Summary
このプロトコルは、工学的心臓組織のための磁気ベースの後負荷調整プラットフォームの製造および実装を記述する詳細な方法を提供する。
Abstract
後負荷は、生理学的および病理学的心臓状態の両方の発達を促進することが知られている。したがって、変更された後負荷状態の結果を研究することは、これらの重要なプロセスを制御するメカニズムに関する重要な洞察をもたらす可能性があります。しかしながら、時間の経過とともに心臓組織の後負荷を正確に微調整する実験的手法は現在欠けている。ここでは、この制御を工学的な心臓組織(EHT)で実現するための新開発の磁気ベースの技術について説明する。磁気応答性のEHT(MR-EHT)を生成するために、組織は中空シリコーンポストに取り付けられ、その一部には小さな永久磁石が含まれています。永久磁石の第2セットは、同じ極性で配向され、ポスト磁石と軸方向に整列するようにアクリルプレートに押し込まれています。後ろ荷重を調整するために、この磁石板はエンコーダを取り付けた圧電ステージを用いてポスト磁石から(高い後荷重)または離れた(低い後荷重)に変換されます。ステージの位置を調整するために使用されるモーションコントロールソフトウェアは、ユーザー定義の後荷重レジメンの開発を可能にし、エンコーダーは、ステージがその場所の不整合を修正することを保証します。この研究では、世界中の他のラボで同様のプラットフォームを開発できるように、このシステムの製造、キャリブレーション、および実装について説明します。2つの別々の実験の代表的な結果は、このシステムを用いて行うことができる異なる研究の範囲を例示するために含まれる。
Introduction
後負荷は、血液1を排出し始めた後の心室の収縮期負荷である。心臓の発達の間、適切な後負荷は心筋細胞成熟2にとって非常に重要である。成人期には、心室後負荷の低レベル(例えば、高レベル脊髄損傷3または宇宙飛行4のような非常に特別な症例の寝たきりの患者において)は、心臓の低萎縮をもたらす可能性がある。逆に、高い後負荷は、心肥大5につながることができます。持久力運動選手または妊婦における心臓肥大は有益かつ生理的であると考えられるが、長期動脈性高血圧または重度の大動脈弁狭窄症に関連する肥大は、心不整脈および心不全に1つを素因とするので有害である6。心不全患者の5年死亡率は現在、1980年代の6~40~50%に70%から減少しているが、この非常に流行している状態(現在、欧米の人口の2.2%)に対する新たな治療治療オプションが依然として大きく必要とされている。
病理学的心臓肥大の分子機構を調査し、この疾患を治療するための予防または治療戦略をテストするために、後負荷のインビボモデルが99、10、11、1210,11,12を開発した。これらのモデルは、後負荷が心室性能に及ぼす影響に関する有益な洞察を提供しているが、後負荷の大きさを細かく制御することはできません。あるいは、切除された心臓および筋肉製剤に対して行われた後荷重のインビトロ研究は、組織負荷を細かく制御することを可能にするが、これらのモデルは縦断研究13、14、15,14,15に役立たない。
これらの問題を克服するために、我々は、設計された心臓組織(EHT)16、17,17における上昇後負荷のインビトロモデルを開発した。このモデルは、柔軟な中空シリコーンポストの間に懸濁されたフィブリンマトリックスに埋め込まれたラット心臓細胞の3次元培養フォーマットである。これらの組織は自発的に(シリコーンポストの抵抗に対して)打ち、食べられない作業を行う。我々は、1週間中空シリコーンポストに硬質金属ブレースを挿入することによって、以前の実験で12倍のATに適用された後負荷を増加させた。これは、病理学的心臓肥大18、19、2019,20の特徴18である多くの変化につながり、心筋細胞肥大、部分的な根落、収縮力の低下、組織弛緩の障害、胎児遺伝子プログラムの再活性化、脂肪酸酸化から嫌気性解糖への代謝シフト、線維化の増加を引き起こした。この手順は、いくつかの研究で成功して採用されています17,,21,,22,それはいくつかの欠点があります.低または非常に高い(12倍)後負荷の2つの状態しかなく、手順は、その時間的な柔軟性を制限し、汚染のリスクをもたらすEhtsの手動処理を必要とします。
最近、Leonardら.はシリコーンポスト23上で培養されたEHTで後負荷を調節するために同様の技術を使用した。様々な長さのブレースは、曲げ運動を制限するために、ポストの外側の周りに配置されました。本研究の著者は、ヒトiPS由来EhTの増加力の発達と成熟を強化した負荷の特異な小中増加が病理学的状態をもたらしたと報告した。しかし、私たちのシステムと同様に、この技術は、後荷重の単数の増加のみを可能にし、その大きさはブレースの長さによって決まります。したがって、後読みによる微調整、時間の経過に伴う後荷重の変更、およびこれらの手法では正確なロードレジメンは不可能です。
ここでは、後抵抗、すなわち、Ehtsの後負荷を磁気的に24に変調するために使用できるシステムのプロトコルを提供する。このプラットフォームは、後負荷の微調整を容易にし、ユーザー定義の後負荷レジメンを可能にし、EHTの無菌性を保証します。
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Protocol
1. アフターロードチューニングプラットフォームの準備
注:プロトコルのこの部分に関連する手順は時間を区別しません。
- 磁気応答性シリコーンラックの製造
注:これらのラックは、Ehts のカルチャ プラットフォームとして機能します。各EHTは、組織に後負荷を与える2つのシリコーンポストの間に懸濁される。後荷重の程度は、これらのポストの剛性に直接関連しています。磁気後負荷調整を可能にするには、一部のポストが磁気応答性である必要があります。- シリコーンポストの24ウェルプレート互換ラックを取得します(補助図1に示す寸法)。この研究で使用されたラックは、40の海岸硬度のシリコーンを使用してこれらの寸法に従って商業シリコーン製品サプライヤーによって製造されました。
- ポスト磁石の極性(例えば、d = 0.5 mm、h = 2.0 mm;材料表を参照)を、より大きな永久磁石に置いて決定します。
- 固定の極性を保ち、磁石を水で潤滑し、一度に1つずつ、シリコーンラックの最も外側の支柱に挿入します。
注:一度に複数の磁石を挿入しようとすると、追加の抵抗が磁石をポストの底まで押し出すことをより困難にします。 - ステンレス製の歯科用ワイヤー(d ≈ 0.4 mm、材料表を参照)の鈍い部分を使用して、慎重に中空のポストキャビティの底に押し込みます。各ポストに最大5個の磁石を積み重ねることができます。
- (丸い鼻)ペンチを使用して、ステンレススチール製の歯科用ワイヤー(d ≈ 0.4 mm、材料表を参照)をブレース幅11.25mm、長さ15mmに曲げてください。ワイヤカッターを使用してブレースを切断し、ファイルを使用して切断面を滑らかにします。正しい寸法を確実に達成するために、自作の治具を使用してワイヤーの曲げに役立てることができます。
注:非磁性で硬い限り、他の材料から作られたブレースによっても固定化後に実現できます。 - ブレースを水で潤滑し、シリコーンラックに挿入し、プロセスの2番目と3番目から最も外側のポストに固定します(完全なシリコンラックのセットアップについては図1を参照)。
注:必要に応じて、制御ポストのベースライン剛性を磁気応答性のポストの剛性に合わせて調整するために、スチレン丸いロッドの断片(材料表を参照)を空のポスト(ブレースまたは磁石を持たないもの)に挿入することができます。 - ラックは1~2日間放置して、残りの水を空気乾燥させます。
- ポストが乾燥したら、シリコン接着剤の滴を使用して、磁石を含む中空シリコーンポストの上部の穴を密封します。
- 後負荷調整装置
注:後荷重調整装置の磁石がシリコーンポストの磁石に向かって移動したり離れたりすると、それに応じて魅力的な磁力が増減し、シリコーンポストの剛性が変化します。この動きは圧電ステージを用いて行う。後ロード調整装置のプロトタイプ性があるため、それを複製する方法に関する詳細なステップバイステップの手順は提供されません。代わりに、同様の後負荷調整装置を構築するための一般化されたガイドラインが、本明細書で詳述される。- 非常に精密な圧電線形モーターを取得して、マグネットプレートをEhtsに向かって垂直に変換し、ETから離れた位置に移動できるようにします(材料表を参照)。
注:このモーターには、ステージの位置を補正するためにリニアエンコーダを取り付けることを強く推奨されています。 - 非磁性ホルダー内に永久磁石のセットを配置し、その直後に置くとポスト磁石と軸方向に整列させます。ここで、大きな円筒形磁石(d=13mm、h=14mm;材料表参照)は、アクリルプラスチックプレート(「磁石板」)内に圧入した。
- 非磁性体を使用して、磁石ホルダーを圧電ステージに取り付けます。これは、L字型のアルミニウムを使用して実現できます(図2を参照)。
- 後負荷調整装置のコンポーネントを収容できるフレームを構築します。少なくとも、この構造は、圧電ステージを垂直に取り付ける場所と、24ウェルプレートを配置する剛性フレームを持つ必要があります。
注:このマウントの位置は、2組の磁石間の軸方向の位置合わせで調整を可能にするために、水平面で変更可能であることが示唆される。この機動性を実現するために、機械式ドライブのシステムが使用されました(図3)。ここで説明する後負荷調整装置は、EHTの収縮性分析システムと互換性があるように設計されました (資料表を参照)。そのため、その寸法は幅29cm、深さ29cm、高さ16cmに制限され、このシステム内に収まるようにしました。 - 組織の視覚的な分析を可能にするには、後負荷調整装置内に光源を取り付けます。ここでは、下記からEHTを照らすにはLEDの配列(図4)を採用した(図5)。
- 非常に精密な圧電線形モーターを取得して、マグネットプレートをEhtsに向かって垂直に変換し、ETから離れた位置に移動できるようにします(材料表を参照)。
- 後負荷チューニングシステムのキャリブレーション
メモ：EHT後荷重を所望の値まで正確に増強するには、磁石の間隔と結果として生じるポスト剛性との関係を決定する必要があります。- セットアップで可能な最も近い(d分) と最も遠い(dmax)の磁石間隔を測定します。これらの距離は、最大および最小の達成可能な後荷重を決定します。
注:培養プレートの底部は、マグネットプレートと磁気応答性シリコーンポストとの間の直接接触を防止します。 - 非磁性重みの範囲を生成し、テスト負荷として機能するために文字列上にマウントします。
- 細かいスケールを使用してテスト荷重の重量を決定し、この重量に従ってラベルを付けます。ここでは、30 mgから200mgまでの6種類のアクリルガラス重量を使用した。
注:ポストを曲げるほど重い重みを選択しますが、数ミリメートル以上ポストを曲げるほど重くはありません。テスト負荷の数を多く使用すると、キャリブレーションがより正確になりますが、時間もかかります。 - 磁気応答性のシリコーンポストが水平に向き合うよう、シリコンラックの1つを垂直に(非磁性材料を使用して)取り付けます。
- プレート磁石の1つ(「キャリブレーションマグネット」)を水平に走行する直線段階に取り付け、磁気応答性のポストに軸方向に整列させます。
- キャリブレーションマグネットを水平ステージを使用して磁気応答性シリコーンポストから定義された距離に配置します(好ましくは、後負荷調整装置で達成可能な最大磁石間隔に等しい距離で開始)。
- テスト荷重の影響を受けてポストのたわみを光学的に記録できるように、このセットアップの側面にカメラを配置します (例えば、材料表を参照)。
注:ユーザーは、ポスト偏向の正確な決定を確実にするために、少なくとも2メガピクセルの解像度のカメラを採用することが示唆される。 - 投稿の「ニュートラル」ポジションの基準として使用する重みがない場合は、投稿の写真を撮ります。
- カメラの視点を変えずに、シリコーンポストの一番端に荷重の1つを取り付け、重量の影響を受けてポストベンドの写真を撮ります。
- すべての重みについてこの測定を繰り返します。
- 各重量の重力によって引き起こされるシリコーンポストの偏向を光学的に決定する。
- 各試験重量の重力に対するシリコーンポスト(x、x軸上)の偏向をグラフ化します(mg、y軸上)。これは、力と偏向の間の線形関係をもたらすはずです。
注:データが非線形である場合、これは、ポストが線形偏向の範囲外であることを示している可能性があります。すなわち、利用された重みが重すぎました。 - (0,0) と取得したデータを渡す線形回帰関数をプロットします (例については図 6Aを参照してください)。この関数の傾き(mg = kx)は、テストされた磁石間隔における磁気応答性シリコーンポストの剛性kである。
- d maxとd dminの間の複数の間隔で、これらの手順を繰り返します。ここでは、~31mm~〜5mmの範囲の9つの異なる磁石位置での偏向を解析した。
- 同じ手法を使用して、キャリブレーションマグネットが存在しない場合の磁気応答性シリコーンポストのベース剛性を決定します。
- また、同じ技術を使用して、移動式の非磁気応答制御ポストの剛性を決定します。
- それぞれの磁石距離に対して、結果のk値をプロットします。これは、負の指数関係をもたらすはずです。
- これらの値を使用して回帰関数をプロットします。たとえば、非線形フィットを使用して |解析ソフトウェアの一相減衰機能(材料表を参照)。この回帰関数は、磁石の間隔と後荷重の関係を記述します (例として図 6Bを参照)。
- セットアップで可能な最も近い(d分) と最も遠い(dmax)の磁石間隔を測定します。これらの距離は、最大および最小の達成可能な後荷重を決定します。
2. EHTの生成と文化
注:EHTの生成と文化は、別の記事25で非常に詳細に説明されています。したがって、これらの側面はプロトコルで簡単に説明します。滅菌条件下で、良好な細胞培養の実践に従って以下の手順を実行してください。
-
EHT世代
- 前に準備したシリコンラックを、少なくとも20分間70%エタノールで満たされた容器に浸します。
注意:高温が永久磁石を損傷する可能性があるので、それらを殺菌するために後負荷調節可能なシリコーンポストをオートクレーブしないでください。 - この容器をバイオセーフティキャビネットに入れ、滅菌水でラック2倍をすすいで空気乾燥させます。
注:汚染の可能性を減らすために、このプロセスは後でEhtsをキャストするために使用される同じバイオセーフティキャビネットで行われるべきです。 - 新生児ラット心室細胞またはhiPSC(ヒト誘導多能性幹細胞)由来の心筋細胞(市販品も含む)を取得(および解凍)し、表1に記載のEHT再構成ミックスを調製する。
- 24ウェル培養プレートの左端4ウェルに2%アガロース溶液を1.5mLピペットし、すぐにポリテトラフルオロエチレン(PTFE)スペーサー(材料表を参照)を液体アガロース溶液に挿入します。
- 培養プレート内の残りの20個のウェルについて、前のステップを繰り返します。
- アガロースを10分間固めた後、PTFEスペーサーを慎重に取り外します。
注:アガロースは固まったときに濁ります。 - PTFEスペーサーによって生成されたアガロース空隙に磁気的に敏感なシリコーンラックのポストを挿入します。
- 再構成のピペット100 μLは、100 mU/Lトロンビン溶液の3μLアリコートに混入します。ピペットを2回上下に混合し、培養プレート上の最初のアガロース型内の空隙に素早く混合物を移す。
- 残りの 23 個の金型について、EHT ごとに新しいピペットチップを使用して、前の手順を繰り返します。
注:細胞沈下を防ぐために、6~8 EHTごとに体質ミックスを穏やかに混ぜます。 - 24ウェルプレートをインキュベーター(37°C、7%CO2、40%O2)に90分間保管してください。22その間、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)に10%馬血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10 μg/mLインスリン、33 μg/mLアプロチニンを加えてEHT培地を調製します。
- 各ウェルに500 μLの温かいEHT培地を加えます。
- 24ウェルプレートをインキュベーター(37°C、7%CO2、40%O2)に30分間保管してください。22この間、各ウェルに1.5mLのEHT培地を入れた2つ目の24ウェルプレートを準備し、インキュベーターに入れる。
- マグネットに敏感なシリコンラックを、キャストしたてのEhTをアガロース金型から慎重に取り出し、2番目の24ウェルプレートに移します。
- 前に準備したシリコンラックを、少なくとも20分間70%エタノールで満たされた容器に浸します。
-
EHT文化
注:組織鋳造に続いて、週に3回、月曜日、水曜日、金曜日に培地を交換してください。- 中程度の変化のために、新しい24ウェルの培養プレートに井戸あたり1.5mLの新鮮なEHT培地をピペットし、このプレートを37°C、7%CO2、40%O2で302分間インキュベーター内に置きます。2
- シリコーンラックを古い24ウェルプレートから細胞培養フードの下の新しいプレートに移します。
- 閉じたEHTプレートを37°C、7%CO2、40%O22のインキュベーターに保管してください。
3. 後負荷修正実験
注:以下のプロトコル手順は、材料表に記載されている圧電モータおよび光コントラクト分析プラットフォームに固有のものです。
- 実験用のアフターロードチューニング装置の準備
- EHTの収縮性に対するアフターロード操作の影響を測定するには、光収縮性分析プラットフォームの最も内側のコンパートメントから照明システムを取り外し、光源を含む後負荷調整装置を挿入する。
- 後読み調整装置の実行に使用するコンピューターに、ステージ モーション コントロール ソフトウェア (「表」を参照) をインストールします。
- 圧電ステージモーターをモーションコントローラ(材料表を参照)に接続し、モーションコントローラをコンピュータに接続します。モーションコントローラが電源にも接続されていることを確認します。
注:モーションコントローラの面には2つのライトがあります。電源に接続すると、両方のライトが数秒間赤く点滅します。動作中は、上面のライトは緑色のままで、下のライトはエラーが発生した場合にのみ赤色に変わります。 - アフターロードチューニング装置の上部にあるプレートマウントに空の24ウェル培養プレートを置きます。
- マウントに取り付けられたXYメカニカルドライブシステムを使用して、空の培養プレートを下のマグネットプレートと光学的に整列させます。
- 後負荷調整装置の操作
- モーションコントローラプラットフォームソフトウェアを起動します。
- モーションコントロールソフトウェアのインストール中にステージポートとして指定されたポートを選択して、piezoステージモーターにソフトウェアを接続し、開いているポートボタンをクリックします。
注:この手順を完了すると、ポートは "開く" と指定され、緑色のボックスに表示されます。 - システムパネルに移動します。ループドロップダウンメニューで「ループを開く」を選択します。
- 手動で磁石板を最も高い位置、すなわち最も近い磁石間隔d分に移動する。マグネットプレートは、培養プレートマウントと接触する必要があります。
- モーションパネルに移動します。「ゼロ」ボタンをクリックして、piezo ステージの現在位置を 0 mm にリセットします。
- マグネットプレートを手動で最も低い位置に移動します。エンコーダの位置(Encのモーションパネルに示されている)を書き留めて、圧電ステージモーターの動きの範囲を決定します。
- [システム]パネルの[移動制限]を、前のステップで決定したモーションの範囲内の値に設定します。これにより、マグネットプレートが培養プレートや後荷重調整装置の底面にぶつかるのを防ぎます。
- もう一度、磁石プレートを最高位置に移動し、[ゼロ]ボタンをクリックします。
- システムパネルに移動し、フィードバックループモードを「閉じたループ」に変更します。これにより、ステージの位置決めでエラーが修正されます。
- これらの設定をシステムに保存するには、[パラメータの保存] ボックスの [保存] ボタンをクリックします。
- EEHを含む24ウェル培養プレートを、磁気応答性のシリコーンラックに培養プレートマウントに置きます。
- 希望の後荷重を達成するために必要な磁石間隔を計算するには、磁石間隔パラメータ d のステップ 1.3.19 から非線形回帰関数を解きます。たとえば、式が:
の場合: d は、mN/mm で必要な後荷重kを達成するために必要な磁石間隔 (mm) であり、5 mN/mm の後荷重を実現するには 12.12 mm の磁石間隔が必要になります。 - 計算された磁石間隔から d 分を差し引く d.結果は、磁石プレートが望ましい後荷重を達成するためにゼロ位置から移動する距離です。
- この値をモーションパネルのターゲットポジション1入力フィールドに入力し、「移動」をクリックして、計算値に合わせて EHT'の後荷重を調整します。
- オプション: インターバル後ロード計画のステージのプログラミング
注:前のセクションでは、1 つの位置に移動して、1 つの位置に留まるステージをプログラムする方法について説明します。しかし、連続ループで繰り返されるモーションシーケンスを自動的に実行するために、異なるコマンドをプログラムに連鎖させることも可能です。モーションコントローラプラットフォームソフトウェアに関する詳細な手順については、ステージメーカーが提供する取扱説明書を参照してください。- 前のセクションで説明したように、後負荷調整装置をセットアップした後、コマンドパネルを開きます。コマンド1PGM1を入力し、Enterキーを押してプログラムの記録を開始します。
- 例えば、圧電ステージがゼロ位置から30mm下がり(EHTから離れて)、40s以降に戻るプログラムを作成するには、次のコマンドチェーンを入力します:1MVA30 → 1WST → 1WTM40000 → 1MVA00 → 1WST
- コマンド1ENDを使用して、プログラムの記録を終了し、保存します。
- コマンド1EXC1を使用して、記録されたプログラムを実行します。
- 連続ループでプログラムを実行し続けるには、1PGL1と入力し、その後に1EXC1コマンドを続けます。
- ループするプログラムを終了するには、コマンド1ESTを入力します。
注: 表 2には、後荷重変更実験に役立つコマンドがいくつか含まれています。このシステムで利用可能なコマンドの完全なリストは、モジュラーモーション制御システムのリファレンスマニュアルにあります。
の場合: d は、mN/mm で必要な後荷重kを達成するために必要な磁石間隔 (mm) であり、5 mN/mm の後荷重を実現するには 12.12 mm の磁石間隔が必要になります。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
磁石ポスト剛性定量
水平指向の磁気応答性シリコーンポストを固定位置に取り付け、このポストからいくつかの定義された距離(「磁石間隔」)に軸方向に整列したキャリブレーションマグネットを配置しました。既知の重量のテスト負荷は、シリコーンポストの端から懸濁され、ポストが曲がった。このたわみは光学的に定量した。試験負荷の重力と結果として生じるポスト偏向との間の線形関係が、すべての磁石間隔で観測された(図6A)。これらの線形関係から得られる剛性の値は、磁石の間隔が増加する負の指数傾向に続いた(図6B)。
段階的な後負荷増加
ラット心臓から生成された制御および磁気応答性EHT(MR-EHT)は、収縮力の高原に達するまで、磁気後負荷(対照組織の場合は0.6 mN/mm、MR-EHTの場合は0.91 mN/mm)の不存在下で培養した。この日(EHT鋳造後24日)、MR-EHTとコントロールEhTは同様の平均力(0.29 mN対0.22 mN)を有していた。次の週に、MR-Ehtに加えられた後負荷は0.91から6.85 mN/mmに段階的に増加し、制御Ehtの後負荷は一定のままでした。平均収縮力は、最大0.95mNの後負荷の増加に伴って増加し、これは対照EhTsのために測定された平均値(0.29 mN)と比較して3倍以上の力の増加を示す(図7A)。一方、ポスト偏向は、対照組織に比べて減少した。培養最終日に、MR-EhTの平均たわみは、コントロールEhTの0.48mmに比べてわずか0.11mmであった(図7B)。27日目から、25~28日の間に一時的な作業増加があった一方で、MR-EHTでは力生産率と強制減衰率が制御EhTよりも高かった(補足図2)。
インターバル後負荷レジメン
磁気応答性シリコーンポスト(MR-EHT)上のラットEhTは、収縮力の高原に達するまで0.91mN/mmの最小後負荷で培養した。この日(EHT鋳造後17日)以降、MR-EhTは7日間の後負荷レジメンを受け、0.91と6.85 mN/mmの間で交互に行われる後負荷のサイクルにEHTを曝露した(図8A)。制御EhTの後負荷は、培養の全期間にわたって0.60 mN/mmで一定に保たれた。この介入の後、MR-Ehtの平均力は17日目に比べて12.0%増加したが、制御EhTで測定されたものは同じ時間枠で1.5%しか増加しなかった(図8B)。しかし、これらの違いは統計的に有意ではなかった。また、力の生産率、力の減衰率および収縮作業に有意な差は測定されなかった(補足図3)。これは、選択された後負荷レジメンがEHT収縮性を高める効率的な手段ではないことを意味する。
図1:磁気応答性のシリコーンラックを組み立てた。(A)直交図と(B)5つの磁石を含む組み立てられた磁気応答性シリコーンラックの断面図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マグネットプレートマグネットプレートとその取り付けブラケットの写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:機械駆動システムマグネットプレートに対して24ウェルプレートの水平位置を調整するために用いられるメカニカルドライブのシステムを示す写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:LEDプレート。光収縮性分析のためにEHTを照らすのに使用されるLEDプレートの写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:完全に組み立てられた後負荷調整装置。LEDプレートを含む完全に組み立てられたアフターロード調整装置の写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ポスト剛性の光学的決定。(A)外部キャリブレーション磁石の存在下で、かつ5つの試験重量の影響下で磁気応答性シリコーンポストのたわみが、9つの決定された磁石間隔で評価された(例として5つ)。(B)磁石の間隔と後剛性の関係を決定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:後負荷の段階的増加に対するEHTの収縮応答。31日間の培養期間にわたって磁気応答性ポスト(MR-EHT;青線)で培養されたコントロールEhT(黒線)およびEHTの収縮測定。(A) MR-EHTはベースライン条件下での制御EhTよりもわずかに高い平均収縮力を有していた。しかし、25日目から、この差は後負荷の増加に伴って増幅された。(B) ポスト偏向は27日目まで両群間で類似していた。過去の後荷重値は3.5 mN/mmで、MR-Ehtのポスト偏向は大幅に低下した。ここで、n = 10 MR-EhTおよびn=10制御EhTsは混合モデル(REML =制限された極度尤度)とシダックの多重比較検定を適合させることによって分析した。グラフの誤差範囲は、平均の標準誤差を表します, ** p < 0.01, *** p < 0.001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: AT の期間後ロード プロトコルに対する契約応答後負荷の変動レジメンの影響下での磁気応答性ETの収縮挙動が観察された。(A) 17日目(d17)に開始された後負荷レジメンは、MR-EHTを最小後負荷(0.91 mM/mm)の40 s間隔に曝し、その後に7日間最大後荷重(6.85 mN/mm)の間隔を40ミリにした。(B)MR-EHT(青いバー)は、制御EhT(黒いバー)のために測定された力は比較的変わらない一方で、インターバル後負荷プロトコル中に力を増加させる傾向を示した。Bこれらの実験では、n = 10 Ehtsをグループごとに分析し、このデータを2ウェイANOVAとシダックの多重比較検定を用いて統計的に比較した。グラフの誤差範囲は平均の標準誤差を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 1 ラット EHT | 24 ラット EhT (+10%) | 1 ハイプス-CM EHT | 24 ハイプスCM EhT (+10%) | コンポーネント | |
| 5 x 105 | 1.3 x 107 | 1 x 106 | 2.6 x 107 | 細胞(新生児ラット心室細胞またはhiPSC由来心筋細胞のいずれか) | |
| 5.57 μL | 147 μL | 5.57 μL | 147 μL | 2x DMEM:20%熱不活性化馬血清、20%10x DMEM、2%ペニシリン/ストレプトマイシン、58%アクアアドイニエスタビリア | |
| 2.53 μL | 66.8 μL | 2.53 μL | 66.8 μL | フィブリノーゲン:200 mg/mL フィブリノーゲン 0.9% NaCl に溶解 | |
| - | - | 0.1 μL | 2.64 μL | Y-27632 | |
| 広告 100 μL | 広告 2640 μL | 広告 100 μL | 広告 2640 μL | EHT鋳造媒体:88%DMEM、10%熱不活性化胎児の子牛血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%L-グルタミン | |
表1:EHTを生成するための再構成ミックス
| コマンド名 | 構文 | 説明 | |
| 絶対移動 | 1MVA[x] | ステージは、mm の位置 [x] に移動します。 | |
| 速度の設定 | 1VEL[x] | ステージの移動速度を [x] に設定する (mm/s) | |
| 緊急停止 | 1EST | 動きを止める | |
| 停止を待つ | 1WST | プログラムの記録中のみ。次のコマンドを実行する前に、前の移動コマンドが完了するまで待機します。 | |
| 期間を待機する | 1WTM[x] | プログラムの記録中のみ。ms 単位で期間 [x] を待機する | |
| 開始プログラムの記録 | 1PGM[x] | スロット [x] でプログラムの記録を開始します。注: スロット [x] は空いている必要があります | |
| プログラム記録の終了 | 1end | プログラムの記録を終了し、プログラムを保存する | |
| プログラムを消去する | 1ERA[x] | スロットに保存された消去プログラム [x] | |
| プログラムの実行 | 1EXC[x] | スロット [x] に保存されたプログラムを実行します。 | |
| ループプログラム | 1PGL[x] | [x]=1 プログラム ループ モード ON [x]=0 プログラム ループ モードがオフ | |
| 読み取りエラーとクリア エラー | 1ERR? | 要求エラー レポート | |
表2:後負荷チューニング実験に役立つコマンド
補足図1:シリコンラックの寸法(A) トップビュー、(B)断面側図、および(C)これらの研究に使用されるシリコンラックの詳細なポストビュー。こちらをダウンロードしてください。
補助図2:段階的な後荷重増加のための収縮パラメータの追加31日間の培養期間にわたって磁気応答性ポスト(MR-EHT;青線)で培養されたコントロールEhT(黒線)およびEHTの収縮測定。(A)MR-EhTは27日目から制御EhTよりも著しく高い力生産率を有していた。(B) MR-EHTでは、27日目以降の制御よりも力の減衰率も有意に高かった。(C) 制御EhTで測定された契約作業は培養期間全体で徐々に増加したが、MR-EHTsが生産する収縮期の仕事は26日目にピークを迎え、その後は制御下のレベルまで低下した。しかし、MR-EHTの仕事は、コントロールEhTの仕事よりも有意に高くはありませんでした。ここで、n = 10 MR-EhTおよびn=10制御EhTsは混合モデル(REML =制限された極度尤度)とシダックの多重比較検定を適合させることによって分析した。グラフの誤差範囲は、平均値 * p < 0.05、 *** p < 0.001 の標準誤差を表します。こちらをダウンロードしてください。
補足図 3: インターバル後ロードプロトコルの追加の収縮パラメータ。後負荷の変動レジメンの影響を受けた磁気応答性EhT(MR-EHT)の収縮挙動が観察された。(A) 時間経過プロトコルの間に、MR EhT(青いバー)は当初、コントロールEhT(黒いバー)と比較して高い力生産率に向けた傾向を示したが、これらの違いは有意ではなく、実験の終わりに向かって減少した。(B) MR-EhTsと制御Ehtsで測定された強制減衰率は、インターバル後負荷プロトコル全体で統計的に類似していた。(C) MR-EhT の契約作業は、後負荷間隔プロトコルの最初の日に増加したが、最終日に減少した。制御EhTのために測定された契約作業は、この期間中に顕著に変化しませんでした。MR-EHTでの作業は、制御Ehtの仕事よりも有意に高くなることはありませんでした。これらの実験では、n=10 ANOVAとシダックの多重比較検定により、1群当たり10個のEHTを分析した。グラフの誤差範囲は平均の標準誤差を表します。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
本明細書で概説されるプロトコルは、工学的心臓組織における後荷重を磁気的に変化させる新しい技術を説明する。この技術は、圧電ステージを使用して、シリコンポストの磁気応答性ラックに向かって、または離れた強力な磁石のプレートを翻訳することに依存しています。2組の磁石が近いほど、Ehtが培養した後荷が強くなります。
このシステムの正常な生産と使用に不可欠ないくつかのステップがあります。磁気応答性のシリコーンラックを製造する際には、支柱内のすべての磁石が同じ極性を持つようにすることが非常に重要です。逆向きに磁石を置くと、磁場の強度を高めるのではなく、弱くなる役割を果たします。同様に、この極性は磁石板内のすべての磁石のそれと一致する必要があり、そうでなければ、磁石の2つのセットは互いに引き付けるのではなく、反発します。また、可能な限り、磁界に干渉する可能性があるため、後負荷調整装置の構築時に磁気材料を使用することは控えます。アルミニウムは、このような理由のための主要な建設材料として提案されています。同様に、材料表に記載されているもの以外の圧電ステージを使用する場合は、磁場や標準的な細胞培養条件(例えば、37°C、湿度100%、高CO2およびO2-濃度)に対して耐性を確保してください。2最後に、ほとんどの圧電線形段階は、負荷容量が低い傾向があるため、水平に取り付けられることを意味します。そのため、マグネットプレートの重量がこの負荷容量を超える場合は、モーターをアンロードするためにカウンターウェイトを使用する必要があります。
ベスト プラクティスにもかかわらず、エンコーダーの表面をそのままにしておくことは非常に困難です。この場合、ステージはクローズド・ループ・モードで実行すると、ターゲット位置に到達する前に移動を停止します。モーションコントローラの赤いLEDが点滅し、モーションコントローラソフトウェアに「エンコーダが検出されていません」というエラーメッセージが表示されます。これを改善するために、ユーザーはイソプロピルアルコールに浸した糸くずのない布でエンコーダの表面をきれいにし、空気を乾燥させる必要があります。
このプロトコルは、このシステムを作成して実装するために私たちの研究室が取った手順を示しています。しかし、これらのステップのいくつかは、異なる手段によって達成することができます。たとえば、光の平均ではなく力変換器を使用して、磁石の間隔と後剛性の関係を確認できます。さらに、カスタム投稿は、埋め込み磁石とブレースで設計され、製造することができます。しかし、これらのオブジェクトの正確な配置は手動で行う方が簡単であることがわかりました。このシステムによって適用される残荷重の範囲を微調整するために、これらのポストは異なる基底剛性または異なる数の磁石で製造することができる。しかし、あまりにも多くの磁石を使用すると、ポスト曲げを妨げるでしょう。あるいは、磁石板内の磁石のサイズや強度を調整することでも実現できる。より大きく、より強い磁石はより高い後荷をもたらす。
この方法には、このシステムの将来のバージョンで改善される可能性のあるいくつかの制限があります。すなわち、適用可能な後荷重の範囲は、ポスト磁石とプレート磁石の間の最大および最小間隔によって物理的に制限される。理想的には、このシステムに使用されるポストは、組織がプレートの底部に直接触れることを許すことなく、組織培養皿のベースにできるだけ近い組織を配置するであろう。しかし、これらの研究で使用された投稿は、このシステムの開発前に商業的に行われたので、ポストの長さは、このプラットフォームのために最適化されていませんでした。同様に、EHT収縮性分析システムはこのシステムより前に構築されていたので、測定空間の中または外の電気コードを可能にするようには設計されていませんでした。したがって、これらのコードの存在は、ガスがゆっくりと内側のチャンバーから漏れることを可能にする小さなエアギャップをもたらしました。これは、それに応じてガスの流量を調整することによって改善することができます。しかし、理想的には、このシステムの将来の実施形態は、これらのコードの出口とエントリポイントを絶縁しているであろう。EHT収縮性分析システムがない場合にこれらの実験を行いたい場合、後負荷調整プラットフォームをインキュベーター内に配置することができます。しかし、システム全体は、1つ以上の棚が取り除かれた場合にのみ標準的なインキュベーター内に収まり、このスペースは他の細胞および組織培養の目的では利用できなくなります。いずれの環境でも組織を光学的に観察するには、ライトが必要です。このシステムに使用されるLEDライトは、かなりの熱を放つことがわかりました。長期間放置すると、この熱が組織に損傷を与える可能性があります。したがって、これらの研究のために、ライトは組織の収縮性を評価しながら、短期間だけ使用された。しかし、一貫して組織を観察したい場合は、照明システムは、これらの目的のために最適化する必要があります。
後負荷は、以前EHTモデル16、23,23で研究されています。しかし、これらの作品は、負荷の単数静的増加を達成するだけの技術を提示しました。あるいは、この研究は、磁気ベースのプラットフォームを使用して、Ehtsの後負荷を微調整し、時間的に調節する方法を実証しました。2つの別々の実験セットの結果は、この装置を使用してEhtに適用できる広範な後負荷レジメンを例示するために使用された。このシステムの将来の将来の用途には、適用された後負荷レジメン(用量および持続時間)が組織成熟および病理学的リモデリングの両方に及ぼす影響に関する研究が含まれる。
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Disclosures
TEとMNHはEHTテクノロジーズ社の共同創設者です。他のすべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、組織培養作業におけるジュッタ・スターバティの支援、写真のためのアクセル・キルヒホフ、編集作業のためのアリス・カサグランデ・セスコネット、そしてこの装置の開発における技術支援のためのビュレント・アクセヒリリオグルへの特別な感謝に感謝する。B.B.は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)スカラーグラント、M.L.R.によってウィテカー国際博士研究員グラントとM.N.H.によってDZHKからの資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d = 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
References
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