Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Магнитная регулировка Afterload в инженерных тканях сердца

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60811
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute of Experimental Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research)
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол содержит подробные методы, описывающие изготовление и внедрение магнитной платформы посленагрузки для инженерных тканей сердца.

Abstract

После нагрузки, как известно, диск развития как физиологических, так и патологических сердечных состояний. Таким образом, изучение результатов измененных состояний послегруза может дать важное представление о механизмах, контролирующих эти критические процессы. Тем не менее, экспериментальный метод для точной тонкой настройки afterload в ткани сердца с течением времени в настоящее время отсутствует. Здесь описана недавно разработанная методика на основе магнитных технологий для достижения этого контроля в инженерных сердечных тканях (EHT). Для получения магнитно отзывчивых ЭГТ (MR-EHT), ткани устанавливаются на полые силиконовые столбы, некоторые из которых содержат небольшие постоянные магниты. Второй набор постоянных магнитов является пресс-вписываются в акриловую пластину, так что они ориентированы с той же полярности и аксиально выровнены с пост магнитов. Для регулировки послегруза, эта пластина магнитов переводится в сторону (более высокая посленагрузка) или прочь (нижняя посленагрузка) от почтовых магнитов с помощью пьезоэлектрической стадии, оснащенной кодером. Программное обеспечение для управления движением, используемое для регулировки позиционирования стадии, позволяет развивать пользовательские схемы посленагруза, в то время как кодировщик гарантирует, что этап корректирует любые несоответствия в своем местоположении. Эта работа описывает изготовление, калибровку и внедрение этой системы, чтобы позволить разработку подобных платформ в других лабораториях по всему миру. Репрезентативные результаты двух отдельных экспериментов включены для примера спектра различных исследований, которые могут быть выполнены с помощью этой системы.

Introduction

После нагрузки систолическая нагрузка на желудочек после того, как он начал выбрасывать кровь1. Во время сердечного развития, соответствующие посленагрузка имеет решающее значение для кардиомиоцитов созревания2. В зрелом возрасте низкий уровень желудочковой послегрузки (например, у прикованных к постели пациентов с травмой спинного мозга высокого уровня3 или в особых случаях, таких как космический полет4)может привести к гипотрофии сердца. И наоборот, высокая послегрузка может привести к сердечной гипертрофии5. В то время как сердечная гипертрофия у спортсменов на выносливость или беременных женщин считается полезной и физиологической, гипертрофия, связанная с длительной артериальной гипертензией или тяжелой стенозом аортального клапана, вредна, так как предрасполагает к сердечной аритмии и сердечной недостаточности6. Хотя 5-летняя смертность пациентов с сердечной недостаточностью снизилась с 70% в 1980-х годах6 до 40-50%7 в настоящее время, по-прежнему существует большая потребность в новых вариантах терапевтического лечения для этого весьма распространенного состояния (в настоящее время 2,2% населения в западном мире)8.

Для изучения молекулярных механизмов патологической сердечной гипертрофии и тестирования профилактических или терапевтических стратегий лечения этого заболевания были разработаныinvivo модели послегруза9,10,,11,,12. Хотя эти модели дали полезную информацию о воздействии послегруза на производительность желудочков, они не позволяют тонко контролировать величину послегруза. Кроме того, исследования in vitro посленагрузки, выполненные на вырезанных сердцах и мышечных препаратах, позволяют более тонко контролировать загрузку тканей, но эти модели не способствуют продольным исследованиям13,,14,15.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали в пробирке модель повышенной afterload в инженерных сердечных тканей (EHTs)16,17. Эта модель представляет собой трехмерный формат культуры для клеток сердца крыс, встроенных в фибрин матрицы приостановлено между гибкими полыми силиконовыми столбами. Эти ткани бьются спонтанно (против сопротивления силиконовых столбов) и выполняют вспомогательную работу. Мы увеличили послегрузование применяется к EHTs в 12 раз в предыдущих экспериментах по вставке жестких металлических скобки в полые силиконовые столбы в течение одной недели. Это привело к множеству изменений, характерных для патологической сердечной гипертрофии18,,19,,20: кардиомиоцитной гипертрофии, частичного некропкоза, снижения сократительной силы, нарушения релаксации тканей, реактивации программы генов плода, метаболического перехода от окисления жирных кислот к анаэробному гликолиззу, а также к увеличению инфиколита. Хотя эта процедура была успешно использована в нескольких исследованиях17,21,22, она имеет некоторые недостатки. Есть только два состояния, низкие или очень высокие (12-кратная) послегруза, и процедура требует ручного обращения с EHTs, что ограничивает его временную гибкость и создает риск загрязнения.

В последнее время, Леонард и др. использовали аналогичную технику модулировать afterload в EHTs культивируется на силиконовые должности23. Брекеты различной длины были размещены вокруг внешней части столбов, чтобы ограничить их изгиб движения. Авторы этого исследования сообщили, что сингулярный малый и средний увеличение нагрузки повышенной силовой разработки и созревания человека iPS полученных EHTs, в то время как более высокие нагрузки привели к патологическому состоянию. Однако, подобно нашей собственной системе, этот метод позволяет только сингулярное увеличение послегруза, величина которой продиктована длиной скобки. Таким образом, тонкие изменения в послегрузке, изменения в послегрузке с течением времени, и точные схемы загрузки невозможны с этими методами.

Здесь мы предоставляем протокол для системы, которая может быть использована для модулирования пост-сопротивления, т.е. послезагрузки EHTs магнитно24. Эта платформа облегчает тонкую настройку послегруза, позволяет определяться пользователями схемпослезагрузки и обеспечивает стерильность EHT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка тюнинг-платформы Afterload

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, участвующие в этой части протокола, не являются чувствительными к времени.

  1. Производство магнитно отзывчивых силиконовых стеллажей
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Эти стеллажи служат культурной платформой для EHT. Каждый EHT приостанавливается между двумя силиконовыми столбами, которые прививаются после загрузки ткани. Степень послегруза напрямую связана с жесткостью этих должностей. Для включения магнитной настройки посленагрузки некоторые столбы должны быть магнитно отзывчивыми.
    1. Приобретите 24-хорошую пластину совместимые стойки силиконовых столбов (размеры, приведенные в дополнительной рисунке 1). Стойки, используемые в этом исследовании, были произведены коммерческим поставщиком силиконовых товаров в соответствии с этими размерами с использованием силикона с береговой твердостью 40.
    2. Определите полярность почтовых магнитов (например, д 0,5 мм, ч 2,0 мм; см. Таблицу Материалов), поместив их на более крупный постоянный магнит.
    3. Сохраняя фиксированную полярность, смазайте магниты водой и вставьте их по одному в внешние столбы силиконовых стеллажей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы попытаетесь вставить более одного магнита за один раз, дополнительное сопротивление сделает его более трудным, чтобы нажать магниты в нижней части поста.
    4. Используйте притупленный кусок зубной проволоки из нержавеющей стали (d - 0,4 мм, см. Таблица материалов),чтобы осторожно подтолкнуть их к нижней части полой полости столба. Вы можете стек до пяти магнитов в каждом сообщении.
    5. Используйте (круглый нос) плоскогубцы, чтобы согнуть зубную проволоку из нержавеющей стали (d ' 0,4 мм, см. Таблица материалов) в скобки 11,25 мм в ширину и 15 мм в длину. Используйте проволочные резцы, чтобы сократить скобки и файл, чтобы сгладить поверхность резки. Для обеспечения правильных размеров достигается, можно использовать самодельные джиг, чтобы помочь в изгибе провода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пост иммобилизация также может быть достигнуто с помощью скобки из других материалов, до тех пор, пока они немагнитные и жесткие.
    6. Смазать скобки с водой и вставить их в силиконовую стойку, фиксируя второй- и третий до внешнего поста в этом процессе (см. Рисунок 1 для полной установки силиконовой стойки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, для того, чтобы адаптировать базовую жесткость контрольных постов в соответствии с магнитно отзывчивыми столбами, фрагменты стирола круглого стержня (см. Таблица материалов)могут быть вставлены в пустые столбы (те, без скобки или магнита).
    7. Пусть стеллажи стоять в течение 1-2 дней, чтобы для любой оставшейся воды в сухой воздух.
    8. Когда столбы сухие, печать отверстия в верхней части полых силиконовых столбов, содержащих магниты с помощью капли силиконового клея.
  2. Настройка посленагрузки
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Как магниты в послегрузо-тюнинг овтернинг устройство перемещается к или от тех, в силиконовых должностей, привлекательные магнитные силы увеличиваются или уменьшаются соответственно, в результате изменения жесткости силиконовых столбов. Это движение достигается с помощью пьезоэлектрической стадии. Из-за прототипа послегрузного тюнингового устройства подробные пошаговые инструкции о том, как его реплицировать, предоставляться не будут. Вместо этого, обобщенные руководящие принципы для построения аналогичного устройства настройки послегруза подробно описаны в настоящем.
    1. Получить высокоточный пьезоэлектрический линейный двигатель, чтобы вертикальный перевод магнитной пластины к и от EHTs (см. Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы этот двигатель был оснащен линейным кодером для коррекции для позиционирования сценического.
    2. Расположите набор постоянных магнитов внутри немагнитного держателя таким образом, чтобы они адышно выровнены с почтовыми магнитами при размещении непосредственно под ними. Здесь крупные цилиндрические магниты (d - 13 мм, ч 14 мм; см. Таблица материалов)были пресс-подтянуты в акриловой пластиковой пластине ("магнитная пластина").
    3. Прикрепите держатель магнита к пьезоэлектрической стадии с помощью немагнитного материала. Это может быть достигнуто с помощью L-образного куска алюминия (см. рисунок 2).
    4. Постройте раму, в ней могут разместиться компоненты прибора после загрузки. Как минимум, эта структура должна иметь место, на котором вертикально смонтировать пьезоэлектрическую сцену, а также жесткую раму, на которой можно разместить 24-ну колодую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что расположение этого крепления может быть изменяемым в горизонтальной плоскости, с тем чтобы обеспечить корректировку осевого выравнивания между двумя наборами магнитов. Для достижения этой маневренности в представленной системе(рисунок 3)использовалась система механических приводов. Описанное здесь устройство настройки послегрузо-загрузки было разработано таким образом, чтобы быть совместимым с системой анализа контрактности EHT (см. Таблица материалов). Таким образом, его размеры были ограничены до 29 см в ширину, 29 см в глубину, и 16 см в высоту, чтобы поместиться в эту систему.
    5. Для визуального анализа тканей установите источник света в приборе послезагрузки. Здесь, массив светодиодов был использован (Рисунок 4) для освещения EHTs снизу (Рисунок 5).
  3. Калибровка системы настройки послегрузо-загрузки
    Примечание:    Для точного увеличения Послегруза EHT до желаемого значения необходимо определить взаимосвязь между интервалом между магнитом и результирующей жесткостью поста.
    1. Измерьте ближайший(dмин)и самый дальний(dmax)интервал магнита возможно в вашей установке. Эти расстояния будут диктовать максимальные и минимальные достижимые послегрузы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дно культуры пластины предотвратит прямой контакт между магнитной пластиной и магнитно отзывчивыми силиконовыми столбами.
    2. Производить диапазон немагнитных весов и смонтировать их на строку, чтобы служить в качестве испытательных нагрузок.
    3. Определите вес тестовых нагрузок с помощью тонкой шкалы и маркируйте их в соответствии с этим весом. Здесь были использованы шесть различных акриловых стеклянных весов в диапазоне от 30 мг до 200 мг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите весы, которые достаточно тяжелы, чтобы согнуть пост, но не настолько тяжелым, что они согнуть пост более чем на несколько миллиметров. Использование большего количества тестовых нагрузок гарантирует более точное калибровку, но также отнимает больше времени.
    4. Смонтировать одну из силиконовых стеллажей вертикально (с использованием немагнитных материалов), так что магнитно отзывчивые силиконовые столбы ориентированы горизонтально.
    5. Установите один из магнитов пластины ("калибровочный магнит") на горизонтально путешествующей линейной стадии таким образом, чтобы он аксиально выровнен с магнитно отзывчивым столбом.
    6. Расположите калибровочный магнит на определенном расстоянии от магнитно отзывчивого силиконового столба с помощью горизонтальной стадии (желательно, начните на расстоянии, равном максимальному интервалу магнитного интервала, достижимому устройством настройки посленагрузки).
    7. Поместите камеру (например, см. Таблица Материалов) в сторону этой настройки, чтобы иметь возможность оптически записывать отклонение поста под влиянием тестовых нагрузок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается, чтобы пользователь использовал камеру с разрешением не менее 2 мегапикселей для обеспечения точного определения отклонения поста.
    8. Сфотографировать сообщение в отсутствие каких-либо весов для использования в качестве ссылки на "нейтральную" позицию поста.
    9. Не изменяя перспективу камеры, прикрепите одну из нагрузок к самому концу силиконового столба и сфотографировать столб изгиб ампенсинга под влиянием веса.
    10. Повторите это измерение для всех весов.
    11. Оптически определить отклонение силиконового столба, вызванного гравитационной силой каждого веса.
    12. График отклонения силиконовой должности(x, на x-оси) против гравитационных сил каждого испытательного веса(мг, на оси y). Это должно привести к линейной взаимосвязи между силой и отклонением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если данные нелинейны, это может означать, что сообщение находится за пределами линейного диапазона отклонений, т.е. использованные веса были слишком тяжелыми.
    13. Участок линейной функции регрессии, проходя через (0,0) и приобретенные данные (см. рисунок 6A для примеров). Склон этой функции(мг и ккс)является жесткость k магнитно отзывчивый силиконовый столб на испытанном интервале магнита.
    14. Повторите эти шаги на нескольких интервалах между dмакс и dмин. Здесь были проанализированы отклонения в девяти различных позициях магнита в диапазоне от 31 мм до 5 мм.
    15. Определите базовую жесткость магнитно отзывчивого силиконового столба при отсутствии калибровочным магнита с использованием той же техники.
    16. Также определить жесткость мобильного, немагнитно отзывчивый контрольный пост с использованием той же техники.
    17. Участок результирующих значений k на соответствующих магнитных расстояниях. Это должно привести к негативным экспоненциальным отношениям.
    18. Участок функции регрессии через эти значения. Например, используйте нелинейный подгонка Функция однофазного распада в программном обеспечении анализа (см. Таблицу материалов). Эта функция регрессии описывает связь между интервалом между магнитом и послегрузом (см. рисунок 6B для примера).

2. Поколение и культура EHT

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение и культура EHT подробно описаны в другой статье25. Поэтому мы рассмотрим эти аспекты лишь кратко в нашем протоколе. Пожалуйста, выполните следующие шаги в стерильных условиях, придерживаясь хороших методов клеточной культуры.

  1. Поколение EHT
    1. Погрузите ранее подготовленные силиконовые стеллажи в контейнер, наполненный 70% этанолом в течение не менее 20 мин.
      ПРЕДЕКТО: Не автоклавировать после нагрузки регулируемые силиконовые столбы, чтобы стерилизовать их, как высокие температуры могут повредить постоянные магниты.
    2. Принесите этот контейнер в шкаф биобезопасности, промойте стойки 2x стерильной водой, и дайте им высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения вероятности заражения этот процесс должен осуществляться в том же кабинете биобезопасности, который впоследствии будет использоваться для отливки ЭГТ.
    3. Приобрести (и оттепели, если это необходимо) неонатальной крысы сердце желудочковых клеток или hiPSC (человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) полученных кардиомиоцитов (также коммерчески доступны) и подготовить EHT восстановления смеси в соответствии с таблицей 1.
    4. Пипетка 1,5 мл теплого 2% агарозного раствора в левые 4 скважины 24-хорошо культурной пластины и сразу же вставьте прокладку политетрафторэтилена (PTFE) (см. Таблица материалов) в жидкий раствор агарозы.
    5. Повторите предыдущий шаг для остальных 20 скважин в пределах культурной плиты.
    6. После того, как агароуз затвердеть в течение 10 минут, тщательно удалите прокладки PTFE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агароза становится мутной, когда она затвердевается.
    7. Вставьте столбы магнитно чувствительных силиконовых стеллажей в агарозные пустоты, производимые прокладками PTFE.
    8. Пипетка 100 л реконституции смешивается в 3 мЛ аликот 100 мУ/л тромбина раствора. Пипетка вверх и вниз дважды, чтобы смешать и быстро передать смесь в пустоту в течение первой формы агарозы на культуре пластины.
    9. Повторите предыдущий шаг для остальных 23 форм, используя новый наконечник трубы для каждого EHT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно перемешать конституцию смесь каждые 6-8 EHTs для того, чтобы предотвратить отложения клеток.
    10. Храните 24-хорошую тарелку в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 7% CO2,40% O2) в течение 90 мин. В то же время, подготовить среду EHT путем дополнения Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) с 10% лошади сыворотки, 1% пенициллин / стрептомицин, 10 мкг /мл инсулина и 33 мкг /мл апротинин.
    11. Добавьте 500 л теплой среды EHT к каждой скважине.
    12. Храните 24-хорошую тарелку в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 7% CO2,40% O2) в течение 30 мин. В течение этого времени, подготовить второй 24-хорошо пластины с 1,5 мл EHT среды в каждой скважине и поместить его в инкубатор.
    13. Аккуратно удалите магниточувствительные силиконовые стеллажи со свежевылитыми EHT на них из агарозных форм и перенесите их на вторую 24-ну колодую пластину.
  2. Культура EHT
    ПРИМЕЧАНИЕ:     После литья ткани, изменить среду три раза в неделю: в понедельник, среду и пятницу.
    1. Для среднего изменения, pipet 1.5 ml свежей среды EHT в наилучшим образом в новую плиту культуры 24-наилучшим образом и уместите эту плиту внутри инкубатор на 37 c, 7% CO2,и 40% O2 на хотя бы 30 минут.
    2. Перенесите силиконовые стеллажи со старой 24-хорошей пластины на новую пластину под капотом клеточной культуры.
    3. Храните закрытые пластины EHT в инкубаторе при 37 градусах По цельсии, 7% CO2и 40% O2.

3. Эксперименты модификации послегрузо-нагрузки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы протокола специфичны для пьезоэлектрической двигательной и оптической платформы анализа контрактности, перечисленных в таблице материалов.

  1. Подготовка прибора послезагрузки для экспериментов
    1. Для измерения воздействия послегрузо-нагрузочных манипуляций на контрактность EHT, отключения и удаления системы освещения из внутреннего отсека платформы анализа оптической контрактности и вставки устройства послегрузо-емкости, включая источник света.
    2. Установите программное обеспечение управления движением сцены (см. Таблица материалов) на компьютере, который будет использоваться для запуска устройства настройки после загрузки.
    3. Подключите пьезоэлектрический сценический двигатель к контроллеру движения (см. Таблицу Материалов),и контроллер движения к компьютеру. Убедитесь, что контроллер движения также подключен к источнику питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два света на лице контроллера движения. При подключении к власти, оба огня мигают красным цветом в течение нескольких секунд. Во время работы верхний свет остается зеленым, в то время как нижний должен покраснеть только в случае ошибки.
    4. Поместите пустую 24-хорошую культурную пластину на плите крепления в верхней части посленагрузки настройки устройства.
    5. Оптически выровнять пустую культурную пластину с магнитной пластиной ниже с помощью системы механического привода XY, прикрепленной к креплению.
  2. Эксплуатация устройства после загрузки-тюнинга
    1. Запустите программное обеспечение платформы контроллера движения.
    2. Подключите программное обеспечение к пьезо этап двигателя, выбрав порт, назначенный в качестве порта этап во время установки программного обеспечения управления движением, а затем нажмите кнопку открытого порта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этого шага порт должен быть обозначен как "открытый" и отображаться в зеленом поле.
    3. Перейдите к панели Системы. Выберите Open Loop в меню выпадения петли.
    4. Ручно перемещайте магнитную пластину в самое высокое положение, т.е. на максимально близкое расстояние между магнитом dмин. Магнитная пластина должна ввести контакт с культурой пластины крепления.
    5. Перейти к движению панели. Нажмите кнопку «Зеро», чтобы сбросить текущее положение стадии пьезо до 0 мм.
    6. Вручную переместите магнитную пластину в самое низкое положение. Запишите положение кодера (указано в панели движения Enc), чтобы определить диапазон движения для пьезоэлектрического двигателя стадии.
    7. Установите ограничения движения в панели Системы на значения в пределах диапазона движения, определяемого на предыдущем этапе. Это предотвращает натыкаясь на магнитную пластину в культурную пластину или в нижней части прибора настройки после нагрузки.
    8. Еще раз переместите магнитную пластину в самое высокое положение и нажмите кнопку «Ноль».
    9. Перейдите к панели системы и измените режим обратной связи на замкнутый цикл. Это гарантирует, что этап будет исправлен для любых ошибок в его позиционировании.
    10. Нажмите кнопку Сохранить в поле Параметры сохранения для хранения этих параметров в системе.
    11. Поместите 24-колодую культурную пластину, содержащую EHT на магнитно отзывчивых силиконовых стеллажах на месте крепления пластины культуры.
    12. Для расчета магнитного интервала, необходимого для достижения желаемой послегрузки, решите нелинейную функцию регрессии со ступени 1.3.19 для параметра интервала между магнитом d. Например, если уравнение: Equation 1 , d будучи магнитным интервалом (в мм), необходимым для достижения желаемой посленагрузки k в мН/мм, то для достижения послегруза 5 мН/мм потребуется магнитный интервал в 12,12 мм.
    13. Вычесть dмин из расчетного интервала магнита d. Результатом является расстояние магнитная пластина должна путешествовать от своего нулевого положения для достижения желаемой послегрузки.
    14. Введите это значение в поле ввода целевой позиции 1 в панели движения и нажмите Перейдите, чтобы настроить послезагрузку EHT s до расчетного значения.
  3. Дополнительно: Программирование стадии для режима интервала после загрузки
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Предыдущий раздел описывает, как запрограммировать сцену, чтобы перейти и остаться в одной позиции. Тем не менее, также можно связать различные команды вместе в программу для достижения автоматически выполненной последовательности движений, которые могут быть повторены на непрерывном цикле. Для получения более подробных инструкций относительно программного обеспечения платформы контроллера движения, обратитесь к руководству по эксплуатации, предоставленному производителем этапов.
    1. После настройки устройства настройки послегрузо-загрузки, описанного в предыдущем разделе, откройте панель командования. Введите команду 1PGM1 и нажмите Enter, чтобы начать запись программы.
    2. Чтобы создать программу, которая, например, приведет к пьезоэлектрической стадии двигаться вниз 30 мм от 1MVA0 нулевой позиции (вдали от EHTs) и вернуться после 40 с, введите 1WST следующую цепочку команд: 1MVA30 1WST 1WTM 40000
    3. Используйте команду 1END, чтобы завершить запись программы и сохранить ее.
    4. Используйте команду 1EXC1 для выполнения записанной программы.
    5. Чтобы программа работала на непрерывном цикле, введите 1PGL1, за которым следует команда 1EXC1.
    6. Чтобы завершить программу циклов, введите команду 1EST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 2 содержит некоторые полезные команды для экспериментов модификации послегруза. Полный список доступных команд для этой системы можно найти в справочном руководстве по модульной системе управления движением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Магнит пост жесткость количественной
Горизонтально ориентированный магнитно отзывчивый силиконовый столб был установлен в фиксированном положении, и аксиally выровненный калибровочный магнит был помещен на нескольких определенных расстояниях ("магнитные интервалы") от этого поста. Тестовые нагрузки известного веса были приостановлены с конца силиконового столба, в результате чего пост согнуть. Это отклонение было количественно оптически. Линейная связь между гравитационной силой испытательной нагрузки и результирующей отклонением поста наблюдалась на всех магнитных интервалах(рисунок 6A). Значения жесткости, полученные из этих линейных отношений, следовали негативной экспоненциальной тенденции с увеличением интервала между магнитами(рисунок 6B).

Шаговое увеличение послегруза
Контрольные и магнитно отзывчивые ЭГТ (MR-EHT), произведенные из крысиных сердец, культивировались при отсутствии магнитной послегрузки (0,6 мн/мм для контрольных тканей и 0,91 мн/мм для MR-EHT) до тех пор, пока не будет достигнуто плато в составе контракти. В этот день (24 дня после литья EHT) Mr-EHT и контроль EHTs имели аналогичные средние силы (0,29 мН против 0,22 млн н). В течение следующей недели послегрузочная нагрузка на МР-ЭХТ постепенно увеличивалась с 0,91 до 6,85 мн/мм, в то время как послегрузка для контроля EHTs оставалась неизменной. Средняя контрактная сила увеличилась с увеличением послегруза до 0,95 мн, что означает более чем 3-кратное увеличение силы по сравнению со средним значением (0,29 мн), измеренным для контроля EHTs(рисунок 7A). После отклонения, с другой стороны, уменьшилось по сравнению с контрольными тканями. В последний день культуры среднее отклонение, измеренное для MR-EHTs, составляло всего 0,11 мм по сравнению с 0,48 мм для контроля EHT(рисунок 7B). С 27-го дня скорость производства силы и скорость распада силы были выше в MR-EHTs, чем в контроле EHTs, в то время как было только переходное увеличение работы в течение дней 25-28(Дополнительный рисунок 2).

Режим послезагрузки
Крысы EHT на магнитно отзывчивых силиконовых столбах (MR-EHTs) культивировались при минимальной нагрузке 0,91 мн/мм до тех пор, пока не было достигнуто плато в составе контракти. С этого дня (17 дней после литья EHT) далее, MR-EHTs прошли 7-дневный режим посленагрузки, который подвергал EHTs циклам посленагрузов, чередующихся между 0,91 и 6,85 мн/мм(рисунок 8A). Послегруза контрольных EHTs сохранялся на уровне 0,60 мН/мм на протяжении всей культуры. После этого вмешательства, средние силы для MR-EHTs увеличились на 12,0% по сравнению с днем 17, в то время как те, измеренные для контроля EHTs только увеличилось на 1,5% за тот же период времени(рисунок 8B). Однако эти различия не были статистически значимыми. Кроме того, не были измерены существенные различия в скорости производства силы, скорости распада сил и сократительных работах(дополнительный рисунок 3). Это означает, что выбранный режим посленагруза не был эффективным средством повышения контрактности EHT.

Figure 1
Рисунок 1: Собранные магнитно отзывчивые силиконовые стеллажи. (A) Ортогональное представление и (B)секционный вид собранных магнитно отзывчивых силиконовых стеллажей, содержащих пять магнитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Магнитная пластина. Фотография магнитной пластины и ее крепления кронштейна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Система механического привода. Фотография, показывающая систему механических приводов, используемых для регулировки горизонтального положения 24-хорошо пластины по отношению к магнитной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Светодиодная пластина. Фотография светодиодной пластины, используемой для освещения EHT для оптического анализа контрактности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Полностью собранное послезагрузка тюнингового устройства. Фотография полностью собранного прибора после загрузки, включая светодиодную пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Оптическое определение после жесткости. (A) Отклонение магнитно отзывчивого силиконового столба в присутствии внешнего калибровоспособного магнита и под воздействием пяти испытательных весов оценивалось в девяти определенных магнитных интервалах (пять показанных в качестве примеров). (B) Определенная связь между расстоянием между магнитом и после жесткости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Сократительная реакция EHTs на поэтапное увеличение послегруза. Контрактные измерения контрольных EHT (черная линия) и EHT культивируется на магнитно отзывчивых столбах (MR-EHT; синяя линия) в течение 31 дня культуры. (A)MR-EHTs имели несколько более высокие средние контрактные силы, чем контроль EHTs в базовых условиях. С 25-го дня, однако, эта разница была усилена с увеличением послегруза. (B) Пост отклонения был похож между обеими группами до 27-го дня. Прошлые значения послегрузо-загрузки 3,5 мН/мм, послеотклонение для MR-EHTs значительно снизилось. Здесь были проанализированы n n 10 MR-EHT и n q 10 контрольehe s, подходящая смешанная модель (REML - ограниченная максимальная вероятность) и многократный сравнительный тест Сидака. Бары ошибок в графиках представляют собой стандартную ошибку среднего значения: p qlt; 0,01, p slt; 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Сократительный ответ EHTs на протокол интервала посленагруза. Наблюдалось сократительное поведение магнитно отзывчивых ЭГТ под влиянием колеблющегося режима послегруза. (A) Режим послегруза, который был начат на 17-й день (d17), подверг мр-ЭГ до 40 с интервалами минимальной посленагруза (0,91 мм/мм), а затем 40 с интервалами максимальной посленагрузки (6,85 мн/мм) в течение 7 дней. (B) MR-EHTs (синие бары) показали тенденцию к увеличению сил во время протокола посленагруза интервала, в то время как силы, измеренные для контроля EHTs (черные полосы) остались относительно неизменными. Для этих экспериментов, n 10 EHTs были проанализированы в группе, и эти данные были статистически сопоставлены с помощью 2-пути ANOVA и Sidak в нескольких сравнительных тестов. Бары ошибок на графиках представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1 Крыса EHT 24 Крысы EHTs (10%) 1 hiPSC-CM EHT 24 HIPSC-CM EHTs (10%) Компонент
5 x 105 1,3 x 107 1 x 106 2.6 x 107 Клетки (либо неонатальные клетки сердца крысы или hiPSC-производные кардиомиоциты)
5,57 л л 147 Лл 5,57 л л 147 Лл 2x DMEM: 20% тепло-инактивированная сыворотка лошади, 20% 10x DMEM, 2% пенициллин/стрептомицин, 58% аква-ад iniectabilia
2,53 л л. 66,8 л л 2,53 л л. 66,8 л л Фибриноген: 200 мг/мл фибриногена растворяется в 0,9% NaCl
- - 0,1 л л 2,64 л л. Y-27632
объявление 100 Л объявление 2640 Зл объявление 100 Л объявление 2640 Зл EHT-литье среды: 88% DMEM, 10% тепло-инактивированной сыворотки плода теленка, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глютамин

Таблица 1: Восстановление смеси для генерации EHT.

Имя команды Синтаксис Описание
Перемещение абсолютное 1МВАХХ Этап перемещается в положение в мм
Установка скорости 1ВЕЛХ) Скорость движения сцены установлена на мм/с
Аварийная остановка 1EST Останавливает любое движение
Дождитесь остановки 1WST Только во время записи программы; Ожидание завершения предыдущей команды движения перед выполнением следующей команды
Подождите период времени 1WTM Только во время записи программы; Ожидания на период времени (x) в мс
Запись программы Beginn 1PGM Начать запись программы в слоте «x»; Примечание: Слот «x» должен быть бесплатным
Запись программы окончание 1END Окончание программы записи и сохранения программы
Программа стирания 1ЕРАх Стереть программу, сохраненную в слоте
Выполнение программы 1ЭКСКК Выполнение программы, сохраненной в слоте
Программа петли 1PGL Режим цикла программы на режиме цикла программы «x»0 выключен
Читать и яснять ошибки 1ERR? Отчет об ошибке запроса

Таблица 2: Полезные команды для экспериментов настройки послезагрузки.

Дополнительная рисунок 1: Размеры силиконовых стеллажей. (A) Вид сверху, (B)секционный вид сбоку, и (C) подробный вид столба силиконовых стеллажей, используемых для этих исследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная диаграмма 2: Дополнительные контрактные параметры для поэтапного увеличения послегруза. Контрактные измерения контрольных EHT (черная линия) и EHT культивируется на магнитно отзывчивых столбах (MR-EHT; синяя линия) в течение 31 дня культуры. (A)MR-EHTs имели значительно более высокую скорость производства силы чем управление EHTs от дня 27 дальше. (B) Скорость распада силы была также значительно больше в MR-EHTs, чем в контроле с 27-го дня. (C) В то время как сократительная работа, измеряемая в контроле EHTs постепенно увеличилась в течение всего периода культуры, сократительная работа, производимая MR-EHTs достигла пика на 26-й день и упала после этого до уровней ниже контроля. Тем не менее, работа в MR-EHTs никогда не была значительно выше, чем в контроле EHTs. Здесь были проанализированы n n 10 MR-EHT и n q 10 контрольehe s, подходящая смешанная модель (REML - ограниченная максимальная вероятность) и многократный сравнительный тест Сидака. Бары ошибок на графиках представляют собой стандартную ошибку среднего значения: p qlt; 0,05, p slt; 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная диаграмма 3: Дополнительные контрактные параметры для протокола интервала после загрузки. Наблюдалось сократительное поведение магнитно отзывчивых ЭГТ (MR-EHT) под влиянием колеблющегося режима послегруза. (A) Во время протокола посленагруза, MR EHTs (голубые полосы) первоначально показали тенденцию к более высокой ставке производства силы по сравнению с контролем EHTs (черные полосы), но эти различия не были значительными и уменьшились к концу эксперимента. (B) Коэффициенты распада сил, измеренные в MR-EHT и контроль EHTs были статистически похожи на протяжении всего протокола посленагруза интервала. (C)Сократительная работа, измеренная для MR-EHT, увеличилась в течение первых дней протокола интервала после нагрузок, но уменьшилась в последний день. Контрактная работа, измеренная для контроля EHTs, за этот период времени заметно не изменилась. Работа в Mr-EHT s никогда не была значительно выше, чем работа в области контроля EHTs. Для этих экспериментов, n 10 EHTs в группе были проанализированы 2-путь ANOVA и Sidak в нескольких сравнительных испытаний. Бары ошибок на графиках представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В протоколе, изложенном в настоящем документе, описывается новая методика магнитного изменения послегрузки в инженерных тканях сердца. Этот метод опирается на использование пьезоэлектрической стадии для перевода пластины сильных магнитов к и от магнитно отзывчивых стеллажей силиконовых столбов. Чем ближе два набора магнитов, тем сильнее посленагрузка, испытаная EHTs, культивируется на них.

Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешного производства и использования этой системы. При изготовлении магнитно отзывчивых силиконовых стеллажей, крайне важно обеспечить, чтобы все магниты в должности ориентированы с той же полярностью. Если магнит находится в обратной ориентации, он будет служить для ослабления, а не увеличить силу магнитного поля. Аналогичным образом, эта полярность должна соответствовать, что из всех магнитов в магнитной пластине, иначе два набора магнитов будет отталкивать, а не привлекать друг друга. Кроме того, где это возможно, воздерживаться от использования магнитных материалов в строительстве устройства регулировки посленагрузки, так как они могут мешать магнитному полю. Алюминий предлагается в качестве основного строительного материала по этой причине. Аналогичным образом, при использовании пьезоэлектрической стадии, кроме той, которая указана в таблице материалов,убедитесь, что она устойчива к магнитным полям и стандартным условиям клеточной культуры (например, 37 градусов по Цельсию, 100% влажности и высоким содержанием CO2 и O 2-концентраций).2 Наконец, имейте в виду, что большинство пьезоэлектрических линейных этапов предназначены для установки горизонтально, так как они, как правило, имеют низкую грузоподъемность. Таким образом, если вес магнитной пластины превышает эту грузоподъемность, противовес следует использовать для разгрузки двигателя.

Несмотря на лучшие практики, это довольно трудно сохранить кодер поверхности нетронутой. Когда это происходит, этап перестанет двигаться до достижения целевого положения при запуске в режиме замкнутого цикла. Красный светодиод контроллера движения будет мигать, дополнительно программное обеспечение контроллера движения будет отображать "Нет кодировщик аудиентолот обнаружен"-ошибка сообщение. Чтобы исправить это, пользователь должен очистить поверхность кодера с ворсом кусок ткани, пропитанной изопропиловым спиртом и дайте ему высохнуть.

Этот протокол демонстрирует шаги, предпринятые нашей лабораторией для создания и внедрения этой системы. Однако некоторые из этих шагов могут быть достигнуты различными средствами. Например, можно использовать силовую трансдуктор, а не оптические средства, чтобы подтвердить связь между расстоянием между магнитом и после жесткости. Кроме того, пользовательские сообщения могут быть разработаны и изготовлены со встроенными магнитами и скобками. Тем не менее, мы обнаружили, что точное позиционирование этих объектов легче выполнить вручную. Для точной настройки диапазона посленагрузов, применимых этой системой, эти столбы могут быть изготовлены с различными базальными жесткостями или с разным количеством магнитов. Хотя, используя слишком много магнитов будет препятствовать пост изгиба. Кроме того, это также может быть достигнуто путем регулировки размера и силы магнитов в магнитной пластине. Большие и сильные магниты дадут более высокие посленагрузки.

Есть несколько ограничений на этот метод, который может быть улучшен в будущих версиях этой системы. А именно, диапазон применимых посленагрузов физически ограничен максимальным и минимальным интервалом между почтовыми магнитами и магнитами пластины. В идеале, должности, используемые для этой системы будет место тканей как можно ближе к основанию ткани культуры блюдо, как это возможно, без прямого позволяя ткани коснуться нижней части пластины. Тем не менее, должности, используемые в этих исследованиях были коммерчески сделаны до разработки этой системы, так что длина должностей не были оптимизированы для этой платформы. Аналогичным образом, поскольку до создания этой системы была построена система анализа контрактности EHT, она не была предназначена для обеспечения электрических шнуров в пространстве измерений или из него. Таким образом, наличие этих шнуров привело к небольшой зазор воздуха, что позволило газам медленно просачиваться из внутренней камеры. Это можно было бы улучшить за счет корректировки тарифов на газ. Однако, в идеале, будущее воплощение этой системы будет иметь изолированные выход и точки входа для этих шнуров. Если вы хотите проводить эти эксперименты в отсутствие системы анализа контрактности EHT, платформа настройки послегруза может быть помещена в инкубатор. Хотя, система в полном объеме будет вписываться только в стандартный инкубатор, если одна или несколько полок удалены, что делает это пространство недоступным для других целей клеточной и или культуры тканей. Для оптического наблюдения тканей в любой среде, огни будут необходимы. Светодиодные фонари, используемые для этой системы, были найдены, чтобы выдать значительное количество тепла. Если оставить на длительные периоды, это тепло потенциально может повредить ткани. Таким образом, для этих исследований, огни были использованы только в течение коротких периодов при оценке сокративости тканей. Однако, если вы желаете последовательно наблюдать ткани, система освещения должна быть оптимизирована для этих целей.

Afterload был ранее изучен в моделях EHT16,,23. Тем не менее, эти работы представили методы, которые были только в состоянии достичь единственного статического увеличения нагрузки. Кроме того, эта работа продемонстрировала, как магнитная платформа может быть использована для тонкой настройки и временного регулирования посленагрузки в EHT. Результаты двух отдельных наборов экспериментов были использованы для примера широкого спектра схем посленагруза, которые могут быть применены к EHTs с помощью этого устройства. Предназначенное будущее применение этой системы включает исследования о влиянии прикладного режима посленагруза (доза и продолжительность) как на созревание тканей, так и на патологическую реконструкцию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

TE и MNH являются соучредителями EHT Technologies GmbH. Всем остальным авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Jutta Starbatty за ее поддержку в работе культуры тканей, Аксель Кирххоф за фотографию, Алиса Casagrande Cesconetto для редактирования работы, и особую благодарность Бюлент Aksehirlioglu за техническую поддержку в разработке этого устройства. B.B. был поддержан стипендиатом JK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) Грантом, M.L.R. Международным докторским стипендиатом Уитакера грантом и M.N.H. за счет средств ДЗК.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical plate magnets HKCM 9962-55184 h = 14 mm, d = 13 mm
Cylindrical post magnets HKCM 9962-63571 h = 2 mm, d = 0.5 mm
Dental wire Ormco 266-1316 d = 0.016 inches (0.406 mm)
GraphPad GraphPad Software, La Jolla, California, USA version 6.00 for Windows
Motion control software for piezo motor Micronix USA free download on manufacturer homepage
Motion controller for piezo motor Micronix USA MMC-100-01000
Optical contractility analysis platform EHT technologies A0001
Piezoelectric linear motor Micronix USA PPS-20-15206 fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible
Styrene Rod Plastruct MR-15 d = 0.015 inches (0.381 mm)
USB camera Reichelt Elektronik REFLECTA 66142

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , Elsevier. (2018).
  2. McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
  3. de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
  4. Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
  5. Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
  6. Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
  7. Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
  8. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
  9. Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
  10. Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
  11. Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
  12. Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
  13. Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 4 Pt 2 747-754 (1985).
  14. Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
  15. Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
  16. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  17. Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
  18. Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
  19. Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
  20. Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
  21. Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
  22. Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
  23. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  24. Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
  25. Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).

Tags

Биология развития Выпуск 159 Ткань-инженерия инженерная сердечная ткань сердечная гипертрофия магниты afterload сжатие
Магнитная регулировка Afterload в инженерных тканях сердца
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Becker, B., Rodriguez, M. L.,… More

Becker, B., Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues. J. Vis. Exp. (159), e60811, doi:10.3791/60811 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter