Summary
Ce protocole fournit des méthodes détaillées décrivant la fabrication et la mise en œuvre d’une plate-forme d’accordage après la charge magnétique pour les tissus cardiaques conçus.
Abstract
Afterload est connu pour conduire le développement des états cardiaques physiologiques et pathologiques. En tant que tel, l’étude des résultats des états de chargement après modifié pourrait donner un aperçu important des mécanismes de contrôle de ces processus critiques. Cependant, une technique expérimentale pour affiner précisément le chargement de la charge cardiaque au fil du temps fait actuellement défaut. Ici, une technique nouvellement développée basée sur des magnétiques pour réaliser ce contrôle dans les tissus cardiaques machinés (EHT) est décrite. Afin de produire des EHT (MR-EHT) réactifs magnétiquement, les tissus sont montés sur des poteaux en silicone creux, dont certains contiennent de petits aimants permanents. Un deuxième ensemble d’aimants permanents est pressé dans une plaque acrylique de sorte qu’ils sont orientés avec la même polarité et sont axially-alignés avec les aimants de poteau. Pour ajuster après la charge, cette plaque d’aimants est traduite vers (après charge supérieure) ou loin (après charge inférieure) des aimants de poteau utilisant un stade piézoélectrique équipé d’un encoder. Le logiciel de contrôle de mouvement utilisé pour ajuster le positionnement en phase permet le développement de schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur, tandis que l’encoder s’assure que l’étape corrige toute incohérence dans son emplacement. Ce travail décrit la fabrication, l’étalonnage et la mise en œuvre de ce système pour permettre le développement de plates-formes similaires dans d’autres laboratoires à travers le monde. Les résultats représentatifs de deux expériences distinctes sont inclus pour illustrer la gamme de différentes études qui peuvent être effectuées à l’aide de ce système.
Introduction
Après charge est la charge systolique sur le ventricule après qu’il a commencé à éjecter le sang1. Pendant le développement cardiaque, une charge après-charge appropriée est d’importance critique pour la maturation cardiomyocyte2. À l’âge adulte, de faibles niveaux de chargement ventriculaire (p. ex., chez les patients alités atteints d’une lésion de la moelle épinière de haut niveau3 ou dans des cas très spéciaux comme le vol spatial4)peuvent entraîner une hypotrophie du cœur. Inversement, la charge après-charge élevée peut mener à l’hypertrophie cardiaque5. Tandis que l’hypertrophie cardiaque dans les athlètes d’endurance ou les femmes enceintes est considérée salutaire et physiologique, l’hypertrophie associée à l’hypertension artérielle à long terme ou la sténose aortique grave de valve est préjudiciable car elle prédispose un aux arythmies cardiaques et à l’insuffisance cardiaque6. Bien que le taux de mortalité sur cinq ans chez les patients souffrant d’insuffisance cardiaque ait diminué de 70 % dans les années 1980de 6 à 40 à 50 %7 actuellement, il y a encore un grand besoin de nouvelles options de traitement thérapeutique pour cette affection très répandue (actuellement 2,2 % de la population dans le monde occidental)8.
Afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie cardiaque pathologique et de tester des stratégies préventives ou thérapeutiques pour le traitement de cette maladie, les modèles in vivo de l’après-charge ont été développés9,10,11,12. Bien que ces modèles aient offert des aperçus bénéfiques des effets de l’après-charge sur les performances ventriculaires, ils ne permettent pas un contrôle fin sur l’ampleur de la charge après la charge. Alternativement, les études in vitro de l’après-charge effectuée sur les cœurs excisés et les préparations musculaires permettent un contrôle plus fin sur le chargement des tissus, mais ces modèles ne sont pas propices aux études longitudinales13,14,15.
Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un modèle in vitro de chargement élevé dans les tissus cardiaques (EHT)16,17. Ce modèle est un format de culture en 3 dimensions pour les cellules cardiaques de rat intégrées dans une matrice de fibrine suspendue entre les poteaux de silicone creux flexibles. Ces tissus battent spontanément (contre la résistance des poteaux en silicone) et effectuent un travail auxotonique. Nous avons augmenté après la charge appliquée aux EHT par un facteur de 12 dans les expériences précédentes par l’insertion d’accolades métalliques rigides dans les poteaux creux de silicone pendant une semaine. Ceci a mené à une multitude de changements, caractéristiques de l’hypertrophie cardiaque pathologique18,19,20: hypertrophie cardiomyocyte, nécroptose partielle, baisse de la force contractile, affaiblissement de la relaxation des tissus, réactivation du programme de gène foetal, changement métabolique de l’oxydation d’acide gras à la glycolyse anaérobie, et une augmentation de la fibrose. Bien que cette procédure a été utilisée avec succès dans plusieurs études17,21,22, il a quelques inconvénients. Il n’y a que deux états, faibles ou très élevés (12 fois) après la charge, et la procédure nécessite une manipulation manuelle des ERE, ce qui limite sa flexibilité temporelle et pose le risque de contamination.
Récemment, Leonard et coll. ont utilisé une technique similaire pour moduler l’après-décharge dans les EHT cultivés sur les poteaux de silicone23. Des accolades de longueurs variables ont été placées autour de l’extérieur des poteaux pour limiter leur mouvement de flexion. Les auteurs de cette étude ont indiqué qu’une augmentation singulière de petite à moyenne de la charge a amélioré le développement et la maturation des EHT humains iPS-dérivés, tandis que des charges plus élevées ont eu comme conséquence un état pathologique. Cependant, semblable à notre propre système, cette technique ne permet que des augmentations singulières de la charge après-charge, dont l’ampleur est dictée par la longueur des accolades. En tant que tel, de fines altérations dans la charge après la charge, des modifications dans l’après-charge au fil du temps, et des régimes de chargement précis ne sont pas possibles avec ces techniques.
Ici, nous fournissons le protocole pour un système qui peut être utilisé pour moduler la post-résistance, c’est-à-dire, après la charge des EHTs magnétiquement24. Cette plate-forme facilite l’ajustement fin de la charge après l’utilisation, permet des schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur et assure la stérilité ehT.
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Protocol
1. Préparation de la plate-forme de réglage après charge
REMARQUE: Les étapes de cette partie du protocole ne sont pas sensibles au temps.
- Fabrication des supports en silicone réactifs magnétiquement
REMARQUE : Ces racks servent de plate-forme culturelle pour les EHT. Chaque EHT est suspendu entre deux poteaux en silicone, qui transmettent après chargement au tissu. Le degré d’après-charge est directement lié à la rigidité de ces poteaux. Pour permettre l’accordage magnétique après la charge, certains des poteaux doivent être réactifs magnétiquement.- Acquérir des supports compatibles 24 puits pour les plaques de poteaux en silicone (dimensions données dans la figure supplémentaire 1). Les racks utilisés dans cette étude ont été produits par un fournisseur commercial de produits en silicone selon ces dimensions en utilisant du silicone avec une dureté de rivage de 40.
- Déterminer la polarité des aimants postaux (p. ex., d - 0,5 mm, h et 2,0 mm; voir Tableau des matériaux)en les plaçant sur un plus grand aimant permanent.
- Garder une polarité fixe, lubrifier les aimants avec de l’eau et les insérer, un à la fois, dans les poteaux les plus externes des grilles en silicone.
REMARQUE: Si vous essayez d’insérer plus d’un aimant à la fois, la résistance supplémentaire rendra plus difficile de pousser les aimants au fond du poteau. - Utilisez un morceau émoussé de fil dentaire en acier inoxydable (d - 0,4 mm, voir Tableau des matériaux) pour les pousser soigneusement au fond de la cavité de poteau creux. Vous pouvez empiler jusqu’à cinq aimants dans chaque poteau.
- Utilisez des pinces (nez rond) pour plier le fil dentaire en acier inoxydable (d - 0,4 mm, voir Tableau des matériaux) en accolades de 11,25 mm de large et 15 mm de long. Utilisez des coupe-fils pour couper les accolades et un fichier pour lisser la surface de coupe. Pour s’assurer que les dimensions correctes sont atteintes, on peut utiliser un gabarit auto-fait pour aider dans la flexion du fil.
REMARQUE: L’immobilisation post peut également être réalisée par des accolades fabriquées à partir d’autres matériaux, tant qu’elles ne sont pas magnétiques et rigides. - Lubricate les accolades avec de l’eau et les insérer dans la grille en silicone, en fixant le deuxième et le troisième au poteau le plus externe dans le processus (voir la figure 1 pour la configuration complète de la grille de silicone).
REMARQUE: En option, afin d’adapter la rigidité de base des poteaux de commande pour correspondre à celle des poteaux magnétiquement sensibles, des fragments de tige ronde de styrène (voir tableau des matériaux) peuvent être insérés dans les poteaux vides (ceux sans accolade ou aimant). - Laisser reposer les grilles pendant 1 à 2 jours pour permettre à toute eau restante de sécher à l’air.
- Lorsque les poteaux sont secs, sceller les trous au sommet des poteaux en silicone creux contenant les aimants à l’aide d’une goutte de colle en silicone.
- Le dispositif de réglage après charge
REMARQUE : Comme les aimants dans le dispositif de réglage après charge sont déplacés vers ou loin de ceux dans les poteaux de silicone, les forces magnétiques attrayantes augmentent ou diminuent en conséquence, ayant pour résultat la rigidité altérée des poteaux de silicone. Ce mouvement est réalisé à l’aide d’une étape piézoélectrique. En raison de la nature prototypique du dispositif d’accordage après charge, des instructions détaillées étape par étape sur la façon de le reproduire ne seront pas fournies. Au lieu de cela, les lignes directrices généralisées pour la construction d’un dispositif similaire de réglage après la charge sont détaillées dans les présentes.- Obtenez un moteur linéaire piezoélectrique très précis pour permettre la traduction verticale de la plaque d’aimant vers et loin des EHT (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Il est fortement suggéré que ce moteur soit équipé d’un encoder linéaire pour corriger le positionnement en phase. - Placez un ensemble d’aimants permanents à l’intérieur d’un support non magnétique de sorte qu’ils sont axially alignés avec les aimants de poteau lorsqu’ils sont placés directement en dessous d’eux. Ici, les grands aimants cylindriques (d ' 13 mm, h et 14 mm; voir Tableau des matériaux) étaient press-fit dans une plaque en plastique acrylique ("plaque d’aimant").
- Attachez le support d’aimant à l’étape piézoélectrique à l’aide d’un matériau non magnétique. Ceci peut être réalisé à l’aide d’un morceau d’aluminium en forme de L (voir la figure 2).
- Construire un cadre qui peut abriter les composants de l’appareil de réglage après charge. Au minimum, cette structure devrait avoir un emplacement sur lequel monter verticalement l’étape piézoélectrique, ainsi qu’un cadre rigide sur lequel placer la plaque de 24 puits.
REMARQUE: Il est suggéré que l’emplacement de cette monture soit modifiable dans le plan horizontal afin de permettre des ajustements dans l’alignement axial entre les deux ensembles d’aimants. Un système de disques mécaniques a été utilisé pour atteindre cette maniabilité dans le système présenté(figure 3). Le dispositif de réglage après charge décrit ici a été conçu pour être compatible avec le système d’analyse de la contractilité EHT (voir Tableau des matériaux). À ce titre, ses dimensions étaient limitées à 29 cm de largeur, 29 cm de profondeur et 16 cm de hauteur pour s’adapter à ce système. - Pour permettre l’analyse visuelle des tissus, installez une source lumineuse dans le dispositif de réglage après charge. Ici, un éventail de LED a été utilisé (figure 4) pour éclairer les ES d’en bas(figure 5).
- Obtenez un moteur linéaire piezoélectrique très précis pour permettre la traduction verticale de la plaque d’aimant vers et loin des EHT (voir Tableau des matériaux).
- Calibrating le système d’accordage après charge
Note:Afin d’augmenter précisément l’après-charge EHT à la valeur désirée, la relation entre l’espacement d’aimant et la rigidité de poteau résultante devra être déterminée.- Mesurez le plus proche (dmin) et l’espacementd’aimantle plus éloigné (dmax ) possible dans votre configuration. Ces distances dicteront les charges maximales et minimales réalisables.
REMARQUE: Le bas de la plaque de culture empêchera le contact direct entre la plaque d’aimant et les poteaux de silicone magnétiquement réactifs. - Produisez une gamme de poids non magnétiques et montez-les sur une chaîne pour servir de charges d’essai.
- Déterminez les poids des charges d’essai à l’aide d’une échelle fine et étiquetez-les en fonction de ce poids. Ici, six poids différents en verre acrylique allant de 30 mg à 200 mg ont été utilisés.
REMARQUE: Sélectionnez des poids assez lourds pour plier le poteau, mais pas si lourd qu’ils plient le poteau de plus de quelques millimètres. L’utilisation d’un plus grand nombre de charges d’essai garantit que l’étalonnage est plus précis, mais il sera également plus long. - Montez l’un des supports en silicone verticalement (à l’aide de matériaux non magnétiques), de sorte que les poteaux en silicone magnétiquement réactifs sont orientés horizontalement.
- Montez l’un des aimants de plaque (l'« aimant d’étalonnage ») sur une étape linéaire horizontalement ambulante de telle sorte qu’il soit axially aligné avec le poteau magnétiquement sensible.
- Placez l’aimant d’étalonnage une distance définie du poteau de silicone magnétiquement réactif à l’aide du stade horizontal (de préférence, commencez à une distance égale à l’espacement maximal de l’aimant réalisable par le dispositif de réglage après charge).
- Placez une caméra (par exemple, voir Tableau des matériaux) sur le côté de cette configuration afin de pouvoir enregistrer optiquement la déviation du poteau sous l’influence des charges d’essai.
REMARQUE: Il est suggéré que l’utilisateur emploie une caméra avec une résolution d’au moins 2 mégapixels pour assurer une détermination précise de la déviation post. - Prenez une photo du poste en l’absence de tout poids à utiliser comme référence pour la position "neutre" du poste.
- Sans changer la perspective de la caméra, attachez l’une des charges à la toute fin du poteau en silicone et prenez une photo du poteau se pliant sous l’influence du poids.
- Répétez cette mesure pour tous les poids.
- Déterminer optiquement la déviation du poteau de silicone causé par la force gravitationnelle de chaque poids.
- Graphique de la déviation du poteau de silicone (x,sur l’axe x) contre la force gravitationnelle de chaque poidsd’essai (mg, sur l’axe y). Cela devrait donner une relation linéaire entre la force et la déviation.
REMARQUE: Si les données ne sont pas linéaires, cela peut indiquer que le poste est en dehors de sa plage linéaire de déviation, c’est-à-dire que les poids utilisés étaient trop lourds. - Tracer une fonction de régression linéaire en passant par (0,0) et les données acquises (voir la figure 6A pour des exemples). La pente de cette fonction (mg kx) est la rigidité k du poteau de silicone magnétiquement réactif à l’espacement d’aimant testé.
- Répétez ces étapes à plusieurs espacements entre dmax et dmin. Ici, des déviations à neuf positions d’aimant différentes allant de 31 mm à 5 mm ont été analysées.
- Déterminez la rigidité de base du poteau de silicone magnétiquement réactif en l’absence de l’aimant d’étalonnage en utilisant la même technique.
- Déterminez également la rigidité d’un poste de commande mobile, non réactif magnétiquement en utilisant la même technique.
- Tracez les valeurs k résultantes contre les distances respectives d’aimant. Cela devrait donner lieu à une relation exponentielle négative.
- Tracer une fonction de régression à travers ces valeurs. Par exemple, utilisez un ajustement non linéaire. Fonction de désintégration en une phase dans le logiciel d’analyse (voir le tableau des matériaux). Cette fonction de régression décrit la relation entre l’espacement d’aimant et la charge après -voir la figure 6B par exemple).
- Mesurez le plus proche (dmin) et l’espacementd’aimantle plus éloigné (dmax ) possible dans votre configuration. Ces distances dicteront les charges maximales et minimales réalisables.
2. Génération ET culture EHT
REMARQUE: La génération et la culture de l’EHT ont été décrites en détail dans un autre article25. Par conséquent, nous ne couvrirons ces aspects que brièvement dans notre protocole. S’il vous plaît effectuer les étapes suivantes dans des conditions stériles, en adhérant à de bonnes pratiques de culture cellulaire.
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Génération EHT
- Immerger les supports en silicone déjà préparés dans un récipient rempli d’éthanol à 70 % pendant au moins 20 minutes.
CAUTION: Ne pas autoclaver les poteaux de silicone après-charge réglable pour les stériliser car des températures élevées peuvent endommager les aimants permanents. - Apportez ce récipient dans l’armoire de biosécurité, rincez les grilles 2x avec de l’eau stérile et laissez-les sécher à l’air.
REMARQUE: Pour réduire la probabilité de contamination, ce processus devrait être effectué dans le même coffret de biosécurité qui sera plus tard utilisé pour lancer les EHT. - Acquérir (et dégeler si nécessaire) les cellules ventriculaires du cœur du rat néonatal ou les cardiomyocytes dérivés du hiPSC (cellules souches pluripotentes induites par l’homme) (également disponibles dans le commerce) et préparer le mélange de reconstitution EHT selon le tableau 1.
- Pipet 1,5 mL de solution chaude d’agarose de 2 % dans les 4 puits les plus à gauche d’une plaque de culture de 24 puits et insérez immédiatement un espaceur en polytetrafluoroethylène (PTFE) (voir tableau des matériaux)dans la solution d’agarose liquide.
- Répétez l’étape précédente pour les 20 puits restants dans la plaque de culture.
- Après avoir permis à l’agarose de se solidifier pendant 10 minutes, retirez soigneusement les espaceurs PTFE.
REMARQUE: L’agarose devient turbide lorsqu’elle s’est solidifiée. - Insérez les poteaux des supports en silicone sensibles magnétiquement dans les vides d’agarose produits par les espaceurs PTFE.
- Pipet 100 L de la reconstitution se mélangent dans une solution de 3 l d’aliquot de 100 mU/L thrombin. Pipette de haut en bas deux fois pour mélanger et transférer rapidement le mélange dans le vide dans le moule d’agarose premier sur l’assiette de culture.
- Répétez l’étape précédente pour les 23 moules restants, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipet pour chaque EHT.
REMARQUE: Mélanger délicatement la constitution mélange tous les 6-8 EHTs afin d’éviter la sédimentation cellulaire. - Conservez la plaque de 24 puits dans un incubateur (37 oC, 7 % de CO2,40 % O2) pour 90 min. Dans l’intervalle, préparer le milieu EHT en complétant le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de cheval, 1% de pénicilline/streptomycine, 10 g/mL d’insuline et 33 g/mL aprotinine.
- Ajouter 500 L de milieu hÉLI chaud à chaque puits.
- Conservez la plaque de 24 puits dans un incubateur (37 oC, 7 % de CO2,40 % O2) pendant 30 min. Pendant ce temps, préparer une deuxième plaque de 24 puits avec 1,5 mL de milieu EHT dans chaque puits et la placer dans l’incubateur.
- Retirez soigneusement les grilles en silicone sensibles aux aimants avec les EHT fraîchement coulés sur eux des moules à agarose et transférez-les à la deuxième plaque de 24 puits.
- Immerger les supports en silicone déjà préparés dans un récipient rempli d’éthanol à 70 % pendant au moins 20 minutes.
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Culture EHT
REMARQUE : Après la coulée de tissus, changez de milieu trois fois par semaine : les lundis, mercredis et vendredis.- Pour un changement moyen, pipet 1,5 mL de milieu d’EHT frais par puits dans une nouvelle plaque de culture de 24 puits et placer cette plaque dans l’incubateur à 37 oC, 7% DE CO2, et 40% O2 pendant au moins 30 min.
- Transférer les supports en silicone de l’ancienne plaque de 24 puits à la nouvelle plaque sous une hotte de culture cellulaire.
- Conservez les plaques EHT fermées dans un incubateur à 37 oC, 7 % de CO2et 40 % O2.
3. Expériences de modification après la charge
REMARQUE: Les étapes de protocole suivantes sont spécifiques à la plate-forme d’analyse de la contractilité du moteur piézoélectrique et optique figurant dans le Tableau des matériaux.
- Préparation du dispositif de réglage après charge pour les expériences
- Pour mesurer les effets des manipulations après charge sur la contractilité EHT, déconnectez et retirez le système d’éclairage du compartiment le plus intime de la plate-forme optique d’analyse de la contractilité et insérez le dispositif de réglage après charge, y compris la source lumineuse.
- Installez le logiciel de contrôle du mouvement de scène (voir Tableau des matériaux) sur l’ordinateur qui sera utilisé pour exécuter l’appareil de réglage après charge.
- Connectez le moteur de scène piezoélectrique au contrôleur de mouvement (voir tableau des matériaux), et le contrôleur de mouvement à l’ordinateur. Assurez-vous que le contrôleur de mouvement est également connecté à une source d’énergie.
REMARQUE: Il y a deux lumières sur la face du contrôleur de mouvement. Lors de la connexion à la puissance, les deux lumières clignotent en rouge pendant quelques secondes. Pendant le fonctionnement, la lumière supérieure reste verte tandis que la lumière inférieure ne doit devenir rouge que si une erreur se produit. - Placez une plaque de culture vide de 24 puits sur la monture de plaque en haut de l’appareil de réglage après charge.
- Alignez optiquement la plaque de culture vide avec la plaque d’aimant ci-dessous à l’aide du système d’entraînement mécanique XY fixé à la monture.
- Fonctionnement de l’appareil de réglage après la charge
- Démarrez le logiciel de plate-forme de contrôleur de mouvement.
- Connectez le logiciel au moteur de stade piezo en sélectionnant le port désigné comme port d’étape lors de l’installation du logiciel de commande de mouvement, puis cliquez sur le bouton port ouvert.
REMARQUE: Après avoir terminé cette étape, le port doit être désigné comme « ouvert » et apparaître dans une boîte verte. - Allez au panneau système. Sélectionnez Open Loop dans le menu Dropdown Loop.
- Déplacez manuellement la plaque d’aimant à sa position la plus élevée, c’est-à-dire, l’espacementd’aimantle plus proche possible. La plaque d’aimant doit entrer en contact avec la monture de plaque de culture.
- Allez au panneau Motion. Cliquez sur le bouton Zéro pour réinitialiser la position actuelle de l’étape piezo à 0 mm.
- Déplacez manuellement la plaque d’aimant à sa position la plus basse possible. Notez la position de l’encoder (indiquée dans le panneau Motion par Enc) pour déterminer la gamme de mouvement pour le moteur de stade piézoélectrique.
- Définissez les limites de déplacement dans le panneau système à des valeurs dans la plage de mouvement déterminée dans l’étape précédente. Cela empêche la plaque d’aimant de se heurter à la plaque de culture ou au fond du dispositif de réglage après charge.
- Une fois de plus, déplacez la plaque d’aimant à sa position la plus élevée et cliquez sur le bouton Zéro.
- Rendez-vous sur le panneau système et modifiez le mode boucle de rétroaction en boucle fermée. Cela garantit que l’étape se corrigera pour toute erreur dans son positionnement.
- Cliquez sur le bouton Enregistrer dans la boîte De paramètres Enregistrer pour stocker ces paramètres dans le système.
- Placez une plaque de culture de 24 puits contenant des EHT sur des supports en silicone magnétiquement réactifs sur la monture de plaque de culture.
- Pour calculer l’espacement d’aimant nécessaire pour obtenir une charge arrière désirée, résolvez la fonction de régression non linéaire de l’étape 1.3.19 pour le paramètre d’espacement d. Par exemple, si l’équation est:
, d étant l’espacement d’aimant (en mm) nécessaire pour atteindre le k après charge désiré dans mN/mm, un espacement d’aimant de 12,12 mm serait nécessaire pour atteindre une charge après la charge de 5 mN/mm. - Soustrayez dmin de l’espacement calculé d. d Le résultat est la distance que la plaque d’aimant doit parcourir à partir de sa position zéro pour atteindre la charge après-charge souhaitée.
- Tapez cette valeur dans le champ d’entrée de la position cible 1 dans le panneau de mouvement et cliquez sur Go pour ajuster la charge arrière des EHT à la valeur calculée.
- Facultatif : Programmation de la scène pour un régime d’après-charge d’intervalle
REMARQUE : La section précédente décrit comment programmer l’étape pour passer à une seule position et y rester. Cependant, il est également possible d’enchaîner différentes commandes en un programme pour réaliser une séquence de mouvements exécutée automatiquement, qui peut être répétée sur une boucle continue. Pour obtenir des instructions plus détaillées concernant le logiciel de plate-forme de contrôleur de mouvement, consultez le manuel d’exploitation fourni par le fabricant de scène.- Après avoir mis en place le dispositif de réglage après charge tel que décrit dans la section précédente, ouvrez le panneau de commandement. Tapez la commande 1PGM1 et appuyez sur Enter pour commencer à enregistrer un programme.
- Créer un programme qui, par exemple, fera descendre l’étape piézoélectrique à 30 mm de la position Zéro (loin des EHT) et revenir après 40 s, entrez dans la chaîne de commandes suivante : 1MVA30 - 1WST ' 1WTM40000 ' 1MVA0 ' 1WST
- Utilisez la commande 1END pour conclure l’enregistrement d’un programme et l’enregistrer.
- Utilisez la commande 1EXC1 pour exécuter le programme enregistré.
- Pour maintenir le programme en marche sur une boucle continue, entrez 1PGL1, suivi de la commande 1EXC1.
- Pour mettre fin à un programme de boucle, entrez la commande 1EST.
REMARQUE : Le tableau 2 contient quelques commandes utiles pour des expériences de modification après la charge. Une liste complète des commandes disponibles pour ce système se trouve dans le manuel de référence pour le système modulaire de contrôle des mouvements.
, d étant l’espacement d’aimant (en mm) nécessaire pour atteindre le k après charge désiré dans mN/mm, un espacement d’aimant de 12,12 mm serait nécessaire pour atteindre une charge après la charge de 5 mN/mm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quantification de raideur de poteau d’aimant
Un poteau de silicone magnétiquement orienté horizontalement a été monté dans une position fixe, et un aimant d’étalonnage axially aligné a été placé à plusieurs distances définies (« espacements d’aimant ») de ce poteau. Les charges d’essai de poids connu ont été suspendues de l’extrémité du poteau de silicone, causant le poteau de plier. Cette déviation a été quantifiée optiquement. Une relation linéaire entre la force gravitationnelle de la charge d’essai et la déviation post résultante a été observée à tous les espacements d’aimant(figure 6A). Les valeurs de rigidité dérivées de ces relations linéaires ont suivi une tendance exponentielle négative avec l’espacement croissant d’aimant(figure 6B).
Augmentation de la charge après la charge stepwise
Les ANT de contrôle et les EHT magnétiquement réactifs (MR-EHT) produits à partir de cœurs de rats ont été cultivés en l’absence de chargement magnétique (0,6 mN/mm pour les tissus témoins et 0,91 mN/mm pour les MR-EHT) jusqu’à ce qu’un plateau en force contractile soit atteint. Ce jour-là (24 jours après la coulée ehT), les MR-EHT et les ANT de contrôle avaient des forces moyennes similaires (0,29 mN contre 0,22 mN). Au cours de la semaine suivante, la charge après-charge exercée sur les TRM a été progressivement augmentée, passant de 0,91 à 6,85 mN/mm, tandis que la charge après charge pour les ES de contrôle est restée constante. La force contractile moyenne a augmenté avec une augmentation du chargement jusqu’à 0,95 mN, ce qui représente une augmentation de plus de trois fois la force par rapport à la valeur moyenne (0,29 mN) mesurée pour les EES témoins(figure 7A). La déviation post,, d’autre part, a diminué par rapport aux tissus témoins. Le dernier jour de culture, la déviation moyenne mesurée pour les TRM n’était que de 0,11 mm contre 0,48 mm pour les EES témoins(figure 7B). À partir du jour 27, le taux de production de force et le taux de désintégration de la force étaient plus élevés dans les TRM que dans les ES témoins, alors qu’il n’y avait qu’une augmentation transitoire du travail sur les jours 25-28(figure supplémentaire 2).
Régime d’après-charge d’intervalle
Les HIT de rat sur les poteaux de silicone magnétiquement sensibles (MR-EHT) ont été cultivés à une charge minimale de 0,91 mN/mm jusqu’à ce qu’un plateau dans la force contractile ait été atteint. A partir de ce jour (17 jours après la coulée ehT), les MR-EHT ont subi un régime de chargement de 7 jours qui a exposé les EHT à des cycles d’après-charges alternant entre 0,91 et 6,85 mN/mm(figure 8A). L’après-charge des EHT de contrôle a été maintenue constante à 0,60 mN/mm pendant toute la durée de la culture. À la suite de cette intervention, les forces moyennes des TRM ont augmenté de 12,0 % par rapport au jour 17, tandis que celles mesurées pour les ES de contrôle n’ont augmenté que de 1,5 % au cours de la même période(figure 8B). Cependant, ces différences n’étaient pas statistiquement significatives. De plus, aucune différence significative dans le taux de production de la force, le taux de dégradation de la force et le travail contractuel n’a été mesurée(figure supplémentaire 3). Cela implique que le régime d’après-charge choisi n’était pas un moyen efficace d’augmenter la contractilité EHT.
Figure 1 : Racks en silicone assemblés magnétiquement réactifs. (A) Vue orthogonale et (B) vue sectionnelle des supports en silicone assemblés magnétiquement sensibles contenant cinq aimants. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Plaque d’aimant. Photographie de la plaque d’aimant et de son support d’attache. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Système d’entraînement mécanique. Photographie montrant le système de disques mécaniques utilisés pour ajuster la position horizontale de la plaque de 24 puits par rapport à la plaque d’aimant. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Plaque LED. Photographie de la plaque LED utilisée pour éclairer les EHT pour l’analyse de la contractilité optique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Dispositif d’accordage complet après la charge. Photographie du dispositif de réglage après charge entièrement assemblé, y compris la plaque LED. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Détermination optique de la rigidité post-postérieure. (A) La déviation d’un poteau de silicone magnétiquement réactif en présence d’un aimant d’étalonnage externe et sous l’influence de cinq poids d’essai a été évaluée à neuf espacements déterminés d’aimant (cinq indiqués comme exemples). (B) Relation déterminée entre l’espacement d’aimant et la rigidité de poteau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Réponse contractile des THE à une augmentation progressive de la charge après la charge. Mesures contractiles des EES de contrôle (ligne noire) et EHT cultivés sur des poteaux magnétiquement réactifs (MR-EHTs; ligne bleue) sur une période de culture de 31 jours. (A) les TM-EH ont eu des forces contractiles moyennes légèrement plus élevées que les ES de base de contrôle dans des conditions de base. À partir du jour 25, cependant, cette différence a été amplifiée avec l’augmentation de la charge après- charge. (B) La déviation post était similaire entre les deux groupes jusqu’au jour 27. Valeurs postérieures de chargement de 3,5 mN/mm, la déviation de poteau pour mr-EHTs a chuté sensiblement. Ici, 10 MR-EHT et n 10 EES de contrôle ont été analysés en adaptant un modèle mixte (REML - probabilité maximale restreinte) et le test de comparaison multiple de Sidak. Les barres d’erreur dans les graphiques représentent une erreur standard de la moyenne, p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Réponse contractile des THE à un protocole d’arrêt après charge. Le comportement contractile des EHT magnétiquement réactifs sous l’influence d’un régime fluctuant de la charge après-charge a été observé. (A) Le régime d’après-charge, qui a été lancé le jour 17 (d17), a exposé les MR-EHT à 40 s intervalles d’après-charge minimale (0,91 mM/mm) suivis de 40 s d’intervalles de charge maximale (6,85 mN/mm) pendant 7 jours. (B) MR-EHTs (barres bleues) a montré une tendance à l’augmentation des forces pendant le protocole d’arrêt après charge, tandis que les forces mesurées pour les EST de contrôle (barres noires) sont restées relativement inchangées. Pour ces expériences, 10 EES ont été analysés par groupe et ces données ont été comparées statistiquement à l’aide d’un test de comparaison multiple d’ANOVA et de Sidak à deux voies. Les barres d’erreur dans les graphiques représentent une erreur standard de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| 1 Rat EHT | 24 Rat EHTs (10 %) | 1 hiPSC-CM EHT | 24 EST hiPSC-CM (10 %) | Composant | |
| 5 x 105 | 1,3 x 107 | 1 x 106 | 2,6 x 107 | Cellules (cellules ventriculaires du cœur de rat néonatal ou cardiomyocytes dérivés du hiPSC) | |
| 5,57 l | 147 l | 5,57 l | 147 l | 2x DMEM: 20% sérum de cheval inactivé par la chaleur, 20% 10x DMEM, 2% pénicilline/streptomycine, 58% aqua ad iniectabilia | |
| 2,53 l | 66,8 l | 2,53 l | 66,8 l | Fibringen: 200 mg/mL Fibringen dissous dans 0,9% NaCl | |
| - | - | 0,1 l | 2,64 l | Y-27632 | |
| ad 100 L | ad 2640 L | ad 100 L | ad 2640 L | Milieu de moulage EHT : 88 % DMEM, 10 % de sérum foetal inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de L-glutamine | |
Tableau 1 : Mélange de reconstitution pour générer des EHT.
| Nom de commande | Syntaxe | Description | |
| Déplacer absolu | 1MVA[x] | L’étape se déplace pour positionner [x] en mm | |
| Vitesse de jeu | 1VEL[x] | Vitesse de mouvement de scène réglée à [x] en mm/s | |
| Arrêt d’urgence | 1EST | Arrête tout mouvement | |
| Attendre l’arrêt | 1WST | Seulement pendant l’enregistrement du programme; Attend l’achèvement de la commande de mouvement précédente avant d’exécuter le prochain commandement | |
| Attendez la période de temps | 1WTM[x] | Seulement pendant l’enregistrement du programme; Attend la période [x] en ms | |
| Enregistrement du programme Beginn | 1PGM[x] | Commencer l’enregistrement du programme dans la fente [x]; Note: Slot [x] doit être gratuit | |
| Enregistrement du programme final | 1END | Fin du programme d’enregistrement et d’enregistrement du programme | |
| Programme d’effacement | 1ERA[x] | Effacer le programme enregistré dans la fente [x] | |
| Exécuter le programme | 1EXC[x] | Exécuter le programme enregistré dans la fente [x] | |
| Programme de boucle | 1PGL[x] | [x]1 Mode boucle de programme ON [x]-0 Mode boucle de programme désactivé | |
| Lire et effacer les erreurs | 1ERR? | Rapport d’erreur de demande | |
Tableau 2 : Commandes utiles pour les expériences d’accordage après la charge.
Figure supplémentaire 1 : Dimensions des supports en silicone. (A) Vue supérieure, (B) vue latérale sectionnelle, et (C) vue détaillée de poste des supports en silicone utilisés pour ces études. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Paramètres contractuels supplémentaires pour l’augmentation progressive après la charge. Mesures contractiles des EES de contrôle (ligne noire) et EHT cultivés sur des poteaux magnétiquement réactifs (MR-EHTs; ligne bleue) sur une période de culture de 31 jours. (A) LES MR-EHT ont eu un taux de production de force significativement plus élevé que les EHT de contrôle à partir du jour 27. (B) Le taux de décomposition de la force était également significativement plus élevé chez les MR-EHT qu’en contrôle à partir du jour 27. (C) Alors que les travaux contractuels mesurés dans les EHT de contrôle ont progressivement augmenté sur toute la période de culture, le travail contractuel produit par les MR-EHT a atteint un sommet le jour 26 et est ensuite tombé à des niveaux inférieurs au contrôle. Pourtant, le travail dans les TRM-EHT n’a jamais été significativement plus élevé que celui des ERH de contrôle. Ici, 10 MR-EHT et n 10 EES de contrôle ont été analysés en adaptant un modèle mixte (REML - probabilité maximale restreinte) et le test de comparaison multiple de Sidak. Les barres d’erreur dans les graphiques représentent une erreur standard de la moyenne, p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 3 : Paramètres contractuels supplémentaires pour le protocole d’intervalle après chargement. Le comportement contractuel des EHTs magnétiquement réactifs (MR-EHTs) sous l’influence d’un régime fluctuant de la charge après-charge a été observé. (A) Pendant l’intervalle après le protocole de chargement, les TM (barres bleues) ont d’abord montré une tendance vers des taux de production de force plus élevés par rapport aux TH de contrôle (barres noires), mais ces différences n’étaient pas significatives et diminuées vers la fin de l’expérience. (B) Les taux de décomposition des forces mesurés dans les TRM et les ES témoins étaient statistiquement similaires tout au long du protocole d’arrêt après chargement. (C) Le travail contractuel mesuré pour les TRM-EHT a augmenté pendant les premiers jours du protocole d’intervalle après charge, mais a diminué le dernier jour. Le travail contractuel mesuré pour les ES de contrôle n’a pas sensiblement changé au cours de cette période de temps. Le travail dans les TRM n’a jamais été significativement plus élevé que le travail dans les EHT de contrôle. Pour ces expériences, 10 EHT par groupe ont été analysés par ANOVA à deux voies et le test de comparaison multiple de Sidak. Les barres d’erreur dans les graphiques représentent une erreur standard de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici décrit une nouvelle technique pour modifier magnétiquement la charge après-charge dans les tissus cardiaques conçus. Cette technique repose sur l’utilisation d’un stade piézoélectrique pour traduire une plaque d’aimants forts vers et loin des supports magnétiquement réactifs de poteaux en silicone. Plus les deux ensembles d’aimants sont proches, plus l’afterload éprouvé par les EHT cultivés sur eux.
Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles à la production et à l’utilisation réussies de ce système. Tout en fabriquant les supports en silicone magnétiquement réactifs, il est crucial de s’assurer que tous les aimants dans les poteaux sont orientés avec la même polarité. Si un aimant est placé dans l’orientation inverse, il servira à affaiblir plutôt qu’à augmenter la force du champ magnétique. De même, cette polarité devrait correspondre à celle de tous les aimants dans la plaque d’aimant, sinon les deux ensembles d’aimants repousseront, plutôt que de s’attirer l’un l’autre. En outre, dans la mesure du possible, s’abstenir d’utiliser des matériaux magnétiques dans la construction du dispositif d’ajustement après charge, car ils peuvent interférer avec le champ magnétique. L’aluminium est suggéré comme matériau de construction primaire pour cette raison. De même, si vous utilisez une étape piézoélectrique autre que celle énumérée dans le Tableau des matériaux,assurez-vous qu’il est résistant aux champs magnétiques et aux conditions de culture cellulaire standard (p. ex., 37 oC, 100 % d’humidité et concentrations élevées de CO2 et O2). Enfin, gardez à l’esprit que la plupart des étapes linéaires piézoélectriques sont destinées à être montés horizontalement, car ils ont tendance à avoir une faible capacité de charge. En tant que tel, si le poids de la plaque d’aimant dépasse cette capacité de charge, un contrepoids doit être utilisé pour décharger le moteur.
Malgré les meilleures pratiques, il est assez difficile de garder la surface encoder vierge. Lorsque cela se produit, l’étape cessera de se déplacer avant d’atteindre la position cible lorsqu’elle est en mode boucle fermée. La LED rouge du contrôleur de mouvement clignotera, en outre le logiciel de contrôleur de mouvement affichera un message d’erreur « Aucun encoder détecté ». Pour remédier à cela, l’utilisateur doit nettoyer la surface de l’encoder avec un morceau de tissu sans peluche trempé dans l’alcool isopropyl et laisser sécher à l’air.
Ce protocole démontre les mesures prises par notre laboratoire pour produire et mettre en œuvre ce système. Cependant, plusieurs de ces étapes pourraient être réalisées par des moyens différents. Par exemple, on pourrait utiliser un transducteur de force, plutôt que des moyens optiques, pour confirmer la relation entre l’espacement d’aimant et la rigidité de poteau. En outre, les poteaux personnalisés peuvent être conçus et fabriqués avec des aimants intégrés et des accolades. Cependant, nous avons constaté que le positionnement précis de ces objets est plus facile à accomplir manuellement. Pour affiner la gamme de charges d’après-travail applicables par ce système, ces poteaux peuvent être fabriqués avec des rigidités basales différentes ou avec un nombre différent d’aimants. Bien que, l’utilisation de trop d’aimants entravera la flexion après. Alternativement, cela peut également être réalisé en ajustant la taille et la force des aimants dans la plaque d’aimant. Des aimants plus grands et plus forts donneront des charges après-charge plus élevées.
Il y a plusieurs limites à cette méthode qui pourraient être améliorées dans les versions futures de ce système. À savoir, la gamme de charges postérieures applicables est physiquement limitée par l’espacement maximal et minimal entre les aimants de poteau et les aimants de plaque. Idéalement, les poteaux utilisés pour ce système placeraient les tissus aussi près que possible de la base du plat de culture tissulaire, sans permettre directement au tissu de toucher le fond de l’assiette. Cependant, les postes utilisés dans ces études ont été fabriqués commercialement avant le développement de ce système, de sorte que la longueur des postes n’ont pas été optimisés pour cette plate-forme. De même, puisque le système d’analyse de la contractilité EHT a été construit avant ce système, il n’a pas été conçu pour permettre aux cordons électriques dans ou hors de l’espace de mesure. En tant que tel, la présence de ces cordons a entraîné un petit espace d’air, ce qui a permis aux gaz de s’échapper lentement de la chambre intérieure. Cela pourrait être amélioré en ajustant les débits de gaz en conséquence. Cependant, idéalement, une incarnation future de ce système aurait isolé les points de sortie et d’entrée pour ces cordons. Si l’on souhaite effectuer ces expériences en l’absence du système d’analyse de la contractilité EHT, la plate-forme de réglage après charge peut plutôt être placée dans un incubateur. Bien que, le système dans son intégralité ne s’adaptera dans un incubateur standard si une ou plusieurs des étagères sont enlevées, rendant cet espace indisponible pour d’autres cellules et ou des fins de culture tissulaire. Pour observer optiquement les tissus dans l’un ou l’autre environnement, des lumières seront nécessaires. Les lumières LED utilisées pour ce système se sont avérées pour dégager une quantité substantielle de chaleur. Si elle est laissée allumée pendant de longues périodes, cette chaleur pourrait potentiellement endommager les tissus. En tant que tel, pour ces études, les lumières n’ont été utilisées que pendant de courtes périodes tout en évaluant la contractilité des tissus. Cependant, si l’on désire observer systématiquement les tissus, le système d’éclairage devra être optimisé à ces fins.
Afterload a déjà été étudié dans les modèles EHT16,23. Cependant, ces œuvres présentaient des techniques qui n’étaient en mesure d’obtenir qu’une augmentation statique singulière de la charge. Alternativement, ce travail a démontré comment une plate-forme magnétique peut être utilisée pour affiner et réguler temporellement le chargement d’après-plan dans les EHT. Les résultats de deux ensembles distincts d’expériences ont été utilisés pour illustrer la large gamme de schémas post-charge qui peuvent être appliqués aux EHT à l’aide de cet appareil. Les applications futures prévues de ce système incluent des études sur l’effet du régime appliqué d’après-charge (dose et durée) sur la maturation des tissus et le remodelage pathologique.
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Disclosures
TE et MNH sont les co-fondateurs d’EHT Technologies GmbH. Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Jutta Starbatty pour son soutien dans le travail de la culture tissulaire, Axel Kirchhof pour la photographie, Alice Casagrande Cesconetto pour le travail d’édition, et un merci spécial à B’lnt Aksehirlioglu pour le soutien technique dans le développement de ce dispositif. B.B. a été soutenu par un boursier DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire), M.L.R. par un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant et M.N.H. par des fonds de la DZHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d = 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
References
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