Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60811
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute of Experimental Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research)
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטות מפורטות המתארות את ייצור ויישום של פלטפורמת כוונון afterload מבוססי מגנטיקה עבור רקמות לב מהונדסים.

Abstract

לאחר העומס ידוע לנהוג בהתפתחות של מצבי לב פיסיולוגיים ופתולוגיים. ככזה, לימוד התוצאות של מצבי העמסה שונה יכול להניב תובנות חשובות למנגנונים השולטים בתהליכים קריטיים אלה. עם זאת, טכניקה ניסיונית לכוונון מדויק של המטען ברקמת הלב לאורך זמן חסרה כעת. כאן, הטכניקה החדשה שפותחה מבוססי מגנטיקה להשגת שליטה זו ברקמות הלב (EHTs) מהונדסים. על מנת לייצר EHTs להגיב מגנטי (MR-EHTs), הרקמות הם רכוב על הודעות סיליקון חלול, כמה מהם מכילים מגנטים קבועים קטנים. קבוצה שנייה של מגנטים קבועים הוא ללחוץ על התאמה לתוך צלחת אקריליק כגון שהם מכוונים עם קוטביות זהה והם מיושרים עם מגנטים פוסט. כדי להתאים את העומס, צלחת זו של מגנטים מתורגמת לכיוון (מטען אחר גבוה יותר) או משם (afterload התחתון) מתוך הפוסט magnets באמצעות שלב פיזואלקטריים מצויד מקודד. תוכנת בקרת התנועה המשמשת להתאמת מיקום הבמה מאפשרת פיתוח של משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש בעוד המקודד מבטיח כי השלב מתקן עבור כל חוסר עקביות במיקומו. עבודה זו מתארת את הייצור, הכיול והיישום של מערכת זו כדי לאפשר פיתוח של פלטפורמות דומות במעבדות אחרות ברחבי העולם. תוצאות הנציגים משני ניסויים נפרדים נכללים כדי להדגים את מגוון המחקרים השונים שניתן לבצע באמצעות מערכת זו.

Introduction

Afterload הוא עומס סיסטולי על החדר אחרי זה התחיל להוציא דם1. במהלך התפתחות הלב, המטען המתאים הוא בחשיבות קריטית עבור התבגרות הקרדיוציט2. בבגרות, רמות נמוכות של העומס החדרית (למשל, בחולים למיטה עם פציעה ברמה גבוהה בחוט השדרה3 או במקרים מיוחדים מאוד כמו טיסה4) יכול לגרום היפופרס של הלב. לעומת זאת, העומס הגבוה יכול להוביל להיפרפרס5. בעוד היפרפרס לב בספורטאים סיבולת או נשים בהריון נחשב מועיל פיסיולוגי, יפרטרופיה הקשורים ביתר לחץ דם עורקים לטווח ארוך או היצרות חמורה של שסתום אבי העורקים הוא מזיק כפי שהוא מקדם אחד להפרעות בקצב הלב וספיקת לב6. למרות שיעור התמותה 5 שנים עבור חולים אי ספיקת לב הופחת מ ~ 70%בשנות ה-80 ל-40-50%7 כיום, יש עדיין צורך גדול אפשרויות טיפול רפואי חדש עבור מצב זה שכיח מאוד (כיום 2.2% האוכלוסייה בעולם המערבי)8.

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היפרפרס הלב הפתולוגי ולבחון אסטרטגיות מונעות או טיפוליות לטיפול במחלה זו, בvivo מודלים של מטען אחרי פותחו9,10,11,12. בעוד מודלים אלה הציעו תובנות מועילות לתוך ההשפעות של העומס afterload ביצועים חדרית, הם אינם מאפשרים שליטה עדינה על בהירות העומס afterload לחילופין, במחקרים בלתי מתורבת של afterload שבוצעו על לבבות מוכי ההכנות שרירים לאפשר שליטה עדינה יותר על טעינת רקמות, אבל מודלים אלה אינם מסייעות למחקרים האורך13,14,15.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו מודל מבחנה של העומס האחורי ברקמות הלב מהונדסים (ehts)16,17. מודל זה הוא בפורמט תלת מימדי התרבות עבור תאי לב חולדה מוטבע מטריצה פיברוב מושעה בין הודעות סיליקון גמיש החלול. רקמות אלה היכו באופן ספונטני (נגד ההתנגדות של הודעות הסיליקון) ולבצע עבודה הקלה. יש לנו הגדלת afterload להחיל EHTs על ידי גורם של 12 בניסויים קודמים על ידי החדרת של מתכת נוקשה לתוך הודעות סיליקון חלול לשבוע אחד. זה הוביל להמון שינויים, מאפיין של לב פתולוגי היפרפרס18,19,20: היפראוטוציט היפר, נמק חלקי, ירידה בכוח כריתת העור, ליקוי של הרפיה רקמות, ההפעלה מראש של תוכנית הגן העובר, משמרת מטבולית של חמצון חומצות שומן כדי גליקולוליזיס אנאירובי, ועלייה פיברוזיס. למרות הליך זה הועסק בהצלחה במספר מחקרים17,21,22, יש לו כמה חסרונות. יש רק שתי מדינות, נמוך או גבוה מאוד (12 קיפול) afterload, ואת ההליך דורש טיפול ידני של EHTs, אשר מגביל את הגמישות הטמפורלית שלה מהווה את הסיכון לזיהום.

לאחרונה, ליאונרד ואח ' השתמשו בטכניקה דומה לווסת את העומס שאחרי ב EHTs תרבותי על הודעות סיליקון23. מסולסלים של אורכים שונים הוצבו סביב החלק החיצוני של ההודעות כדי להגביל את התנועה כיפוף שלהם. המחברים של מחקר זה דיווחו כי גידול יחיד קטן בינוני בעומס כוח משופר התפתחות והתבגרות של האדם הנגזר של ה-iPS, בעוד נטען גבוה יותר הביא למצב פתולוגי. עם זאת, בדומה למערכת שלנו, טכניקה זו מאפשרת רק להגברת היחיד בעומס האחר, בסדר הגודל שהוא מוכתב על-ידי אורך הגשר. ככזה, שינויים עדינים ב-afterload, שינויים ב-afterload לאורך זמן, משטרי טעינה מדויקת אינם אפשריים עם טכניקות אלה.

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת שיכולה לשמש לווסת לאחר ההתנגדות, כלומר, אחרי העומס של EHTs מגנטוסטי24. פלטפורמה זו מקלה על הכיוונון העדין של afterload, מאפשר משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש, ומבטיח עקרות EHT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פלטפורמת הכוונון של Afterload

הערה: השלבים המעורבים בחלק זה של הפרוטוקול אינם תלויי-זמן.

  1. ייצור מתלים ממגנטים הקשובים לסיליקון
    הערה:     ארונות תקשורת אלה משמשים כפלטפורמת התרבות של EHTs. כל EHT מושעה בין שני הודעות סיליקון, אשר מהקנות לטעון את הרקמה. דרגת afterload קשורה ישירות הנוקשות של הודעות אלה. כדי לאפשר כוונון afterload מגנטי, חלק מההצבות צריכים להגיב באופן ממגנט.
    1. השיגו 24 מדפים מתאימים לצלחת של הודעות סיליקון (מידות שניתנו באיור המשלים 1). המדפים המשמשים במחקר זה יוצרו על ידי ספק מסחרי מוצרי סיליקון על פי ממדים אלה באמצעות סיליקון עם קשיות החוף של 40.
    2. לקבוע את קוטביות הפוסט מגנטים (למשל, d = 0.5 מ"מ, h = 2.0 מ"מ; ראה טבלת חומרים) על ידי הצבת אותם על מגנט קבוע גדול יותר.
    3. לשמור על קוטביות קבועה, לשמן את המגנטים עם מים ולהכניס אותם, אחד בכל פעם, אל העמודים החיצוניים ביותר של ארונות הסיליקון.
      הערה: אם אתה מנסה להוסיף יותר ממגנט אחד בכל פעם, ההתנגדות הנוספת תעשה את זה קשה יותר לדחוף את המגנטים לתחתית ההודעה.
    4. השתמש פיסת הקהה של חוט שיניים פלדת אל-חלד (ד ≈ 0.4 מ"מ, ראה טבלה של חומרים) כדי לדחוף אותם בזהירות אל החלק התחתון של חלל post חלול. אתה יכול לערום עד חמישה מגנטים בכל הודעה.
    5. שימוש (עגול-אף) צבת לכופף חוט שיניים נירוסטה (ד ≈ 0.4 מ"מ, ראה טבלה של חומרים) לתוך סוגריים מסולסלים 11.25 מ"מ רוחב ו 15 מ"מ אורך. השתמשו בחותכי תיל כדי לגזור את הסוגריים המסולסלים ואת הקובץ כדי להחליק את משטח החיתוך. כדי להבטיח את הממדים הנכונים מושגת, אפשר להשתמש בג עצמית כדי לסייע התיל כיפוף.
      הערה: ניתן להשיג גם בסוגריים מסולסלים שעשויים מחומרים אחרים, כל עוד הם לא-מגנטיים ונוקשים.
    6. שדוד את הפלטה במים והכנס אותם לתוך מתלה הסיליקון, מתקן את ההצבה השנייה והשלישית לחיצונית בתהליך (ראה איור 1 עבור התקנה מלאה של מתלה הסיליקון).
      הערה: באופן אופציונלי, כדי להתאים את הנוקשות הבסיסית של הודעות בקרה כדי להתאים את זה של הודעות תגובה מגנזיום, שברי של המוט העגול יריעות (ראה טבלת חומרים) ניתן להוסיף לתוך ההודעות הריקות (אלה ללא סוגר או מגנט).
    7. תנו לארונות לעמוד במשך 1 – 2 ימים כדי לאפשר למים הנותרים להתייבש באוויר.
    8. כאשר ההודעות יבשות, לאטום את החורים בחלק העליון של הודעות סיליקון חלול המכיל את המגנטים באמצעות טיפה של דבק סיליקון.
  2. התקן הכוונון של הטעינה
    הערה:     כמו מגנטים במכשיר הכוונון afterload מועברים לכיוון או הרחק מן ההודעות הסיליקון, כוחות מגנטיים אטרקטיביים להגדיל או להקטין בהתאם, והתוצאה היא קשיות שונה של הודעות סיליקון. תנועה זו מושגת באמצעות שלב פיזואלקטריים. בשל אופיו האופייני של התקן כוונון afterload, מפורט הוראות צעד אחר צעד על איך לשכפל אותו לא יסופק. במקום זאת, הנחיות כללית לבניית התקן דומה של כוונון afterload מפורטים להלן.
    1. השג מנוע מאוד מדויק ליניארי מאוד פיזואלקטריים כדי לאפשר את התרגום האנכי של הצלחת מגנט לכיוון והרחק ehts (ראה לוח חומרים).
      הערה: הוא הציע מאוד כי מנוע זה להיות מצויד עם מקודד ליניארי לתקן את מיצוב הבמה.
    2. מיקום קבוצה של מגנטים קבועים בתוך מחזיק לא מגנטי כזה שהם מיושרים עם מגנטים פוסט כאשר ממוקמים ישירות מתחתם. כאן, מגנטים גליליים גדולים (d = 13 מ"מ, h = 14 מ"מ; ראו טבלת חומרים) היו התאמה לעיתונותבתוך צלחת פלסטיק אקרילי ("מגנט צלחת").
    3. לצרף את מחזיק מגנט לשלב פיזואלקטריים באמצעות חומר לא מגנטי. ניתן להשיג זאת באמצעות פיסת אלומיניום בצורת L (ראה איור 2).
    4. בנו מסגרת שיכולה לשכן את הרכיבים של התקן הכוונון של המטען. לכל הפחות, מבנה זה צריך להיות מיקום שבו כדי לטעון אנכית את השלב פיזואלקטריים, כמו גם מסגרת נוקשה שעליה למקם את הצלחת 24-באר.
      הערה: הוא הציע כי המיקום של הר זה ניתן לשינוי במישור האופקי כדי לאפשר התאמות יישור צירית בין שני סטים של מגנטים. מערכת של כוננים מכניים שימש להשגת יכולת תמרון זו במערכת המוצגת (איור 3). מכשיר הכוונון של המטען שמתואר כאן נועד להיות תואם למערכת הניתוח של המחשב הפעיל של EHT (ראה טבלת חומרים). ככזה, הממדים שלו היו מוגבלים 29 ס"מ רוחב, 29 ס"מ עומק, ו 16 ס"מ גובה כדי להשתלב במערכת זו.
    5. כדי לאפשר ניתוח חזותי של הרקמות, התקן מקור אור בתוך התקן כוונון afterload. כאן, מערך של נוריות הועסק (איור 4) כדי להאיר את ehts מלמטה (איור 5).
  3. מכייל את מערכת כוונון המטען האחורי
    הערה    על מנת להגדיל במדויק EHT afterload את הערך הרצוי, את הקשר בין מגנט המרווח ואת הקשיות הפוסט כתוצאה יהיה צורך להיקבע.
    1. למדוד את המרווח הקרוב ביותר (dדקות) ואת הריווח הרחוק ביותר (dmax) האפשרי בהתקנה שלך. המרחקים האלה יכתיב את העומסים. המקסימליים והמינימליים
      הערה: החלק התחתון של לוחית התרבות ימנע מגע ישיר בין הצלחת המגנט והודעות הסיליקון התגובה ממגנטית.
    2. ליצור מגוון של משקולות שאינן מגנטיות ולטעון אותם על מחרוזת כדי לשמש עומסים הבדיקה.
    3. לקבוע את המשקולות של טעינת הבדיקה באמצעות קנה מידה עדין ולתייג אותם לפי משקל זה. כאן, שישה משקולות זכוכית אקריליק שונים החל 30 מ"ג ל 200 mg שימשו.
      הערה: בחר משקולות מספיק כבד כדי לכופף את ההודעה, אבל לא כל כך כבד שהם לכופף את ההודעה יותר מאשר כמה מילימטרים. שימוש במספר גדול יותר של טעינות בדיקה מבטיח שהכיול יהיה מדויק יותר, אך הוא יהיה גם רב יותר בזמן.
    4. הר אחד מארונות הסיליקון במאונך (באמצעות חומרים שאינם מגנטיים), כך הודעות הסיליקון התגובה מגנטית מכוונות אופקית.
    5. הר אחד של הצלחת מגנטים ("כיול מגנט") על הבמה ליניארי נע אופקית כך שהוא מיושר באופן מגנטי עם ההודעה תגובה מגנטוטית.
    6. הצב את מגנט כיול מרחק מוגדר מפוסט סיליקון מגנטי תגובה באמצעות השלב האופקי (רצוי, להתחיל במרחק שווה מרווח מגנט המרבי השגה על ידי התקן כוונון afterload).
    7. מניחים מצלמה (לדוגמה, ראה טבלת חומרים) לצד ההגדרה כדי להיות מסוגל להקליט את הסטיה של הפוסט תחת השפעת המבחנים.
      הערה: הוא הציע כי המשתמש להעסיק מצלמה עם רזולוציה של לפחות 2 מגה פיקסל כדי להבטיח נחישות מדויקת של הטיה פוסט.
    8. צלם תמונה של ההודעה בהיעדר משקולות כלשהן לשימוש כהפניה למיקום "ניטרלי" של הפוסט.
    9. מבלי לשנות את נקודת המבט של המצלמה, לצרף אחד העומסים עד סוף מאוד של הפוסט סיליקון ולצלם את הפוסט כיפוף תחת השפעת המשקל.
    10. חזור על מדידה זו עבור כל המשקולות.
    11. באופן optically לקבוע את הסטיה של הפוסט סיליקון שנגרם על ידי כוח הכבידה של כל משקל.
    12. גרף הטיה של הפוסט הסיליקון (x, על ציר x) נגד כוח הכבידה של כל משקל בדיקה (mg, על ציר y). זה אמור להניב קשר ליניארי בין כוח והטיה.
      הערה: אם הנתונים הם לא ליניאריים, זה עשוי להעיד כי ההודעה היא מחוץ לטווח הליניארי של הטיה, כלומר, משקולות מנוצל היו כבדים מדי.
    13. התווה פונקציית רגרסיה ליניארית העוברת דרך (0, 0) והנתונים שנרכשו (ראה איור 6A לדוגמה). השיפוע של פונקציה זו (mg = ב) הוא הנוקשות k של פוסט סיליקון מגנטי תגובה במרווח מגנט נבדק.
    14. חזור על שלבים אלה במספר רווחים בין dmax ו -dmin. כאן, ב 9 תנוחות מגנט שונים הנע מ ~ 31 מ"מ כדי ~ 5 מ"מ נותחו.
    15. לקבוע את הקשיחות הבסיסית של פוסט סיליקון מגנזיום תגובה בהעדר מגנט כיול באמצעות אותה טכניקה.
    16. כמו כן לקבוע את הנוקשות של הודעה נייד, לא מגנט תגובה בקרת באמצעות אותה טכניקה.
    17. להתוות את ערכי k שהתקבל נגד מרחקים מגנט בהתאמה. הדבר אמור להניב קשר מעריכי שלילי.
    18. התוויית פונקציית רגרסיה באמצעות ערכים אלה. לדוגמה, השתמש בהתאמה לא-ליניארית | פונקציית ריקבון בשלב אחד בתוכנת הניתוח (עיין בטבלת החומרים). פונקציית רגרסיה זו מתארת את הקשר בין ריווח מגנט לבין עומס שאחרי (ראה איור 6B לדוגמה).

2. EHT דור ותרבות

הערה: דור EHT ותרבות תוארו בפירוט רב בסעיף אחר25. לכן, אנו רק נכסה היבטים אלה בקצרה בפרוטוקול שלנו. נא לבצע את השלבים הבאים תחת תנאים סטריליים, הקפדה על שיטות לתרבות התא הטוב.

  1. דור EHT
    1. לטבול את ארונות הסיליקון שהוכנו בעבר במיכל מילא 70% אתנול לפחות 20 דקות.
      זהירות: אל תאוטובים הודעות סיליקון מתכווננת לאחר הטעינה כדי לעקר אותם כמו טמפרטורות גבוהות יכול לפגוע מגנטים קבועים.
    2. הביאו את המיכל לתוך ארון הביובטיחות, שטפו את מתלה 2x במים סטריליים, והרשו להם להתייבש באוויר.
      הערה: כדי להפחית את הסבירות של זיהום, תהליך זה צריך להתבצע באותו ארון בטיחות ביולוגית שמאוחר יותר ישמש להטיל את EHTs.
    3. לרכוש (ולהפשיר במידת הצורך) לבלב בתאי לב המוח הגוף או היפנוטית (תא גזע הנגרמת על ידי אדם)-הקרדיוציטים הנגזר (גם מסחרית זמין) ולהכין את המיקס EHT החוקה על פי לוח 1.
    4. Pipet 1.5 mL של חם 2% agarose פתרון לשמאל 4 בארות של לוחית 24 היטב התרבות ומיד להוסיף טפלון (לראות את הטבלה של חומרים) לתוך הפתרון הנוזלי.
    5. חזור על השלב הקודם עבור 20 הבארות הנותרות בתוך לוח התרבות.
    6. לאחר שאפשר לחזק את הצמח במשך ~ 10 דקות, הסר בזהירות את המיאכרים.
      הערה: הצמח מתהפך כשהוא מתחזק.
    7. הכנס את ההצבות של ארונות הסיליקון הרגישים ממגנטים לחללים המיוצרים על ידי המוספרים.
    8. Pipet 100 μl של שילוב החוקה לתוך 3 μl סדרת מחלקים של 100 mU/L תרומבין פתרון. פיפטה למעלה ולמטה פעמיים כדי לערבב ובמהירות להעביר את התערובת לתוך הריק בתוך התבנית הראשונה של הצמח על צלחת התרבות.
    9. חזור על השלב הקודם עבור 23 התבניות הנותרות, תוך שימוש בתשר חדש עבור כל EHT.
      הערה: בעדינות לערבב את החוקה לערבב כל 6-8 EHTs כדי למנוע משקעי תאים.
    10. אחסן את הצלחת 24-באר באינקובטור (37 ° c, 7% CO2, 40% O2) עבור 90 דקות. בינתיים, להכין את מדיום EHT על ידי להשלים את מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום סוסים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 μg/mL אינסולין ו 33 μg/mL aprotinin נין.
    11. הוסף 500 μL של המדיום EHT חם לכל טוב.
    12. אחסן את הצלחת 24-באר באינקובטור (37 ° c, 7% CO2, 40% O2) עבור 30 דקות. במהלך הזמן הזה, להכין צלחת השני 24-באר עם 1.5 mL של מדיום EHT בכל טוב ולמקם אותו בחממה.
    13. הסר בזהירות את מתלה הסיליקון מגנט רגיש עם EHTs טרי על אותם מתוך תבניות agarose ולהעביר אותם לצלחת השנייה 24-היטב.
  2. התרבות של EHT
    הערה:     בעקבות השלכת רקמות, שנה בינונית שלוש פעמים בשבוע: בימי שני, רביעי ושישי.
    1. עבור שינוי בינוני, pipet 1.5 mL של בינוני EHT טריים לתוך לוחית חדשה 24-היטב התרבות ומקום צלחת זו בתוך החממה ב 37 ° c, 7% CO2, ו 40% O2 עבור לפחות 30 דקות.
    2. העבר את מתלה הסיליקון מלוחית הרישוי הישנה לצלחת החדשה שמתחת למכסה המנוע של התאים.
    3. אחסן את צלחות EHT סגור בחממה ב 37 ° c, 7% CO2, ו 40% O2.

3. ניסויים בשינוי בעומסים

הערה: שלבי הפרוטוקול הבאים הם ספציפיים לפלטפורמת הניתוח האופטי והתנועה האופטית המפורטת בטבלת החומרים.

  1. הכנת מכשיר כוונון afterload לניסויים
    1. כדי למדוד את ההשפעות של מניפולציות לאחר העומס על כיוונון EHT, לנתק ולהסיר את מערכת התאורה מהתא הפנימי ביותר של פלטפורמת ניתוח אופטי כוונון ולהכניס את המכשיר הכוונון afterload כולל את מקור האור.
    2. התקן את תוכנת בקרת התנועה של הבמה (ראה טבלת חומרים) במחשב שישמש להפעלת התקן כוונון afterload.
    3. חבר את מנוע הבמה פיזואלקטריים לבקר התנועה (ראה טבלת חומרים), ואת בקר התנועה למחשב. ודא שבקר התנועה מחובר גם למקור חשמל.
      הערה: יש שני אורות על הפנים. של בקר התנועה עם ההתחברות לעוצמה, שתי הנוריות מהבהבות באדום למשך מספר שניות. במהלך הפעולה, האור העליון נשאר ירוק בזמן שהתחתון צריך להפוך לאדום רק אם מתרחשת שגיאה.
    4. מניחים צלחת התרבות הריקה 24 היטב על הר הצלחת בחלק העליון של המכשיר כוונון afterload.
    5. ליישר את צלחת התרבות הריקה עם הצלחת מגנט למטה באמצעות מערכת כונן מכני XY המצורפת להר.
  2. הפעלת התקן כוונון אחרי העומס
    1. הפעל את תוכנת פלטפורמת בקר התנועה.
    2. חבר את התוכנה למנוע הבמה piezo על ידי בחירת היציאה המיועדת כיציאת הבמה במהלך ההתקנה של תוכנת בקרת תנועה ולאחר מכן לחץ על לחצן יציאה פתוחה .
      הערה: לאחר השלמת שלב זה, יש לייעד את היציאה כ"פתוחה" ולהופיע בתיבה ירוקה.
    3. עבור אל לוח המערכת . בחר באפשרות ' פתח לולאה ' בתפריט הנפתח לולאה .
    4. באופן ידני להעביר את הצלחת מגנט לעמדה הגבוהה ביותר שלו, כלומר, מגנט הקרובים ביותר האפשרי dדקות. לוחית המגנט צריכה ליצור. קשר עם הר התרבות
    5. . לך ללוח התנועה לחץ על לחצן אפס כדי לאפס את המיקום הנוכחי של השלב piezo ל-0 מ"מ.
    6. להעביר באופן ידני את הצלחת מגנט למצב הנמוך ביותר האפשרי שלה. כתוב את תנוחת מקודד (המצוין בלוח התנועה על ידיהרכב) כדי לקבוע את טווח התנועה עבור מנוע הבמה פיזואלקטריים.
    7. הגדר את מגבלות הנסיעה בלוח המערכת לערכים בטווח התנועה שנקבע בשלב הקודם. זה מונע את הצלחת מגנט להיתקל לתוך לוחית התרבות או התחתון של המכשיר כוונון afterload.
    8. שוב, להעביר את הצלחת מגנט למיקומו הגבוה ביותר ולחץ על כפתור אפס .
    9. עבור אל לוח המערכת ושנה את מצב לולאת המשוב ללולאה סגורה. פעולה זו מבטיחה כי השלב יהיה מדויק עבור כל שגיאה במיצוב.
    10. לחץ על לחצן שמור בתיבה שמור פרמטרים כדי לאחסן הגדרות אלה במערכת.
    11. מניחים לוח התרבות 24 היטב המכיל EHTs על מדפים סיליקון מגנזיום תגובה על הר לוחית התרבות.
    12. כדי לחשב את מרווח המגנט הדרוש כדי להשיג את העומס הרצוי, לפתור את פונקציית הרגרסיה לינארית משלב 1.3.19 עבור פרמטר המרווח מגנט d. לדוגמה, אם המשוואה היא: Equation 1 , d להיות מרווח מגנט (mm) הכרחי כדי להשיג את הצורך המבוקש המטען k ב-mN/mm, מרווח מגנט של 12.12 מ"מ יהיה צורך להשיג את המטען של 5 mN/mm.
    13. חיסור dדקות מהמרווח המחושב של מגנט d. התוצאה היא מרחק את הצלחת מגנט יש לנסוע מעמדה אפס שלה כדי להשיג את המטען הרצוי.
    14. הקלד ערך זה בשדה הקלט ' תנוחת יעד 1 ' בלוח התנועה ולחץ על ' עבור ' כדי לכוונן את הטעינה של הערך של ehts לערכים המחושבים.
  3. אופציונלי: תכנות הבמה עבור משטר מרווח אחרי העמסה
    הערה:     המקטע הקודם מתאר כיצד לתכנת את הבמה כדי לעבור ולהישאר במיקום יחיד. עם זאת, ניתן גם לשרשר פקודות שונות יחד לתוכנית כדי להשיג רצף של תנועות באופן אוטומטי, שניתן לחזור עליהן בלולאה רציפה. לקבלת הוראות מפורטות יותר בנוגע לתוכנת הפלטפורמה של בקר התנועה, עיין במדריך ההפעלה שסופק על-ידי יצרן הבמה.
    1. לאחר הגדרת התקן הכוונון של afterload כמתואר בסעיף הקודם, פתח את לוח הבקרה. הקלד את הפקודה 1Pgm1 והקש Enter כדי להתחיל בהקלטת תוכנית.
    2. כדי ליצור תוכנית אשר, למשל, יגרום לשלב פיזואלקטריים לרדת 30 מ"מ מהמיקום אפס (הרחק ehts) ולחזור אחרי 40 s, הזן את שרשרת הפקודות הבאות: 1mva30 → 1wst → 1mva30 → 1mva30 → 1wst
    3. השתמש בפקודה 1End כדי להסיק הקלטה של תוכנית ושמירתו.
    4. השתמש בפקודה 11 כדי לבצע את התוכנית המוקלטת.
    5. כדי להשאיר את התוכנית פועלת בלולאה רציפה, הזן 1Pgl1ולאחריו הפקודה 1, 1 .
    6. כדי לסיים תוכנית לולאה, הזן את הפקודה 1Est.
      הערה: טבלה 2 מכילה כמה פקודות שימושיות עבור ניסויים שינוי מטען אחרי עומס. רשימה מלאה של הפקודות הזמינות עבור מערכת זו ניתן למצוא במדריך הייחוס עבור מערכת בקרת תנועה מודולרית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מגנט פוסט נוקשות לכמת
מגנטי מונחה אופקית התגובה לפוסט סיליקון הותקן במצב קבוע, ו מגנט כיול מיושר axially הוצב בכמה מרחקים מוגדרים ("מגנט הרווחים") מתוך הודעה זו. העומס מבחן של משקל ידוע הושעו מסוף הפוסט סיליקון, גורם לעמוד לכופף. הטיה זו היתה מקוונטית. מערכת יחסים קווית בין כוח הכבידה של עומס הבדיקה והטיה שלאחר ההודעה נצפתה בכל החללים המגנט (איור 6A). ערכי הנוקשות הנובעים מקשרים ליניאריים אלה פעלו בעקבות מגמה מעריכית שלילית עם הגדלת ריווח המגנט (איור 6B).

הגדלת העומס של הסטפני
בקרה ותגובה מגנטית EHTs (MR-EHTs) המיוצר מלבבות חולדה היו מתורבתים בהעדר המטען המגנטי (0.6 mN/mm עבור רקמות שליטה ו 0.91 mN/mm עבור MR-EHTs) עד מישור בכוח כניסה הגיע. ביום זה (24 ימים לאחר הליהוק EHT), MR-Eht ושליטה Eht היו כוחות מרושע דומה (0.29 mN נגד 0.22 mN). במהלך השבוע הבא, העומס שהופעל על MR-EHTs עלה באופן הצטבר מ 0.91 אל 6.85 mN/mm, בעוד שלאחר העומס עבור EHTs שליטה נשאר קבוע. מרושע כוח הקונקטילה גדל עם להגדיל את העומס עד 0.95 mN, אשר מסמן יותר להגדיל 3-קיפול בכוח בהשוואה לערך הממוצע (0.29 mN) נמדד עבור EHTs בקרה (איור 7A). לאחר הטיה, לעומת זאת, ירדה בהשוואה לרקמות הבקרה. ביום האחרון של התרבות, הסטיה מרושע נמדד MR-EHTs היה רק 0.11 mm לעומת 0.48 mm עבור EHTs בקרה (איור 7B). החל מיום 27 על, שיעור הייצור כוח ושיעור ריקבון כוח היו גבוהים יותר MR-EHTs מאשר בקרת EHTs בעוד היה רק עלייה ארעית בעבודה לאורך ימים 25 – 28 (איור משלים 2).

משטר מרווח אחרי העמסה
העכבר EHTs על תגובות סיליקון מגנט תגובה (MR-EHTs) היו מתורבתים במטען אחר מינימלי של 0.91 mN/mm עד מישור בכוח הקונקטילה הגיע. מיום זה (17 ימים לאחר הליהוק EHT) והלאה, MR-Eht עבר משטר שלאחר העומס של 7 ימים אשר חשף את Eht כדי מחזורים של העומס afterload סירוגין בין 0.91 ו 6.85 mN/mm (איור 8A). העומס האחורי של שליטה EHTs המשיך קבוע ב 0.60 mN/mm על כל משך התרבות. בעקבות התערבות זו, הכוחות הממוצעים של MR-EHTs גדלו ב-12.0% לעומת היום ה -17, בעוד אלה שנמדדו עבור EHTs בקרה הוגדלה רק על-ידי 1.5% באותה מסגרת זמן (איור 8B). עם זאת, הבדלים אלה לא היו משמעותיים סטטיסטית. יתרה מזאת, אין הבדלים משמעותיים בקצב ייצור הכוח, שיעור הדעיכה בכוח והעבודה הקונאקטורית נמדדו (איור משלים 3). הדבר מרמז על כך שמשטר המטען הנבחר לא היה אמצעי יעיל להגדלת התפקוד החיצוני של EHT.

Figure 1
איור 1: מדפים מורכבים בעלי יכולת תגובה ממגנטית. (א) השקפה אורתוגונלית ו (ב) התצוגה הדו התאספו של ארונות סיליקון מגנטי מורכב המכיל חמישה מגנטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מגנט לוחית. צילום של לוחית המגנט. ומסגרת ההחזקה שלה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מערכת הכונן המכני. צילום המציג את המערכת של כוננים מכניים המשמשים להתאמת המיקום האופקי של צלחת 24 הטוב ביחס לצלחת מגנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: לוחית LED. צילום של לוחית LED המשמש להאיר EHTs לניתוח אופטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: לאחר ההרכבה מלאה של התקן הכוונון של afterload. צילום של המכשיר במלואו מורכב אחרי טעינה כוונון כולל לוחית LED. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: קביעה אופטית של נוקשות פוסט. (א) הטיה של פוסט סיליקון ממגנט הגיב בנוכחות מגנט כיול חיצוני ותחת השפעת חמש משקולות מבחן הוערך בתשעה מרווחים מגנט קבוע (חמש הראו כדוגמאות). (ב) היחסים שנקבעו בין מגנט הריווח לפוסט נוקשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תגובת הקונקטילה של EHTs לעלייה מראש בעומס האחורי. מדידות הקונקטיטיות בבקרת EHTs (קו שחור) ו-EHTs מתורבתים בהצבות תגובה ממגנטית (MR-EHTs; קו כחול) במשך תקופה של 31 יום. (א) למר-ehts היה מעט יותר ממוצע כוחות הביטחון מאשר שליטה ehts תחת תנאים בסיסיים. מיום 25, עם זאת, הבדל זה היה מוגבר עם הגדלת afterload. (ב) הסטה פוסט הייתה דומה בין שתי הקבוצות עד יום 27. בעבר ערכי afterload של 3.5 mN/mm, הטיה לאחר MR-EHTs ירד באופן משמעותי. כאן, n = 10 MR-EHTs ו-n = 10 השליטה EHTs נותחו על ידי התאמת מודל מעורב (REML = סבירות מקסימלית מוגבל) ו Sidak בדיקת השוואה מרובה. קווי השגיאה בגרפים מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תגובת הקונקטילה של EHTs לפרוטוקול העמסת מרווח. התנהגות הקונאקטולה של תגובה מגנטית של EHTs תחת ההשפעה של משטר התנודות של המטען האחורי נצפתה. (א) משטר afterload, אשר הופעל ביום 17 (d17), חשף MR-ehts כדי 40 s מרווחי הזמן של עומס afterload ינימלי (0.91 mm/mm) ואחריו מרווחי 40 s של המטען המקסימלי (6.85 mN/mm) במשך 7 ימים. (ב) MR-ehts (ברים כחולים) הראה מגמה לקראת הגדלת כוחות במהלך הפרוטוקול לאחר עומס הזמן, בעוד הכוחות הנמדדים ehts שליטה (ברים שחורים) נשאר יחסית ללא שינוי. עבור ניסויים אלה, n = 10 EHTs נותחו לקבוצה הנתונים האלה היו סטטיסטית בהשוואה באמצעות 2-way ANOVA ו Sidak בדיקת השוואה. קווי שגיאה בגרפים מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1 חולדה העכבר 24 חולדות (+ 10%) 1 היפנוסק-ס מ 24 היפרסק-ס מ (+10%) רכיב
5 x 105 1.3 x 107 1 x 106 2.6 x 107 תאים (או משני הצדדים לבבות בעלי לב או בתאי הלבה הנגזרים)
5.57 מיקרומטר 147 מיקרומטר 5.57 מיקרומטר 147 מיקרומטר 2x Dמ1:20% החום המופעל סרום הסוס, 20% 10x DMEM, 2% פניצילין/, 58% אקווה ad iniectabilia
2.53 מיקרומטר 66.8 מיקרומטר 2.53 מיקרומטר 66.8 מיקרומטר בריבריד: 200 mg/mL Fibrinogen הומס 0.9% הנאגל
- - 0.1 מיקרומטר 2.64 מיקרומטר Y-27632
מודעה 100 μL מודעה 2640 μL מודעה 100 μL מודעה 2640 μL EHT-הליהוק בינוני: 88% DMEM זיכרון, 10% החום-מופעל סרום עגל עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין

טבלה 1: שילוב מחדש עבור יצירת EHTs.

שם הפקודה תחביר תיאור/
הזז מוחלט 1MVA [x] שלב מהלכים למיקום [x] ב mm
מהירות מוגדרת עדי מיכאל מהירות תנועת הבמה מוגדרת ל [x] ב-mm/s
עצירת חירום 1EST מפסיק כל תנועה
המתן לעצירה 1WST רק במהלך הקלטת התוכנית; ממתין להשלמת פקודת התנועה הקודמת לפני ביצוע הפקודה הבאה
המתן לתקופת זמן 1WTM [x] רק במהלך הקלטת התוכנית; ממתין לתקופת זמן [x] ב-ms
הקלטת תוכנית התחלה 1PGM [x] התחלת הקלטת תוכנית בחריץ [x]; הערה: חריץ [x] צריך להיות חופשי
סיים הקלטת תוכנית 1END סיים תוכנית הקלטה ושמירה של תוכנית
מחיקת תוכנית 1ERA [x] מחק תוכנית שנשמרה בחריץ [x]
הפעלת תוכנית 1EXC [x] הפעלת תוכנית שנשמרה בחריץ [x]
תוכנית לולאה 1PGL [x] [x] = 1 מצב לולאה של התוכנית ב [x] = 0 מצב לולאה של התוכנית כבוי
שגיאות בקריאה ובניקוי ? מה זה? דוח שגיאת בקשה

טבלה 2: פקודות שימושיות לניסויים בכוונון אחרי הטעינה.

איור משלים 1: מידות של ארונות סיליקון. (א) השקפה עליונה, (ב) הצבת תצוגה צדדית, ו (ג) הודעה מפורטת של המדפים הסיליקון המשמשים למחקרים אלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 2: פרמטרים משלימים נוספים להגברת העומס. מדידות הקונקטיטיות בבקרת EHTs (קו שחור) ו-EHTs מתורבתים בהצבות תגובה ממגנטית (MR-EHTs; קו כחול) במשך תקופה של 31 יום. (א) MR-ehts היה שיעור ייצור כוח גבוה באופן משמעותי מאשר ehts שליטה מיום 27 על. (ב) שיעור ריקבון הכוח היה גם גדול יותר באופן משמעותי ב-MR-ehts מאשר בשליטה מיום 27 ואילך. (ג) בעוד שעבודת הקונאקטולה נמדדת בשליטה ehts הוגדלה בהדרגה על פני תקופת התרבות כולה, העבודה באמצעות כישורים שיוצרו על ידי MR-ehts השיאה ביום 26 וירד לאחר מכן לרמות מתחת לשליטה. עם זאת, העבודה במר-EHTs מעולם לא הייתה גבוהה באופן משמעותי מזו של EHTs שליטה. כאן, n = 10 MR-EHTs ו-n = 10 השליטה EHTs נותחו על ידי התאמת מודל מעורב (REML = סבירות מקסימלית מוגבל) ו Sidak בדיקת השוואה מרובה. קווי השגיאה בגרפים מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע, * p < 0.05, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 3: פרמטרים נוספים של הליך מרווח עבור פרוטוקול afterload. התנהגות הקונאקטולה של תגובה מגנטית של EHTs (MR-EHTs) תחת השפעת משטר התנודות של המטען האחורי נצפתה. (א) במהלך פרוטוקול העמסת המרווח, MR EHTs (ברים כחולים) הראה תחילה מגמה לקראת שיעורי ייצור כוח גבוה יותר לעומת EHTs שליטה (בריםשחורים), אבל הבדלים אלה לא היו משמעותיים ופחתו לקראת סוף הניסוי. (ב) כפיית שיעורי ריקבון הנמדד MR-ehts ושליטה ehts היו מבחינה סטטיסטית דומה לאורך פרוטוקול אחרי עומס מרווח. (ג) עבודה כואקטעית שנמדדה עבור MR-ehts גברה במהלך הימים הראשונים של פרוטוקול מרווחי הזמן, אך פחתה ביום האחרון. העבודה באמצעות הפעולה שנמדדה לבקרת EHTs לא שינוי באופן ניכר במהלך פרק זמן זה. עבודה במר-EHTs מעולם לא הייתה גבוהה באופן משמעותי מהעבודה ב-EHTs שליטה. עבור ניסויים אלה, n = 10 EHTs לקבוצה נותחו על ידי 2-way בדיקת ANOVA ו Sidak של מבחן השוואה. קווי שגיאה בגרפים מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר להלן מתאר טכניקה חדשה לצורך שינוי מגנטית של העמסה ברקמות הלב. טכניקה זו מסתמכת על השימוש בשלב פיזואלקטריים כדי לתרגם צלחת של מגנטים חזקים כלפי והרחק מארונות מגנזיום תגובה של הודעות סיליקון. ככל ששני סטים של מגנטים, חזקה העומס שחוו על ידי EHTs תרבותי עליהם.

קיימים מספר שלבים קריטיים לייצור ולשימוש מוצלחים במערכת זו. בעוד בדיית לתאי סיליקון מגנזיום להגיב, הוא חשוב באופן מכריע כדי להבטיח כי כל המגנטים בתוך ההודעות מכוונים עם קוטביות זהה. אם מגנט מוצב בכיוון ההפוך, הוא ישמש להחליש ולא להגדיל את חוזק השדה המגנטי. באופן דומה, קוטביות זו צריך להתאים את זה של כל המגנטים בתוך הצלחת מגנט, אחרת שני סטים של מגנטים יהיה להדוף, במקום למשוך אחד את השני. בנוסף, במידת האפשר, הימנע משימוש בחומרים מגנטיים בבניית התקן התאמת העומסים, מכיוון שהם יכולים להפריע לשדה המגנטי. אלומיניום מוצע כחומר הבנייה העיקרי מסיבה זו. באופן דומה, אם השימוש בשלב הפיזואלקטריים שונה מזו המופיעה בטבלת החומרים, ודא שהוא עמיד בפני שדות מגנטיים ובתנאי תרבות תאים סטנדרטיים (לדוגמה, 37 ° c, 100% לחות, ו-high CO2 ו-O2ריכוזים). לבסוף, זכור כי רוב השלבים פיזואלקטריים ליניארי נועדו להיות מותקן אופקית, כפי שהם נוטים להיות בעלי קיבולת עומס נמוכה. ככזה, אם המשקל של צלחת המגנט עולה על קיבולת עומס זו, יש להשתמש במשקל נגד כדי לפרוק את המנוע.

למרות השיטות הטובות ביותר, זה די קשה לשמור על שטח מקודד טהור. כאשר הדבר יתרחש, השלב יפסיק לנוע לפני שיגיע לתנוחת היעד בעת ההפעלה במצב לולאה סגורה. LED אדום של בקר התנועה תהבהב, בנוסף תוכנת בקר התנועה יציג "לא זוהה מקודד"-הודעת שגיאה. כדי לתקן את זה, המשתמש צריך לנקות את פני השטח של המקודד עם פיסת בד נטול סיבים ספוגה אלכוהול איזופרופיל ולתת לו להתייבש באוויר.

פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים שננקטו על ידי המעבדה שלנו כדי לייצר וליישם את המערכת. עם זאת, ניתן להשיג כמה שלבים אלה באמצעים שונים. לדוגמה, אדם יכול להשתמש מתמר כוח, במקום האמצעים האופטיים, כדי לאשר את הקשר בין מגנט הריווח לפוסט נוקשות. בנוסף, הצבות מותאמות אישית יכול להיות מעוצב ומפוברק עם מגנטים מוטבעים ומגשר. עם זאת, גילינו כי מיקום מדויק של אובייקטים אלה קל יותר לבצע באופן ידני. כדי לכוונן את מגוון הטעינות afterloads חלים על ידי מערכת זו, הודעות אלה יכולים להיות מיוצרים עם מחלות בסיס שונות או עם מספר שונה של מגנטים. למרות, שימוש מגנטים רבים מדי לעכב פוסט כיפוף. לחילופין, זה יכול להיות מושגת גם על ידי התאמת גודל וחוזק של מגנטים בתוך צלחת מגנט. מגנטים גדולים יותר וחזקים יותר תניב המון אחר.

קיימות מספר מגבלות לשיטה זו שניתן לשפר אותן בגירסאות עתידיות של מערכת זו. כלומר, טווח העומסים הישימים מוגבל באופן פיזי על ידי המרווח המקסימלי והמינימלי בין מגנטים פוסט לבין מגנטים צלחת. באופן אידיאלי, ההודעות המשמשות עבור מערכת זו היו מניחים את הרקמות קרוב לבסיס של הצלחת תרבות הרקמה ככל האפשר, מבלי לאפשר ישירות את הרקמה לגעת בתחתית הצלחת. עם זאת, ההודעות המשמשות במחקרים אלה היו מסחרית לפני הפיתוח של מערכת זו, כך האורכים של ההודעות לא היו ממוטבים עבור פלטפורמה זו. באופן דומה, כיוון שמערכת הניתוח של EHT נבנתה לפני מערכת זו, היא לא תוכננה לאפשר מיתרי חשמל במרחב המדידה או ממנו. ככזה, נוכחותם של חוטים אלה הביאה לפער אוויר קטן, שאיפשר לגזים לדלוף לאט אל מחוץ לחדר הפנימי. זה יכול להיות יחסי הדרך על ידי התאמת שיעורי זרימת הגז בהתאם. עם זאת, באופן אידיאלי, התגלמות עתידית של מערכת זו יהיה מבודד יציאה וכניסה נקודות עבור אלה חוטים. האם יש לרצות לבצע ניסויים אלה בהעדר מערכת הניתוח של EHT, פלטפורמת הכוונון של afterload יכולה להיות ממוקמת בתוך אינקובטור. למרות, המערכת בשלמותו תתאים רק בתוך אינקובטור רגיל אם אחד או יותר של המדפים יוסרו, עיבוד מרחב זה לא זמין עבור תאים אחרים או רקמות הרקמה למטרות. כדי להתבונן ברקמות בכל אחת מהסביבה, האורות יהיו נחוצים. נורות ה-LED ששימשו למערכת זו נמצאו כדי לוותר על כמות ניכרת של חום. אם מדובר בתקופות ארוכות, חום זה עלול לגרום נזק לרקמות. ככזה, עבור מחקרים אלה, האורות היו משמשים רק לתקופות קצרות תוך הערכת כמובן של הרקמות. עם זאת, צריך אחד הרצון להתבונן בעקביות ברקמות, מערכת התאורה תצטרך להיות ממוטב למטרות אלה.

לאחר העומס נחקרו בעבר במודלים eht16,23. עם זאת, יצירות אלה הציגו טכניקות שהיו רק מסוגלים להשיג עלייה סטטית יחיד בטעינה. לחילופין, עבודה זו הוכיחה כיצד פלטפורמת מגנטיקה מבוססת ניתן להשתמש כדי לכוונן ולווסת באופן זמני ב EHTs. התוצאות של שני סטים נפרדים של ניסויים שימשו כדי להדגים את מגוון רחב של משטרי afterload שניתן להחיל על EHTs באמצעות התקן זה. יישומים עתידיים מיועדים של מערכת זו כוללים מחקרים על ההשפעה של משטר העמסה מיושם (המינון והמשך) על התבגרות הרקמה ושיפוץ פתולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TE ו-והינם מייסדי משותף של החברה. לכל הסופרים האחרים. אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים Jutta Starbatty על התמיכה שלה בעבודת התרבות רקמה, אקסל קירשהוף לצילום, אליס Casagrande סקונטו לעריכת עבודה, ותודות מיוחדת בולנט Aksehirlioglu לתמיכה טכנית בפיתוח של התקן זה. בי בי היה נתמך על ידי DZHK (המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם) המלומד גרנט, M.L.R. על ידי ויטאקר הבינלאומי בתר דוקטורט גרנט ו M.N.H. על ידי קרנות מן DZHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical plate magnets HKCM 9962-55184 h = 14 mm, d = 13 mm
Cylindrical post magnets HKCM 9962-63571 h = 2 mm, d = 0.5 mm
Dental wire Ormco 266-1316 d = 0.016 inches (0.406 mm)
GraphPad GraphPad Software, La Jolla, California, USA version 6.00 for Windows
Motion control software for piezo motor Micronix USA free download on manufacturer homepage
Motion controller for piezo motor Micronix USA MMC-100-01000
Optical contractility analysis platform EHT technologies A0001
Piezoelectric linear motor Micronix USA PPS-20-15206 fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible
Styrene Rod Plastruct MR-15 d = 0.015 inches (0.381 mm)
USB camera Reichelt Elektronik REFLECTA 66142

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , Elsevier. (2018).
  2. McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
  3. de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
  4. Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
  5. Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
  6. Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
  7. Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
  8. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
  9. Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
  10. Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
  11. Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
  12. Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
  13. Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 4 Pt 2 747-754 (1985).
  14. Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
  15. Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
  16. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  17. Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
  18. Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
  19. Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
  20. Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
  21. Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
  22. Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
  23. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  24. Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
  25. Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 159 רקמה-הנדסה רקמת לב מהונדסים היפרפרס לב מגנטיקה afterload התכווצות
התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Becker, B., Rodriguez, M. L.,… More

Becker, B., Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues. J. Vis. Exp. (159), e60811, doi:10.3791/60811 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter