्थापकों के जीनोटिपिंग को शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं को अद्वितीय आसानी, गति और दक्षता के साथ जीएम चूहों को तैयार करने में सक्षम होना चाहिए।

Introduction

संकुल नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) प्रणाली एक वैज्ञानिक सफलता है जो जीनोम1में अभूतपूर्व लक्षित संशोधन प्रदान करती है । CRISPR/Cas9 प्रणाली Cas9 प्रोटीन और गाइड आरएनए (gRNA) दो आणविक घटकों के साथ शामिल है: एक लक्ष्य विशिष्ट CRISPR आरएनए (crRNA) और एक ट्रांस सक्रिय CRISPR आरएनए (tracrRNA)2 । एक एसआरएनए कै9 प्रोटीन को जीनोम में विशिष्ट लोकस, क्रेना के पूरक 20 न्यूक्लियोटाइड्स और प्रोटोस्तेजक आसन्न आकृति (पाम) के निकट निर्देश देता है। Cas9 प्रोटीन लक्ष्य अनुक्रम को बांधता है और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को प्रेरित करता है जो या तो त्रुटि-प्रवण नॉनहोमोकोगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) या उच्च निष्ठा होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)3,4,4,5द्वारा मरम्मत की जाती है। NHEJ सम्मिलन या/और हटाने (indels) की ओर जाता है, और इसलिए समारोह के जीन हानि के लिए जब एक कोडिंग अनुक्रम लक्षित है । एचडीआर में होमोलॉजी सीक्वेंस3,4,,5युक्त मरम्मत टेम्पलेट की उपस्थिति में सटीक जीनोम संपादन होता है । NHEJ और HDR क्रमशः नॉकआउट और नॉक-इन चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

जबकि CRISPR/Cas9 प्रणाली स्पष्ट रूप से उत्कृष्ट प्रभावकारिता और निष्ठा के साथ जीएम चूहों की पीढ़ी में तेजी आई है, वैज्ञानिकों जो इन तरीकों को लागू अक्सर तकनीकी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । सबसे पहले, पारंपरिक प्रोटोकॉल को निषेचित अंडों6,,7के प्रणोदक में CRISPR संपादन उपकरण शुरू करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता होती है। यह तकनीक समय लेने वाली है और आमतौर पर व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, कई समूहों ने माइक्रोइंजेक्शन को इलेक्ट्रोपोरेशन8,9,,10,,11,12,13से बदल दिया । हालांकि, शुरुआती इलेक्ट्रोपोशन प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोपोराशन के लिए ताजा भ्रूण का उपयोग किया जाता था। यह एक और समस्या का कारण बना है, क्योंकि प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा भ्रूण तैयार करना मुश्किल14है ।

हाल ही में हमने और अन्य लोगों ने जीनोम संपादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन के उपयोग को संयुक्त किया है, जो जीएम चूहों15,,16की पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ मानव रोगों के पशु मॉडल को तेजी से उत्पन्न करने के लिए उन्नत भ्रूण हेरफेर कौशल के बिना शोधकर्ताओं को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल भी काफी जीएम चूहों, जैसे संस्थापकों16में आनुवंशिक विषमता के रूप में पैदा करने में व्यावहारिक चुनौतियों को कम कर देता है । मोज़ेकवाद पर काबू पाने के लिए, हम भ्रूण विगलन के बाद 1 घंटे के भीतर CRISPR अभिकर्म का कार्य करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जीनोम की पहली प्रतिकृति से पहले संपादन होता है। एक अन्य सुधार में अवांछनीय मोज़ेकिज्म17को कम करने के लिए Cas9 mRNA के बजाय Cas9 प्रोटीन का उपयोग शामिल है । इसके अलावा, हमने एक-कोशिका भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक इष्टतम विधि विकसित की है जो विकास दर को दो-सेल चरण16तक बढ़ाती है: भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का उपयोग नाटकीय रूप से निषेचन के बाद फ्रीज-गल ओसाइट्स के अस्तित्व में सुधार करता है, शायद उसी तंत्र द्वारा जो फ्रीज-गल गए निषेचित oocytes को अधिक लचीलाबनाताहै।

यहां हम जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पेश फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग कर, एक सेल C57BL/6J भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए संशोधित विधि सहित । इसमें 1) जीआरएनए डिजाइन, CRISPR रिएजेंट तैयारी और असेंबली शामिल है; 2) आईवीएफ, क्रायोप्रिजर्वेशन, और एक सेल भ्रूण की विगलन; 3) फ्रीज-गल भ्रूण में CRISPR अभिकर्मकों के इलेक्ट्रोपोरेशन; 4) भ्रूण छद्म गर्भवती मादा चूहों के अंडाशय में स्थानांतरण; और 5) F0 संस्थापक जानवरों के Genotyping और अनुक्रम विश्लेषण।

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Protocol

इस अध्ययन में किए गए सभी पशु देखभाल और प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के नियमों और विनियमों के अनुसार किया गया था। प्रायोगिक प्रोटोकॉल को टोयामा विश्वविद्यालय, टोक्यो विश्वविद्यालय, जिची विश्वविद्यालय और मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोसाइंस की प्रयोगशाला पशुओं की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सामग्री की तालिका में सभी अभिकर्मकों के बारे में जानकारी दिखाई जाती है.

1. CRISPR रिएजेंट्स डिजाइन

  1. सीआरआरएनए डिजाइन
    1. कम ऑफ-टारगेट साइटों के साथ विशिष्ट सीआरएनआरए डिजाइन करने के लिए CRISPR डायरेक्ट19 (https://crispr.dbcls.jp/) पर जाएं।
      नोट: सीआरएनए20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/) को डिजाइन करने के लिए कई अन्य उपयोगी उपकरण हैं।
    2. लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम डालें और निम्नलिखित परिवर्तन करें:
      पाम अनुक्रम आवश्यकता = एनजीजी
      विशिष्टता जांच = माउस (Mus musculus) जीनोम, GRCm38/mm10 (दिसंबर, २०११)
      नोट: एक उदाहरण के रूप में, टायरोसिनज़ (टायर) नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए, एक्सोन 2 (9476-9692 से न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम) को लक्षित किया गया था।
    3. क्लिक करें डिजाइन,और अत्यधिक विशिष्ट हिट के लिए, मार्क शो अत्यधिक विशिष्ट लक्ष्य केवल.
    4. संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए,"12 मेर + पाम"और"8 मेर + पाम"के कॉलम में सबसे कम मूल्य के साथ लक्ष्य अनुक्रम चुनें।
      नोट: इन स्तंभों में,("1")इंगित करता है कि अनुक्रम में इच्छित लक्ष्य साइट के साथ केवल एक सही मैच है और एक से अधिक संख्या संभावित ऑफ-टारगेट साइटों की उपस्थिति का संकेत देती है।
    5. सीआरएनए संश्लेषण कंपनियों(सप्लाइमेंटरी टेबल 1)से परिणामी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का आदेश दें।
      नोट: एक्सोन 2 टायर जीन के लिए, निम्नलिखित लक्ष्य अनुक्रम का उपयोग किया गया था: जीजीएसीसीटैक्टाक्ट्टासीटीसीसी, पाम अनुक्रम(चित्रा 2A)के रूप में + टीजीजी के साथ।
  2. एचडीआर-मध्यस्थता संपादन प्रयोगों (यानी, दस्तक-इन चूहों की पीढ़ी) के लिए एकल स्ट्रैंड ओलिगोडेऑक्सीन्यूक्लियोटाइड (ssODN) डिजाइन।
    1. दोनों तरफ 30-60 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) होमोलॉजी आर्म्स सहित लगभग 80-180 बीपी होने के लिए ssODN लंबाई डिजाइन करें।
      नोट: 75-85 एनटी लंबाई का एक ssODN, जिसमें 30-35 एनटी होमोलॉजी आर्म और जीआरएनए के पूरक शामिल हैं, ने उच्च दस्तक-संपादन दक्षता21दिखाई ।
    2. पाम अनुक्रम में अभीष्ट संशोधन और मूक उत्परिवर्तन डालें या, यदि संभव न हो, तो जीनोम संपादन के बाद पुनर्काटको अवरुद्ध करने के लिए पाम के 5 ' पड़ोसी आधार पर।
      नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए सीआरएनए और एसएसओडीएन को सप्लीमेंट्री टेबल 1में सूचीबद्ध किया गया है ।

2. इन विट्रो निषेचन, भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन, और फ्रीज-विगलन

  1. इन विट्रो निषेचन
    1. गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी) के साथ आईपी इंजेक्शन द्वारा सुपरोवलेट C57BL/6J महिला चूहों (4 या 8 सप्ताह पुराने) ने ४८ घंटे के बाद ७.५ आईयू ह्यूमन कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) के साथ इंजेक्शन के बाद ।
      नोट: अल्ट्रा-सुपरओव्यूलेशन22का उपयोग करके ओव्यूलेटेड ओसाइट्स की संख्या में लगभग 3x की वृद्धि की जा सकती है।
    2. यौन परिपक्व C57BL/6J पुरुष चूहों (3-5 महीने पुराने) से कौडा एपीडिडिमिड्स निकालें ।
      नोट: नर चूहों का त्याग किए बिना शुक्राणुओं को इकट्ठा करना संभव है।
    3. एक विच्छेदन सुई के साथ शुक्राणुओं के थक्के निकालें और उन्हें क्षमता के लिए 1.5 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में मानव ट्यूबल द्रव (एचटीएफ) की 200 माइक्रोन ड्रॉप में इनक्यूबेट करें।
    4. एचसीजी इंजेक्शन के बाद 16-18 घंटे के ओविडक्ट्स से क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) एकत्र करें और उन्हें 2 घंटे से अधिक समय के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) में पैराफिन तरल के साथ कवर किए गए एचटीएफ माध्यम की ताजा 200 माइक्रोन ड्रॉप में इनक्यूबेट करें।
      नोट: संज्ञाहरण के तहत सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा चूहों का बलिदान करना बेहतर है क्योंकि सीओ2 साँस लेना के माध्यम से इच्छामृत्यु आईवीएफ और भ्रूण विकास23को प्रभावित करती है ।
    5. ऊष्मायन माध्यम की सीमा से शुक्राणु निलंबन के 1-5 माइक्रोन जोड़ें, जिसमें सीओसी युक्त एचटीएफ माध्यम की 200 माइक्रोन ड्रॉप हो और उन्हें 3 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    6. शेष शुक्राणु और क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाने के लिए पोटेशियम-पूरक सिंप्लेक्स अनुकूलन मध्यम (KSOM) 3x के साथ ओसाइट्स को धोएं।
    7. एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रोन्यूक्लियर गठन और एक सेल भ्रूण के ग्रेड की जांच करें ।
  2. एक कोशिका भ्रूण का क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 10 मिन के लिए 20% एफबीएस (पैराफिन तरल के साथ कवर नहीं) युक्त HTF के एक २०० μL ड्रॉप में एक सेल भ्रूण इनक्यूबेट ।
    2. 20-100 भ्रूण ों को 1 एम डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) समाधान24के 50 माइक्रोन में स्थानांतरित करें।
    3. एक क्रायोट्यूब के नीचे में 100 भ्रूण युक्त समाधान के 5 μL स्थानांतरित करें और चिलर या बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए ठंडा करें।
    4. DAP213 के 45 μL जोड़ें (2 एम डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड, 1 एम एसीटामाइड, और 3 एम प्रोपलीन ग्लाइकोल) ट्यूब वॉल के साथ धीरे-धीरे समाधान करें, ट्यूबों को कैप करें, और एक चिलर में या बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए रखें।
      नोट: नमूना विगलन के दौरान उन्हें आसानी से हटाने के लिए टोपियां भी कसकर जकड़ना न करें।
    5. तरल नाइट्रोजन में तेजी से ट्यूब स्टोर करें।
  3. भ्रूण विगलन
    1. क्रायोट्यूब का ढक्कन खोलें, शेष तरल नाइट्रोजन को त्यागें, और 0.25 मीटर सुक्रोज समाधान के 900 माइक्रोन को 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से ही जोड़ें।
      नोट: 0.25 मीटर सुक्रोज समाधान को पहले से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए क्योंकि ठंडे समाधान का उपयोग विगलन के बाद भ्रूण व्यवहार्यता को कम कर देता है।
    2. 10x के लिए जल्दी से पिपेट और क्रायोट्यूब की सामग्री को प्लास्टिक डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: पाइपिंग को ध्यान से किया जाना चाहिए, ताकि कोई बुलबुले उत्पन्न न हों और भ्रूण को नुकसान पहुंचाएं।
    3. KSOM माध्यम में रूपात्मक रूप से सामान्य निषेचित ओसाइट्स 2x को पैराफिन तरल से ढके धोएं और उन्हें इलेक्ट्रोपोराशन तक सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।

3. CRISPR अभिकर्मकों की विधानसभा और इलेक्ट्रोपोराशन

नोट: इलेक्ट्रोपॉरेशन के लिए, हमने प्लेटिनम प्लेट इलेक्ट्रोड (ऊंचाई: 0.5 मिमी, लंबाई: 10 मिमी, चौड़ाई: 3 मिमी, गैप: 1 मिमी) और एक चरण प्रकार इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग किया जिसे पहले8 (सामग्री की तालिका)वर्णित किया गया था। एक दो चरण प्रकार इलेक्ट्रोपोरेटर का भी उपयोग किया जा सकता है(सामग्री की तालिका)।

  1. CRISPR अभिकर्मकों की तैयारी और विधानसभा
    1. आदेश CRISPR अभिकर्मकों (यानी, सीआरआरएनए, ट्रेसरना, और Cas9 प्रोटीन) और ssODN अगर एचडीआर-मध्यस्थता संपादन प्रयोगों(सामग्री की तालिका और पूरक तालिका 1)प्रदर्शन कर रहा है ।
    2. इस प्रकार एनालिंग सॉल्यूशन तैयार करें।
      1. कम-सीरम मिनिमम जरूरी मीडियम सॉल्यूशन(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)में 1 μg/μL crRNA और 1 μg/μL tracrRNA तैयार करें और न्यूकलीज-फ्री बफर के 42 माइक्रोन में प्रत्येक समाधान के 6 माइक्रोन जोड़ें।
      2. इस मिश्रण को 3 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर ड्राई हीटर में इनक्यूबेट करें और 5 मिन के लिए आरटी पर ठंडा करें।
      3. ऑप्टी-एमईएम I में पतला 1 μg/μL HiFi Cas9 प्रोटीन तैयार करें और 60 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए पिछले मिश्रण में 6 माइक्रोन जोड़ें।
      4. एचडीआर-मध्यस्थता संपादन प्रयोगों को करने में, 1 μg/μL ssODN के 6 μL जोड़ें । क्योंकि अंतिम मात्रा 60 माइक्रोन होनी चाहिए, चरण 3.1.2.1 में न्यूकलीज-मुक्त पानी के 36 माइक्रोन का उपयोग करें।
        नोट: सीआरआरएनए, ट्रेसरना, कैस9 प्रोटीन और ssODN की अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/μL होगी ।
      5. एक होल स्लाइड ग्लास में अंतिम मिश्रण (आरएनपी कॉम्प्लेक्स) के 25 माइक्रोन तक 100 भ्रूणों को स्थानांतरित करें और उन्हें 10 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. इलेक्ट्रोपॉरेशन
    1. CRISPR अभिकर्मकों के नए मिश्रण के 6 μL के साथ इलेक्ट्रोड गैप भरें और मिश्रण में 20-25 भ्रूण जोड़ें।
      नोट: भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन इलेक्ट्रोड के बीच किसी भी संपर्क से बचना महत्वपूर्ण है, जो विद्युत दालों के दौरान भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है।
    2. एक कदम प्रकार इलेक्ट्रोपोरेटर के लिए निम्नलिखित परिस्थितियों में इलेक्ट्रोपोशन करें:
      वोल्टेज: 25 वी, पल्स दिशा (पीडी) +
      पर: 3 एमएस, बंद: ९७ एमएस
      दोहराता है: 5x
      नोट: इलेक्ट्रोपोराशन को मोज़ेकिज्म को रोकने के लिए पहले डीएनए प्रतिकृति से पहले जीनोम संपादन सुनिश्चित करने के लिए विगलन के बाद 1 घंटे से अधिक नहीं किया जाना चाहिए।
    3. दो-चरण प्रकार के इलेक्ट्रोपोरेटर के लिए, शर्तों को इस प्रकार सेट करें:
      Poring पल्स = 40V, पीडी +
      = 1 या 2.5 एमएस; पल्स अंतराल = 50 एमएस
      दोहराता है: 4x, क्षय 10%

      पल्स = 5 या 7V स्थानांतरण; पीडी +/-.
      पर: 50 एमएस; पल्स अंतराल = 50 एमएस।
      =5x दोहराता है; क्षय = 40%।
      नोट: निर्माता द्वारा निर्दिष्ट विशिष्ट सीमा के भीतर बाधा बनाए रखने के लिए वॉल्यूम को समायोजित करना महत्वपूर्ण है।
    4. संशोधित क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर 2 (एम 2) माध्यम के साथ भ्रूण 3x धोएं और इसके बाद पैराफिन तरल के साथ कवर किए गए KSOM माध्यम की एक बूंद के साथ दो वॉश करें।
    5. आगे प्रत्यारोपण के लिए रात भर सीओ2 इनक्यूबेटर में धोए गए भ्रूण (KSOM माध्यम में) को इनक्यूबेट करें।

4. भ्रूण हस्तांतरण

  1. छद्म गर्भवती मादा चूहों को तैयार करें। मेट आईसीआर मादा चूहों (3-6 महीने) भ्रूण हस्तांतरण (ईटी) से 1 दिन पहले पुरुष चूहों के साथ।
    नोट: चूहों को अगली सुबह एक copulatory प्लग के लिए जांच की जानी चाहिए । प्लग वाले चूहों को छद्म गर्भवती माना जाता है और इसका उपयोग ईटी के लिए किया जा सकता है।
  2. सफल प्रत्यारोपण के लिए एक मार्कर के रूप में एक ग्लास केशिका में 2-3 मिमी के वैकल्पिक अंतराल में एस्पिरेट हवा और KSOM (पैराफिन तरल के बिना) ।
  3. KSOM (पैराफिन तरल के बिना) की 200 माइक्रोन ड्रॉप में 20-24 भ्रूण परिचय और प्रत्येक अंडाशय में प्रत्यारोपण के लिए कांच केशिका में 10-12 भ्रूण आकर्षित।
  4. आइसोफ्लोरीन (साँस लेना) द्वारा मादा चूहों को एनेस्थेटइज़ करें या मेडेटोमिडीन/मिडाजोलम/ब्यूटॉलनॉल (०.३ मिलीग्राम/किलो, ४.० मिलीग्राम/किलो, और क्रमशः ५.० मिलीग्राम/किलो) के संयोजन के समाधान का आईपी इंजेक्शन । एक हीटिंग पैड पर अपने वेंट्रल पक्ष पर एनेस्थेटाइज्ड माउस की स्थिति। एक मॉइस्चराइजिंग जेल के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस की आंखों की रक्षा करें।
  5. पृष्ठीय मिडलाइन के निचले हिस्से के साथ दाढ़ी और पोविडोन आयोडीन के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित 70% इथेनॉल के साथ पीछा किया।
  6. पृष्ठीय मिडलाइन के समानांतर एक लंबा ~ 1 सेमी चीरा बनाएं।
  7. ओविडक्ट को बाहर निकालें और बाँझ प्लास्टिक ड्रेप पर रखें। गर्म बाँझ खारा का उपयोग कर इसे नम रखें।
  8. ओविडक्ट को स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  9. माइक्रोस्प्रिंग कैंची द्वारा एम्पुला के कुछ मिलीमीटर ऊपर के अम्बाइला के बीच ओविडक्ट की दीवार में छेद करें।
  10. छेद में भ्रूण युक्त कांच केशिका की नोक डालें और केशिका धारक के मुखपत्र में धीरे से उड़ाने के लिए भ्रूण निष्कासित जब तक एक हवा बुलबुला ampulla में दिखाई दे रहा है ।
    नोट: प्रति अंडाशय 10-12 भ्रूण के बीच स्थानांतरण।
  11. ओविडक्ट दीवार से कांच केशिका वापस लें और प्रजनन अंग को धीरे-धीरे शरीर गुहा में वापस धकेल दें।
  12. भ्रूण को अन्य अंडाशय में पेश करने के लिए पिछली प्रक्रिया दोहराएं।
  13. ईटी प्रक्रिया को पूरा करने पर, एक साधारण बाधित सीवन पैटर्न (50, अवशोषित, लट सिंथेटिक टांके) के साथ पेरिटोनम को सीवन करें और फिर एक साधारण बाधित पैटर्न या एक दफन चमड़ी बाधित सिलाई पैटर्न (60) के साथ त्वचा नॉनरोलेक्बल, मोनोसिंथेटिक टांके)।
  14. माउस को 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग प्लेट पर गर्म रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए।
  15. सर्जरी के बाद 7 दिनों तक रोजाना जानवर के स्वास्थ्य की निगरानी करें।

5. गेनोनोटपिंग और अनुक्रम विश्लेषण

  1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण
    नोट: हमने निर्माता की सिफारिशों के बाद चूहों के कान के ऊतकों से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए न्यूक्लियोस्पिन ऊतक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग किया।
    1. नमूना के लिए बफर टी 1 और प्रोटीनेस कश्मीर समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें और 10 एस के लिए भंवर द्वारा मिश्रण करें।
    2. 2 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक पूरी तरह से lysis प्राप्त किया जाता है पर इनक्यूबेट। इन्क्यूबेशन के हर 30 मिन के लिए 10 एस के लिए भंवर।
    3. बफर बी 3 के 200 माइक्रोन जोड़ें, 30 एस के लिए सख्ती से भंवर, और 10 वर्ष के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. सैंपल और भंवर में 100% इथेनॉल के 210 माइक्रोन जोड़ें।
    5. प्रत्येक नमूने के लिए, एक ऊतक कॉलम को संग्रह ट्यूब में रखें और नमूने को कॉलम में लागू करें।
    6. 11,000 x ग्रामपर 1 मिन के लिए सेंट्रलाइज, प्रवाह को छोड़ दें, और कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
    7. नमूना (पहला वॉश) धोने के लिए बफर बीडब्ल्यू के 500 माइक्रोन जोड़ें, 1 1 11,000 x ग्रामपर 1 मिन के लिए अपकेंद्री, प्रवाह को त्यागें और कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
    8. कॉलम (दूसरा वॉश) में बफर बी 5 के 600 माइक्रोन जोड़ें, 1 1 11,000 x ग्रामपर 1 मिन के लिए अपकेंद्री, प्रवाह को छोड़ दें, और कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
    9. सिलिका झिल्ली को सुखाने के लिए 11,000 x ग्राम पर 1 मिन के लिए कॉलम को सेंट्रलाइज करें और न्यूक्लियोस्पिन ऊतक कॉलम को 1.5 मीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में रखें।
    10. बफर बीई के 100 माइक्रोन जोड़ें, 1 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, फिर 11,000 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र 1 न्यूनतम।
  2. पीसीआर प्रवर्धन और शुद्धि
    1. लक्षित लोकस के आसपास 400-500 बीपी अनुक्रम को बढ़ाने के लिए प्राइमर 3 प्लस वेबसाइट (https://primer3plus.com/) का उपयोग करके प्राइमर डिजाइन करें।
    2. एक नया पीसीआर प्रोटोकॉल डिजाइन करें और अनुभवजन्य रूप से इसका परीक्षण करें।
    3. अवांछित एंजाइमों, न्यूक्लियोटाइड्स, प्राइमर और बफर घटकों को हटाने के लिए पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें। एक मानक शुद्धिकरण विधि का उपयोग इस प्रकार किया जा सकता है।
      1. पीसीआर उत्पादों के 50 माइक्रोन में फिनॉल के 50 माइक्रोन जोड़ें और भंवर द्वारा मिलाएं।
      2. 11,000 x ग्राम पर 1 मिन के लिए सेंट्रलाइज और ऊपरी पारदर्शी परत को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
      3. 30 एस के लिए 99.5% इथेनॉल और 5 एम अमोनियम एसीटेट और भंवर के 20 माइक्रोन जोड़ें।
      4. 10 मिन के लिए आरटी पर रखें और 10 मिन के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
      5. अधिनायक को त्यागें और डीएनए पैलेट को 70% इथेनॉल के 1 mL से धो लें।
      6. 10 मिन के लिए आरटी पर गोली सूखी और RNase मुक्त पानी के 10 μL में भंग ।
        नोट: पीसीआर कॉलम आधारित शुद्धिकरण किट को फिर से टिप्पणी की जाती है क्योंकि फिनॉल मनुष्यों के लिए विषाक्त है।
  3. सेंगर अनुक्रमण
    1. शुद्ध पीसीआर एम्प्लिकटन की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीएनए क्वाटिफिकेशन विश्लेषण (सामग्री की तालिकादेखें) चलाएं।
    2. पीसीआर उत्पाद (एस) और अनुक्रमण प्राइमर (एस) को अनुक्रमण सेवा प्रदाता को भेजें।
    3. उपलब्ध ऑनलाइन वेबसाइटों का उपयोग करके अनुक्रम का विश्लेषण करें।
      नोट: इस अध्ययन में, CRISP-ID25 (http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/) अनुक्रम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

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Representative Results

1 एम डीएमएसओ और DAP213 समाधान में क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद 10 मिन के लिए 20% एफबीएस युक्त एचटीएफ में ऊष्मायन सहित एक सेल भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए हमारी संशोधित विधि, दो-कोशिका चरण में फ्रीज-गल भ्रूण की विकासदर में सुधार(चित्रा 1,पी = 0.009, छात्र टी-परीक्षण)। फ्रीज-गल भ्रूण जीएम चूहों के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया और इलेक्ट्रोपोशन की स्थिति अनुकूलित किया गया: 3 एमएस दालों और ९७ एमएस अंतराल के साथ 25 वी के पांच दोहराता है एक इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग कर के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है । प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता एल्बिनो टायरोसिनसे जीन (Tyr) नॉकआउट चूहों(चित्रा 2)की पीढ़ी द्वारा जांच की गई थी । ऐसा करने के लिए, एक्ऑन 2 को लक्षित करने वाले GRNA को डिजाइन किया गया था(चित्रा 2A)और CRISPR अभिकर्मकों को प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था। संपादन उपकरणों को जीनोम की पहली प्रतिकृति से पहले जीनोम संपादन सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण विगलन के 1 एच के भीतर इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और इस प्रकार संस्थापकों(चित्रा 2B)में मोज़ेकिज्म को रोका गया था। सभी उत्पन्न चूहे एल्बिनो थे, और केवल एक माउस मोज़ेक था, जिसमें सफेद और काले पैच(चित्रा 2C)के साथ कोट था। एक माउस को छोड़कर दो अलग-अलग उत्परिवर्ती एलील्स (हेटेरोजिगौस उत्परिवर्तन) को शरण देने वाले सभी एल्बिनो चूहों को चित्रा 2Eमें दिखाया गया है। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि हमारी विधि अनुक्रमण विश्लेषण के साथ-साथ कोट रंग(चित्रा 2C-ई)द्वारा पुष्टि की गई कम मोज़ेक दर के साथ लगभग 100% की संपादन दक्षता प्रदान कर सकती है।

इसके बाद, प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता को नॉकआउट और दस्तक चूहों की कई पंक्तियों की पीढ़ी द्वारा जांचा गया था। जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों के साथ नॉकआउट और दस्तक चूहों उत्पन्न कर सकता है। उत्पंन F0 चूहों के अधिकांश जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के साथ संभोग किया गया F1 पीढ़ियों के लिए उत्परिवर्ती alleles के जर्मलाइन संचरण की पुष्टि करने के लिए । जैसा कि प्रत्याशित है, होमोज़िगौस एफ0 चूहों के सभी F1 वंश विषमथे, जिनमें एक उत्परिवर्ती एलील और एक जंगली प्रकार के एलील थे। संस्थापकों और उनकी पीढ़ियों के जीनोनोटिंग के बीच कोई अलग उत्परिवर्तन नहीं देखा गया । वर्णित प्रोटोकॉल ने कम समय के भीतर जीएम चूहों को उत्पन्न किया (यानी, ~ 4 सप्ताह) जैसा कि चित्रा 3में प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) फ्रीज-गल भ्रूण के दो सेल चरण विकास दर में सुधार हुआ । एफबीएस + भ्रूण की संख्या 286 थी (प्रयोग 3x दोहराया गया था), और एफबीएस-भ्रूण की संख्या 272 थी (प्रयोग 3x दोहराया गया था)। डेटा मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा अनुमति के साथ Darwish एम एट अल16 से पुन: पेश किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दर के साथ Tyr नॉकआउट चूहों की पीढ़ी। यह आंकड़ा अनुमति के साथ Darwish एम एट अल16 से संशोधित किया गया है । (A)योजनाबद्ध चित्रण जिसमें gRNA के डिजाइन को दर्शाया गया है। पाम अनुक्रम लाल रंग में दिखाया गया है। (ख)फ्रीज-गल भ्रूण के लिए इलेक्ट्रोपोराशन के समय को दर्शाता चित्रण, पीला प्रतीक विद्युतीकरण समय का प्रतिनिधित्व करता है । (ग)उत्पन्न Tyr नॉकआउट चूहों की प्रतिनिधि छवियां । (D)टायर नॉकआउट चूहों के विभिन्न एलों का अनुक्रम विश्लेषण। लक्ष्य अनुक्रम लाल रंग में लेबल किया गया है और डैश उत्परिवर्ती एलील्स में न्यूक्लियोटाइड्स के विलोपन का संकेत देता है। WT = जंगली प्रकार एम = उत्परिवर्ती एलील। (ई)एम 1 एलील युक्त एल्बिनो माउस के क्रोमेटोग्राम का एक प्रतिनिधि हिस्सा डी में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल का वर्कफ्लो। पहला कदम क्रायोपआरक्षित भ्रूण तैयार करना था। महिला C57BL/6J चूहों superovulated थे, पहले PMSG इंजेक्शन द्वारा, तो ४८ एच बाद में एचसीजी इंजेक्शन द्वारा । COCs 16 घंटे बाद एकत्र किए गए और पुरुष C57BL/6J चूहों से एकत्र शुक्राणुओं के साथ आईवीएफ के अधीन थे । निषेचित ओसाइट्स को क्रायोप्आरक्षित किया गया था और जरूरत होने तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया था। दूसरे कदम में भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन को विगलन करना शामिल था । क्रायोपआरक्षित भ्रूण गल गए थे और CRISPR रिएजेंट्स (यानी, ट्रेसरना, सीआरआरएनए और कैस9 प्रोटीन) को इकट्ठा किया गया था और भ्रूण को विगलन करने के बाद 1 एच के भीतर इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। तीसरे कदम में भ्रूण हस्तांतरण और चूहों का जन्म शामिल था । इलेक्ट्रोपोराशन के एक दिन बाद, दो सेल भ्रूण छद्म गर्भवती महिला चूहों के अंडाशय के लिए स्थानांतरित करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों कि बाद में संपादन दक्षता की पुष्टि करने के लिए Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर जीनोटाइप किया गया उत्पंन करने के लिए किया गया । यदि बड़ी संख्या में क्रायोआरक्षित भ्रूण पहले से तैयार किए जाते हैं तो हर प्रयोग (चरण 1) से पहले निषेचित ओसाइट्स तैयार करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को छोटा किया जा सकता है। यह आंकड़ा डार्काश एम एट अल से अनुकूलित है ।16कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

उत्परिवर्ती चूहे इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण 2-सेल भ्रूण स्थानांतरित भ्रूण पिल्ले (%) उत्परिवर्ती चूहों (%) मोज़ेक चूहों की संख्या
टायर को 124 84 48 12 (25) 100 1
Glrb KO 151 94 40 6 (15) 100 0
Slc39a6 KO 48 25 25 5 (20) 100 0
बाग3 KI 233 84 20 3 (15) 50 1
Camk2a KI 124 70 70 14 (20) 64.3 0

तालिका 1: C57BL/6J पृष्ठभूमि के फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग कर जीएम चूहों की कई लाइनों का उत्पादन ।

अनुपूरक तालिका 1। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों(तालिका 1)के साथ जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह उन्नत भ्रूण हेरफेर कौशल के बिना शोधकर्ताओं को आसानी से उत्परिवर्ती चूहों बनाने के लिए सक्षम बनाता है क्योंकि यह प्रजनन इंजीनियरिंग और जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों दोनों में नवीनतम और सबसे उपयोगी प्रगति का लाभ उठाता है: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) और फ्रीज-गल भ्रूण में इलेक्ट्रोपोराशन । इन अग्रिमों ने जीएम चूहों के उत्पादन को सुगम और तेज किया। जैसा कि चित्रा 3में वर्णित है, जीएम चूहों को उत्पन्न करने में ~ 4 सप्ताह लगते हैं। 26समान दृष्टिकोणों का उपयोग करके अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में, हमारी विधि दक्षता, जन्म दर और मोज़ेकवाद के मामले में बेहतर है।

भ्रूण की विकासदर में सुधार के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले एफबीएस में एक कोशिका भ्रूण का ऊष्मायन महत्वपूर्ण है । प्रोटोकॉल में वर्णित क्रायोपआरक्षित भ्रूण की विद्युत स्थिति, CRISPR अभिकर्मकों की संपादन दक्षता और भ्रूण के अस्तित्व के बीच समझौता करने की अनुमति देती है। दरअसल, कठोर या मामूली स्थितियां क्रमशः16भ्रूण की विकासदर और संपादन दक्षता को प्रभावित कर सकती हैं। इलेक्ट्रोपोराशन(चित्रा 2 बी)का समय संस्थापकों में मोज़ेकवाद को दूर करने और यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि जीनोम संशोधन केवल दो एलील की उपस्थिति में होता है। यह पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है जिसमें यह दर्शाया गया है कि प्रारंभिक चरण का विद्युतीकरण गैर-मोज़ेक म्यूटेंट17का उत्पादन कर सकता है । इसके अलावा, gRNA/mRNA के बजाय RNP का उपयोग मोज़ेक दर कम हो जाती है और संपादन दक्षता17में सुधार करती है ।

वर्णित प्रोटोकॉल में कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह कम समय (~ 4 सप्ताह) के भीतर उत्परिवर्ती चूहों को उत्पन्न करता है। दूसरा, यह एक बेहद कुशल और मजबूत प्रोटोकॉल है; नॉकआउट (KO) और नॉक-इन (KI) चूहों की कई लाइनें उच्च उत्परिवर्तन दरों (KO = 100%, KI = 50 से 64.3%) के साथ उत्पन्न हुई थीं। तीसरा, यह सुविधाजनक और लागत प्रभावी है । पूर्ण सिंथेटिक सीआरआरएनए, ट्रेसरना, एसएसओडीएन और कैस 9 प्रोटीन का उपयोग कै9 वेक्टर और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन की थकाऊ तैयारी की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके बजाय, यह शोधकर्ताओं को बस वाणिज्यिक अभिकर्मकों और मानक उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति देता है । चौथा, यह माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग नहीं करता है, जिसके लिए उच्च तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। पांचवां, यह संस्थापकों में मोज़ेकवाद को कम करता है, और इस प्रकार मोज़ेक चूहों के जटिल जीनोटिपिक विश्लेषण पर काबू पाने के लिए संपादित एलील्स के अधिक कुशल जर्मलाइन संचरण की ओर जाता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल C57BL/6J inbred तनाव के साथ कुशल है, जो F1 संकर के उपयोग से बचा जाता है, और इस तरह आनुवंशिक जटिलता से छुटकारा पाने के लिए कई बैकक्रॉस करने की आवश्यकता है । F1 पीढ़ियों के genotyping सटीक रोगाणु संचरण की पुष्टि की । हालांकि, एलील जटिलता और एफ0 संस्थापकों14,,27के जीनोटिंग से बहिष्कृत बाद की पीढ़ी के जीनोटाइपिंग की भ्रामक भविष्यवाणी के कारण एफ0 चूहों के फेनोटाइप का अध्ययन करने की सिफारिश नहीं की जाती है।

यह गैर मानव वानरों और सूअर और भेड़, जो हमेशा आसानी से उपलब्ध नहीं है के रूप में बड़े जानवरों के जीनोम संपादन में फ्रीज गल भ्रूण के उपयोग का दोहन करने के लिए प्रमुख महत्व का है । भ्रूण ठंड के तरीके जानवरों की प्रजातियों के आधार पर बहुत अलग हैं। इसलिए, हमें लगता है कि हमारा क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल केवल चूहों पर लागू हो सकता है। दूसरी ओर, हमारा प्रोटोकॉल संभावित रूप से जीएम चूहों की पीढ़ी के लिए Cas9 के अलावा अन्य इंजीनियरिंग न्यूक्लीज का उपयोग करने के लिए लागू होता है, क्योंकि इलेक्ट्रोपोराशन को पहले28, 29, 29, 29, 28, 29,29भ्रूण में Cas12a जैसे अन्य न्यूकलीज पेश करने की सूचना दी गई है।

प्रोटोकॉल की एक सीमा जीनोम में एक लंबे ट्रांसजीन का सटीक एकीकरण है, जिसे इलेक्ट्रोपोराशन-आधारित प्रोटोकॉल में मुश्किल माना जाता है। हालांकि, एक संभावित समाधान की सूचना दी गई थी: माउस जीनोम में 4.9 केबी तक ट्रांसजीन का एकीकरण सफलतापूर्वक एक एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के साथ इलेक्ट्रोपोराशन के संयोजन से किया गया था- मध्यस्थता एचडीआर दाता वितरण प्रणाली30,जो पहले के प्रकाशन31की पुष्टि करता था। इसके अलावा, ऑफ-टारगेट साइड इफेक्ट्स की संभावित घटना CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ एक बड़ी चिंता का विषय है । हमने संभावित ऑफ-टारगेट प्रभाव को बाहर करने के लिए संपादित चूहों के पूरे जीनोम अनुक्रमण का प्रदर्शन नहीं किया है। हालांकि, हमने CRISPR टूल का इस्तेमाल किया है जिन्हें आरएनपी32जैसे ऑफ-टारगेट इफेक्ट को कम करने के लिए सूचित किया गया है। इसके अलावा, हमने एक उच्च निष्ठा Cas9 संस्करण का उपयोग किया जो ऑन-टारगेट प्रदर्शन33का त्याग किए बिना ऑफ-टारगेट संपादन को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, हमने CRISPRdirect सॉफ़्टवेयर (https://crispr.dbcls.jp) का उपयोग करके जीआरएनए डिजाइन किया है, जिसके परिणामस्वरूप कम से कम लक्ष्य साइटों19के साथ लक्ष्य दृश्यों में परिणाम होना चाहिए। जीनोटाइप-फेनोटाइप करणीय संबंध की पुष्टि करने और ऑफ-टारगेट प्रभावों के बारे में चिंताओं को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं को विभिन्न जीआरएनए का उपयोग करके एक ही जीनोटाइप के कई संपादित चूहों को उत्पन्न करना चाहिए या कई पीढ़ियों के लिए उत्पन्न चूहों के बैकक्रॉसिंग को करना चाहिए।

नॉकआउट चूहों NHEJ तंत्र और फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन का उपयोग कर उत्पन्न व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है और प्रासंगिक फेनोटाइप दिखाओ । हालांकि, कटा हुआ अवशिष्ट प्रोटीन या तो अनुवाद पुनर्दीक्षा या संपादित एक्सेन34,,35के लंघन के कारण मौजूद हो सकता है। इसलिए, फेनोटाइप की सटीक व्याख्या करने के लिए, अवशिष्ट प्रोटीन समारोह या अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन आवश्यक है। एक से अधिक gRNA का उपयोग कर पूर्ण जीन नॉकआउट चूहों की पीढ़ी एक अच्छा विकल्प होगा । हालांकि, विशेष ध्यान देने की पुष्टि करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए कि जीन में गैर-कोडिंग आरएनए के लिए लिखित अंतर्निक क्षेत्र शामिल नहीं हैं, जिनमें नियामक कार्य हो सकते हैं और इसलिए फेनोटाइपिक विश्लेषण को जटिल बना सकते हैं।

इस अध्ययन में, हम एक सरल प्रोटोकॉल दिखाते हैं जिसके द्वारा कई शोधकर्ता 4 सप्ताह या उससे कम समय में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को उत्पन्न कर सकते हैं। फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन के उपयोग के संयोजन से, हम मानव रोगों के माउस मॉडल की तैयारी को आसान, त्वरित और कुशल प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों को कोई प्रासंगिक वित्तीय खुलासे नहीं है ।

Acknowledgments

हम पशु देखभाल के लिए हितोमी सावदा और एलिजाबेथ गार्सिया का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 और 16K01946) और Hokugin अनुसंधान अनुदान (एच.एन.) और जिची मेडिकल विश्वविद्यालय युवा अन्वेषक पुरस्कार (एचयू के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था । ओत्सुका तोशिमी स्कॉलरशिप फाउंडेशन ने एमडी का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

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References

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6 (3), 63 (2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).

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आनुवंशिकी अंक १५८ CRISPR/Cas9 एक सेल भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन इलेक्ट्रोपोराशन आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों जीएम जीनोम संपादन FBS
आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उच्च दक्षता उत्पादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग
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Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki,… More

Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

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