Summary
Este protocolo proporciona métodos detallados que describen la fabricación e implementación de una plataforma de ajuste de la carga posterior basada en magnéticos para tejidos cardíacos diseñados.
Abstract
Se sabe que la carga posterior impulsa el desarrollo de estados cardíacos fisiológicos y patológicos. Como tal, el estudio de los resultados de los estados alterados de la carga posterior podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que controlan estos procesos críticos. Sin embargo, actualmente falta una técnica experimental para afinar con precisión la descarga posterior en el tejido cardíaco con el tiempo. Aquí, se describe una técnica basada en magnéticos recientemente desarrollada para lograr este control en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT). Con el fin de producir EHT magnéticamente sensibles (MR-HIF), los tejidos se montan en postes de silicona huecos, algunos de los cuales contienen pequeños imanes permanentes. Un segundo conjunto de imanes permanentes se ajusta a presión en una placa de acrílico de tal manera que están orientados con la misma polaridad y están alineados axialmente con los imanes de poste. Para ajustar la carga posterior, esta placa de imanes se traduce hacia (mayor carga posterior) o lejos (carga posterior inferior) de los imanes de poste utilizando una etapa piezoeléctrica equipada con un codificador. El software de control de movimiento utilizado para ajustar el posicionamiento de la etapa permite el desarrollo de regímenes de postcarga definidos por el usuario, mientras que el codificador garantiza que la etapa corrige cualquier incoherencia en su ubicación. Este trabajo describe la fabricación, calibración e implementación de este sistema para permitir el desarrollo de plataformas similares en otros laboratorios de todo el mundo. Se incluyen resultados representativos de dos experimentos separados para ejemplificar la gama de diferentes estudios que se pueden realizar con este sistema.
Introduction
Después de la carga es la carga sistólica en el ventrículo después de que ha comenzado a expulsar sangre1. Durante el desarrollo cardíaco, una carga posterior adecuada es de importancia crítica para la maduración de cardiomiocitos2. En la edad adulta, los niveles bajos de carga posterior ventricular (por ejemplo, en pacientes postrados en cama con lesión medular de alto nivel3 o en casos muy especiales como el vuelo espacial4) pueden dar lugar a la hipotrofia del corazón. Por el contrario, una alta carga posterior puede conducir a hipertrofia cardíaca5. Mientras que la hipertrofia cardíaca en atletas de resistencia o mujeres embarazadas se considera beneficiosa y fisiológica, la hipertrofia asociada con hipertensión arterial a largo plazo o estenosis de la válvula aórtica grave es perjudicial ya que predispone a una arritmias cardíacas e insuficiencia cardíaca6. Aunque la tasa de mortalidad a 5 años de los pacientes con insuficiencia cardíaca se ha reducido del 70% en la década de 19806 a 40–50%7 en la actualidad, todavía existe una gran necesidad de nuevas opciones de tratamiento terapéutico para esta condición altamente prevalente (actualmente 2,2% de la población en el mundo occidental)8.
Con el fin de investigar los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca patológica y probar estrategias preventivas o terapéuticas para el tratamiento de esta enfermedad, se han desarrollado modelos in vivo de poscarga99,10,,11,,12. Si bien estos modelos han ofrecido información beneficiosa sobre los efectos de la carga posterior en el rendimiento ventricular, no permiten un control fino sobre la magnitud de la carga posterior. Alternativamente, los estudios in vitro de la carga posterior realizados en corazones extirpados y preparaciones musculares permiten un control más preciso sobre la carga de tejidos, pero estos modelos no son propicios para estudios longitudinales13,,14,,15.
Para superar estos problemas, desarrollamos un modelo in vitro de postcarga elevada en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT)16,,17. Este modelo es un formato de cultivo tridimensional para células de corazón de rata incrustadas en una matriz de fibrina suspendida entre postes de silicona huecos flexibles. Estos tejidos laten espontáneamente (contra la resistencia de los postes de silicona) y realizan trabajos auxiliares. Hemos aumentado la carga posterior aplicada a los EHT en un factor de 12 en experimentos anteriores mediante la inserción de llaves metálicas rígidas en los postes de silicona huecos durante una semana. Esto condujo a una multitud de cambios, característicos de la hipertrofia cardíaca patológica18,,19,20: hipertrofia de cardiomiocitos, necroptosis parcial, disminución de la fuerza contráctile, deterioro de la relajación tisular, reactivación del programa genético fetal, un desplazamiento metabólico de la oxidación de ácidos grasos a glucólisis anaeróbica, y un aumento de la fibrosis. Aunque este procedimiento se ha empleado con éxito en varios estudios17,21,22, tiene algunas desventajas. Sólo hay dos estados, bajo o muy alto (12 veces) después de la carga, y el procedimiento requiere el manejo manual de los EGT, lo que limita su flexibilidad temporal y plantea el riesgo de contaminación.
Recientemente, Leonard y otros utilizaron una técnica similar para modular la carga posterior en EHT cultivados en postes de silicona23. Se colocaron llaves de diferentes longitudes alrededor del exterior de los postes para restringir su movimiento de flexión. Los autores de este estudio informaron que un aumento singular de la carga de fuerza mejorada desarrollo de la fuerza y maduración de EHT derivados de iPS humanos, mientras que las cargas más altas resultaron en un estado patológico. Sin embargo, al igual que nuestro propio sistema, esta técnica sólo permite aumentos singulares en la carga posterior, cuya magnitud está dictada por la longitud de los frenos. Como tal, las alteraciones finas en la carga posterior, las modificaciones en la carga posterior a lo largo del tiempo, y los regímenes de carga precisos no son posibles con estas técnicas.
Aquí, proporcionamos el protocolo para un sistema que se puede utilizar para modular la post-resistencia, es decir, la carga posterior de EhTs magnéticamente24. Esta plataforma facilita el ajuste preciso de la carga posterior, permite los regímenes de postcarga definidos por el usuario y garantiza la esterilidad de EHT.
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Protocol
1. Preparación de la plataforma de ajuste Afterload
NOTA: Los pasos implicados en esta porción del protocolo no son sensibles al tiempo.
- Fabricación de los bastidores de silicona magnéticamente sensibles
NOTA: Estos bastidores sirven como la plataforma de cultura para los EHT. Cada EHT se suspende entre dos postes de silicona, que imparten la carga posterior al tejido. El grado de carga posterior está directamente relacionado con la rigidez de estos postes. Para habilitar el ajuste magnético de la carga posterior, algunos de los postes deben ser sensibles magnéticamente.- Adquirir bastidores de 24 pocillos compatibles con placas de 24 pocillos de silicona (dimensiones indicadas en la Figura Suplementaria 1). Los bastidores utilizados en este estudio fueron producidos por un proveedor comercial de productos de silicona de acuerdo con estas dimensiones utilizando silicona con una dureza de la costa de 40.
- Determinar la polaridad de los imanes de poste (p. ej., d a 0,5 mm, h a 2,0 mm; ver Tabla de materiales)colocándolos en un imán permanente más grande.
- Manteniendo una polaridad fija, lubrique los imanes con agua e insértelos, uno a la vez, en los postes más exteriores de los bastidores de silicona.
NOTA: Si intenta insertar más de un imán a la vez, la resistencia adicional hará que sea más difícil empujar los imanes a la parte inferior del poste. - Utilice una pieza contundente de alambre dental de acero inoxidable (d a 0,4 mm, véase Tabla de materiales)para empujarlos cuidadosamente a la parte inferior de la cavidad del poste hueco. Puedes apilar hasta cinco imanes en cada poste.
- Utilizar alicates (de punta redonda) para doblar el alambre dental de acero inoxidable (d a 0,4 mm, ver Tabla de materiales)en soportes de 11,25 mm de ancho y 15 mm de largo. Utilice cortadoras de alambre para cortar las llaves y un archivo para suavizar la superficie de corte. Para asegurarse de que se alcanzan las dimensiones correctas, se puede utilizar una plantilla auto-hecha para ayudar en la flexión del alambre.
NOTA: La inmovilización posterior también se puede lograr mediante aparatos ortopédicos fabricados con otros materiales, siempre y cuando no sean magnéticos y rígidos. - Lubricar las llaves con agua e insertarlas en el bastidor de silicona, fijando el segundo y el tercer poste en el proceso (consulte la figura 1 para la configuración completa del bastidor de silicona).
NOTA: Opcionalmente, con el fin de adaptar la rigidez de la línea de base de los postes de control para que coincida con la de los postes magnéticamente sensibles, se pueden insertar fragmentos de varilla redonda de estireno (ver Tabla de materiales)en los postes vacíos (aquellos sin un dispositivo o imán). - Deje reposar los bastidores durante 1-2 días para permitir que el agua restante se seque al aire.
- Cuando los postes estén secos, selle los orificios en la parte superior de los postes huecos de silicona que contienen los imanes con una gota de pegamento de silicona.
- El dispositivo de ajuste de carga posterior
NOTA: A medida que los imanes del dispositivo de ajuste de la carga posterior se mueven hacia o lejos de los de los postes de silicona, las fuerzas magnéticas atractivas aumentan o disminuyen en consecuencia, lo que resulta en una rigidez alterada de los postes de silicona. Este movimiento se logra utilizando una etapa piezoeléctrica. Debido a la naturaleza prototípica del dispositivo de ajuste de la carga posterior, no se proporcionarán instrucciones detalladas paso a paso sobre cómo replicarlo. En su lugar, las directrices generalizadas para construir un dispositivo de ajuste de carga posterior similar se detallan aquí.- Obtener un motor lineal piezoeléctrico de alta precisión para permitir la traducción vertical de la placa de imán hacia y lejos de los EIMT (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Se sugiere encarecidamente que este motor esté equipado con un codificador lineal para corregir el posicionamiento de la etapa. - Coloque un conjunto de imanes permanentes dentro de un soporte no magnético de modo que estén alineados axialmente con los imanes de poste cuando se coloquen directamente debajo de ellos. Aquí, los grandes imanes cilíndricos (d a 13 mm, h a 14 mm; ver Tabla de Materiales)se ajustaban a presión dentro de una placa de plástico acrílico ("placa de imán").
- Fije el soporte del imán a la etapa piezoeléctrica utilizando un material no magnético. Esto se puede lograr utilizando una pieza de aluminio en forma de L (ver Figura 2).
- Construya un marco que pueda albergar los componentes del dispositivo de ajuste de carga posterior. Como mínimo, esta estructura debe tener una ubicación en la que montar verticalmente la etapa piezoeléctrica, así como un marco rígido en el que colocar la placa de 24 pocillos.
NOTA: Se sugiere que la ubicación de este soporte sea modificable en el plano horizontal para permitir ajustes en la alineación axial entre los dos conjuntos de imanes. Se utilizó un sistema de accionamientos mecánicos para lograr esta maniobrabilidad en el sistema presentado(Figura 3). El dispositivo de ajuste de la carga posterior descrito aquí fue diseñado para ser compatible con el sistema de análisis de contractilidad EHT (ver Tabla de Materiales). Como tal, sus dimensiones se limitaban a 29 cm de ancho, 29 cm de profundidad y 16 cm de altura para caber dentro de este sistema. - Para permitir el análisis visual de los tejidos, instale una fuente de luz dentro del dispositivo de ajuste de la carga posterior. Aquí, se empleó una serie de LEDs(Figura 4) para iluminar los EHT desde abajo(Figura 5).
- Obtener un motor lineal piezoeléctrico de alta precisión para permitir la traducción vertical de la placa de imán hacia y lejos de los EIMT (ver Tabla de Materiales).
- Calibración del sistema de ajuste de la carga posterior
Nota:Con el fin de aumentar con precisión la descarga posterior de EHT al valor deseado, será necesario determinar la relación entre el espaciado del imán y la rigidez del poste resultante.- Mida el espaciado de imán más cercano (dmin) y más lejano (dmax) posible en su configuración. Estas distancias dictarán las cargas posteriores máximas y mínimas alcanzables.
NOTA: La parte inferior de la placa de cultivo evitará el contacto directo entre la placa imán y los postes de silicona con respuesta magnética. - Produzca una gama de pesos no magnéticos y móntelos en cadena para que sirvan como cargas de prueba.
- Determine los pesos de las cargas de prueba utilizando una báscula fina y etiquételas de acuerdo con este peso. Aquí, se utilizaron seis diferentes pesos de vidrio acrílico que van desde 30 mg a 200 mg.
NOTA: Seleccione pesos que sean lo suficientemente pesados como para doblar el poste, pero no tan pesados que doblen el poste más de unos pocos milímetros. El uso de un mayor número de cargas de prueba garantiza que la calibración sea más precisa, pero también llevará más tiempo. - Monte uno de los bastidores de silicona verticalmente (utilizando materiales no magnéticos), de modo que los postes de silicona con respuesta magnética estén orientados horizontalmente.
- Monte uno de los imanes de placa (el "imán de calibración") en una etapa lineal que viaja horizontalmente de tal manera que esté alineado axialmente con el poste de respuesta magnética.
- Coloque el imán de calibración a una distancia definida desde el poste de silicona con capacidad de respuesta magnética utilizando la etapa horizontal (preferiblemente, comience a una distancia igual al espaciado máximo del imán alcanzable por el dispositivo de ajuste de la carga posterior).
- Coloque una cámara (por ejemplo, consulte Tabla de materiales)al lado de esta configuración para poder registrar ópticamente la desviación del poste bajo la influencia de las cargas de prueba.
NOTA: Se sugiere que el usuario emplee una cámara con una resolución de al menos 2 megapíxeles para garantizar una determinación precisa de la desviación posterior. - Tome una foto del poste en ausencia de cualquier peso para utilizar como referencia para la posición "neutral" del poste.
- Sin cambiar la perspectiva de la cámara, conecte una de las cargas al extremo del poste de silicona y tome una foto del poste que se dobla bajo la influencia del peso.
- Repita esta medida para todos los pesos.
- Determinar ópticamente la desviación del poste de silicona causada por la fuerza gravitacional de cada peso.
- Graficar la desviación del poste de silicona (x, en el eje X) contra la fuerza gravitacional de cada peso de prueba (mg, en el eje Y). Esto debería producir una relación lineal entre la fuerza y la desviación.
NOTA: Si los datos no son lineales, esto puede indicar que el poste está fuera de su rango lineal de desviación, es decir, los pesos utilizados eran demasiado pesados. - Trazar una función de regresión lineal pasando a través de (0,0) y los datos adquiridos (consulte la figura 6A para ver ejemplos). La pendiente de esta función (mg - kx) es la rigidez k del poste de silicona magnéticamente sensible en el espaciado de imán probado.
- Repita estos pasos en varios espaciados entre dmax y dmin. Aquí, se analizaron las desviaciones en nueve posiciones de imán diferentes que van de 31 mm a 5 mm.
- Determine la rigidez de la base del poste de silicona con capacidad de respuesta magnética en ausencia del imán de calibración utilizando la misma técnica.
- También determinar la rigidez de un poste de control móvil, no magnéticomente sensible utilizando la misma técnica.
- Trazar los valores k resultantes contra las distancias de imán respectivas. Esto debería producir una relación exponencial negativa.
- Trazar una función de regresión a través de estos valores. Por ejemplo, utilice Ajuste no lineal ( Non-linear fit ) Función de descomposición monofásica en el software de análisis (ver la Tabla de Materiales). Esta función de regresión describe la relación entre el espaciado del imán y la carga posterior (véase la figura 6B para un ejemplo).
- Mida el espaciado de imán más cercano (dmin) y más lejano (dmax) posible en su configuración. Estas distancias dictarán las cargas posteriores máximas y mínimas alcanzables.
2. Generación y Cultura EHT
NOTA: La generación y la cultura de EHT se han descrito con gran detalle en otro artículo25. Por lo tanto, sólo cubriremos estos aspectos brevemente en nuestro protocolo. Por favor, lleve a cabo los siguientes pasos bajo condiciones estériles, adhirándose a las buenas prácticas de cultivo celular.
-
Generación de EHT
- Sumerja los estantes de silicona previamente preparados en un recipiente lleno de 70% de etanol durante al menos 20 minutos.
PRECAUCION: No autoclave los postes de silicona ajustables en la carga posterior para esterilizarlos, ya que las altas temperaturas pueden dañar los imanes permanentes. - Lleve este recipiente al gabinete de bioseguridad, enjuague los estantes 2veces con agua estéril y déjelos secar al aire.
NOTA: Para reducir la probabilidad de contaminación, este proceso debe llevarse a cabo en el mismo gabinete de bioseguridad que posteriormente se utilizará para fundir los EHT. - Adquirir (y descongelar si es necesario) células ventriculares del corazón de rata neonatal o cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (también disponibles comercialmente) y preparar la mezcla de reconstitución de EHT de acuerdo con la Tabla 1.
- Pipet 1.5 mL de solución caliente de agarosa del 2% en los 4 pocillos más a la izquierda de una placa de cultivo de 24 pocillos e inserte inmediatamente un espaciador de politetrafluoroetileno (PTFE) (ver Tabla de Materiales)en la solución de agarosa líquida.
- Repita el paso anterior para los 20 pozos restantes dentro de la placa de cultivo.
- Después de permitir que la agarosa se solidifique durante 10 minutos, retire cuidadosamente los espaciadores de PTFE.
NOTA: La agarosa se vuelve turbia cuando se ha solidificado. - Inserte los postes de los estantes de silicona sensibles magnéticamente en los huecos de agarosa producidos por los espaciadores de PTFE.
- Pipet 100 l de la mezcla de reconstitución en una alícuota de 3 l de solución de trombina de 100 ml/L. Pipetear hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar y transferir rápidamente la mezcla al vacío dentro del primer molde de agarosa en la placa de cultivo.
- Repita el paso anterior para los 23 moldes restantes, utilizando una nueva punta de pipeteo para cada EHT.
NOTA: Mezcle suavemente la constitución mezcla cada 6-8 EIMTs para evitar la sedimentación celular. - Almacene la placa de 24 pocillos en una incubadora (37oC, 7% CO2,40% O2) durante 90 min. Mientras tanto, prepare el medio EHT complementando el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero de caballo, un 1% de penicilina/estreptomicina, 10 g/ml de insulina y 33 g/ml de aprotinina.
- Añadir 500 s de medio EHT caliente a cada poca.
- Almacene la placa de 24 pocillos en una incubadora (37oC, 7% CO2,40% O2) durante 30 min. Durante este tiempo, prepare una segunda placa de 24 pocillos con 1,5 ml de medio EHT en cada poca y colóquela en la incubadora.
- Retire cuidadosamente los estantes de silicona sensibles al imán con los HEH recién fundidos de los moldes de agarosa y transfieralos a la segunda placa de 24 pocillos.
- Sumerja los estantes de silicona previamente preparados en un recipiente lleno de 70% de etanol durante al menos 20 minutos.
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Cultura EHT
NOTA: Después de la fundición de tejido, cambie el medio tres veces por semana: los lunes, miércoles y viernes.- Para un cambio medio, pipeteo 1,5 ml de medio EHT fresco por pozo en una nueva placa de cultivo de 24 pocillos y coloque esta placa dentro de la incubadora a 37 oC, 7% CO2y 40% O2 durante al menos 30 minutos.
- Transfiera los bastidores de silicona de la placa antigua de 24 pocillos a la placa nueva bajo una campana de cultivo celular.
- Almacene las placas EHT cerradas en una incubadora a 37oC, 7% CO2y 40% O2.
3. Experimentos de modificación después de la carga
NOTA: Los siguientes pasos de protocolo son específicos de la plataforma de análisis de contractilidad óptica y motor piezoeléctrico enumerada en la Tabla de Materiales.
- Preparación del dispositivo de ajuste de carga posterior para experimentos
- Para medir los efectos de las manipulaciones de carga posterior en la contractilidad EHT, desconecte y retire el sistema de iluminación del compartimento más interno de la plataforma de análisis de contractilidad óptica e inserte el dispositivo de ajuste de carga posterior, incluida la fuente de luz.
- Instale el software de control de movimiento de etapa (consulte Tabla de materiales)en el equipo que se utilizará para ejecutar el dispositivo de ajuste de carga posterior.
- Conecte el motor de etapa piezoeléctrico al controlador de movimiento (consulte Tabla de materiales) y el controlador de movimiento al ordenador. Asegúrese de que el controlador de movimiento también esté conectado a una fuente de alimentación.
NOTA: Hay dos luces en la cara del controlador de movimiento. Al conectarse a la alimentación, ambas luces parpadean en rojo durante unos segundos. Durante el funcionamiento, la luz superior permanece verde, mientras que la inferior solo debe ponerse roja si se produce un error. - Coloque una placa de cultivo vacía de 24 pocillos en el soporte de la placa en la parte superior del dispositivo de sintonización de la carga posterior.
- Alinee ópticamente la placa de cultivo vacía con la placa de imán de abajo utilizando el sistema de accionamiento mecánico XY conectado al soporte.
- Funcionamiento del dispositivo de ajuste de la carga posterior
- Inicie el software de la plataforma del controlador de movimiento.
- Conecte el software al motor de la etapa piezoeléctrica seleccionando el puerto designado como puerto de etapa durante la instalación del software de control de movimiento y luego haga clic en el botón de puerto abierto.
NOTA: Después de completar este paso, el puerto debe designarse como "abierto" y aparecer en un cuadro verde. - Vaya al panel Sistema. Seleccione Abrir bucle en el menú desplegable Bucle.
- Mueva manualmente la placa de imán a su posición más alta, es decir, el espaciado de imán más cercano posible dmin. La placa de imán debe hacer contacto con el soporte de la placa de cultivo.
- Vaya al panel Movimiento. Haga clic en el botón Cero para restablecer la posición actual de la etapa piezoeléctrica a 0 mm.
- Mueva manualmente la placa imán a su posición más baja posible. Anote la posición del codificador (indicada en el panel Movimiento por Enc)para determinar el rango de movimiento del motor de etapa piezoeléctrico.
- Establezca los Límites de viaje en el panel Sistema en valores dentro del rango de movimiento determinado en el paso anterior. Esto evita que la placa de imán se tope con la placa de cultivo o la parte inferior del dispositivo de sintonización de la carga posterior.
- Una vez más, mueva la placa imán a su posición más alta y haga clic en el botón Cero.
- Vaya al panel del sistema y cambie el modo de bucle de retroalimentación a Bucle cerrado. Esto garantiza que la etapa corregirá cualquier error en su posicionamiento.
- Haga clic en el botón Guardar del cuadro Guardar parámetros para almacenar estos ajustes en el sistema.
- Coloque una placa de cultivo de 24 pocillos que contenga EHT en estantes de silicona magnéticamente sensibles en el soporte de la placa de cultivo.
- Para calcular el espaciado del imán necesario para lograr la carga posterior deseada, resuelva la función de regresión no lineal del paso 1.3.19 para el parámetro de espaciado del imán d. Por ejemplo, si la
ecuación es: , d siendo el espaciado del imán (en mm) necesario para lograr la descarga deseada k en mN/mm, un espaciado de imán de 12,12 mm sería necesario para lograr una carga posterior de 5 mN/mm. - Restar dmin del espaciado de imán calculado d. El resultado es la distancia que la placa imán tiene que viajar desde su posición Cero para lograr la carga posterior deseada.
- Escriba este valor en el campo de entrada Posición de destino 1 del panel Movimiento y haga clic en Ir para ajustar la carga posterior de los EHT al valor calculado.
- Opcional: Programación de la etapa para un régimen de intervalo de carga posterior
NOTA: La sección anterior describe cómo programar la etapa para moverse y permanecer en una sola posición. Sin embargo, también es posible encadenar diferentes comandos en un programa para lograr una secuencia de movimientos ejecutada automáticamente, que puede repetirse en un bucle continuo. Para obtener instrucciones más detalladas sobre el software de la plataforma del controlador de movimiento, consulte el manual de instrucciones proporcionado por el fabricante de la etapa.- Después de configurar el dispositivo de ajuste de carga posterior como se describe en la sección anterior, abra el panel Comando. Escriba el comando 1PGM1 y pulse Intro para iniciar la grabación de un programa.
- Para crear un programa que, por ejemplo, hará que la etapa piezoeléctrica se mueva 30 mm desde la posición Cero (lejos de los ETM) y regrese después de 40 s, ingrese la siguiente cadena de comandos: 1MVA30 - 1WST - 1WTM40000 - 1MVA0 - 1WST
- Utilice el comando 1END para concluir la grabación de un programa y guardarlo.
- Utilice el comando 1EXC1 para ejecutar el programa grabado.
- Para mantener el programa ejecutándose en bucle continuo, escriba 1PGL1, seguido del comando 1EXC1.
- Para terminar un programa de bucle, escriba el comando 1EST.
NOTA: La Tabla 2 contiene algunos comandos útiles para experimentos de modificación de la carga posterior. Puede encontrar una lista completa de los comandos disponibles para este sistema en el manual de referencia del sistema de control de movimiento modular.
ecuación es: , d siendo el espaciado del imán (en mm) necesario para lograr la descarga deseada k en mN/mm, un espaciado de imán de 12,12 mm sería necesario para lograr una carga posterior de 5 mN/mm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuantificación de rigidez del poste del imán
Un poste de silicona con respuesta magnética horizontal se montó en una posición fija, y se colocó un imán de calibración alineado axialmente a varias distancias definidas ("espaciados de imán") de este poste. Las cargas de prueba de peso conocido se suspendieron del extremo del poste de silicona, haciendo que el poste se doblara. Esta desviación se cuantificó ópticamente. Se observó una relación lineal entre la fuerza gravitacional de la carga de prueba y la desviación posterior resultante en todos los espaciados de imanes(Figura 6A). Los valores de rigidez derivados de estas relaciones lineales siguieron una tendencia exponencial negativa con el aumento del espaciado de los imanes(Figura 6B).
Aumento escalonado después de la carga
El control y los EGT con capacidad magnética (MR-HGT) producidos a partir de corazones de rata se cultivaron en ausencia de carga posterior magnética (0,6 mN/mm para los tejidos de control y 0,91 mN/mm para MR-EhT) hasta que se alcanzó una meseta en la fuerza contráctil. En este día (24 días después de la fundición EHT), MR-HIF y EHT de control tenían fuerzas medias similares (0,29 mN frente a 0,22 mN). Durante la semana siguiente, la carga posterior ejercida en MR-HEHTs se incrementó incrementalmente de 0,91 a 6,85 mN/mm, mientras que la carga posterior para los EHT de control se mantuvo constante. La fuerza contráctil media aumentó con el aumento de la carga posterior hasta 0,95 mN, lo que marca más de un aumento de fuerza de más de 3 veces en comparación con el valor medio (0,29 mN) medido para los EHT de control(Figura 7A). La deflexión posterior, por otro lado, disminuyó en comparación con los tejidos de control. En el último día de cultivo, la desviación media medida para MR-HEH tMr fue de sólo 0,11 mm en comparación con 0,48 mm para los EHT de control(Figura 7B). A partir del día 27, la tasa de producción de fuerza y la tasa de decaimiento de la fuerza fueron más altas en los MR-EHT que en los EHT de control, mientras que sólo hubo un aumento transitorio en el trabajo durante los días 25–28(Figura suplementaria 2).
Régimen de intervalo sin carga
Los EGT de rata en postes de silicona magnéticamente sensibles (MR-HGT) se cultivaron con una carga posterior mínima de 0,91 mN/mm hasta que se alcanzó una meseta con fuerza contráctil. A partir de este día (17 días después de la fundición ehT), los MR-EHT se sometieron a un régimen de carga posterior de 7 días que expuso los EHT a ciclos de postcargas alternando entre 0,91 y 6,85 mN/mm(Figura 8A). La carga posterior de los EIM de control se mantuvo constante a 0,60 mN/mm durante toda la duración del cultivo. Tras esta intervención, las fuerzas medias de los MR-HEH aumentaron un 12,0% en comparación con el día 17, mientras que las medidas para los EHT de control solo aumentaron un 1,5% en el mismo período de tiempo(Figura 8B). Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Además, no se midieron diferencias significativas en la tasa de producción de fuerza, la tasa de descomposición de la fuerza y el trabajo contentual(Figura complementaria 3). Esto implica que el régimen de poscarga seleccionado no era un medio eficiente de aumentar la contractilidad de EHT.
Figura 1: Bastidores de silicona magnéticomente responsivos. (A) Vista ortogonal y (B) vista seccional de bastidores de silicona montados con capacidad magnética de respuesta que contengan cinco imanes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Placa de imán. Fotografía de la placa imán y su soporte de fijación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Sistema de accionamiento mecánico. Fotografía que muestra el sistema de accionamientos mecánicos utilizados para ajustar la posición horizontal de la placa de 24 pocillos con respecto a la placa de imán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Placa LED. Fotografía de la placa LED utilizada para iluminar EHTs para análisis de contractilidad óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Dispositivo de ajuste de carga posterior completamente montado. Fotografía del dispositivo de sintonización de la carga posterior completamente montado, incluida la placa LED. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Determinación óptica de la rigidez del poste. (A) La desviación de un poste de silicona con respuesta magnética en presencia de un imán de calibración externo y bajo la influencia de cinco pesos de prueba se evaluó en nueve espaciados de imán determinados (cinco se muestran como ejemplos). (B) Relación determinada entre el espaciado del imán y la rigidez del poste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Respuesta contráctil de los EHT a un aumento escalonado de la carga posterior. Mediciones contráctil de EGT de control (línea negra) y EhT cultivados en postes magnéticamente sensibles (MR-HGT; línea azul) durante un período de cultivo de 31 días. (A) los MR-HIT tenían fuerzas contráctilpromedios medias ligeramente más altas que las EHT de control en condiciones de referencia. A partir del día 25, sin embargo, esta diferencia se amplió con el aumento de la carga posterior. (B) La desviación posterior fue similar entre ambos grupos hasta el día 27. Los valores de descarga posterior anteriores de 3,5 mN/mm, la desviación posterior para LOS MR-EHT disminuyó sustancialmente. En este punto, se analizaron los EGT de control n a 10 MR-HLT y n a 10 mediante el montaje de un modelo mixto (REML - probabilidad máxima restringida) y la prueba de comparación múltiple de Sidak. Las barras de error de los gráficos representan un error estándar de la media, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Respuesta contráctil de los ETM a un protocolo de carga posterior de intervalo. Se observó el comportamiento contentual de los EHT con capacidad magnéticamente bajo la influencia de un régimen fluctuante de poscarga. (A) El régimen de carga posterior, que se inició el día 17 (d17), expuso los MR-HET a intervalos de 40 s de carga posterior mínima (0,91 mM/mm) seguidos de intervalos de 40 s de carga posterior máxima (6,85 mN/mm) durante 7 días. (B) MR-HEHTs (barras azules) mostraron una tendencia hacia el aumento de las fuerzas durante el intervalo después del protocolo de carga, mientras que las fuerzas medidas para los EIM de control (barras negras) se mantuvieron relativamente sin cambios. Para estos experimentos, se analizaron los EGT de n a 10 por grupo y estos datos se compararon estadísticamente utilizando una prueba de comparación múltiple de ANOVA y Sidak de 2 vías. Las barras de error de los gráficos representan un error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 Rata EHT | 24 Rat EHTs (+10%) | 1 HIPSC-CM EHT | 24 HET hiPSC-CM (+10%) | Componente | |
| 5 x 105 | 1.3 x 107 | 1 x 106 | 2.6 x 107 | Células (células ventriculares del corazón de rata neonatal o cardiomiocitos derivados de hiPSC) | |
| 5.57 L | 147 l | 5.57 L | 147 l | 2x DMEM: 20% suero de caballo inactivado por calor, 20% 10x DMEM, 2% penicilina/estreptomicina, 58% aqua ad iniectabilia | |
| 2.53 L | 66,8 l | 2.53 L | 66,8 l | Fibrinógeno: 200 mg/ml fibrinógeno disuelto en 0,9% NaCl | |
| - | - | 0,1 l | 2,64 l | Y-27632 | |
| ad 100 l | ad 2640 L | ad 100 l | ad 2640 L | Medio de fundición EHT: 88% DMEM, 10% suero de becerro fetal inactivado por calor, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina | |
Tabla 1: Mezcla de reconstitución para generar EHT.
| Nombre del comando | Sintaxis | Descripción | |
| Mover absoluto | 1MVA[x] | La etapa se mueve a la posición [x] en mm | |
| Establecer velocidad | 1VEL[x] | Velocidad de movimiento del escenario establecida en [x] en mm/s | |
| Parada de emergencia | 1EST | Detiene cualquier movimiento | |
| Espere a que se detenga | 1WSt | Sólo durante la grabación del programa; Espera a que se complete el comando de movimiento anterior antes de ejecutar el siguiente comando | |
| Esperar durante el período de tiempo | 1WTM[x] | Sólo durante la grabación del programa; Espera el período de tiempo [x] en ms | |
| Grabación del programa Beginn | 1PGM[x] | Comience la grabación del programa en la ranura [x]; Nota: La ranura [x] debe ser libre | |
| Finalizar la grabación del programa | 1END | Finalizar la grabación del programa y guardar el programa | |
| Programa Borrar | 1ERA[x] | Borrar programa guardado en la ranura [x] | |
| Ejecutar programa | 1EXC[x] | Ejecutar programa guardado en la ranura [x] | |
| Programa de bucle | 1PGL[x] | [x]-1 Modo de bucle de programa ON [x]-0 Modo de bucle de programa desactivado | |
| Leer y borrar errores | 1ERR? | Solicitar informe de error | |
Tabla 2: Comandos útiles para experimentos de ajuste de carga posterior.
Figura suplementaria 1: Dimensiones de los bastidores de silicona. (A) Vista superior, (B) vista lateral seccional y (C) vista posterior detallada de los bastidores de silicona utilizados para estos estudios. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Parámetros de contentudo adicionales para el aumento escalonado de la carga posterior. Mediciones contráctil de EGT de control (línea negra) y EhT cultivados en postes magnéticamente sensibles (MR-HGT; línea azul) durante un período de cultivo de 31 días. (A) LOS MR-HIF tenían una tasa de producción de fuerza significativamente mayor que los EHT de control a partir del día 27. (B) La tasa de descomposición de la fuerza también fue significativamente mayor en los MR-EHT que en el control desde el día 27 en adelante. (C) Si bien el trabajo contráctil medido en los EHT de control aumentó gradualmente durante todo el período de cultivo, el trabajo contráctil producido por los MR-EHT alcanzó su punto máximo el día 26 y cayó a partir de entonces a niveles por debajo del control. Sin embargo, el trabajo en MR-HEHTs nunca fue significativamente mayor que el de los EHT de control. En este punto, se analizaron los EGT de control n a 10 MR-HLT y n a 10 mediante el montaje de un modelo mixto (REML - probabilidad máxima restringida) y la prueba de comparación múltiple de Sidak. Las barras de error de los gráficos representan un error estándar de la media, * p < 0.05, *** p < 0.001. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 3: Parámetros de contentuación adicionales para el protocolo de carga posterior de intervalo. Se observó el comportamiento contentual de los EHT con capacidad magnética (MR-HEH) bajo la influencia de un régimen fluctuante de la carga posterior. (A) Durante el protocolo de postcarga de intervalos, los MR EHT (barras azules) mostraron inicialmente una tendencia hacia tasas de producción de fuerza más altas en comparación con el control de eEH (barras negras), pero estas diferencias no fueron significativas y disminuyeron hacia el final del experimento. (B) Las tasas de decaimiento de la fuerza medidas en MR-HEH y los EHT de control fueron estadísticamente similares a lo largo del protocolo de carga posterior a intervalos. (C) El trabajo contráctil medido para MR-HEHTs aumentó durante los primeros días del protocolo de intervalo de carga posterior, pero disminuyó en el último día. El trabajo contráctil medido para los EHT de control no cambió notablemente durante este período de tiempo. El trabajo en MR-HEHTs nunca fue significativamente mayor que el trabajo en el control de los EHT. Para estos experimentos, se analizaron los HIT de n a 10 por grupo mediante la prueba de comparación múltiple de 2 vías de ANOVA y Sidak. Las barras de error de los gráficos representan un error estándar de la media. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este documento describe una nueva técnica para alterar magnéticamente la descarga posterior en tejidos cardíacos de ingeniería. Esta técnica se basa en el uso de una etapa piezoeléctrica para traducir una placa de imanes fuertes hacia y lejos de bastidores magnéticamente sensibles de postes de silicona. Cuanto más cerca estén los dos conjuntos de imanes, más fuerte será la carga posterior experimentada por los EHT cultivados en ellos.
Hay varios pasos que son críticos para la producción y el uso exitosos de este sistema. Al fabricar los bastidores de silicona con capacidad de respuesta magnética, es crucial asegurarse de que todos los imanes dentro de los postes estén orientados con la misma polaridad. Si se coloca un imán en la orientación inversa, servirá para debilitar se debilitará en lugar de aumentar la fuerza del campo magnético. Del mismo modo, esta polaridad debe coincidir con la de todos los imanes dentro de la placa de imán, de lo contrario los dos conjuntos de imanes se repelen, en lugar de atraerse unos a otros. Además, siempre que sea posible, abstenerse de utilizar materiales magnéticos en la construcción del dispositivo de ajuste de la carga posterior, ya que pueden interferir con el campo magnético. El aluminio se sugiere como un material de construcción primario por esta razón. Del mismo modo, si se utiliza una etapa piezoeléctrica distinta de la enumerada en la Tabla de Materiales, asegúrese de que sea resistente a los campos magnéticos y a las condiciones de cultivo celular estándar (por ejemplo, 37 oC, 100% de humedad y altas concentraciones de CO2 y O2). Por último, tenga en cuenta que la mayoría de las etapas lineales piezoeléctricas están destinadas a montarse horizontalmente, ya que tienden a tener una baja capacidad de carga. Como tal, si el peso de la placa imán supera esta capacidad de carga, se debe utilizar un contrapeso para descargar el motor.
A pesar de las mejores prácticas, es bastante difícil mantener la superficie del codificador prístina. Cuando esto ocurre, la etapa dejará de moverse antes de alcanzar la posición de destino cuando se ejecuta en modo de bucle cerrado. El LED rojo del controlador de movimiento parpadeará, además, el software del controlador de movimiento mostrará un mensaje de error "No se detecte codificador". Para remediar esto, el usuario debe limpiar la superficie del codificador con un trozo de tela sin pelusas empapado en alcohol isopropílico y dejar que se seque al aire.
Este protocolo demuestra los pasos dados por nuestro laboratorio para producir e implementar este sistema. Sin embargo, varias de estas medidas podrían lograrse por diferentes medios. Por ejemplo, se podría utilizar un transductor de fuerza, en lugar de medios ópticos, para confirmar la relación entre el espaciado del imán y la rigidez posterior. Además, los postes personalizados podrían diseñarse y fabricarse con imanes y aparatos ortopédicos integrados. Sin embargo, hemos encontrado que el posicionamiento preciso de estos objetos es más fácil de lograr manualmente. Para ajustar la gama de cargas posteriores aplicables por este sistema, estos postes se pueden fabricar con diferentes rigidezes basales o con un número diferente de imanes. Sin embargo, el uso de demasiados imanes impedirá la flexión posterior. Alternativamente, esto también se puede lograr ajustando el tamaño y la fuerza de los imanes dentro de la placa de imán. Los imanes más grandes y fuertes producirán cargas posteriores más altas.
Hay varias limitaciones a este método que podrían mejorarse en futuras versiones de este sistema. A saber, el rango de poscargos aplicables está físicamente limitado por el espaciado máximo y mínimo entre los imanes de poste y los imanes de placa. Idealmente, los postes utilizados para este sistema colocarían los tejidos lo más cerca posible de la base del plato de cultivo de tejido, sin permitir directamente que el tejido toque la parte inferior de la placa. Sin embargo, los puestos utilizados en estos estudios se hicieron comercialmente antes del desarrollo de este sistema, por lo que las longitudes de los puestos no fueron optimizadas para esta plataforma. Del mismo modo, dado que el sistema de análisis de contractilidad EHT se construyó antes de este sistema, no fue diseñado para permitir cables eléctricos dentro o fuera del espacio de medición. Como tal, la presencia de estos cables dio lugar a una pequeña brecha de aire, lo que permitió que los gases se filtraran lentamente fuera de la cámara interior. Esto podría mejorarse ajustando los caudales de gas en consecuencia. Sin embargo, idealmente, una futura realización de este sistema tendría puntos de salida y entrada aislados para estos cables. Si se desea realizar estos experimentos en ausencia del sistema de análisis de contractilidad EHT, la plataforma de ajuste de la carga posterior se puede colocar dentro de una incubadora. Sin embargo, el sistema en su totalidad sólo cabe dentro de una incubadora estándar si se retira uno o más de los estantes, haciendo que este espacio no esté disponible para otros propósitos de cultivo celular y o tisular. Para observar ópticamente los tejidos en cualquier ambiente, las luces serán necesarias. Las luces LED utilizadas para este sistema se encontraron para desprender una cantidad sustancial de calor. Si se deja encendido durante largos períodos, este calor podría dañar potencialmente los tejidos. Como tal, para estos estudios, las luces sólo se utilizaron durante períodos cortos mientras se evaluaba la contractilidad de los tejidos. Sin embargo, si uno desea observar constantemente los tejidos, el sistema de iluminación tendrá que ser optimizado para estos fines.
Afterload ha sido estudiado previamente en los modelos EHT16,23. Sin embargo, estos trabajos presentaban técnicas que sólo eran capaces de lograr un aumento estático singular en la carga. Alternativamente, este trabajo demostró cómo una plataforma basada en magnéticos se puede utilizar para afinar y regular temporalmente la descarga posterior en EHT. Los resultados de dos conjuntos separados de experimentos se utilizaron para ejemplificar la amplia gama de regímenes de poscarga que se pueden aplicar a los EPR que utilizan este dispositivo. Las aplicaciones futuras previstas de este sistema incluyen estudios sobre el efecto del régimen de poscarga aplicado (dosis y duración) tanto en la maduración de tejidos como en la remodelación patológica.
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Disclosures
TE y MNH son cofundadores de EHT Technologies GmbH. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Jutta Starbatty por su apoyo en el trabajo de cultivo de tejidos, Axel Kirchhof por la fotografía, Alice Casagrande Cesconetto por el trabajo de edición, y un agradecimiento especial a Aksehirlioglu por el apoyo técnico en el desarrollo de este dispositivo. B.B. fue apoyado por una beca DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), M.L.R. por una beca de beca federal postdoctoral Whitaker y M.N.H. por fondos de la DZHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d = 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
References
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